Composiciones farmacéuticas que comprenden una sal de tungsteno (VI) para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos, en particular Alzheimer y esquizofrenia.

La invención se refiere al uso de composiciones farmacéuticas que 5 comprenden compuestos de tungsteno (Vl) para el tratamiento de transtornos neurodegenerativos, en particular, Ia enfermedad de Alzheimer y otras tauopatías, es decir, transtornos neurodegenerativos que implican deposición anormal de Ia proteina tau en sus diferentes isoformas, en el cerebro, y también para Ia esquizofrenia. 10

ESTADO DE LA TéCNICA

Los trastornos neurodegenerativos se pueden definir como transtornos crónicos y progresivos del sistema nervioso que afectan las funciones 15 neurológicas y de comportamiento, que comienzan con cambios bioquímicos específicos que conducen en última instancia a los diferentes síndromes clínicos e histopatológicos. Entre estos transtornos están Ia enfermedad de Alzheimer, Ia enfermedad de Huntington y Ia enfermedad de Parkinson.

20 La enfermedad de Alzheimer es Ia forma más común de demencia entre Ia gente anciana, que implica las partes del cerebro que controlan el pensamiento, memoria y lenguaje. Se caracteriza por dos signos patológicos principales: placas amiloides y haces neurofibrilares (neurofibrillary tangles, NFT), además de pérdida de células neuronales en regiones específicas del

25 cerebro. El β-amiloide se origina a partir de Ia fragmentación de una proteína llamada proteína precursora del amiloide (APP). En un cerebro sano, estos fragmentos de proteína son degradados y eliminados. En Ia enfermedad de Alzheimer, estos fragmentos se acumulan para formar estructuras insolubles denominadas placas de amiloide. Los NFTs consisten en fibras entrelazadas

30 que se encuentran dentro de las neuronas. Principalmente están compuestas de Ia proteína específica de neuronas denominada tau, que forma parte de estructuras subcelulares llamadas microtúbulos. Los microtúbulos son uno de los componentes del citoesqueleto celular y están implicados en varias funciones tales como el transporte ¡ntracelular y Ia generación de asimetría.

35 La principal función de Ia proteína tau es estabilizar los microtúbulos. En Ia enfermedad de Alzheimer y también en otras tauopatías, Ia proteina tau muestra algunas aberraciones bioquímicas, de las cuales Ia hiperíosforilación

es la más sobresaliente. Como consecuencia Ia proteína tau se agrega, los microtúbulos se desestabilizan y, por consiguiente, Ia función neuronal se compromete.

La fosforilación de proteínas es un mecanismo regulatorio post-traduccional utilizado por las células para modular enzimas y proteínas estructurales. La fosforilación y de-fosforilación de Ia proteína tau en los residuos treonina y serina se controla por varias proteína-quinasas y proteína-fosfatasas. Una de las proteína-quinasas que fosforilan tau es Ia glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK3). GSK3 es el principal enzima implicado en el proceso de hiperfosforilación anormal de Ia proteína tau, y se sobreexpresa en los cerebros de pacientes con Ia enfermedad de Alzheimer así como en pacientes con otras tauopatías. Se ha propuesto que los inhibidores farmacológicos de Ia fosforilación de Ia proteina tau, específicamente los inhibidores de GSK3 selectivos, podrían usarse para tratar Ia enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades neurodegenerativas.

Se conocen varios inhibidores de GSK3, pero los efectos secundarios asociados a Ia toxicidad y los problemas relativos a absorción, distribución, metabolismo y excreción de los inhibidores conocidos, afectan a su potencial clínico (cfr. "Pharmacological inhibitors of glycogen synthase kinase 3", Laurent Meijer et al., Trends in Pharmacological Sciences 2004, vol. 25, No. 9, pp. 471-480).

Algunas de las claves más importantes para el desarrollo de inhibidores de GSK3 para el tratamiento efectivo de Ia enfermedad de Alzheimer y otras tauopatías son Ia posesión de inhibidores selectivos de esta quinasa que en primer lugar no interfieran con otros procesos de señalización celular, Io que significaría que no tendrían efectos adversos, por otro lado deberían ser capaces de atravesar Ia barrera hematoencefálica y tener potencia in vivo.

Los cambios en Ia regulación de Ia actividad GSK3 también se han asociado a Ia esquizofrenia (cf. E.S: Emamian et al., Nat. Genet, 2004, vol. 36, pp.131- 7). Según J.A. Lieberman, Ia esquizofrenia claramente satisface muchos de los criterios que definen los transtomos neurodegenerativos (cf. J.A.

Lieberman, Bioloqical Psvchiatrv, 1999, vol. 46, pp. 729-739). También se han descrito pruebas directas e indirectas de que el curso progresivo de Ia

esquizofrenia está asociado a procesos neurodegenerativos en curso (cf. P.C. Ashe y otros., Proa. Neuro-Biol. Psvchiat. & Biol. Psvchiat 2001 , vol.25, pp.691-707).

A pesar de todos los esfuerzos en investigación invertidos en el pasado, el tratamiento y/o prevención de transtornos neurodegenerativos tales como Ia enfermedad de Alzheimer o Ia esquizofrenia están lejos de ser satisfactorios. Por Io tanto, el proporcionar compuestos para el tratamiento de alteraciones patológicas en sistemas neuronales relacionados con Ia fosforilación de tau, tales como Ia enfermedad de Alzheimer y otras tauopatías, así como para el tratamiento de Ia esquizofrenia, en humanos, es de gran importancia.

DESCRIPCIóN DE LA INVENCIóN

Los inventores han encontrado que los compuestos de tungsteno (Vl) inhiben GSK3 en células neurales tanto en sistemas de cultivo de células como |n vivo. La principal consecuencia de esta inhibición es una reducción significativa en Ia fosforilación dependiente de GSK3 de Ia proteína asociada a microtúbulos denominada tau. Así, dado que los compuestos de tungsteno (Vl) contribuyen a Ia inactivación de GSK3, el uso de estos compuestos representa una nueva aproximación terapéutica para tratar Ia enfermedad de Alzheimer y otras tauopatías, y también para el tratamiento de Ia esquizofrenia.

El tungstato sódico es un agente anti-d ¡abético y anti-obesidad en varios modelos de animales. Este compuesto muestra un perfil de toxicidad bajo y en Ia actualidad han finalizado los ensayos clínicos de Fase I. EP 1.400.246- A describe una composición farmacéutica de un compuesto de tungsteno (Vl) para disminuir Ia glicemia en humanos que sufren de diabetes mellitus de Tipo 1 (IDDM) o de Tipo 2 (NIDDM). EP 755.681-A enseña que los compuestos de tungsteno (Vl) también son eficientes para el tratamiento de Ia obesidad/sobrepeso en humanos no diabéticos. Sin embargo, los compuestos de tungsteno (Vl) nunca se han propuesto para el tratamiento de Ia enfermedad de Alzheimer o de cualquier tauopatía, o de Ia esquizofrenia.

Según un aspecto de Ia presente invención, se proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de transtornos

neurodegenerativos, en un mamífero, incluyendo un humano, tales como Ia esquizofrenia o tauopatías tales como Ia enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal con parkinsonismo asociado al cromosoma 17, parálisis supranuclear progresiva, esclerosis lateral amiotrófica/parkinsonismo-demencia compleja de Guam, enfermedad de Pick, degeneración corticobasal, y argirofilia granulosa. Dicha composición comprende una cantidad efectiva de un compuesto formado por tungsteno (Vl) y una parte química aceptable farmacéuticamente, o de un solvato de dicho compuesto, en combinación con excipientes farmacéuticamente aceptables o portadores.

En el contexto de esta invención, Ia expresión "un compuesto formado por tungsteno (Vl) y una parte química (chemical moiety, en inglés) farmacéuticamente aceptable" pretende incluir cualquier entidad química formada por uno o varios átomos de tungsteno en su estado de oxidación 6+, que está unida a una estructura química farmacéuticamente aceptable por sí misma. El catión W^ ⁺ no ha sido ni observado ni aislado, y siempre se encuentra acompañado de una parte química parcialmente formada por una esfera de coordinación alrededor del átomo de W(VI). La esfera de coordinación puede estar formada por ligandos inorgánicos (óxido, hidróxido, peróxido, fosfato, etc.) como, por ejemplo, en el caso del anión tungstato (con una esfera de coordinación formada por cuatro iones óxido), o en el caso de los peroxitungstatos (con esferas de coordinación formadas por mezclas de iones óxido y peróxido). La esfera de coordinación también puede estar formada por ligandos orgánicos que sean moléculas o iones unidos al átomo de W(VI) a través de átomos de O, S o N pertenecientes a diferentes compuestos orgánicos farmacéuticamente aceptables (p.ej. alcoholes farmacéuticamente aceptables, tioles, ácidos carboxílicos, aminas, aminoácidos, heterociclos nitrogenados, etc.). También son posibles esferas de coordinación mixtas inorgánicas/orgánicas. Cuando Ia estructura formada por el átomo de W(VI) y su esfera de coordinación no es neutra, el término "parte química" también incluye a cualquier especie iónica farmacéuticamente aceptable que neutralice al compuesto de tungsteno (Vl) en su totalidad. Por ejemplo, el anión tungstato está siempre acompañado por un catión (p.ej. sodio, potasio, magnesio, calcio), formando una sal neutra de tungstato. El ion tungstato origina una serie de isopolitungstatos (paratungstatos, metatungstatos, etc.) que difieren en el grado de agregación; su uso también

se contempla en esta invención. Son comunes los solvatos de los compuestos de tungsteno (Vl) (p.ej. el dihidrato del tungstato sódico), y su uso también se considera parte de esta invención.

En una realización preferida, el compuesto de tungsteno (Vl) en Ia composición farmacéutica es una sal de tungstato. Especialmente preferidas son las sales de especies catiónicas seleccionadas del grupo formado por los cationes sodio, potasio, magnesio y calcio. Los compuestos de tungsteno (Vl) más preferidos son el tungstato sódico y su dihidrato. Este último es disponible comercialmente. El tungstato sódico dihidrato es una sal blanca, inolora con textura fina y cristalina, y se disuelve fácilmente en agua.

El producto puede administrarse oralmente en cualquier forma galénica convencional, siendo el comprimido Ia forma preferida. Este sistema ha sido utilizado en humanos inscritos en ensayos clínicos de Fase I de este compuesto para el tratamiento de Ia obesidad/sobrepeso en humanos no diabéticos (EP 755.681 -A) .

Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de un compuesto formado por tungsteno (Vl) y una parte química farmacéuticamente aceptable, o de un solvato de dicho compuesto, para Ia preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de un transtorno neurodegenerativo en un mamífero, incluyendo un humano. En una realización particular el transtorno neurodegenerativo es una tauopatía tal como Ia enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal con parkinsonismo asociado al cromosoma 17, parálisis supranuclear progresiva, esclerosis lateral amiotrófica/parkinsonismo-demencia compleja de Guam, enfermedad de Pick, degeneración corticobasal, y Argirofilia granulosa. En otra realización particular el transtorno neurodegenerativo es Ia esquizofrenia.

La invención también se refiere a un método de tratamiento y/o profilaxis de un mamífero, incluyendo un humano, que sufre o es susceptible de sufrir transtornos neurodegenerativos tales como los mencionados previamente, en particular Ia enfemedad de Alzheimer o Ia esquizofrenia, dicho método comprende Ia administración a dicho paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto formado por tungsteno (Vl) y una parte química aceptable farmacéuticamente, o un solvato de dicho

compuesto, en combinación con excipientes farmacéuticamente aceptables o portadores.

El tratamiento terapéutico de tauopatías que se deriva de esta invención es una aproximación nueva y, respecto a los tratamientos propuestos previamente en Ia técnica, éste implica varias ventajas destacables: éste inhibe a GSK3; especificidad, reduce Ia hiperfosforilación anormal de tau; eficacia, ejerce su acción a corto plazo; falta de toxicidad, se han hecho los ensayos clínicos de Fase I; y bajo precio.

A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. El resumen de esta solicitud se incorpora aquí como referencia. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.

BREVE DESCRIPCIóN DE LOS DIBUJOS

FIG. 1 es una ilustración gráfica del efecto de tungstato en GSK3-β y en Ia fosforilación de tau en células neuroblastoma SH-SY5Y.

FIG. 2 es una ilustración gráfica del efecto de tungstato en Ia fosforilación de tau en cerebros de ratas sanas y de ratas resistentes a Ia insulina.

FIG. 3 es una ilustración gráfica del efecto de tungstato en Ia fosforilación de tau en cerebros de ratas diabéticas por inyección de estreptozotocina.

DESCRIPCIóN DETALLADA DE REALIZACIONES PARTICULARES

Descripción detallada de las figuras

Los resultados se muestran, en parte de forma gráfica en las figuras adjuntas:

En Ia FIG. 1 se muestra el efecto del tungstato (W) en Ia fosforilación de GSK3-β y tau en Ia línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y. Los datos corresponden a las medias y las barras de error representan Ia desviación estandard obtenida a partir de tres experimentos independientes. A) Células de neuroblastoma SH-SY5Y fueron incubadas durante 10 minutos en presencia (+) o ausencia (-) de 1 mM tungstato sodio y sus extractos proteicos fueron ensayados por Western blot con anticuerpos que reconocen GSK3-β cuando está fosforilada en Ia Ser-9 y contra GSK3-β total. La fosforilación de GSK3-β en Ser-9 causa su inactivación (D. A: Cross et al., Nature, vol. 378, pp.785-789). El diagrama muestra Ia relación entre Ia GSK3- β fosforilada en Ser-9 (GSK3β-pS9) y Ia cantidad total de GSK3-β. B) Células SH-SY5Y fueron incubadas con concentraciones crecientes de tungstato y el grado de fosforilación de tau fue determinado por Western blot con el anticuerpo tau-1 , que reconoce tau cuando las serinas 198, 199 o 202 están desfosforiladas. Los diagramas muestran Ia relación entre tau desfosforilado (tau1 ) y total (7.51 ). C) Células SH-SY5Y fueron incubadas durante 10 minutos en presencia (+) o ausencia (-) de 1 mM tungstato sódico (W) y el grado de fosforilación de tau fue determinado por Western blot con el anticuerpo AT180, que reconoce tau cuando Ia treonina 231 está fosforilada. El diagrama muestra Ia relación entre tau fosforilado (AT180) y total (7.51 ). La cantidad total de tau fue determinada con el anticuerpo 7.51. Los datos corresponden a las medias y las barras de error representan Ia desviación estándar de 3 a 5 experimentos independientes.

En Ia FIG. 2 se muestra el efecto del tungstato (W) en Ia fosforilación de tau en cerebros de ratas sanas y resistentes a insulina A) Análisis por Western blot de Ia fosforilación de GSK3 (izquierda) y tau (derecha) en extractos de cerebros de ratas inyectadas intracranealmente con solución salina (-) o 0.1 mM tungstato (+). El grado de fosforilación fue determinado mediante anticuerpos contra GSK3-β (pS9) fosforilada en Ser-9, contra tau fosforilado en Ia treonina 231 (AT180) y contra tau desfosforilado en las serinas 198, 199 o 202 (tau-1). La cantidad total de GSK3 y tau fue determinada mediante Ia interacción con anticuerpos generados contra GSK3 y tau (7.51 ), respectivamente. B) Análisis por Western blot de Ia fosforilación de GSK3-β (izquierda) y tau (derecha) en ratas control (Ctrl) y resistentes a insulina (IR). La fosforilación fue determinada mediante un anticuerpo que reacciona con (GSK3-β fosforilada en Ser-9 (pS9-GSK3-β) o con los anticuerpos tau-1 y

AT180. Las cantidades totales de GSK3 y tau fueron determinadas como en A. C) Ratas resistentes a insulina fueron inyectadas intracranealmente con solución salina (-) o 0.1 mM tungstato (+), sus cerebros fueron extraídos y homogeneizados, y se realizaron Western blots de las proteínas cerebrales con los anticuerpos tau-1 y AT180. La cantidad total de tau fue determinada con el anticuerpo 7.51. Se observó una disminución en Ia interacción con el anticuerpo AT180 y un incremento con el anticuerpo tau-1.

En Ia FIG. 3 se muetra el efecto del tungstato (W) en Ia fosforilación de tau de cerebros de ratas diabéticas STZ. A) Análisis por Western blot de Ia fosforilación en Ser-9 de GSK3 en extractos cerebrales de ratas sanas inyectadas intraperitonealmente con solución salina (Ctrl) o tungstato (W) (50 mg/kg). El diagrama muestra Ia relación entre GSK3 fosforilada en Ser-9 y Ia cantidad total de GSK3 (GSK3-β). B) como en A), ratas diabéticas STZ inyectadas intraperitonealmente con 50 o 75 mg/kg de tungstato. C) Análisis por Western blot de Ia fosforilación de tau en Ia secuencia reconocida por el anticuerpo tau-1 en extractos cerebrales de ratas sanas control inyectadas intraperitonealmente con solución salina (Ctrl) o tungstato (W) (50 mg/kg). El diagrama muestra Ia relación entre tau reconocido por el anticuerpo tau-1 y Ia cantidad total de tau que es reconocida por el anticuerpo 7.51. D) como en C), ratas diabéticas STZ inyectadas intraperitonealmente con 50 o 75 mg/kg de tungstato. Los datos corresponden a las medias y las barras de error representan Ia desviación estándar obtenidas a partir de tres a cinco experimentos independientes.

EJEMPLOS

Anticuerpos y reactivos

El tungstato de sodio dihidrato fue adquirido a Cario Erba (Milán, Italia). Se han utilizado los siguientes anticuerpos contra tau: 7.51 (M. Novack et al., Proa Nati. Acad. Sci. USA 1991. vol. 88, pp. 5837-5841 ) (cedido por el Dr. C. Wischik, University of Aberdeen, Aberdeen, Reino Unido), AT-180 (Innogenetics, Gante, Bélgica), y tau-1 (Chemicon, Temecula, CA). El anticuerpo AT-180 reconoce tau cuando está fosforilado en Ia treonina 231. El anticuerpo tau-1 reconoce tau solamente cuando las serinas 198, 199 y 202 no están fosforiladas y el anticuerpo 7.51 reconoce tau total de forma

independiente a sus modificaciones postraduccionales. La numeración de los epítopos de tau se basa en Ia isoforma más larga de esta proteína en humanos que contiene 441 aminoácidos. El resto de anticuerpos utilizados han sido: phospho-GSK3-β (Ser-9) y anti-GSK3 de CeII Signaling, (Beverly, MA). Los enzimas y reactivos bioquímicos utilizados son de Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) salvo que se indique Io contrario. El resto de productos químicos utilizados fueron de grado analítico.

Análisis por Western blot

El análisis del grado de fosforilación de tau y GSK3 se realizó por Western blot con los anticuerpos que se mencionan en el anterior apartado. Las células se homogeneizaron a 4 ⁰ C en 50 mM ácido N-2-hidroxietil-piperazin- N'-2-etanosulfónico (HEPES), pH 7.4, 10 mM ácido etilen diamino tetraacético (EDTA), 0.1 % 4-(1 ,1 ,3,3-tetrametilbutil) fenil-polietilen glicol (tritón X-100), 20 mM NaF, 0.1 mM ortovanadato sódico, 1 mM fluoruro de fenil metil sulfonilo, 10 μg/ml ácido isovaleril-Val-Val-4-amino-3-hidroxi-6- metilheptanoil-Ala-4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico (Pepstatina A); y 10 μg/ml aprotinina. Los usados celulares se centrifugaron a 10,000 g durante 30 minutos a 4 ⁰ C y posteriormente fueron calentados a 100 ⁰ C durante 5 minutos en tampón de muestra de electroforesis. La concentración proteica se determinó mediante el método del BCA (Pierce, Rockford, IL). Las proteínas fueron separadas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) del 10% y fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell Bioscience, Dassel, Alemania).

Después de bloquear los sitios de unión no especifica de proteínas en las membranas con tampón fosfato salino (PBS), 0.05% sorbitan monolaurato polioxietileno (Tween 20) y 5% leche en polvo desnatada, las membranas se incubaron durante una noche a 4 ⁰ C con los anticuerpos primarios diluidos en el tampón anterior. Las proteínas reconocidas por los anticuerpos fueron visualizadas mediante reacción de quimioluminiscencia (Perkin Elmer Life Sciences Boston, MA) después de su incubación con anticuerpos secundarios conjugados a peroxidasa de rábano (Dako A/S Glostrup, Dinamarca). El análisis densitométrico de las proteínas reconocidas por los anticuerpos se realizó con el software GS-710 (Bio-Rad, Hercules, CA) y los niveles de fosfo-proteínas fueron normalizados mediante el cálculo de Ia relación entre las señales dependientes e independientes de Ia fosforilación.

EJEMPLO 1 : Efectos del tunαstato en Ia fosforilación de GSK3-β en Ser-9 en Ia línea celular SH-SY5Y

Con Ia finalidad de examinar los efectos del tungstato sobre células neuronales, se analizó Ia acción inhibidora del tungstato dihidrato sobre GSK3-β mediante el análisis de su fosforilación en Ia Ser-9, en Ia línea celular de neuroblastoma SH-S Y5Y (ref.: 94030304 de Ia Colección Europea de Cultivos Celulares, Salysbury, Whiltshire, Gran Bretaña). El neuroblastoma humano SH-S Y5Y se cultivó en medio de cultivo celular de Dulbecco

Modificado por Eagle (DMEM; Invitrogen-Gibco, Carlsbad, CA) suplementado con 10% (v/v) suero bovino fetal (FBS; Invitrogen-Gibco), 2 mM glutamina, y 50 μg/ml gentamicina. El día previo al experimento, las células fueron sembradas en placas multipocillo y cultivadas en medio NeuroBasal (NB) en ausencia de suero bovino fetal (Invitrogen-Gibco). El tungstato de sodio dihidrato fue disuelto en agua doble destilada y añadido al medio de cultivo a 0.1 , 1 ó 5 mM de concentración final. Las células fueron incubadas durante 5 ó 10 minutos en estas condiciones. Las células control fueron incubadas con el mismo volumen de agua doble destilada. La exposición de las células de neuroblastoma humano SH-SY5Y a tungstato sódico incrementó de forma significativa Ia fosforilación de GSK3- β en Ia Ser-9 (FIG. 1A), Io que indica que este enzima fue ¡nactivada por el tratamiento.

A continuación se ensayó si Ia acción inhibidora del tratamiento con tungstato sobre GSK3 se correlacionaba con una disminución en Ia fosforilación de Ia proteína tau en los sitios modificados por esta proteína quinasa. En consecuencia, se analizó el estado de fosforilación de tau en células SH- SY5Y tratadas con tungstato. Para ello se utilizó en primer lugar un anticuerpo que reconoce Ia proteína tau dependiendo de su estado de fosforilación por GSK3 mediante Western blot. El anticuerpo tau-1 interacciona con tau cuando las serinas 198,199 o 202 no se encuentran modificadas pero no Io hace cuando estos residuos se encuentran fosforilados. Se observa un incremento significativo de Ia inmunoreactividad con el anticuerpo tau-1 (FIG. 1B), Io que sugiere que el tratamiento con tungstato inhibe Ia fosforilación de las serinas 198, 199 o 202 de tau.

Además, se observa en células tratadas con tungstato una disminución en Ia fosforilación del epítopo reconocido por otro anticuerpo (AT-180) que

reconoce otro epítopo dependiente de Ia fosforilación de GSK3 en tau (FIG. 1C).

Estos resultados muestran que el tratamiento con tungstato estimula ia fosforilación de GSK3-β en Ia Ser-9 e inhibe Ia fosforilación de tau en determinadas secuencias de esta proteína que son modificadas por esta proteína quinasa en células de origen neuronal.

EJEMPLO 2: Efectos del tungstato sódico en Ia fosforilación de tau in vivo.

Con Ia finalidad de estudiar los efectos del tungstato en Ia fosforilación de tau in vivo, se analizó en primer lugar el grado de fosforilación de esta proteína y el de GSK3- β en Ia Ser-9 en cerebros procedentes de ratas Wistar sanas tratadas o no con tungstato.

Las ratas Wistar macho que pesaban 220-240 g (IFFA CREDO, L ^' Arbresse, Francia) se estabularon individualmente en un ciclo de 12:12-h luz-oscuridad con temperatura y humedad controladas. No se observaron cambios significativos en Ia fosforilación de tau o GSK3 en presencia o ausencia de tungstato en ambos grupos (FIG. 2A). Estos resultados están de acuerdo con datos previos que indican que el tungstato no es activo cuando se ensaya en animales sanos.

A continuación, se ensayaron los efectos del tungstato en un modelo de resistencia a insulina en el cual este compuesto es farmacológicamente activo: ratas obesas por alimentación con una dieta rica en grasas. Un grupo de ratas fue alimentado con una dieta control (8% de las calorías procedentes de grasa, tipo AO4 de Panlab, Barcelona, España), otro grupo fue alimentado con una dieta rica en grasas, en Ia que el 65% de las calorías procedía de grasas (cfr. M. Claret et al., Obes Res 2004, vol. 12, pp.16596- 1603), con Ia finalidad de inducir resistencia a insulina. Después de 30 días en estas condiciones de alimentación las ratas fueron anestesiadas y se les inyectó intraventricularmente 5 μl bien de solución salina o de una solución 110 nM de tungstato sódico disuelto en solución salina ("Tungstate Decreases Weight gain and adiposity in obese rat through increased thermogenesis and lipid oxidation", Claret et al, Endocrinoloαv vol. 146, pp. 4362-4369). Después de 24 horas, se extrajeron los cerebros de las ratas y

se aislaron los cortexes que fueron homogeneizados en tampón fosfato salino. Los extractos proteicos fueron ensayados con anticuerpos contra tau y GSK3-β por Western blot.

Los niveles de GSK3-β fosforilados en Ia Ser-9 se redujeron en los cerebros de las ratas resistentes a insulina cuando se comparaban con los animales sanos no obesos (FIG. 2B izquierda). Este hallazgo indica que esta quinasa es más activa en las ratas resistentes a insulina. Este hecho debería comportar un incremento en Ia fosforilación de tau en este grupo de animales ya que esta proteína es un excelente sustrato de GSK3. De acuerdo con esto se observó un incremento en Ia unión del anticuerpo AT180 a tau y un descenso en Ia asociación del anticuerpo tau-1 en ratas obesas cuando se comparaba con el grupo de animales no obesos (FIG. 2B derecha). El tratamiento con tungstato producía un descenso en Ia fosforilación en el epítopo reconocido por el anticuerpo AT180 y un incremento en Ia cantidad de proteína reconocida por el anticuerpo tau-1 (FIG. 2C). Estos resultados están de acuerdo con los obtenidos en células de origen neuronal: el tratamiento con tungstato reducía Ia fosforilación de tau dependiente de GSK3.

Por otro lado, se han ensayado los efectos del tungstato en un modelo de diabetes de tipo-1 , Ia rata diabética por inyección de estreptozotocina (STZ) (cfr. A. Junod et al., J. Clin. Invest. 1969, vol. 48, pp. 2129-2139). La diabetes fue confirmada mediante Ia determinación de Ia glicemia a partir de sangre extraída Ia vena caudal (Glucometer élite, Bayer, Barcelona, Spain). Se utilizaron un total de 3 ratas tratadas y 3 ratas control. Los tratamientos con tungstato se realizaron por inyección ¡ntraperitoneal de tungstato (50 o 75 mg/kg) a ratas diabéticas STZ.

En este caso de nuevo no se observaron diferencias en Ia fosforilación de GSK3 en Ia Ser-9 o en Ia de tau en el epítopo reconocido por el anticuerpo tau-1 , en animales sanos tratados o no con tungstato. (FIGs. 3A y C). Sin embargo, en los animales diabéticos por inyección de STZ, el tratamiento con tungstato incrementó Ia fosforilación en Ia Ser-9 de GSK3-β y redujo Ia fosforilación de tau en el epítopo reconocido por el anticuerpo tau-1 (FIGs. 3 B y D).

Estos resultados muestran que el tungstato sódico disminuye Ia fosforilación de tau en ratas resistentes a insulina o diabéticas. Todos los experimentos fueron realizados de acuerdo con Ia normativa establecida para protección de los animales destinados a experimentación (Unión Europea y Directiva del Gobierno Autónomo) y los protocolos fueron previamente aprobados por el Comité ético de Experimentación Animal de Ia Universidad de Barcelona.