O presente Certificado de Adição, decorrente do pedido de Patente de Invenção PI0502497-8, depositado em 05 de novembro de 2005, refere-se ao uso de composições farmacêuticas contendo um agonista do receptor Mas, como a Angiotensina-(1-7), no tratamento de doenças degenerativas musculares.

Dentre as doenças degenerativas musculares, a Distrofia Muscular de Duchene (DMD) é a doença neuromuscular de origem genética mais comum, afetando 1 em cada 3.500 recém-nascidos do sexo masculino. A DMD é causada por mutações no gene da distrofina, no cromossomo X, e é caracterizada por atrofia muscular, aumento da sinalização pelo fator de crescimento transformador (TGF)-beta e fibrose (Matsumura, K. and Campbell, K.P. Muscle and Nerve 17, 2-15, 1994).

A distrofina, o complexo de glicoproteína associado à distrofina e a laminina alfa-2 conectam a matriz extracelular ao citoesqueleto intracelular, sendo, portanto, cruciais para a manutenção da integridade estrutural das fibras musculares (Blake, D.J. , Weir, A., Newey, S.E. and Davies, K.E. Physiological Reviews 82, 291-329, 2002). As principais consequências da ausência de distrofina no músculo esquelético são a instabilidade do sarcolema e o aumento da vulnerabilidade da fibra ao esforço mecânico, o que resulta em degeneração da fibra, seguida de uma regeneração parcial. A regeneração completa, porém, é impossibilitada pela fibrose (proliferação do tecido conectivo), que substitui progressivamente o tecido muscular (Mann, C.J. , et al. Skeletal Muscle 1 , 21 , 201 1 ; Serrano, A.L. and Munoz-Canoves, P. Experimental Celi Research 316, 3050-3058, 2010; Caceres, S., et al. Eur J Celi Biol 79, 173-181 , 2000).

A fibrose é um processo complexo, cujos mecanismos ainda não foram completamente descritos. Caracteriza-se pelo acúmulo excessivo de colágeno e outros componentes da matriz extracelular e ocorre em condições de doenças crónicas que podem afetar vários tecidos e órgãos (Wynn, T.A. J Pathol 214, 199-210, 2008; Wynn, TA J Clin /wesf 1 17, 524-529, 2007).

Assim, o presente certificado de adição trata do uso da angiotensina-1 -7 [Ang-(1 -7)] no tratamento desse tipo de distrofia muscular.

A Angiotensina-1 -7 [Ang-(1 -7)] é um metabólito alternativo do sistema renina-angiotensina (RAS), com efeitos opostos aos da angiotensina II (Ang II). A Ang-(1 -7) está envolvida em vários processos importantes, como vasodilatação, inibição da proliferação celular, efeito anti-hipertensivo e antiarrítmico (Marangoni, R.A., et al. Peptides 27, 1770-1775, 2006; Ferrario, C.M., Trask, A.J. and Jessup, J.A. American Journal Of Physiology. Heart And Circulatory Physiology 289, H2281 -2290, 2005; Tallant, E.A., Ferrario, CM. and Gallagher, P.E. American Journal Of Physiology. Heart And Circulatory Physiology 289, H 1560-1566, 2005; Iwata, M., et al. American Journal Of Physiology Heart And Circulatory Physiology 289, H2356-2363, 2005; Grobe, J.L., et al. American Journal Of Physiology. Heart And Circulatory Physiology 292, H736-742, 2007Benter, I.F., Ferrario, C.M., Morris, M. and Diz, D.l. The American Journal Of Physiology 269, H313-319, 1995; Ferreira, A.J., Santos, R.A. and Almeida, A.P. Hypertension 38, 665-668, 2001 ). Além disto, a Ang-(1 - 7) está envolvida na proteção de tecidos contra danos crónicos, através de efeitos diretos sobre a fibrogênese tecidual (Iwata, M., et al. American Journal Of Physiology. Heart And Circulatory Physiology 289, H2356-2363, 2005; Grobe, J.L., Mecca, A.P., Mao, H. and Katovich, MJ. American Journal Of Physiology. Heart And Circulatory Physiology 290, H2417-2423, 2006).

Os efeitos da Ang-(1 -7) são mediados pelo receptor Mas. O eixo Ang-(1 - 7)1 receptor Mas parece representar um mecanismo contra-regulatório do RAS, capaz de proteger tecidos cronicamente danificados dos efeitos danosos da Ang II produzida localmente (Santos, R.A., et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 8258-8263, 2003; Warner, F.J., Lubel, J.S., McCaughan, G.W. and Angus, P.W. Clin Sei (Lond) 1 13, 109-1 18, 2007).

O TGF-β é um mediador central de fibrogênese, regulado e estimulado em doenças fibroticas, atuando diretamente ou através de outros fatores de crescimento (Wynn, T.A. J Pathol 214, 199-210, 2008; Prud'homme, G.J. Laboratory Investigation; A Journal Of Technical Methods And Pathology 87, 1077-1091 , 2007; Vial, C, et al. J Cell Physiol 215, 410-421 , 2008). Estudos anteriores mostraram que a administração de Losartan, um bloqueador de receptor de Ang II tipo 1 , inibe o aumento da atividade de sinalização de TGF- β, que transduz seu sinal através da cascata de sinalização intracelular Smad e promove remodelamento muscular em modelo murino da síndrome de Marfan DMD21 , proporcionando proteção contra o desuso ou atrofia muscular em humanos com sarcopenia (Massague, J. Nat Rev Mol Cell Biol 1 , 169-178, 2000; Burks, T.N., et al. Science Translational Medicine 3, 82ra37, 201 1 ). Além disto, o tratamento com Losartan após indução de danos musculares também melhorou a regeneração do músculo esquelético em modelo murino adulto normal, através da redução do tecido fibrótico (Bedair, H.S., Karthikeyan, T., Quintero, A., Li, Y. and Huard, J. The American Journal Of Sports Medicine 36, 1548-1554, 2008).

No presente Certificado de Adição demonstra-se que a administração oral ou infusão de Ang-(1-7) ao modelo murino de DMD, camundongos mdx, normaliza a arquitetura do músculo esquelético, diminui a fibrose local e melhora a atividade muscular in vitro e in vivo. Os efeitos positivos da Ang-(1 -7) são mediados pela inibição da sinalização dependente de TGF-P-Smad através do receptor Mas.

Camundongos mdx tratados com um antagonista de Mas (A-779) por infusão e camundongos mdx deficientes para o receptor Mas apresentaram arquitetura muscular altamente deteriorada, aumento de fibrose, aumento da sinalização de TGF-beta e diminuição da força muscular. Estes resultados sugerem que, tanto a Ang-(1-7) quanto qualquer outro agonista do receptor Mas, podem ser usados para melhorar a qualidade de vida e retardar a morte de indivíduos que apresentam doenças degenerativas musculares, como a DMD. Foi encontrado no estado da técnica o uso de inibidores do receptor AT1 de angiotensina II para o tratamento de distrofia muscular. Como exemplo podemos citar o documento WO2009054725 que descreve um meio e um método para aliviar um ou mais sintomas da distrofia muscular de Duchenne e ou distrofia muscular de Becker, o qual se baseia em administrar ao paciente uma composição farmacêutica compreendendo, dentro outros compostos, o Losartan, o qual atua inibindo receptor do tipo I de angiotensina II. O trabalho de Elbaz M e col (2012), o qual demonstrou que o tratamento com Losartan reduziu a fibrose e restaurou a remodelagem do músculo esquelético em camundongos modelo com distrofia muscular congénita.

E ainda o trabalho desenvolvido por Cabello- Verrugio, C e col (2012), o qual demonstrou que o uso de inibidores do receptor AT1 de angiotensina II diminuiu o nível de proteínas fibróticas no músculo de camundongos.

Portanto, esses estudos não comprometem a presente invenção, já que essa trata de agonistas de receptor MAS.

Além disso, o documento WO2005040791 protege o uso de uma composição farmacêutica para o tratamento de doenças musculares, dentre outras, consistindo de um agente terapêutico que se liga ao polipeptideo receptor de angiotensina e somatostina. Contudo, neste documento não se especifica o tipo de doença muscular e nem qual seria o agente terapêutico. Portanto, não existe no estado da técnica estudos que demonstram o uso de agonistas de receptor MAS, como por exemplo Ang-(1 -7), no tratamento da distrofia muscular.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 demonstra o efeito da Ang-(1 -7) na restauração da arquitetura muscular, diminuição da fibrose, antagonismo de TGF-β e aumento da força muscular esquelética em camundongos mdx. (a) Efeito da Ang-(1 -7) na arquitetura do músculo esquelético Gastrocnêmio (GM) em camundongos mdx; (b) a coloração com vermelho Sirius (porções mais escuras) mostra arquitetura melhorada do músculo GM de camundongos mdx após infusão; (c) fibrose (evidenciada pela coloração de colágenos tipos I e III, e de fibronectina) no músculo GM após infusão com Ang-(1 -7); (d) níveis de expressão de fibronectina e colágeno do tipo III em comparação com o selvagem (wt). One way ANOVA, *P < 0.005, **P < 0,005 vs wt. (e) acúmulo de pSmad3 no músculo GM de camundongos mdx não-tratados comparado com camundongos mdx tratados com Ang-(1 -7). One way ANOVA, *P <0,0001 (camundongos mdx tratados com Ang-(1 -7) versus não-tratados); (f) Aplicação de Ang-(1 -7) incluída em hidroxipropil β-ciclodextrina (ΗΡβΟϋ) em camundongos mdx por gavagem. Foi analisada a arquitetura e o decréscimo na quantidade de colágeno total em camundongos mdx que receberam Ang-(1-7) por via oral (g) teste de esteira de camundongos mdx tratados com Ang-(1 -7) comparados com camundongos não-tratados. (h) Relação força-frequência in vitro do músculo DFG explantado, com força isométrica resultante normalizada para a área de seção transversal do músculo (tensão relativa) versus frequência de estímulo (1 -200 Hz). Two way ANOVA, *P <0.001 , n=8, escala de 50 μητι.

A Figura 2 mostra a infusão com Ang-(1 -7) sob efeito de TGF-β na arquitetura muscular e na fibrose em músculo GM de camundongos mdx idosos, (a) comparação da histologia deteriorada dos camundongos mdx não- tratados com camundongos mdx de oito meses de idade que receberam Ang- (1 -7) por infusão, (b) colágeno total após infusão de camundongos mdx idosos com Ang-(1 -7) evidenciada pela coloração com vermelho Sirius (porções mais escuras), comparada com camundongos mdx não-tratados. (c) fibronectina no músculo de animais tratados com Ang-(1-7) em comparação com não-tratados. (d) quantificação dos níveis de colágeno tipo III em camundongos mdx tratados com Ang-(1-7) e não-tratados após análise PR Western blot. Os dados referem-se à média ± SEM (n= 3 animais), t-Student * P < 0,0022. (e) quantidade de núcleos positivos para pSmad3 após infusão de Ang-(1 -7). One way ANOVA, *P < 0,005 (camundongos mdx tratados com Ang-(1 -7) versus não-tratados). (f) teste de esteira de camundongos mdx idosos tratados com Ang-(1 -7) em comparação com camundongos mdx não-tratados. Escala de 50 m.

A Figura 3 mostra o efeito de A-779, um potente antagonista de Ang-(1- 7), na histologia do músculo distrófico, na fibrose, no sinal de TGF-β e na força do músculo esquelético de camundongos mdx. (a) Análise histológica de músculo GM de camundongos mdx tratados com o antagonista A-779 em comparação com camundongos mdx não-tratados. (b) Acúmulo de colágeno total em GM de camundongos mdx tratados com o antagonista por infusão, em comparação com camundongos mdx não-tratados. Coloração com vermelho Sirius. (c) Proteínas fibróticas (evidenciado pelo colágeno tipo I, tipo III e fibronectina) em camundongos mdx infundidos com o antagonista, em comparação com músculos de camundongos mdx não-tratados. (d) Resultado da quantificação do Western blot de proteína total de DPG mostrando os níveis de fibronectina de camundongos mdx infundidos com A-779 comparados aos mdx não tratados. Os níveis de fibronectina (FN) foram quantificados através da expressão relativa em comparação com o selvagem. Os dados correspondem à média ± SEM (n= 3 animais). One way ANOVA, ^* P < 0,0008. (e) acúmulo de pSmad3 em músculo GM de camundongos mdx em comparação com camundongos distróficos não-tratados, na presença do antagonista de Ang-(1-7). O gráfico mostra o aumento na quantidade de núcleos positivos para pSmad3 após infusão com A-779. One Way ANOVA, ^* P <0,0001 (camundongos tratados com A-779 versus camundongos mdx não- tratados), (f) desempenho em esteira de camundongos mdx tratados com o antagonista de Ang-(1-7) comparação com camundongos mdx não-tratados. Os dados correspondem à média ± SEM (n= 5 animais). One Way ANOVA, ^* P < 0,05. (g) relação força-frequência in vitro de músculo DPG explantado, com força isométrica resultante normalizada para a área de seção transversal do músculo (tensão relativa) versus frequência de estímulo (1 -200 Hz), em camundongos mdx infundidos com A-779 quando comparados com camundongos mdx não-tratados. Two way ANOVA, ^* P < 0,001 , n=5, escala de 50 μητ

A Figura 4 mostra a deterioração da estrutura muscular, o desempenho de corrida e o aumento de fibrose e de sinais de TGF-beta em camundongos mdx Knoc Out (KO) para o receptor, (a) níveis transcritos de receptor Mas no músculo GM distrófico (mdx-KO) comparado com músculos selvagens (WT- KO). One way ANOVA, ^* P < 0.05, n=3. (b) comparação da arquitetura deteriorada do músculo GM de camundongos mdx KO-mas com camundongos selvagem KO-mas. (c) aumento do colágeno total, determinado por coloração com vermelho Sirius no músculo GM de camundongos mdx deficientes para o receptor Mas comparado ao tipo selvagem, (d) A fibrose extensiva (evidenciada pela coloração de colágeno tipo I, III e fibronectina) em músculo GM de camundongos mdx-Mas-KO comparado à camundongo selvagem, (e) Resultado quantitativo da análise de Western blot de fibronectina e colágeno de extrato proteico total de DPG de wt, wt-Mas-KO, em músculo de mdx-Mas-KO, quando comparados com camundongos mdx e selvagens. Os níveis de fibronectina (FN) e colágeno tipo III (Col III) foram quantificados através da expressão relativa, em comparação com o selvagem. Os dados correspondem à média ± SEM (n=3 animais). One way ANOVA, ^* P < 0,0001 para FN. One way ANOVA, ^** P < 0,002 para Col III. (f) aumento de pSmad3 associado aos núcleos em músculo GM de camundongos mdx-Mas-KO comparado a camundongos mdx. A análise quantitativa indica um aumento na quantidade de pSmad3 núcleo positivo em GM de mdx-Mas-KO, quando comparados com camundongos mdx. One way ANOVA, ^* P < 0,0001 (n=3 animais), (g) desempenho de corrida em teste de esteira de camundongos mdx-Mas-KO em comparação com camundongos mdx. One Way ANOVA, *P<0,0001 , n=5.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA

A presente invenção consiste no uso de uma composição farmacêutica contendo um agonista do receptor Mas, como a Angiotensina-(1-7), para o tratamento de doenças degenerativas musculares, como a Distrofia Muscular de Duchene. Tal composição caracteriza-se por compreender pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável como água, solução salina, soluções tamponadas com fosfato, solução de Ringer, solução de dextrose, solução de Hank, soluções salinas biocompatíveis contendo ou não polietileno glicol, combinados ao agonista do receptor Mas livre ou acoplado a sistemas de liberação controlada. Os sistemas de liberação controlada podem compreender lipossomas, ciclodextrinas, polímeros biodegradáveis, cápsulas, micro- e nano- cápsulas, micro- e nano-partículas, preparações de bolus, bombas osmóticas, dispositivos de difusão, lipoesferas e/ou sistemas de administração transdérmicos. Outras composições de liberação controlada da presente invenção incluem líquidos que, quando submetidos a mudanças de temperatura, formam um sólido ou um gel in situ. Veículos não aquosos, como óleos fixos, óleo de sesame, etil-oleato, ou triglicerídeo também podem ser usados como excipientes. Outras formulações úteis incluem agentes capazes de aumentar a viscosidade, como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol, ou dextran.

Os excipientes também podem conter quantidades menores de aditivos, como substâncias que aumentam isotonicidade e estabilidade química de substância ou tampões. Exemplos de tampões incluem tampão fosfato, tampão bicarbonato e tampão Tris, enquanto exemplos de preservativos incluem timerosal, m - ou o-cresol, formalina e benzil-álcool.

As composições podem se apresentar no estado líquido ou sólido, em preparações para administração pelas vias oral, tópica, intramuscular, intravenosa, subcutânea, via inalação ou por dispositivo implantável.

Exemplos:

Os exemplos que seguem são utilizados para melhor compreensão da tecnologia, mas não são limitantes da mesma.

Para a realização dos exemplos, foram utilizados camundongos machos, da linhagem C57BLJ6 ScSn, selvagens, mdx29 , Mas-KO30 ou mdx-Mas-KO, de 12 semanas de idade. Os exercícios experimentais foram realizados em esteira de corrida para camundongos, três vezes por semana, durante trinta minutos cada vez, na velocidade de 12 m/min por 1 ou 2 meses (De Luca, A., et al. Am J Pathol 166, 477-489, 2005). Experimentos em camundongos controle e camundongos mdx de 8 meses de idade foram realizados sem o exercício. Todos os protocolos foram aprovados pelos < comités de ética da Universidade Católica do Chile e da Universidade Federal Minas Gerais (Brasil). Ao final dos experimentos, os músculos gastrocnêmio (GM), músculo esquelético anterior da tíbia (TA) e o músculo esquelético do diafragma (DPG) foram dissecados e removidos sob anesthesia, sendo os animais sacrificados em seguida. Os tecidos foram rapidamente congelados e estocados a -80°C até a utilização, ou usados para experimentos de eletrofisiologia (Cabello- Verrugio, C, Morales, G., Cabrera, D., Vio, CP. and Brandan, E. Journal Of Cellular And Molecular Medicine, 20 1 , Morales, G., Cabello-Verrugio, C, Cabrera, D., Goldschmeding, R. and Brandan, E. J . Pathol. 225 490-501 , 201 1 ).

O tratamento com Angiotensina-(1 -7) foi realizado com camundongos selvagens, Mas-KO, mdx e mdx-Mas-KO, iniciando-se o tratamento com 12 semanas de idade, através de minibombas osmóticas (Alzet, Durect co, modelo 1004) s.c. com liberação de Ang-(1 -7) (100 ng/kg*min) durante 28-56 dias. A Ang-(1-7) incluída em hidroxipropil β-ciclodextrina (ΗΡβΰϋ) (50 ug/kg) (Lula et al. Peptides 28( 1 ):2199-210, 2007) foi administrada diariamente por gavagem oral, por 28 dias. Ao final dos experimentos, foram medidos os níveis de fibrose e força muscular.

O antagonismo de Mas através de tratamento com A-779 (D Ala- Angiotensin-(1-7), Phoenix Pharmaceuticals, EUA), um potente antagonista do receptor Mas, foi realizado através de administração via minibombas osmóticas (100 ng/kg*min) por 2 meses.

Para o isolamento de RNA, transcrição reversa e PCR em tempo real, o

RNA total foi isolado do músculo GM utilizando-se Trizol (Invitrogen, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA total (2 ug) foi submetido à transcrição reversa para cDNA utilizando-se hexâmeros randômicos e transcriptase reversa Superscript (Invitrogen, EUA). O PCR quantitativo em tempo-real Taqman foi realizado em duplicate, no termociclador Stratagene MX 3005 (Agilent Technology), utilizando-se iniciadores pre-desenhados para Mas murino e gene housekeeping GAPDH (Taqman Assays-on-Demand, Applied Biosystems, EUA). A expressão do mRNA foi quantificada pelo método comparativo dCt (2-AACT), utilizando-se GAPDH como gene de referência. Os níveis de mRNA foram expressos em relação ao camundongo selvage.

A análise de imunoblot foi realizada com músculos DPG ou GM, que foram homogeneizadas em 10 volumes de Tris-EDTA pH 7,4 com PMSF 1 mM, acrescidos de um volume de tampão contendo glicerol 2%, SDS 4%, Tris 0, 125M pH 6,8. Alíquotas foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida 10%, transferidas eletroforeticamente para membranas PVDF (Millipore, USA) e marcadas com anticorpos específicos para fibronectina, tubulina (Sigma-Aldrich, EUA), colágeno III (Rockland, EUA), e GAPDH (Chemicon, EUA). A visualização foi realizada por quimioluminescência (Pierce, EUA) (Morales, G., Cabello- Verrugio, C, Cabrera, D., Goldschmeding, R. and Brandan, E. J . Pathol. 225 490-501 , 201 1 ).

Para a microscopia de imunofluorescência, criofatias de músculo (7 μηι) foram fixadas em paraformaldeído 4%, bloqueadas por 1 h em soro de cabra 10% em PBS, e incubadas por 1 h à temperatura ambiente com anticorpos anti-fibronectina, anti-colágeno III ,anti-colágeno I e anti-fosfoSmad3 (invitrogen, EUA) (Cabello-Verrugio, C, Morales, G. , Cabrera, D. , Vio, CP. and Brandan, E. Journal Of Cellular And Molecular Medicine, 20 1 ; Morales, G., Cabello-Verrugio, C, Cabrera, D., Goldschmeding, R. and Brandan, E. J. Pathol. 225 490-501 , 201 1 ). Como anticorpos secundários, foram utilizados anti IgG conjugados com Alexa Fluor 568. Para coloração do núcleo, as fatias foram incubadas com 1 ug/mL de Hoechst 33258 em PBS por 10 min.

Para a quantificação de fosfoSmad3, os núcleos positivos para pSmad3 foram contados através do contador de células ImageJ v1 ,43u plug-in, em10 janelas diferentes para cada músculo analisado, com fotografias ampliadas 40x. Os dados obtidos foram corrigidos para a área total.

Para a histologia do músculo esquelético e coloração com vermelho Sirius, criofatias d músculo GM e TA foram coradas com hematoxilina e eosina, e o conteúdo total de colágeno foi medido através da coloração com vermelho Sirius 1 % em ácido pícrico (Cabello-Verrugio, C, Morales, G., Cabrera, D., Vio, CP. and Brandan, E. Journal Of Cellular And Molecular Medicine, 201 1 ; Morales, G., Cabello-Verrugio, C, Cabrera, D., Goldschmeding, R. and Brandan, E. J . Pathol. 225 490-501 , 20 1 ).

Para a avaliação das propriedades contráteis, os camundongos foram sacrificados e o DPG foi rapidamente retirado e mergulhado em solução Krebs- Ringer oxigenada. A força do músculo foi determinada como descrito anteriormente (Cabello-Verrugio, C, Morales, G. , Cabrera, D. , Vio, CP. and Brandan, E. Journal Of Cellular And Molecular Medicine, 201 1 ; Morales, G., Cabello-Verrugio, C, Cabrera, D., Goldschmeding, R. and Brandan, E. J . Pathol. 225 490-501 , 201 1 ). O comprimento ótimo do músculo (Lo) e a voltage do estímulo foram determinadas através de manipulações do comprimento do músculo para produzir a força isométrica de contração máxima. A força isométrica tetânica específica máxima foi determinada a partir do platô da curva que relaciona a força isométrica específica (mN/mm2) com a frequência de estímulo (Hz) de 1 a 200 Hz por 450 ms, com 2 min de intervalo entre os estímulos. A massa muscular e o Lo foram usados para calcular a força resultante específica (força normalizada por área transversal da fibra muscular total (CSA), mN/mm2).

Para o teste de corrida, camundongos selvagens, Mas-KO, mdx e mdx- Mas-KO foram submetidos ao teste de corrida em esteira durante 5 min a 15 m/min. Foi contado o número de vezes em que os camundongos foram detidos no primeiro terço da plataforma em movimento.

A significância estatística das diferenças entre a média dos grupos experimentais foi avaliada por one-way ANOVA, com o teste de comparação múltipla post hoc Bonferroni (Graph Pad Prism 5.00). Uma diferença foi considerada estatisticamente significativa quando P<0,05. O teste Studenfs t foi realizado quando apenas dois grupos experimentais foram comparados. O teste two-way ANOVA foi realizado para o teste de força in vitro, onde dois parâmetros (frequência e força) foram analisados para cada grupo de dados.

EXEMPLO 1 : EFEITO DA ANG-(1-7) NO FENÓTIPO DO MÚSCULO ESQUELÉTICO

Para avaliar o efeito in vivo da Ang-(1-7) no fenótipo do músculo esquelético de camundongos mdx, Ang-(1-7) foi infundida por bombas osmóticas, a partir de 12 semanas de idade. Após quatro semanas de infusão, a análise histológica mostrou uma melhora na morfologia do músculo esquelético, indicando uma forte diminuição da quantidade de tecido inflamatório e fibrose ao redor das fibras individuais no músculo gastrocnêmio (GM) (Fig. 1a). A infusão de Ang-(1-7) diminuiu ou reduziu consideravelmente a quantidade de colágeno total (Fig. 1b) e colágeno tipo I, III no endomísio e perimísio de músculo GM e no músculo DPG (Fig. 1c). EXEMPLO 2: EFEITO DA ANG-(1 -7) SOBRE A ATIVIDADE DE TGF-BETA Visto que a atividade de TGF-beta associada à fibrose foi descrita como aumentada em camundongos mdx e em outras doenças musculares, a quantidade de pSmad3 foi determinada na presente invenção em músculos de camundongos mdx que receberam Ang-(1-7) (Cohn, R.D., et al. Nature Medicine 13, 204-210, 2007). A análise de Western blot do extrato proteico total de DPG mostra redução de fibronectina e colágeno após infusão com Ang-(1-7) (n=4), em comparação com camundongos mdx não-tratados (n=4) e selvagens (n=3) (Fig. 1 d). Foi observada uma diminuição significativa de pSmad3 nuclear em GM (Fig. 1e) de camundongos tratados, em comparação com os níveis para camundongos selvagens. Para confirmar os efeitos de Ang-(1 -7), este peptídeo foi incluído em hidroxipropil β-ciclodextrina (ΗΡβΟϋ) e administrado aos camundongos por gavagem (Lula et al. Peptides 28( 1 ):2199-210, 2007). As análises histológicas de GM e TA mostraram uma melhora significativa (Fig. 1f) além de uma diminuição da coloração de colágeno total, colágeno tipo III e uma diminuição de pSmad3, em comparação com fatias de músculo de camundongos mdx.

EXEMPLO 3: EFEITO DA ANG-(1-7) NA FUNÇÃO MUSCULAR

Posteriormente, avaliou-se o impacto do tratamento de camundongos mdx com Ang-(1 -7) ou (HPPCD) na função muscular. O teste de corrida em esteira revelou um número significativamente diminuído de detenções em comparação com camundongos mdx não-tratados (Fig. 1g). Em seguida, foram avaliadas as propriedades fisiológicas do DPG de camundongos selvagens, camundongos mdx e camundongos mdx infundidos com Ang-(1 -7). O DPG explantado de camundongos mdx tratados com Ang-(1 -7) gerou força absoluta significativamente maior emu ma grande faixa de frequências de estímulo (30- 200 Hz) quando comparados com camundongos mdx não-tratados (Fig. 1 h). Estes resultados indicam que a Ang-(1 -7) administrada por infusão ou por via oral apresenta um efeito benéfico na estrutura, fibrose e fisiologia do músculo esquelético, envolvendo uma diminuição da sinalização por TGF-beta.

EXEMPLO 4: EFEITOS DA ANGIOTENSINA-(1-7) EM ANIMAIS IDOSOS A fibrose e o dano muscular aumentam com a idade, conforme previamente descrito. Por esta razão, avaliou-se o efeito de Ang-(1 -7) em animais idosos. Camundongos mdx de oito meses de idade receberam Ang-(1- 7) por dois meses. A análise histological de GM e TA revelou uma melhora estrutural importante em comparação com camundongos mdx não-tratados (Fig. 2a). Os níveis de colágeno total, colágeno tipo III e fibronectina diminuíram significativamente (Fig. 2b,c,d). Em animais idosos, a Ang-(1-7) também diminuiu a sinalização por TGF-beta, determinada pela translocação nuclear de pSmad3 (Fig 2e). Por último, determinou-se o desempenho de camundongos mdx tratados com Ang-(1-7) em esteira. O tratamento diminuiu significativamente o número de detenções durante o teste para valores ainda menores que os dos animais selvagens (Fig. 2f). Estas observações indicam que Ang-(1-7) também apresenta efeitos benéficos em músculo esquelético de animais idosos. EXEMPLO 5: AVALIAÇÃO DO PAPEL DO RECEPTOR MAS NA ATIVIDADE DA ANGIOTENSINA-(1 -7)

A Ang-(1-7) realiza suas atividades primariamente através do receptor Mas. Para avaliar se os efeitos benéficos observados em camundongos mdx foram mediados por este receptor, camundongos mdx foram infundidos com A- 779, um potente agonista do receptor Mas antagonist (Santos, R.A., et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 8258-8263, 2003). O tratamento de camundongos mdx com A- 779 deteriorou significativamente o GM e o TA, como demonstrado pelas análises histológicas (Fig. 3a). Foi observado um aumento no colágeno total colágeno tipo I, III e fibronectina em GM de camundongos mdx tratados com A- 779 em comparação com camundongos não-tratados (Fig. 3 b,c, d).

Diante da demonstração de que a Ang-(1 -7) diminui a translocação de pSmad3 em camundongos mdx, foi avaliada a translocação deste mediador de sinalização de TGF-beta em resposta à infusão de A-779. Um aumento significativo da translocação de pSmad3 para o núcleo foi observado em GM e TA (Fig. 3e). A infusão de A-779 também aumentou o número de detenções no teste da esteira, em comparação com os camundongos mdx não-tratados (Fig. 3f).

A força absoluta de DPG explantado de camundongos mdx infundidos com o antagonista de Mas foi determinada. A força resultante diminuiu significativamente em comparação com camundongos mdx em uma grande faixa de frequências de estímulo (30 a 80 Hz) (Fig. 3g).

Esses resultados indicam que o bloqueio específico de Mas aumenta o dano e a fibrose e diminui o desempenho dos animais em corrida em esteira, além de diminuir a força específica em músculo isolado. Estes efeitos parecem ser mediados por TGF-β, visto que foi observado um aumento significativo na sinalização deste fator de crescimento.

EXEMPLO 6: EFEITOS DA ANGIOTENSINA-(1-7) EM ANIMAIS KNOCK OUT PARA O RECEPTOR MAS

As evidências demonstradas nos exemplos anteriores sugerem que o fenótipo benéfico observado em músculo esquelético de camundongos mdx em resposta ao tratamento com Ang-(1 -7) seja mediado por Mas. Desta forma, avaliou-se os efeitos de Ang-(1 -7) em camundongos Mas-knockout e mdx- Mas-KO (Fig. 4). Os camundongos mdx-Mas-KO apresentaram menor peso corporal que os camundongos mdx com 12 semanas de idade. O músculo GM distrófico apresentou níveis aumentados de transcritos de Mas, em comparação com músculos de camundongos selvagens. Como esperado, não foi detectado mRNA para Mas em GM, TA e DPG de Mas-KO ou mdx-Mas-KO (Fig. 4a). A histologia de GM de Mas-KO foi semelhante à de camundongos selvagens. Porém, GM e TA de mdx-Mas-KO apresentou aumento importante na arquitetura deteriorada, inflamação e áreas danificadas em comparação com músculos de camundongos mdx (Fig. 4b). Os músculos distróficos GM e TA que não expressam Mas apresentaram aumento no colágeno total e colágeno tipo I, III e fibronectina (Fig. 4 c,d,e). A sinalização de TGF-beta também foi aumentada em mdx-Mas-KO como evidenciado pelo aumento de pSmad3 translocado para o músculo em GM (Fig. 4f) e TA (dados não mostrados). O desempenho de mdx-Mas-KO no teste de corrida diminuiu em comparação com camundongos mdx. Não foram observadas diferenças entre camundongo selvagem e Mas-KO (Fig. 4g).

Visto que os efeitos da Ang-(1-7) são mediados pela ativação do receptor Mas, pode-se inferir que qualquer composto que atue como agonista deste receptor pode apresentar efeitos benéficos para o tratamento de doenças musculares degenerativas.