REVENDICATIONS
1- Méthode pour la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique d'un patient (ou d'un autre mammifère) comprenant l'extraction du matériel biologique d'un échantillon biologique prélevé chez un patient ou un autre mammifère puis la mise en contact du matériel biologique avec au moins 7 réactifs spécifiques choisi parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles du complexe Liv21 et de ces partenaires d'interactions présentant une séquence nucléotidique ayant l'une quelconque des séquences n°l 19 à 146, on détermine l'expression desdits gènes cibles.
2- Méthode pour la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique de mammifère comprenant l'extraction du matériel biologique d'un échantillon biologique prélevé chez un mammifère puis la mise en contact du matériel biologique avec au moins 12 réactifs spécifiques choisi parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles du complexe Liv21 et de ces partenaires d'interactions présentant une séquence nucléotidique ayant l'une quelconque des séquences n°l 19 à 146, on détermine l'expression desdits gènes cibles.
3- Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'échantillon biologique prélevé chez le patient est un échantillon sanguin.
4- Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'échantillon biologique prélevé chez le patient est un échantillon sanguin.
5- Méthode selon la revendication 1 à 4, caractérisé en ce que le matériel biologique extrait de l'échantillon prélevé chez le patient (ou un autre mammifère) comprend des acides nucléiques. 6- Méthode selon la revendication 5, caractérisé en ce que lesdits réactifs spécifiques de l'étape 2) sont des sondes d'hybridation.
7- Méthode selon la revendication 6 caractérisé en ce que les sondes d'hybridation sont immobilisées sur un support.
8- Méthode selon la revendication 7 caractérisé en ce que le support est une biopuce.
9- Support comprenant au moins 7 sondes d'hybridation spécifique de gènes cibles présentant une séquence nucléotidique ayant l'une quelconque des SEQ ID 119 à 146 et au moins un contrôle.
10- Support comprenant au moins 7 sondes d'hybridation spécifique de gènes cibles présentant urie séquence peptidique ayant l'une quelconque des SEQ ID 119 à 146 et au moins un contrôle.
11 Méthode -selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle le produit d'expression des gènes est détecté au niveau de l'ARNm et /ou de la protéine.
12- Méthode selon la revendication 6, dans laquelle la protéine est détectée à l'aide d'un anticorps spécifique ou de produits d'expression des gènes faite à l'aide d'une puce à ADN ou à protéines.
13- Méthode selon la revendication 7, dans laquelle la protéine est détectée par une analyse Western blot, par immunohistochimie, par immunocytochimie, par immunoradiographie ou par marquage à la péroxydase ou par SPR.
14- Méthode selon l'une quelconque des revendications 3-8, dans laquelle une augmentation significative de PKCε dans le cytoplasme des cellules extraites est indicative de la présence de cellules cancéreuses.
15- Méthode selon la revendication 1 ou 2, comprenant en outre la détection du produit de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi le groupe consistant en le gène de la protéine kinase C epsilon (PKCε), le gène E2F1 et le gène E2F4.
16- Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les produits de l'expression des gènes du complexe LIV21 sont des polypeptides comprenant une séquence peptidique sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1 et 121
17- Méthode selon la revendication 7, dans laquelle l'anticorps se lie spécifiquement à un polypeptide comprenant une séquence peptidique sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1 à 121.
18- Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle méthode permettant la détection de cancer métastasé, le suivi thérapeutique et/ou les récidives de traitement. |
Test pharmaco diagnostique ciblant l'oncologie et Ia neurodégénérescence
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de la médecine et de la biologie. Elle concerne un nouveau test de dépistage et de suivi thérapeutique en oncologie. Plus particulièrement, elle se rapporte aux tests diagnostiques et/ou thérapeutiques en oncologie et sur les maladies neurodégénératives. Le ciblage moléculaire par des vecteurs peptidiques et anticorps ou des siRNA ouvre à une nouvelle conception de l'interdépendance qu'il y a entre outils diagnostiques et thérapeutiques qui maintenant vont de paire et ouvre la voie du pharmacodiagnostic. La compréhension des jeux d'équilibre entre surexpression et sous expression des gènes suivant leur localisation dans un compartiment cellulaire ou un autre fonction de l'état de prolifération permet d'ouvrir des perspectives d'analyse différentielle plus fine.
DESCRIPTION DE L'ETAT DE L'ART
Les maladies neurodégénératives liées à l'âge et les cancers impliquent tous les deux une modification du processus physiologique de la mort cellulaire programmée ou apoptose. La mort neuronale est anormalement accélérée au cours des maladies neurodégénératives telles que les maladies d'Alzheimer, Huntington, Parkinson etc.. En revanche, le processus de cancérisation correspond à un blocage de l'apoptose conduisant à une multiplication incontrôlée des cellules. Le lien entre ces deux processus est actuellement devenu un champ d'investigation majeur de recherche sur le vieillissement. Le contrôle de l'équilibre entre division cellulaire (mitose), différenciation et mort cellulaire programmée (apoptose), est fondamental au cours de processus physiologiques normaux, comme le développement embryonnaire, la régénération des tissus et le vieillissement. Une altération de cet équilibre peut conduire à des situations pathologiques majeures comme la formation de tumeurs ou certaines maladies neurodégénératives. Le cancer est l'une des causes principales de mortalité à travers le monde. Alors que, au cours de la dernière génération, les pourcentages de décès reliés aux maladies
cardiaques, cardiovasculaires et un bon nombre d'autres maladies sont à la baisse, le nombre de décès relié aux différentes formes de cancer est à la haussé. Malgré l'avancement rapide de notre compréhension des différentes formes de cancer, les faibles taux de survie sont généralement attribuables à un diagnostic et un traitement inadéquats. La plupart des tumeurs ne peuvent être détectées que lorsqu'elles atteignent une taille d'environ lcm. Puisqu'il y a un laps de temps relativement court du développement continu d'une tumeur jusqu'à un stade devenant incompatible avec la survie, cela laisse peu de temps pour une intervention thérapeutique. Donc, le diagnostic précoce devient la clef du succès pour le traitement du cancer.
Pour une multitude de raisons, le diagnostic précoce demeure illusoire pour la plupart des formes de cancer. Pour certaines formes de cancer, des marqueurs spécifiques de la maladie ne sont pas disponibles ou ne le sont seulement qu'à un stade avancé de la maladie, rendant le diagnostic difficile. Pour certaines autres formes de cancer, les marqueurs sont disponibles mais ne sont pas toujours spécifiques à la maladie ou ils peuvent être associés à sa forme bénigne.
Le cancer de la peau par exemple est le cancer le plus répandu au Canada. En 1992 uniquement, 50 300 nouveaux cas de cancer de la peau ont été rapportés, comparés aux 19 300 cas de cancer du poumon, aux 16 200 cas de cancer colorectal et aux 15 700 cas de cancer du sein. En d'autres mots, le cancer de la peau est aussi fréquent que les 3 principaux types de cancers réunis. Son incidence continue de croître avec ses 64 200 nouveaux cas en 1997, soit une augmentation de 14 000 cas annuellement en 5 ans. En particulier, l'incidence du mélanome malin croît à un taux de 2% par année. Le diagnostic précoce demeure la clef d'un traitement efficace. Une tumeur maligne est facilement accessible et peut être enlevée à l'aide d'une chirurgie mineure. En fait, la guérison est de 100% si le cancer de la peau est détecté assez tôt. Le diagnostic précoce du cancer de la peau demeure toutefois difficile. Celui-ci n'est pas qu'une seule maladie mais toute une gamme de conditions reliées les unes aux autres, qui apparaissent similaires dans bien des cas à l'inspection visuelle. Un diagnostic basé sur une telle inspection est donc subjectif. Un épithélioma basocellulaire ou un épithélioma
spinocellulaire ont un développement clinique fort différent. Un épithélioma basocellulaire se répand de façon latérale sur la surface de la peau, sans pénétrer dans les couches plus profondes de la peau. Ainsi, bien que pouvant défigurer, un épithélioma basocellulaire développe rarement des métastases et est rarement mortel. Cependant, un épithélioma spinocellulaire provoque des métastases et est souvent mortel. Il devient donc important d'être capable de distinguer ces 2 types de cancer de la peau et de pouvoir les traiter localement par ciblage moléculaire type siRNA Un diagnostic définitif du cancer de la peau requiert une biopsie et une analyse histologique. Le cancer du colon est la troisième cause de mortalité reliée au cancer chez les hommes et les femmes en Amérique du Nord (16 200 cas par année). La détection précoce, menant à une intervention précoce, a démontré que l'on peut améliorer le succès du traitement et le taux de survie. Par exemple, le taux de survie sur 5 ans est de 92% pour un patient dont la maladie a été détectée à un stade précoce, alors que le taux descend à environ 60% chez les patients avec un cancer localisé, et à environ 6% chez ceux présentant des métastases. Cependant, seulement le tiers des cancers du colon est détecté à un stade précoce. Une des raisons de ce délai dans le diagnostic est l'absence d'un test de dépistage sensible, peu dispendieux et non-invasif.
Le cancer du sein est un des plus communs chez la femme avec le cancer du colon; Le taux de mortalité est le plus élevé de tous les cancers affectant les femmes.
Il y a très peu de marqueurs diagnostics capables de détecter le cancer du sein et ils ont seulement une valeur prédictive de 20%. Il n'y a pas non plus de marqueurs qui puissent détecter ou déterminer l'invasivité et l'agressivité des cellules cancéreuses métastatiques ou qui permettent un suivi thérapeutique. Vu son hétérogénéité, c'est le cancer qui a le plus d'intérêt à être étudié par biopuce permettant un ajustement des thérapeutiques fonction des . résultats de sous expression et de surexpression des gènes du complexe Liv21.
Au cours des dernières années, des progrès considérables ont été faits dans la compréhension des moyens mis en œuvre par les oncogènes et les gènes suppresseurs de tumeurs pour réguler la prolifération cellulaire et l'apoptose. L'une des cibles
principales de ces régulateurs "est la famille des facteurs de transcription de type E2F (E2F1,E2F2,E2F3,E2F4 etc..) dans la voie de signalisation des protéines E2Fs et RB. Ces protéines jouent un rôle central dans le contrôle de la division cellulaire en couplant la régulation des gènes nécessaires à la progression du cycle cellulaire aux signaux extracellulaires (mitogènes, inhibiteurs de la prolifération). Elle se comporte comme un oncogène en stimulant la prolifération des cellules tumorales. Parmi les gènes exprimés, on trouve :
- La sur-expression du facteur de transcription E2F4 et l'oncogène c-myc qui induisent l'apoptose des cellules post mitotiques par accumulation de réactif oxygénés (Tanaka, 2002)
- le gène p53, appartenant à la famille des gènes suppresseurs de tumeur, bloque le cycle cellulaire en cas de lésion de l'ADN. Il est maintenant démontré que ce gène est aussi impliqué dans le déroulement de l'apoptose (Oren, 1994 ; Yonish-Rouach, 1996).
- la cycline Dl, une des protéines constituant les sous-unités régulatrices des kinases du cycle cellulaire, indispensable à la progression du cycle cellulaire. Cette protéine est aussi exprimée au cours de l'apoptose dans divers types cellulaires (Han et al, 1996 ; Pardo et al, 1996).
- chkl et 2, crb2, p21 et autres oncogènes et cytokines comme le TNF alpha etc....
Il serait souhaitable de disposer de nouvelles méthodes diagnostiques qui détecteraient la présence de cancer avec plus de spécificité et qui permettrait la distinction entre les cellules cancéreuses agressives ayant une tendance à métastaser par rapport à celles plus localisées qui ont une faible probabilité de métastaser. Un marqueur qui puisse donc révéler la prolifération cellulaire serait d'une grande utilité. Le Ki67 et le CAFl
(Amoulzy ;Institut Curie) étant déjà des marqueurs nucléaires qui signent l'état de prolifération' de nombreux cancers, les marqueurs du complexe LIV21 seront les marqueurs cytoplasmiques au moins équivalents et complémentaires.
RESUME DE L'INVENTION
La présente invention concerne un nouveau test de dépistage de la réinduction du cycle cellulaire ciblant l'oncologie. Il s'agit d'un test diagnostique et d'un test pronostique
pour différents cancers (cancers du sein, de la vessie, de l'ovaire, du poumon, de la peau, de la prostate, du colon, du foie, glioblastome, sarcome, leucémie, etc.). Plus particulièrement, l'invention concerne l'utilisation des gènes ou des protéines du complexe LIV21 ainsi que leurs dérivés comme outils thérapeutiques et comme marqueurs diagnostiques et pronostiques des cancers. L'invention concerne donc la détection du. gène ou de la protéine LIV21 avec un kit comprenant des anticorps ou des sondes spécifiques de LrV2"l.mais aussi l'invention est d'utiliser l'ensemble des marqueurs de proliférations et facteurs de transcription qui jouent un rôle dans le processus de cancérisation et de neurodégénerescence pour certains. Donc l'invention réside dans là fabrication de puces diagnostiques à ADN, protéines et à anticorps comprenant les anticorps connus des différentes protéines du complexe associé suivant les phases du cycle cellulaire LIV21 c'est-à-dire sans restriction à celles là : anticorps de RBP2, E2F4 , E2F1, SUMO, HDACl, crb2, Int2,cmd2, cycE/cdk2,cdkl, ,CREBl et p300, Rb, p 107, pi 30 de la familles des pockets protéines. Mais aussi NFkB ,cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, Ki67, CAFl, la cycline A et Dl. Les puces à protéines permettront d'étudier les interactions protéiques et les modifications post traductionnelles, plus particulièrement les phosphorylations et méthylations de certaines protéines, qui signent un état caractéristique de la cellule malade différent des interactions protéiques et du métabolisme de la cellule saine. L'état d'expression et de silencing de certains gènes étant différent. Les puces à séquences nucléotidiques permettront d'étudier dans des extraits cellulaires nucléaires et par ailleurs cytoplasmique ou membranaires les sous expressions ou les surexpressions des gènes et les ratio entre gènes comme entre protéines du complexe Liv21 et de ses partenaires associés.
Un premier objectif de la présente invention est de mettre en évidence une méthode de détection et de pronostic du cancer et de son potentiel métastatique. De préférence, le cancer est sélectionné parmi les cancers du sein, de la vessie, de l'ovaire, du poumon, de la peau, de la prostate, du colon, du foie, un sarcome, une leucémie et le glioblastome, sans être limité à ceux-ci.
Un aspect de la présente invention consiste en l'utilisation du complexe LIV21 comme indicateur pronostic du cancer et dans son suivi thérapeutique. On définit le complexe LIV21 par l'extrait de protéines et peptides étudiés en spectrométrie de masse type Maldi et ESI MSMS ou Maldi Tof Tof. Lequel extrait a été obtenu par l'accrochage du complexe Liv21 à un de ces anticorps polyclonaux de LIV21 décrit dans le brevet (PCT/FR2006/000510). Le complexe Liv21 se définit aussi par son profil global de spectrométrie de masse (Fig 5) et le nombre et le Poids moléculaire des bandes d'extraits protéiques obtenus sur les gels d'acrylamide des figures IA et IB fonction de la température à laquelle est soumis l'échantillon et des conditions de migration décrites. En effet, lorsque par exemple le peptide LIV21F est localisé dans le cytoplasme et qu'on révèle directement par hybridation in situ par exemple ou par analyse de biopuce sa plus forte expression dans le cytoplasme, les cellules cancéreuses dans les tissus sont agressives. Inversement, lorsque le produit de l'expression du gène LIV21 ou l'expression d'un peptide comme LIV21F est localisé préférentiellement dans le noyau cellulaire, ceci est un indicateur pronostic que les cellules du tissu sont différentiées et quiescentes et donc non invasives. L'efficacité d'un traitement du cancer peut également être suivie par la traçabilité du complexe protéique LIV21, de ses dérivés et des ratios avec les" protéines associées. Mais aussi par diagmicroarray ou biopuce contenant entre autre cette protéine et son complexe LIV21 associé (figure 20 et figure 21).
Par ailleurs, la détection de la protéine kinase C epsilon (PKCε) est également intéressante puisqu'il a été déterminé que PKCε phosphoryle la protéine LIV21 pour la maintenir dans le cytoplasme. Ainsi, une augmentation significative de PKCε est indicative de la présence de cellules cancéreuses. Par ailleurs, le rapport LIV21/ PKCε augmente dans la fraction cytoplasmique de cellules cancéreuses. Il en est de même de la détection de HDACl qui a été montré comme LIV21 comme impliqué dans les complexes PML/SUMO/Rb/HDAC-1 De façon plus générale la famille des HDACs
surexprimées elles entrainent le silencing des gènes supresseurs de tumeurs d'où l'intérêt d'utiliser des inhibiteurs HDAC en thérapie associés à d'autres inhibiteurs régulant la cascade métabolique impliquant le complexe protéique LIV21 qui contient les protéines LIV21, E2F4, Histones H4, H3, SUMO, PML, Rb, E2F1 etc.... En outre, la détection des protéines E2F1 et/ou E2F4 présente un intérêt. En effet, La protéine LIV21 forme un complexe avec E2F4 qui est capable d'inhiber l'expression du gène E2F1 dans le noyau, l'expression du gène E2F1 étant un signe de prolifération cellulaire. Ainsi, une diminution de l'association de LIV21 avec la protéine E2F4 est indicative de la présence de cellules cancéreuses. De même, la présence de la protéine E2F1 dans le noyau est indicative de la présence de cellules cancéreuses.
En conséquence, la présente invention concerne une méthode pour la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique de tissu (par exemple, sein, ovaire, endomètre, vessie, mélanome, prostate, glioblastome etc..) de patients, cette méthode comprenant la détection des produits de l'expression des gènes du complexe LIV21 dans le noyau comparativement à ces mêmes produits dans le cytoplasme des cellules dans l'échantillon biologique de tissu dudit patient, une localisation desdits produits de l'expression .du gène LIV21 dans le cytoplasme étant indicative de la présence de cellules cancéreuses et une localisation desdits produits de l'expression des gènes du complexe LIV21 dans le noyau étant indicative de la présence de cellules non- cancéreuses. De préférence, une localisation de certains desdits produits de l'expression des gènes du ' complexe LIV21 dans le cytoplasme sont indicatifs de la présence de cellules cancéreuses invasives et/ou métastatiques.
Facultativement, la méthode selon la présente invention comprend en outre la détection du produit de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi le groupe consistant en le gène de la protéine kinase C epsilon (PKCε), le gène E2F1 et le gène E2F4. La méthode peut notamment comprendre la détection du produit de l'expression de deux de ces gènes ou des trois gènes. Par ailleurs, au moins un des rapports LIV21 / PKCε, LIV21 / E2F4 et LIV21 / E2F1 peut être déterminé dans la présente méthode. Ce
rapport peut être déterminé dans le cytoplasme et dans le noyau séparément de préférence. De préférence, ces rapports sont déterminés dans le noyau. De préférence, ces rapports sont comparés à ceux obtenus dans une cellule saine. Le niveau d'expression de chaque enzyme ou polypeptide du complexe SUMO/Rb/HDAC ou pour certains types cellulaires du complexe PML/ SUMO/Rb/HDAC est un indicateur supplémentaire de l'état de prolifération de la cellule.
Ces rapports d'expression ou de silencing peuvent être détectés via le niveau d'expression ou d'inhibition des protéines elles même dans des microarrays (biopuces) fabriqués selon les méthodes classiques décrites (Lubman David M,QIAO TIECHENG Alex,Mathew ABY J etc..) ou de nouveaux outils d'automatisation d'hybridation comme de lecture US2004152212 et Yu Xinglong US 2005019828 et de nouveaux supports accrochant les polypeptides Klages Claus Peter Avant de redécrire le principe de ces biopuces qui sont bien connues de l'homme de métier, on redonnera les définitions suivantes : L'échantillon biologique peut être notamment un échantillon de sang, de sérum, de salive, tissu, de tumeur, de moelle osseuse, de cellules circulantes du patient. On dispose de cet échantillon biologique par tout type de prélèvement connu de l'homme du métier. Au sens de la présente invention, on entend par matériel biologique, tout matériel permettant de détecter l'expression d'un gène cible. Le matériel biologique peut comprendre notamment des protéines, ou des acides nucléiques tels que notamment les acides desoxyribonucléiques (ADN) ou les acides ribonucléiques (ARN). L'acide nucléique peut être notamment un ARN (acide ribonucléique). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel biologique comprend des acides nucléiques, préférentiellement, des ARN, et encore plus préférentiellement des ARN totaux. Les ARN totaux comprennent les ARN de transfert, les ARN messagers (ARNm), tel que les ARNm transcrits du gène cible, mais également transcrits de tout autre gène et les ARN ribosomaux. Ce matériel biologique comprend du matériel spécifique d'un gène cible, tel que notamment les ARNm transcrits du gène cible ou les protéines issues de ces ARNm mais peut comprendre également du matériel non spécifique d'un gène cible, tel que notamment les ARNm transcrits d'un gène autre que le gène cible, les ARNt, les
AKNr issus d'autres gènes que le gène cible et de préférence les extraits à étudier seront analysés quand il s'agit de cultures cellulaires directement sur cultures fraiches avec ou sans traitement préalable aynt subies un prtocole d'extraction séparant les compartiments cellulaires. Ce type de kit connu de l'homme de métier permet par un jeu de tampon subtils d'extraire uniquement les membranes ou seulement ce qui est contenu dans le cytoplasme ou le noyau ou le cytosquelette et cela de façon différentielle. On peut utiliser le kit Proteo extract (ref 539790) de calbiochem par exemple.
L'autre aspect de la présente invention est l'utilisation des gènes et des protéines citées ci dessus comme marqueurs de l'invasivité et de l'agressivité métastatique des cellules cancéreuses de prostate, colon, de vessie, du mélanome, ovaire, endomètre, col et cancers en neurologie ou en ORL etc.. En effet des tests pharmaco diagnostics successifs dans le suivi d'un traitement permettront d'observer par comparaison au fil du temps les -variations des taux d'expression des gènes ou de leur silencing et ainsi de mieux évaluer l'efficacité des 'traitements, de réajuster ces traitements dans le cadre de multithérapie adaptée afin que l'équilibre physiologique des différents produits des gènes impliqués dans ces complexes métaboliques soient maintenus. La plasticité de ces équilibres justifie qu'on utilise des biopuces diagnostiques et pour le suivi thérapeutique avec les gènes les plus pertinents des complexes métaboliques impliqués dans la physiologie de la prolifération anarchique dans le cas du cancer du sein qui est très hétérogène. Donc chaque individu ou chaque sous groupe phénotypique d'individus va montrer un profil de sous expressions et de sur expressions des gènes des complexes métaboliques impliqués qui lui est spécifique.
Dans un mode de réalisation, le produit d'expression des gènes est détecté au niveau de PAKNm. L'ARNm peut être détecté par une analyse RT-PCR (cf exemples ci-joint). Il peut également être détecté par. une analyse « Northern blot ».
Dans un mode de réalisation alternatif, le produit d'expression des gènes est détecté au niveau de la protéine ou des peptides caractérisant le complexe LIV21 et ses partenaires
d'interaction. De préférence, la protéine et / ou le complexe protéique LIV21 associé est détectée à l'aide d'un anticorps spécifique. Par exemple, la protéine peut être détectée par une analyse Western blot et par SPR. Dans un mode de réalisation préféré, elle est détectée par immuno histochimie, immuno cytochimie, micro fiuidique, radiographie ou par marquage à la peroxydase.
Dans un mode de réalisation' particulier de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène PKCε, une augmentation significative de PKCε est indicative de la présence de cellules cancéreuses. Par ailleurs, la méthode peut également comprendre la détermination du rapport LIV21/ PKCε dans le noyau, les membranes et le cytoplasme. Ce rapport peut être comparé à celui observé dans une cellule saine. Une augmentation du rapport LIV21/ PKCε dans la fraction cytoplasmique est indicative de cellules cancéreuses.
Dans un autre mode de réalisation particulier de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène E2F4, la méthode comprend la détection de l'association de LIV21 avec la protéine E2F4, et une diminution de cette association dans le noyau cellulaire étant indicative de la présence de cellules cancéreuses. Par ailleurs, la méthode peut également comprendre la détermination du rapport LIV21/ E2F4 dans le noyau et/ou le cytoplasme. Ce rapport peut être comparé à celui observé dans une cellule saine.
Dans un mode de réalisation supplémentaire de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène E2F1, la présence de la protéine E2F1 dans le noyau est indicative de la présence de cellules cancéreuses. Par ailleurs, la méthode peut également comprendre la détermination du rapport LIV21/ E2F1 dans le noyau et/ou le cytoplasme. Ce rapport peut être comparé à celui observé dans une cellule saine. Dans un mode de réalisation particulier, la méthode comprend la détection d'un si RNA marqué afin de cibler la séquence spécifique qui le caractérise et ainsi signaler le lieu de l'expression de l'ARN messager du gène d'intérêt. Ainsi le si RNA spécifique peut être
utilisé comme marqueur diagnostic comme le serait un anticorps et permettre de localiser dans un cas particulier comme sur des extemporanés ou tout type d'échantillon prélevé sur un patient par exemple échantillon de tissu cancéreux, la fluorescence pour tout autre marquage utilisé sur le si RNA et retrouvé dans un compartiment cellulaire sur l'échantillon, un si RNA du gène E2F1 et E24 et PKC epsilon permettrait un diagnostic complémentaire.
La méthode selon la présente invention permet notamment la détection de cancer métastasé, le suivi thérapeutique et/ou les récidives de traitement.
Un deuxième aspect de l'invention concerne la protéine LIV21 humaine ainsi que les fragments de ' celle-ci. Plus particulièrement, la présente invention concerne une protéine LIV21 humaine isolée, purifiée ou recombinante comprenant une séquence peptidique sélectionnée parmi SEQ DD Nos 1 à 5 ou de façon plus générale parmi les séquences peptidiques le caractérisant obtenues par MALDI (Figure 3,4 et 5) et NanoLC-ESI-MS. Dans un mode de réalisation préféré, le polypeptide comprend les trois séquences peptidiques SEQ ID Nos 1 et 2 et 3. De préférence, le complexe LIV21 comprend des protéines ayant un motif leucine zipper, un domaine basique caractéristique des domaines de liaison à l'ADN, et une séquence de nucléarisation. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne des polypeptides dont la séquence consiste en une séquence peptidique caractérisée par les spectrogrammes des figures 3,4,5 des bandes de gels 1,2 et 3, sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1 et 2 et 3 et 4 et 5 et la centaine de séquences supplémentaires non ordonnées (cf. séquences listées en annexe), les .fragments unmatched repérés dans les analyses MALDI TOF (cf. figures 3,4,5), ces fragments unmatched correspondant à des masses M (H+) non étiquetées caractérisent en partie la protéine LIV21 et certains éléments de son complexe protéique.
Un troisième aspect de l'invention concerne un anticorps qui se lie spécifiquement à un polypeptide selon la présente invention. Plus particulièrement, l'anticorps peut se lier
spécifiquement à un polypeμtide comprenant une séquence peptidique sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1-120 et de préférence parmi SEQ ID N° 1 et 2 ou 3 et/ou 15 ou 51 ou une séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles ci. La présente invention concerne notamment un sérum anti-LIV21 fabriqué en immunisant un animal ou un humain avec un polypeptide selon la présente invention, notamment un polypeptide comprenant une séquence peptidique sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1- 120, de préférence parmi les séquences là 5 et 51 ou une séquence présentant 70,80 ou 90% d'identité avec celles-ci. Un quatrième aspect de l'invention concerne un kit permettant la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique d'un patient, ce kit comprenant un ou des éléments sélectionné(s) parmi le groupe consistant en un anticorps qui se lie spécifiquement à LIV21 humaine selon la présente invention et un sérum anti-LIV21 selon la présente invention, une sonde oligonucléotidique spécifique de l'ARNm de LIV21 et une paire d'amorces spécifique de l'AKNm de LIV21. Dans un mode particulier de l'invention, le kit comprend en outre des moyens de détection du produit de l'expression d'un gène ou une sonde oligonucléotidique spécifique de l' ARNm des facteurs sélectionné parmi le groupe consistant en le gène de la protéine kinase C epsilon (PKCε), le gène E2F1 et le gène E2F4. Mais aussi les anticorps sous forme de microarray d'anticorps de RBP2, SUMO 5 HDAC, TNFalpha , crb2, cycE/cdk2,cdkl, ,CREBl et p300, Rb, pi 07, pl30, NFkB ,cdc2A, mdm2, p21, p53, p65 et microarray avec des peptides caractéristiques connus de l'homme de métier des protéines citées ci- dessus, leurs antigènes étant référencés. C'est la combinaison de ces différents peptides correspondant aux interactions spécifiques des complexes protéiques qui interviennent dans la dysrégulation du métabolisme qui engendre la prolifération anarchique spécifique du cancer ou la neurodégénerescence.
L'invention concerne l'utilisation d'un anticorps spécifique de LIV21 humain pour le diagnostic du cancer et les anticorps de son complexe protéique mais aussi des anticorps spécifiques de RBP2, SUMO 5 FIDAC, TNFalpha , crb2, cycE/cdk2,cdkl, ,CREBl et p300, Rb, p 107, pl30, NFkB ,cdc2A, mdm2, p21, p53, p65. De même, l'invention
concerne l'utilisation d'une paire d'amorces ou d'une sonde spécifiques de LIV21 pour le diagnostic du cancer. De préférence, le diagnostic est effectué ex vivo sur des échantillons d'un patient. (ponction,biopsie,broyats cellulaires, aspirations bronchiques, puces à ADN, à Protéines, à anticorps, support hydrophobes, ou à ions métalliques etc..)
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 A: gel monodimensionnel (gradient acrylamide) et bidimensionnel SDS Page caractérisant le complexe LIV21. Figure IB : gβl-bidffi^Hβiθmel-etanalyse-des-ma-sses-e^
LIV21 et conséquences sur l'étude de la thérapeutique
Figure 3A: liste des pics monoisotopiques de la bande 1 à 50 kD et de la bande 2 a entre 49 et 50 KD
Figure 3B :est le profil de la protéine LIV21 par Spectrométrie de masse (Maldi) M
(H+) pour la bande de gel monodimensionnel correspondant à la bande 2 migrant à 49 -
5OkD. les peptides issus de la digestion sont solubilisés dans un solvant :
Acetonitrile/eau (l/l)contenant 0,1% de TFA (acide trifluoro acétique). une solution saturée de la matrice acide alpha cyano-4-hydroxycinnamique est faite dans le même solvant. On prélève un même volume des deux solutions, on mélange et on dépose 1 microlitre sur la plaque du Maldi pour analyse.
La Figure 4 est un profil du spectrogramme de la bande 1
Figure 5 est le troisième spectrogramme correspondant à la bande de gel d' acrylamide 12% monodimensionnel migrant a 51- 52 KD et révélée par le bleu de coumàssie et l'anticorps de LIV21.
La figure 5bis est la liste des pics monoisotopiques du troisième spectrogramme correspondant à la bande de gel d' acrylamide monodimensionnel migrand à 52 kD et révélée par le bleu de coumàssie et l'anticorps de LIV21.
Les pics monoisotopiques avec une valeur M H+. Les masses sont données avec trois chiffres derrière la virgule par les plateformes protéomiques car
Ils estiment que c'est la limite de la précision d'acquisition des machines MALDI TOF.
Les figures 3-5 décrivent les analyses en MALDI donnant un jeu de séquences polypeptidiques assignables à LFV21. et son complexe.
Figure 6 : analyse sur les banques de données des listing de pics monoisotopiques.
Exemple de la chlatrine CLH22. Les paramètres de recherche Mascot sont : enzyme trypsine, modifications variables : carbamethylation et oxydation des methionines, sans limite de masse moléculaire, sans restriction de point isoelectrique. Figure 7 : idem mais deuxième exemple : Type de masse : monoisotopique. Erreur de masse (MS) : suivant l'observateur 50 ppm ou lOOppm. Non coupure trypsique :1 Les masses saisies sont M
(H+)/ masses réelles. Pour le spectrogramme 1 les cystéines sont bloquées par iodoacétamide. La possibilité' de digestion de la trypsine bovine Proméga peut être incomplète avec oubli de coupure. Séquences communes avec Gallus Gallus (gi 50732569), la Syntaxine de souris, Le variant d'histatin-3-2 (P 15516-00-01-00), la ZN575-Human, la G6 P translocase, la
HSP60 chaperonine, la déaminase, ferredoxin-NADP(+) réductase, la polyribonucléotidyl transférase de pseudomonas,chlathrin, la déhydrolipoamide déshydrogénase. Figure 8 : pool d'ARN
Figure 9 : PCR avec les gènes de ménage et Analyse des masses moléculaires
Figure 10 : PCR avec les amorces montrant une bande à 1400pb
Figure 11 : Gel 2 avec analyse des masses moléculaires
Figure 12 :Gel 3 à 55° et analyse des masses moléculaires Figure 13 : Gel 4 à 45° et à 55° et analyse des masses moléculaires
Figure 14 : criblage ligature bande 400pb clones Bl à BlO
Figure 15 : criblage ligature bande 1400 pb clones Cl à ClO
Figure 16 : Gel 5 : ligature criblage sur les cinq nouveaux clones
Figure 17 : Gel 6 Criblage des clones recombinants S55T et S55M et analyses des masses moléculaires.
Figure 18 : exemples de comparaison de séquences nucléotidiques entre les clones séquences.
Figure 19 : si RNA design
La Figure 20 puce à protéines selon Yeretssian mais avec nommés les peptides des protéines des complexes d'intérêt étudié dans l'invention.
La Figure 21 Biopuce de ^ puits permettant de voir la surexpression ou
Les Figures 23 montrent par immunocytochimie LIV21. Le co-marquage (par immunomarquages fluorescents) de LIV21 (vert) et de ADN (rouge au propidium) dans les noyaux des cellules c'est rouge et ici une variation de grisLIV21 (vert) est cytoplasmique dans les cellules du cancer du colon.
La Figure 24. marquage à la peroxydase de lames parrafinées de tissu mammaire normal sur les biopsies de tissus sains et l'expression de LIV21 nucléaire dans ces biopsies
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
L'invention est relative à l'identification d'antigènes dans des lysats cellulaires par immunoprécipitation. L'analyse de l'interaction physique de différentes protéines associées dans le complexe LIV21 comme, E2F4 et E2F1 a été étudiée par co- immunoprécipitation de complexes protéiques. Cette analyse a permis de mettre en évidence de nouveaux marqueurs présentant une utilité diagnostique et pronostique pour le cancer (cf.PCT/FR2006/000510). A partir de l'analyse monodimensionnelle et bidimensionnelle de gel d'electrophorèse (Figure 1 et 2), les échantillons protéiques correspondant à la protéine putative et aux éléments du complexe ont été extraits des gels et digérés par de la trypsine (Proméga ) afin d'être analysés par spectrométrie de masse type MALDI (Figure 3 à 5) et ESI MS/MS. Les résultats confrontés aux banques de données de protéomiques ont permis de mettre en évidence plusieurs séquences peptidiques d'intérêts dont certaines données en exemple (Figure 6 et 7), certaines étant retrouvées chez l'humain avec des scores très significatifs ( splicing de Phistatine etc.. Figure 8 et 9), ces séquences ont servies d'amorces (une fois retrotranscrites en
cDNA) pour cribler une banque constituée à partir de cellules MCF7 spécifiques des cancers mammaires (Figures 10 à 17).
Le clonage a permis de mettre en évidence une vingtaine de clones sur les 150 clones
Supprimé : ont obtenus dont dix clones ont été séquences et sont caractéristiques du, complexe JLIV21 _
" j Supprimé : le nouveau gène (Figure 17). A partir de ces séquences, des siKNA ont été déterminer afin de permettre une régulation type silencing au sein de ce complexe métabolique d'intérêt pour développer des applications thérapeutiques (Figure 18).
Chez les cellules post-mitotiques, l'apoptose pourrait correspondre à une tentative avortée de mitose. C'est dans ce contexte qu'a été développée l'application de LIV21. L'inventeur a identifié des séquences du gène LIV21. En utilisant l'anticorps LIV21 sur colonnes d'affinité il a pu extraire des peptides de la protéine LIV21, il a également utilisé une seconde approche par kit de coimmunoprécipitation (Pierce) pour avoir de plus grandes -quantités de protéines (exemple 1) A partir de séquences peptidiques de la protéine LIV21 obtenues par spectrométrie de masse (exemple 2), une conception d'amorces permettant d'amplifier un fragment d'ADNc a été réalisée (exemple 3). Après culture et amplification de cellules de lignées MCF7, extraction et purification des ARN, des RT PCR et le clonage en vecteur navette ont été réalisés puis un criblage des colonies résistantes et un séquençage ont permis de révéler des séquences caractérisant les gènes du complexe LIV21 (exemples 4 et 5). Plus de vingt clones caractéristiques sur 150 clones ont été étudiés. . L' ADNc de ces clones a été utilisé pour cribler une banque préparée à partir de l'ARNm total de cellules MCF7. La séquence de
Supprimé : est un ces nouveaux produits sont des, nouveaux facteurs de transcription φnt la translocation
Supprimé : est corrélée à nucléaire pour certains, changent le rôle et la fonction,. D'autre part, ils forment des l'établissement de la quiescen cellulaire hétérodimères avec d'autres facteurs de transcription, et certains, se lient à l'ADN. -j Supprimé : il
L'inventeur a alors suivi, à ϋaide de transferts de Northern Blot, l'expression de ce nouveau produit au cours du développement, du stade embryonnaire. Il a été observé que la quantité de la protéine LIV21 augmente au fur et à mesure du développement, c'est à dire au fur et à mesure de l'établissement d'un état cellulaire quiescent. Par la
ces nouveaux produits sont des nouveaux facteurs de transcription dont la translocation nucléaire pour certains, changent le rôle et la fonction. D'autre part, ils forment des hétérodimères avec d'autres facteurs de transcription, et certains se lient à PADN.
L'inventeur a alors suivi, à l'aide de transferts de Northern Blot, l'expression de ce nouveau produit au cours du développement, du stade embryonnaire. Il a été observé que la quantité de la protéine LIV21 augmente au fur et à mesure du développement, c'est à dire au fur et à mesure de l'établissement d'un état cellulaire quiescent. Par la même stratégie, il a montré que le complexe LIV21/E2F4 était inhibiteur de l'expression de E2F1. Ce complexe pourrait correspondre à un nouveau point de contrôle dans l'arrêt de prolifération cellulaire.
La découverte de cette nouvelle molécule LIV21, pourrait avoir valeur de diagnostic pour les raisons suivantes. En procédant à un criblage de la localisation de LIV21 dans une dizaine de tumeurs humaines, l'inventeur a pu observer que, dans toutes les cellules tumorales en prolifération, cette protéine est cytoplasmique au lieu d'être nucléaire grâce à l'anticorps LIV21 (exemple 8). Elle ne se trouve donc pas dans le bon compartiment cellulaire pour être active sur l'arrêt de la multiplication des cellules.
La présence de LIV21 a ainsi pu être observée chez les mammifères. Le panel d'expression de LIV21 en fonction de l'état cellulaire (cycles mitotiques, repos cellulaire, différentiation) a été étudié sur des tissus provenant de différents mammifères. Les analyses protéiques sur les différents échantillons de tissus ont confirmé que l'expression de ce facteur de transcription apparaît associée à une progression vers un état cellulaire quiescent (arrêt des mitoses et entrée en différenciation). LIV21 est présent dans des lignées cellulaires tumorales en prolifération active et son expression est essentiellement cytoplasmique. Les mêmes résultats sont obtenus sur les adénocarcinomes mammaires humains (exemple 9).
Ainsi, la présente invention porte sur un nouveau test de dépistage d'anomalies de la réinduction du cycle cellulaire. Ce test pharmaco diagnostic se base sur l'étude du mécanisme d'action du nouveau gène, codant pour un nouveau facteur de transcription potentiel appelé LIV21, qui régule négativement la prolifération. LIV21 est impliqué dans l'arrêt de la prolifération cellulaire. Le fragment d'ADNc isolé code pour une protéine contenant un motif leucine zipper, un domaine basique caractéristique des domaines de liaison à PADN, ainsi qu'une séquence de nucléarisation similaire au nuclear receptor binding factor ORl 1H6 , cd53 antigen avec le fragment de 400 pb. Pour exemple, on citera LIV21 qui est cytoplasmique lorsque les cellules prolifèrent alors qu'elle devient nucléaire lorsque les cellules deviennent quiescentes. La caractérisation de ce facteur suggère une nouvelle voie de régulation négative de la prolifération des cellules, de par son association avec l'un des membres de la famille des EF(s) : E2F4. Ce dernier est connu pour réguler négativement le cycle cellulaire en association avec la protéine P130 ou protéine poche de la famille RB. La localisation observée pour LFV21 dans les cellules tumorales (localisation cytoplasmique) et dans les cellules physiologiques (localisation nucléaire) suggère en tout état de cause que son fonctionnement est perturbé lorsque le développement cellulaire devient anarchique.
La caractérisation de cette molécule, l'étude de la chronologie et de la topologie de son expression indiquent aussi que ce facteur de transcription ubiquitaire a une expression et une localisation régulée en fonction de l'état cellulaire : expression plus forte et localisation nucléaire pour les cellules sorties des cycles mitotiques, expression faible et localisation cytoplasmique pour les cellules en prolifération active telles que les cellules tumorales humaines.
LIV21 apparaît comme une molécule clé permettant de stabiliser un autre facteur de transcription (E2F4) dans le noyau cellulaire et d'ainsi induire un arrêt de prolifération cellulaire.
De plus, il a été montré que la localisation de LIV21 dans le compartiment cytoplasmique est régulée par PKCε. En effet, lorsque LIV21 est phosphorylée par PKCε, LIV21 est localisé dans le compartiment cytoplasmique. Inversement, lorsque la phosphorylation de LIV21 par PKCε est inhibée, LIV21 est localisé dans le compartiment nucléaire.
Etudiant de façon exhaustive les complexes métaboliques impliquant LIV21, E2F4,HDAC et PKCε, et dans certaines populations et pour certains cancers, le rôle de séquences virales, il a designé ,des puces pharmaco diagnostiques dédiées avec un choix innovant de facteurs de transcription et de peptides des différents complexes, ce jeu de biomolécules étant caractéristique de l'invention, comme leurs polynucléotides correspondant. C'est ce jeu spécifique de protéines ou gènes intervenant dans l'équilibre métabolique suivant leur degré d'expression et jouant sur la prolifération cellulaire qui fait tout l'intérêt de la fabrication des puces pharmacodiagnostiques dédiées à chaque type de cancer quelque soit la technique de support et d'interaction protéine protéine ou protéine gène ou protéine anticorps utilisée.
LIV21
La présente invention concerne le complexe LIV21 et ses séquences nucléotidiques utilisables également sous forme de si RNA pour les applications thérapeutiques et aussi la protéine LIV21 ainsi que des dérivés et des fragments de celle-ci.
La protéine LTV21 est une protéine qui, suivant l'épissage alternatif qu'elle subit, elle se présente au moins sous trois formes de taille différentes (Figure 7). Par ailleurs, elle peut être phosphorylée ou sumoylée. Elle présente un poids moléculaire apparent entre 50 kD et 51 kD dans des analyses par immunobuvardage (Western Blot).
Elle peut se présenter sous forme de dimère présentant alors un poids moléculaire de plus de 10OkD.
Cette protéine a été caractérisée par Spectrométrie de masse (Maldi) (Exemple 1 ;
Figure 1,2,3). Elle donne plus de 54 peptides suite à une digestion par la trypsine Proméga (Figure 7). Les caractéristiques de la protéine LIV21 sont également décrites
dans les figures 1 ,2, 3 ,4. 55 peptides particuliers du complexe LIV21 sont décrits :
LIV21a (SEQ ID No 1) et LIV21b (SEQ ID No 2) de la SEQ N)I à 55 et à la séquence
110.
CWTLIEAVGSRAKKEAAAEEAK(SEQ ID NO : 56)
. Par ailleurs, deux autres peptides de LIV21 sont également décrits : le peptide LIV21c
(SEQ ID No 3) et le peptide LIV21d (SEQ ID No 4). La plus longue séquence est le peptide LIV21e (SEQ ID N° 5).KFFVFALILALMLSMCGADSHAKR.
D'autres peptides particuliers de LIV 21 sont décrits dans LA LISTE ADDITIONNELLE.
Une homologie avec un segment fonctionnel de la protéine zinc finger 575 (ZN575-
Human) :score 13 à 48 et jusqu'à 91% de recouvrement
MLERGAESAAGATDPSPT (SEQ ID NO : 57)
EAPHQGPPQKPSQSAPGPTASAGSPPR (SEQ ID NO : 58) RRRPPPQRPHR (SEQ ID NO : 59)
CPDCDKAFSYPSK (SEQ ID NO : 60)
LAHGGARPHPCPDCPK (SEQ ID NO : 61)
SKLAAHLWTHAPTRPYPCP(SEQ ID NO : 62)
LAAHLWTHAPTRPYPCP(SEQ ID NO : 63) Une homologie avec un segment fonctionnel de la sulfotransférase 6 (OST6-Human/
Q96Q15
MAGSGGLGGGAGG(SEQ ID NO : 64)
ASRAPMLLVALVL(SEQ ID NO : 65)
APMLLVALVLGAY(SEQ ID NO : 66) TLDGQITMEK(SEQ ID NO : 67)
Homologie avec UPI000056685F (souris) clusterde 290AA :
PTSLHPYBPASLHPYIPTSLHPYIPASLHP(SEQ ID NO : 68)
Deux Homologies pour l'étude Maldi de la bande 1, l'une avec la leucine zipper nuclear factor Gi 11545323 :
VMADELTNSR(SEQ TD NO : 69)
MSIQCDVWRSK(SEQ DD NO : 70)
GEFLGQSEGVIEPNK(SEQ ID NO : 71)
MAETVLRILDPVTCK(SEQ ID NO : 72) LLVASVGDDLQYHFER(SEQ ID NO : 73)
Et l'autre dans la même analyse : homologie avec BRCAl (gi 23928365) :
SQQNRWAESK(SEQ ED NO : 74)
MNVEKAEFCNK(SEQ ID NO : 75)
NSQGVAWITLNSSIQK(SEQ ID NO : 76) VCTKPVESTIEDKIFGK(SEQ ID NO : 77)
Motif leucine zipper :
AGLQEEAQQLRDE(SEQ ID NO : 78)
Homologie avec une cycline dépendant kinase : CKS lhuman(P61024)
MSHKQIYYSDK(SEQ ID NO : 79) YDDEEFEYRHVMLPK(SEQ ID NO : 80)
LVPKTHLMSESEWR(SEQ ID NO : 81)
Avec une preprotein translocase (Q4HL57_Camla)
KAYECDITYGTNNEFGFDYLR(SEQ ID NO : 82)
TMITEAGISKAEK(SEQ ID NO : 83) Une homologie avec TCFL4 (17q21) dans la région basique hélix loop hélix leucine zipper
Mdm2 et HlVl :
GAVTSSNIAA(SEQ ID NO : 111)
DLDQSV (SEQ ID NO : 112) EGF et HPV16
EWWRLD (SEQ ID NO : 113)
KNSLD (SEQ ID NO : 114)
MHIESLDS (SEQ ID NO : 115)
LEQVE (SEQ ID NO : 116) LHLESLKDS (SEQ ID NO : 117)
Une homologie avec Semaphorin 4C :
ERAVESDCYAEQV(SEQ ED NO : 84)
CVAVGGHSGSLLIQHVM(SEQ ID NO : 85)
ARWTFGGRDLPAEQPGSFLYDARL(SEQ ID NO : 86) Ferrodoxin NADP reductase (score à 60)
Polyribonucleotide nucleotidyl transferase de pseudomonas syringae
(Q4ZNR6_PSEU2) score à 47 15% recouvrement.
IPGGFFKR(SEQ ID NO : 87)
TVRPLNIEVGVLP(SEQ ID NO : 88) GITEEIMEIALGQ(SEQ ID NO : 89)
VTDILKEGQEVEV(SEQ ID NO : 90)
Clathrin,humaine, (gi 9257202) score à 52 ayant aussi une homologie avec le récepteur olfactif humain (gi 15293711) score à 32.
Une homologie avec les peptides digérés à la trypsine de l'ADP/ATP translocase non humaine (ADT_CHLKE) score à 60 et 30% de recouvrement
ETQADPMAFVK(SEQ ID NO : 91)
KTAVAPIERV(SEQ ID NO : 92)
SGQVPRYTGIVNCFVR(SEQ ED NO : 93)
KDTIKGLFPKY(SEQ IDNO : 94) GGPMALYQGFGVSVQGIIVYR(SEQ ID NO : 95)
KGVLFKDERT(SEQ ED NO : 96)
VAQQEGMKAFFK(SEQ ID NO : 97)
FINPNAVSSASE(SEQ EDNO : 98)
La synthaxine de souris score à 58 et 18% de recouvrement retrouvé dans les tumeurs mammaires BRCAl.
Homologies de séquences peptidiques digérées à la trypsine :
SVQALIADFQGTPTFTYK (SEQ ID NO : 99) YETTGLSESREK(SEQ ID NO : 100)
ANIKDLSHILK(SEQ ED NO : 101)ERMEPTYQLSR(SEQ ID N° : 102)
FLDDLKTLDQK(SEQ ED NO : 103) Homologie avec BRCAl de la bande à 50KD mais à lOOkd
SEQ 56 : CWTLDEAVGSRAKKEAAAEEAK ayant une homologie avec la séquence 6 et GPPSPPPGIPGQP (SEQ DD NO : 104)de KIAA1739 (gi 12698023) CVTLSAQGRGTPKPGLFGAP (SEQ ID NO : 105) QMAHFSDVAEAYIEK(SEQ ID NO : 106)
FYAWMEQAPFSSLAQEGK(SEQ ID NO : 107) NLYTEIVYTPISTPDGTLVK(SEQ ID NO : 108) GANNNLFGLDGNVGTTVENTER(SEQ ID NO : 109) K.FQFGQSTVTLETGR.I(SEQ ID NO : 110) Au sens de l'invention, les protéines préférées comprennent au moins une séquence choisie parmi SEQ ID Nos : 1-110 ou une séquence présentant 70% ; 80% ou, de préférence, 90% d'homologie avec celle-ci.
Le complexe LIV21 a des protéine comprenant des structures 3D en hélice qui ont un rôle fonctionnel majeur pour ses interactions avec le reste du complexe LIV21, La présente invention concerne un complexe protéique humain, purifié présentant une séquence comprenant la séquence SEQ ID No 1 et/ou SEQ DD No 2 et/ou SEQ ID No 3 et/ou SEQ ID No 4 et/ou SEQ ED No 5. De préférence, le polypeptide LIV21F comprend les séquences SEQ ID Nos 1,2 et 5. Dans un mode de réalisation particulier, le complexe est étudié par rapport a une séquence sélectionnée parmi les séquences peptidiques le caractérisant obtenues par MALDI (Figure 3,4 et 5). L'invention concerne également les trois peptides LIV21a (SEQ ID No 1) et LIV21b (SEQ ID No 2) et LIV21e (SEQ ID No 5). Elle concerne également des peptides comprenant au moins 10 acides aminés consécutifs de LIV21 humain, de préférence au moins 20, 30 ou 50 acides aminés consécutifs des peptides de L1V21 (cf.liste des séquences 1- 120 en annexe).
La présente invention concerne également un polynucléotide codant pour la protéine humaine LIV21, LIV21a et/ou LIV21b, plus généralement un polynucléotide codant pour un polypeptide selon la présente invention. Le polynucléotide codant pour LIV21 peut être un ARN, un ADNc ou un ADN génomique. Les polynucléotides selon la présente invention peuvent être isolés à partir de cellules, plus particulièrement de
cellules humaines, ou à partir de banques d'ADNc humains. Ils peuvent également être obtenus par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) effectuée sur l'ADN total des cellules ou encore par RT-PCR effectuée sur les ARN totaux des cellules ou par synthèse chimique. Les sondes et amorces décrites dans la présente demande peuvent être utilisées pour isoler et/ou préparer un polynucléotide codant pour une protéine du complexe LIV21. Elle concerne en outre un vecteur de clonage ou d'expression comprenant un tel polynucléotide.
Un tel vecteur peut contenir les éléments nécessaires à l'expression (vecteur d'expression) et éventuellement à la sécrétion de la protéine dans une cellule hôte
(peptide signal de sécrétion). Lesdits vecteurs comportent de préférence: un promoteur, des signaux, d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de 'la transcription. Le vecteur peut être un plasmide, un cosmide, un BAC, un phage, un virus ou autre. L'invention concerne également une cellule hôte ou un animal non-humain transgénique comprenant un vecteur ou un polynucléotide selon la présente invention.
L'invention concerne en outre des dérivés d'intérêt de LIV21 qui sont par exemple des protéines de fusion dans lesquelles LIV21 est fusionnée à des protéines marqueurs comme la GFP. Par ailleurs, les protéines du complexe LIV21 peuvent être marquées par tout moyen connu de l'homme du métier.
La présente invention concerne également un anticorps qui se lie spécifiquement à un polypeptide selon la présente invention, de préférence LIV21 humaine, un fragment ou un dérivé de celle-ci. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps se lie spécifiquement à un peptide LIV21a ou LIV21b.
Les anticorps peuvent être polyclonaux ou monoclonaux. Il peut également s'agir de fragments et dérivés d'anticorps présentant substantiellement la même spécificité antigénique, en particulier des fragments d'anticorps (par ex., Fab, Fab'2, CDRs),
d'anticorps Humanisés, polyfonctionnels, monocaténaires (ScFv), etc. Les anticorps de l'invention peuvent être produits à l'aide de méthodes conventionnelles, comprenant l'immunisation d'un animal et la récupération de son sérum (polyclonal) ou de cellules spléniques (de manière à produire des hybridomes par fusion avec des lignées cellulaires appropriées).
Lesdits anticorps peuvent être obtenus directement à partir de sérum humain ou à partir de sérum d'animaux immunisés avec les protéines ou les peptides selon la présente invention. Des méthodes de production d'anticorps polyclonaux à partir d'espèces animales variées incluant les rongeurs (souris, rats, etc.), les primates, les chevaux, les cochons, les moutons, les lapins, la volaille, etc. sont décrites par exemple dans Vaitukaitis et al. (Vaitukaitis, Robbins et al. 1971). L'antigène est combiné avec un adjuvant (par ex., Freud's adjuvant) et administré à un animal, typiquement par injection sous-cutanée. Des injections répétées peuvent être réalisées. Les échantillons sanguins (immun sérum) sont collectés et les immunoglobulines sont séparées.
La présente invention concerne un sérum anti-LIV21 fabriqué en immunisant un animal avec le polypeptide selon la présente invention. Dans un mode de réalisation particulier, l'animal a été immunisé avec le peptide LIV21a et/ou LIV21b. Dans un mode de réalisation préféré, l'animal est immunisé avec ces deux peptides. Par exemple, les peptides peuvent être couplés à une protéine porteuse telle que l'hémocyanine, puis injectés à un animal, par exemple un lapin, pour immunisation. Des anticorps polyclonaux ont été obtenus à partir de ces deux peptides en ayant immunisé deux lapins et en ayant saigné un lapin pour avoir un sérum pré immun.
Des méthodes de production d'anticorps monoclonaux à partir de différentes espèces animales peuvent être trouvées par exemple dans Harlow et al. (Harlow 1988) ou dans Kohler et al. (Kohler and Milstein 1975). Ces méthodes comprennent l'immunisation d'un animal avec un antigène, suivie de la récupération des cellules spléniques qui sont ensuite fusionnées avec des cellules immortalisées, telles que des cellules de myélome.
Les hybridomes résultant produisent des anticorps monoclonaux et peuvent être sélectionnés par dilutions limites de manière à isoler les clones individuels. Les anticorps peuvent également être produits par sélection de banques combinatoires d'immunoglobulines, telles que celles divulguées par exemple dans Ward et al. (Ward, Gussow et al. 1989).
L'invention a également pour objet l'utilisation des anticorps selon l'invention pour la détection et/ou la purification de la protéine LïV21 humaine. Particulièrement, les anticorps spécifiques de LIV21 peuvent être utilisés pour la détection de ces protéines dans un échantillon biologique. Ils constituent ainsi un moyen d'analyse immunocytochimique ou immunohistochimique ou par microfluidique de l'expression de LFV21 sur des coupes de tissus. Généralement pour de telles analyses, les anticorps utilisés sont marqués afin d'être détectables. En alternative, les anticorps peuvent être marqués indirectement.
Dans un mode de réalisation préféré, les anticorps sont marqués. Les marqueurs incluent les radiomarqueurs, les enzymes, les marqueurs fluorescents, luminescents, chimiques, des particules magnétiques, par marquage à l'or, par marquage de type biotine/avidine, péroxydase, etc..
L'invention a également pour objet une méthode de détection de la protéine LIV21 dans un échantillon biologique, comprenant une étape de traitement convenable des cellules par tout moyen approprié permettant de rendre accessible le milieu intracellulaire, une étape de mise en contact dudit milieu intracellulaire ainsi obtenu avec un anticorps spécifique de la protéine LIV21 humaine et une étape de mise en évidence par tout moyen approprié du complexe LIV21 -anticorps formé. Dans des modes de réalisation particuliers, les extraits cytoplasmiques et/ou nucléaires sont préparés, et ces extraits sont mis en contact avec l'anticorps spécifique de la protéine LIV21 humaine.
Diagnostic
La présente invention enseigne la mise au point du test pharmaco diagnostiαue. permettant aussi le suivi de l'évolution d'une prolifération cellulaire. En particulier, la présente invention permet le suivi de l'évolution d'une prolifération cellulaire sur des cellules ou des tissus frais, sur des cellules ou des tissus congelés et sur des tissus traités entre autre avec de la paraffine. Les applications peuvent être le diagnostic du cancer ainsi le suivi de l'évolution d'une prolifération cellulaire. De préférence, le cancer est sélectionné parmi les cancers du sein, de la vessie, de l'ovaire, du poumon, de la peau, de la prostate, du colon, du foie, un sarcome, une leucémie et le glioblastome, sans être limité à ceux-ci.
Cinq de ces propriétés peuvent être utilisées: son passage du compartiment cytoplasmique cellulaire au compartiment nucléaire, la propriété de s'associer • au. facteur de transcription E2F4 afin de former un complexe inhibant l'expression du facteur E2F1 et la capacité de LIV21 à se transloquer dans le noyau par inhibition spécifique de PKCε, la sumoylation de LIV21 quand celui-ci est nucléaire et intégrée dans les corps PML et son interaction avec HDAC.
Ces différentes propriétés de LIV21 peuvent être exploitables par tous les moyens d'imagerie optique, sonique et de spectroscopie actuels. Attendu que l'état majoritairement cytoplasmique de cette protéine dans les cas de cancer par rapport à sa situation nucléaire dans les cellules saines est une différence géographique et structurelle qui permet, sans nécessité d'un marqueur fluorescent, de différencier des profils spectraux du pattern fonctionnel du tissu cancéreux versus du tissu sain et ainsi de faire le diagnostic.
Ces résultats montrent que la localisation cytoplasmique de protéines du complexe
LIV21 et la localisation nucléaire d'autres protéines de ce même complexe est un indicateur de l'agressivité et du potentiel métastatique du cancer. La détection du lieu de l'expression des protéines ' du complexe LIV21 indique la présence de cellules
cancéreuses, plus particulièrement de cellules cancéreuses invasives, agressives et/ou métastatiques.
L'invention concerne par ailleurs des méthodes de diagnostic ou de pronostique du cancer mettant en oeuvre la détection de la localisation cytoplasmique d'un facteur de transcription localisé dans le noyau dans des cellules saines.
La présente invention concerne une méthode pour la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique d'un patient comprenant la détection du produit de l'expression du gène LFV21 dans le noyau et/ou le cytoplasme des cellules dans l'échantillon biologique dudit patient, une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21 dans le cytoplasme étant indicative de la présence de cellules cancéreuses et une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21 dans le noyau étant indicative de la présence de cellules non-cancéreuses. De préférence, une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21 dans le cytoplasme est indicative de la présence de cellules cancéreuses invasives et/ou métastatiques. La méthode comprend de préférence une étape préalable de traitement convenable des cellules contenues dans l'échantillon par tout moyeri approprié permettant de rendre accessible le milieu intracellulaire. La méthode comprend facultativement une étape de comparaison avec un échantillon biologique ne contenant pas de cellules cancéreuses.
Facultativement, la méthode selon la présente invention comprend en outre la détection du produit de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi le groupe consistant en le gène de la protéine kinase C epsilon (PKCε), le gène E2F1 et le gène E2F4. La méthode peut notamment comprendre la détection du produit de l'expression de deux de ces gènes ou des trois gènes. Par ailleurs, au moins un des rapports LIV21 / PKCε, LIV21 / E2F4 et LIV21 / E2F1 peut être déterminé dans la présente méthode. Ce rapport peut être déterminé dans le cytoplasme et/ou dans le noyau. De préférence, ces rapports sont déterminés dans le noyau. De préférence, ces rapports sont comparés à ceux obtenus dans une cellule saine.
Dans un mode de réalisation, le produit d'expression des gènes est détecté au niveau de PAKNm, PARNm pouvant être détecté par tout moyen bien connu de l'homme du métier.
Ainsi, la méthode selon la présente invention concerne également la détection d'un polynucléotide codant pour la protéine LIV21 humaine ou un fragment de celle-ci, par exemple LIV21a et/ou LIV21b. Le polynucléotide codant pour LIV21 peut être un ARNm, un ADNc ou un ADN génomique. Les polynucléotides peμvent être isolés à partir de cellules de l'échantillon biologique. Ils peuvent également être obtenus par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) effectuée sur l'ADN total des cellules ou encore par RT-PCR effectuée sur les ARN totaux des cellules ou des ARN polyA.
L'ARNm peut être détecté par une analyse RT-PCR. Pour cela, la méthode met en oeuvre une paire d'amorces spécifique du produit d'expression à détecter, notamment LIV21, PKCε, E2F1 ou E2F4. Par « paire d'amorces spécifique » est entendu qu'un moins une des amorces est spécifique du produit d'expression à détecter. C'est-à-dire que cette paire d'amorces permet d'amplifier spécifiquement un fragment de PARNm désiré. De préférence, l'analyse par RT-PCR est effectuée sur des extraits nucléaires et/ou cytoplasmiques des cellules contenues dans l'échantillon de la patiente. Facultativement, l'analyse par RT-PCR peut être une analyse quantitative. Une paire d'amorces spécifiques de LIV21 peut être préparée sur la base des enseignements de la présente demande. Par exemple, la paire d'amorces peut comprendre les amorces décrites dans les séquences SEQ ID Nos 3 et 4.
Les paires d'amorce spécifiques de PKCε, E2F1 et E2F4 sont bien connues par l'homme du métier (Caroll JS 2000 ; Mundle SD 2003 ; Stevaux O 2002 ;Cheng T 2002 ; OpalkaB 2002).
L'ARNm peut également être détecté par une analyse NoRthern blot. Pour cela, la méthode met en oeuvre une. sonde spécifique du produit d'expression à détecter,
notamment LIV21, PKCε, E2F1 ou E2F4. Une sonde spécifique de LIV21 peut être préparée sur la base des enseignements de la présente demande. Un exemple de sonde spécifique comprend la séquence SEQ ID No 5. De préférence, l'analyse Northern blot est effectuée sur des extraits nucléaires et/ou cytoplasmiques des cellules contenues dans l'échantillon de la patiente. La sonde nucléique est marquée. La technique de marquage des oligonucléotides. est bien connue de l'homme du métier. Le marquage des sondes selon l'invention peut être réalisé par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 32 P, le 33 P, ou le 3 H. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels que la biotine, l'avidine, la streptavidine, la digoxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémoluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents. Les sondes spécifiques de PKCε, E2F1 et E2F4 sont bien connues par l'homme du métier.
Dans un mode de réalisation alternatif, le produit d'expression des gènes est détecté au niveau de chaque protéine du complexe Liv21. De préférence, chaque protéine est détectée à l'aide d'un anticorps spécifique. Ainsi, la méthode comprend une étape de mise en contact des cellules de l'échantillon biologique avec un anticorps dirigé contre chaque protéine ou peptide du complexe LIV21. Les anticorps peuvent être monoclonaux ou polyclonaux. L'anticorps anti-LIV21F peut par exemple être un sérum anti-LIV21F. L'anticorps anti Histone peut être un anticorps monoclonal. Pour les anticorps dirigés contre les facteurs de transcription ou les translocases par exemple, l'utilisation de ces anticorps comme des médicaments inhibiteurs de la transduction du signal devra se faire systématiquement après étude du profil d'expression de la biopuce ADNc ou Anticorps ou / et protéines. Les anticorps chimériques font aussi parti de cette application (cf. par exemple la protéine de fusion PML/RAR chromosome 15/17). On devra fonction du taux d'expression des protéines ou gènes de chaque sujet atteint de tumeur, ajuster la posologie de l'administration d'un ou plusieurs anticorps, siRNA et/ou de traitements chimiques connus par l'homme de métier et utilisé déjà dans ce type de pathologie à son stade d'évolution. Cela s'apparente dans un premier temps à un
traitement de pharmacogénomique dans le sens où il serait le mieux adapté à l'échelle individuelle fonction du pattern d'expression de chaque gène et protéine d'intérêt et de son taux d'expression dans son compartiment cellulaire étudié pour chaque complexe protéique d'intérêt. Ce type d'approche peut évoluer très vite afin de suivre des profils d'expression communs à des sous types de sujets atteints d'un même type de cancer au même stade (normalisation à étudier dans des cohortes de sujets atteints avec un phénotype bien caractérisé versus sujets sains). Le cancer du sein étant un des plus difficile à aborder par cette méthode thérapeutique nouvelle puisqu'il est connu pour son hétérogénéité phénotypique. Les composés chimiques anticancéreux comme par exemple l'IL2, Pinterféron, les inhibiteurs de kinase ou les antimitotiques décrits dans la littérature ne font pas partis des composés selon l'invention mais les compositions pharmaceutiques les comprenant comme leur utilisation en thérapie font partie de la présente invention.
Lorsque le produit de l'expression d'un des gènes PKCε, E2F1 et E2F4 doit être détecté, la méthode peut utiliser des anticorps spécifiques des protéines PKCε, E2F1 et E2F4, respectivement. Les anticorps polyclonaux et monoclonaux dirigés contre PKCε, E2F1 et E2F4 sont disponibles commercialement. A titre d'exemple, on peut citer, pour PKCε, un anticorps polyclonal de lapin (Santa Cruz Technology, sc-214), pour E2F1, un anticorps polyclonal de lapin (Santa Cruz Technology, sc-860), et pour E2F4, un anticorps polyclonal de lapin (Santa Cruz Technology, sc-866). De préférence, les anticorps sont marqués, directement ou par l'intermédiaire d'un anticorps secondaire. Les techniques de marquage des anticorps sont bien connues de l'homme du métier.
Dans un mode de réalisation particulier, la protéine peut être détectée par une analyse d'immunobuvardage (Western blot). L'analyse Western blot peut être réalisée sur des extraits nucléaires et/ou cytoplasmiques des cellules contenues dans l'échantillon de la patiente. Brièvement, les protéines sont mises à migrer dans un gel puis transférer sur une membrane. Ensuite, cette membrane est incubée en présence des anticorps et la
fixation des anticorps est éventuellement révélée à l'aide d'anticorps secondaires marqués.
Dans un autre mode de réalisation, la protéine est détectée par immunohistochimie, immunocytochimie ou immunoradiographie. Ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. L'analyse d' immunocytochimie peut être effectué sur des cellules entières provenant de l'échantillon ou étant dérivées de celui-ci, par exemple par culture cellulaire. Elle peut également être réalisée sur des noyaux isolés. L'analyse d'immunohistochimie peut être faite sur des coupes de tissu mammaire.
A titre d'illustration, une analyse par immunocytochimie peut comprendre les étapes suivantes. Cependant, il est entendu que d'autres modes préparatoires peuvent être mis en oeuvre. Des cellules provenant de l'échantillon biologique sont cultivées, de préférence sur des lames (Lab Tek,Nunc, Allemagne), puis lavées avec du tampon et fixées avec du paraformaldéhyde (par ex. 4%). Une étape de saturation est de préférence réalisée en incubant les cellules avec du tampon S (PBS-Triton XlOO 0,1% - SVF 10%). Les cellules sont ensuite incubées avec l'anticorps primaire et sont ensuite lavées et incubées avec un anticorps secondaire fluorescent, si nécessaire. Les noyaux peuvent être marqués à Piodure de propidium (Sigma). Les lames sont montées au moviol pour l'observation en microscopie à fluorescence. Par ailleurs, des noyaux isolées prélevés au cours d'une extraction nucléaire peuvent être fixés avec du paraformaldéhyde (par ex. 4%). Les suspensions de noyaux sont déposées entre lame et lamelle et l'observation est faite en microscopie à fluorescence et en microscopie confocale. Les anticorps primaires sont par exemple des anticorps de lapin et les anticorps secondaires sont des anticorps marqués dirigés contre les IgG de lapin.
Les échantillons biologiques proviennent d'un patient potentiellement atteint de cancer ou atteint de cancer de manière avérée. Par "échantillon biologique", on entend notamment un prélèvement du type fluide biologique, tissu vivant, fragment de tissu, mucosité, organe ou fragment d'organe, ou tout surnageant de culture obtenu à l'aide
d'un prélèvement. La méthode selon la présente invention peut comprendre une étape de prélèvement d'un échantillon biologique du patient. L'étape de détection peut être effectuée directement sur une coupe de tissu de l'échantillon, sur une culture de cellules provenant de l'échantillon, sur des extraits cellulaires totaux, des extraits nucléaires et/ou cytoplasmiques.
Dans un mode de réalisation particulier de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène PKCε, une augmentation significative de PKCε est indicative de la présence de cellules cancéreuses. Plus précisément, la quantité de PKCε dans des cellules saines est comparée à la quantité de PKCε dans les cellules de l'échantillon et l'augmentation significative est déterminée par cette comparaison. La méthode selon la présente invention peut éventuellement comprendre la mesure du taux LIV21 / PKCε. Ce rapport LIV21 / PKCε augmente dans la fraction cytoplasmique des cellules cancéreuses par rapport à des cellules saines.
Dans un autre mode de réalisation particulier de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène E2F4, la méthode comprend la détection de l'association de LIV21 avec la protéine E2F4, et une diminution de cette association étant indicative de la présence de cellules cancéreuses. La détection de l'association de LIV21 avec la protéine E2F4 peut être réalisée par une détection concomitante de LIV21 et de E2F4. La méthode selon la présente 'invention peut éventuellement comprendre la mesure du taux E2F4 / LIV21. Ce rapport E2F4 / LIV21 diminue dans le noyau des cellules cancéreuses par rapport à des cellules saines.
Dans un mode de réalisation supplémentaire de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène E2F1, la présence de la protéine E2F1 dans le noyau est indicative de la présence de cellules cancéreuses. La méthode selon la présente invention peut éventuellement comprendre la mesure du taux E2F1 / LIV21. Ce rapport E2F1 / LIV21 augmente dans la fraction nucléaire des cellules cancéreuses par rapport à des cellules saines.
La méthode selon la présente invention permet notamment la détection de cancer métastasé, le suivi thérapeutique et/ou les récidives de traitement et de déterminer le degré d'invasivité d'un cancer. La spécificité de la détection peut être liée aux croisements des informations obtenues par l'existence et la topographie de LIV21 par tous les moyens d'imagerie et de spectroscopie et obtenues par l'association aux autres indicateurs cancérologiques connus via des puces à protéines ou des microarrays. Ainsi, la détection basée sur LIV21 peut être associée à la détection d'autres marqueurs du cancer, en particulier du cancer du sein, connus de l'homme du métier.
En effet, la présente invention concerne une méthode de suivi thérapeutique d'un traitement anti-cancéreux chez un patient souffrant d'un cancer comprenant, l'administration du traitement anti-cancéreux au dit patient et la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique du patient selon la méthode de la présente invention. Une diminution des cellules cancéreuses sera indicative de l'efficacité du traitement. La détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique du patient selon la méthode de la présente invention peut être effectuée une fois ou plusieurs fois au cours du traitement anti-cancéreux ou après le traitement anticancéreux. De préférence, l'échantillon biologique provient du tissu touché par le cancer traité.
Par ailleurs, la présente invention concerne également une méthode de détection des récidives suite à un traitement anti-cancéreux d'un cancer chez un patient comprenant, la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique du patient selon la méthode de la présente invention. La détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique du patient selon la méthode de la présente invention peut être effectuée une fois ou plusieurs fois après le traitement anti-cancéreux. La détection de cellules cancéreuses est indicative de récidives. De préférence, l'échantillon biologique provient du tissu touché par le cancer traité.
La présente invention décrit également un kit pour la mise en œuvre d'une méthode selon l'invention. Plus particulièrement, l'invention concerne un kit permettant la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique d'un patient comprenant un ou des éléments sélectionné(s) parmi le groupe consistant en un anticorps qui se lie spécifiquement à LF/21 humaine selon la présente invention et un sérum anti-LIV21 selon la présente invention, une sonde oligonucléotidique spécifique de l'ARNm de LIV21 et une paire d'amorces spécifique de l'ARNm de LIV21. Dans un mode de réalisation préféré, le kit comprend des anticorps qui se lient spécifiquement à LIV21 humaine. Dans un autre mode de réalisation préféré, le kit comprend une sonde oligonucléotidique spécifique de l'ARNm de LIV21. Il peut également comprendre une sonde spécifique d'un gène « house-keeping ». Le kit selon la présente invention peut comprendre des réactifs permettant la détection d'un complexe LIV21 -anticorps produit lors d'une réaction immunologique. Facultativement, le kit selon la présente invention comprend en outre des moyens de détection du produit de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi le groupe consistant en le gène de la protéine kinase C epsilon (PKCε), le gène E2F1 et le gène E2F4. Ces moyens de détection peuvent être des anticorps spécifiques de la protéine, des sondes oligonucléotidiques spécifiques de l'ARNm concerné et/ou une paire d'amorces spécifique de l'ARNm.
La présente invention concerne également une composition diagnostique comprenant un ou des éléments sélectionné(s) parmi le groupe consistant en un anticorps selon la présente invention et un sérum selon la présente invention, une sonde oligonucléotidique spécifique de l'ARNm de LIV21 et une paire d'amorces spécifique de l'ARNm de LïV21.
Thérapie Anti-cancereuse
Dans le contexte d'une thérapie anti-cancéreuses, on peut envisager d'augmenter la quantité de LIV21 présente dans le noyau. Pour cela, on pourrait augmenter l'expression de LIV21 dans le noyau des cellules cancéreuses. LIV21 étant capable de s'auto-nucléariser, la réalisation d'un vecteur d'expression comprenant un
polynucléotide codant pour LIV21 humaine pourrait être envisagée dans le but de faire surexprimer cette protéine dans le noyau des cellules dont on souhaite réguler la prolifération.
Le vecteur d'expression codant LIV21 humain peut être administré in vivo au patient par tout moyen connu de l'homme du métier.
Par exemple, le vecteur d'expression peut être administré sous forme d'ADN nu (par exemple EP 465 529). Des techniques de microinjection, électroporation, précipitation au phosphate de calcium, formulations à l'aide de nanocapsules ou de liposomes sont d'autres techniques disponibles.
Le vecteur d'expression peut également être sous la forme d'un virus recombinant comprenant, insérée dans son. génome, un polynucléotide codant pour LIV21 humaine. Le vecteur viral peut être par exemple choisi parmi un adéno virus, un rétrovirus, en particulier un lentivirus, ainsi qu'un virus adéno-associé (AAV), un virus de l'herpès (HSV), un cytomégalovirus (CMV), un virus de la vaccine, etc. De manière avantageuse, le virus recombinant est un virus défectif.
De préférence, le vecteur d'expression permet un ciblage cellulaire. Ainsi, ce vecteur pourrait cibler les cellules cancéreuses ou le type cellulaire particulier qui est affecté par le cancer. Le ciblage d'un type cellulaire particulier peut être réalisé en plaçant le polynucléotide codant LIV21 sous le contrôle d'un promoteur tissu-spécifique. Dans une autre alternative, le vecteur d'expression peut faire l'objet d'un ciblage, par exemple en l'associant à une molécule spécifique d'un tissu particulier ou des cellules cancéreuses, par exemple un anticorps spécifique d'une molécule exprimée spécifiquement par le tissu particulier ou les cellules cancéreuses. Par ailleurs, le choix du vecteur d'expression peut influencer également le ciblage. En effet, si le vecteur d'expression est un virus, le tropisme du virus naturel ou modifié peut également permettre un certain ciblage.
La présente invention concerne donc une composition pharmaceutique comprenant un polynucléotide codant pour LIV21, plus particulièrement un vecteur d'expression codant pour LIV21. Elle concerne également l'utilisation d'une composition pharmaceutique comprenant un polynucléotide codant pour LIV21, en particulier un vecteur d'expression codant pour LIV21, comme médicament. De préférence, la présente invention concerne l'utilisation d'une composition pharmaceutique comprenant un polynucléotide codant pour LIV21, en particulier un vecteur d'expression codant pour LIV21, pour la préparation d'un médicament destiné à traiter un cancer. La présente invention concerne enfin une méthode de traitement du cancer chez un patient comprenant l'administration aux cellules cancéreuses d'un polynucléotide codant pour LIV21, l'expression de LIV21 permettant de réduire ou d'abolir le phénotype cancéreux des cellules traitées. De préférence, le cancer est sélectionné parmi les cancers du sein, de la vessie, de l'ovaire, du poumon, de la peau, de la prostate, du colon, et le glioblastome, sans être limité à ceux-ci.
Par ailleurs, on pourrait également favoriser la localisation nucléaire de LF/21, par exemple en diminuant l'activité de PKCε dans les cellules cancéreuses et en utilisant les inhibiteurs d'HDAC.
Dans un autre mode particulier de thérapie anti-cancéreuse, on peut envisager de diminuer l'activité de PKCε dans les cellules cancéreuses. Cette diminution d'activité peut être réalisée en diminuant l'activité de la protéine PKCε ou en diminuant son expression. Une diminution de l'activité de la protéine PKCε peut être obtenue en administrant aux cellules cancéreuses des inhibiteurs de la protéine PKCε. Les inhibiteurs de la protéine PKCε sont bien connus de l'homme du métier. Une diminution de l'expression de la protéine PKCε peut être obtenue en utilisant des antisens ou des siRNA spécifiques du gène PKCε. Des kits sont commercialement disponibles. Par ailleurs, les techniques concernant les inhibitions par anti-sens ou
siRNA sont bien connues de l'homme du métier. (Arya R 2004, Lee W 2004, Sen A 2004, Platet N 1998, Hughes 1987)
La présente invention concerne donc une composition pharmaceutique comprenant un inhibiteur de la protéine PKCε. Elle concerne également l'utilisation d'une composition pharmaceutique comprenant un inhibiteur de la protéine PKCε comme médicament, en particulier pour la préparation d'un médicament destiné à traiter un cancer. Elle concerne enfin une méthode de traitement du cancer chez un patient comprenant l'administration aux cellules cancéreuses d'un inhibiteur de la protéine PKCε, l'inhibiteur de la protéine PKCε permettant de réduire ou d'abolir le phénotype cancéreux des cellules traitées. Dans un premier mode de réalisation, l'inhibiteur de la protéine PKCε diminue l'activité de la protéine PKCε. Dans un deuxième mode de réalisation, l'inhibiteur de la protéine PKCε diminue l'expression de la protéine PKCε. De préférence, le cancer est sélectionné parmi les cancers du sein, de la vessie, de l'ovaire, du poumon, de la peau, de la prostate, du colon, du foie, un sarcome, une leucémie et le glioblastome, sans être limité à ceux-ci. Les inhibiteurs de PKC epsilon sont publiés et utilisés dans le commerce pour d'autres applications.
Dans le contexte d'une thérapie d'une maladie neurodégénérative, on peut envisager de diminuer la quantité de LFV21 présente dans le noyau. Pour cela, on pourrait diminuer ou bloquer l'expression de LIV21 dans le noyau des cellules touchées par la maladie neurodégénérative. Les cellules touchées par la maladie neurodégénérative sont généralement des neurones, des motoneurones, etc.. Dans un mode de réalisation préféré, la maladie neurodégénérative est choisie parmi la maladie d'Alzheimer, de Huntington, de Parkinson et la sclérose latérale amyotrophique (ALS). L'inhibition ou le blocage de l'expression de LFV21 peut être réalisé par tout moyen connu de l'homme du métier. Notamment, à titre d'illustration, on peut citer la stratégie antisens, siRNA, et les ribozymes. Ainsi, un oligonucléotide antisens ou un vecteur d'expression codant pour cet oligonucléotide antisens pourrait être préparé et utilisé pour bloquer la traduction de l'ARNm codant LFV21 in vivo. Par ailleurs, un ribozyme peut être préparé
pour couper et détruire in vivo l'AKNm codant LIV21. On peut également envisager une stratégie en triple hélice dans laquelle un oligonucléotide est conçu pour s'hybrider avec le gène codant LIV21 et bloquer ainsi la transcription de ce gène.
Par ailleurs, Pour cela, on pourrait également défavoriser la localisation nucléaire de LIV21, par exemple en augmentant l'activité de PKCε dans les cellules touchées par la maladie neurodégénérative.
Dans un autre mode particulier de thérapie contre une maladie neurodégénérative, on peut envisager d'augmenter l'activité de PKCε dans les cellules touchées par la maladie neurodégénérative. Cette augmentation d'activité peut être réalisée en augmentant l'activité de Ja protéine PKCε ou en augmentant son expression. Une augmentation de l'activité de la protéine PKCε peut être obtenue en administrant aux cellules touchées par la maladie neurodégénérative des activateurs de la protéine PKCε. Les activateurs de la protéine PKCε sont bien connus de l'homme du métier (Toma O (2004),
Activation des PKC par DAG, AGPI : acide oléique, linoléique, arachidonique etc..
Activation et protéolyse des PKC dans les cellules gonadotropes :Communication 2004 de Macciano H, Junoy B, Mas JL Drouva SV UMR6544 Marseille). Une augmentation de l'expression de la protéine PKCε peut être obtenue en utilisant des vecteurs d'expression codant pour la protéine PKCε et permettant de la surexprimer dans les cellules touchées par la maladie neurodégénérative.
Ainsi, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un activateur de la protéine PKCε ou un vecteur d'expression codant pour la protéine PKCε. Elle concerne en outre l'utilisation d'un activateur de la protéine PKCε ou d'un vecteur d'expression codant pour la protéine PKCε pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une maladie neurodégénérative.
Méthode de criblage
L'invention concerne des méthodes pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs diminuant la prolifération cellulaire, basées sur la mesure de la localisation nucléaire versus cytoplasmique de LIV21, ou de la liaison de la protéine LIV21 à la protéine E2F4.
Dans un premier mode de réalisation, la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs d'intérêt thérapeutique comprend la mise en contact d'un composé candidat avec une cellule et la détermination de la localisation nucléaire versus cytoplasmique du produit d'expression de LIV21. Une augmentation de la localisation nucléaire de LIV21 indique que le composé candidat est actif pour diminuer ou abolir la prolifération cellulaire. Une diminution de la localisation nucléaire de LIV21 indique que le composé candidat est actif pour traiter ou prévenir une maladie neurodégénérative.
Dans un deuxième mode de réalisation, la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs d'intérêt thérapeutique comprend la mise en contact d'un composé candidat avec une cellule et la détermination du niveau d'expression du gène codant pour la protéine PKCε. Une diminution de l'expression de PKCε indique que le composé candidat est actif pour diminuer ou d'abolir la prolifération cellulaire. Une augmentation de l'expression de PKCε indique que le composé candidat est actif pour traiter ou prévenir une maladie neurodégénérative.
Dans un troisième mode de réalisation, la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs d'intérêt thérapeutique comprend la mise en contact d'un composé candidat avec une cellule et la détermination du niveau de complexe
LIV21/E2F4. Une augmentation du niveau de complexe LIV21/E2F4 indique que le composé candidat est actif pour diminuer ou d'abolir la prolifération cellulaire. Une diminution du niveau de complexe LIV21/E2F4 indique que le composé candidat est actif pour traiter ou prévenir une maladie neurodégénérative.
Dans un quatrième mode de réalisation, la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs d'intérêt thérapeutique comprend la mise en contact d'un composé candidat avec une cellule et la détermination du niveau d'expression du gène codant pour la protéine E2F1. Une diminution.de l'expression de E2F1 indique que le composé candidat est actif pour diminuer ou d'abolir la prolifération cellulaire. Une augmentation de l'expression de E2F1 indique que le composé candidat est actif pour traiter ou prévenir une maladie neurodégénérative.
L'invention a encore pour objet une méthode de criblage d'un composé capable d'interagir in vitro, directement ou indirectement, avec LIV21 caractérisée en ce que: dans une première étape, on met en contact le composé candidat et LIV21 et, dans une deuxième étape, on détecte par tout moyen approprié le complexe formé entre ledit composé candidat et LIV21.
La présente invention a également pour objet une méthode de criblage d'un composé capable de moduler (activer ou inhiber) l'activité de la protéine LIV21, caractérisée en ce que: dans une première étape, on met en contact des cellules d'un échantillon biologique exprimant la protéine LIV21 avec un composé candidat, dans une deuxième étape, on mesure par tout moyen approprié l'effet dudit composé candidat sur l'activité de ladite protéine LIV21, et dans une troisième étape on sélectionne des composés candidats capables de moduler ladite activité. L'activité de LIV21 peut par exemple être estimée par l'intermédiaire de l'évaluation de la capacité de la cellule à se diviser, par la mesure de l'expression du gène E2F1, ou par la localisation cytoplasmique et/ou nucléaire de LIV21.
Le composé candidat peut être une protéine, un peptide, un acide nucléique (ADN ou ARN), un lipide, un composé organique ou inorganique. Notamment, le composé candidat pourrait être un anticorps, un anti-sens, un ribozyme ou un siRNA. •
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples et les figures qui suivent, donnés à titre non limitatif.
EXEMPLES EXEMPLE 1
Extraction des protéines du complexe LIV21
La lignée des cellules MCF-7
La lignée MCF-7 est une lignée humaine non clonale de cellules d'adénocarcinome du sein. Lors de leur différenciation induite par des facteurs exogènes, ces cellules développent une hypertrophie, des protrusions membranaires et une tendance à se dissocier les unes des autres. Elles acquièrent un phénotype sécrétoire se caractérisant par l'apparition de nombreux granules et de canalicules secrétaires.
In vivo, ces cellules sont peu métastasiques et cette invasivité réduite serait due à une faible activité constitutive des protéines kinases C (PKCs) et à un taux peu élevé de l'expression de la protéine kinase C alpha.
Cette lignée est utilisée dans de nombreuses études sur la prolifération, la différenciation et l'apoptose. Ces études utilisent des drogues appropriées comme le TNF pour l'induction de l'apoptose, ou le TPA (12 -O -tetradecanoyl phorbol-13 - SUMOate) pour l'induction de la différenciation et donc pour l'étude de la sortie du cycle cellulaire.
Extraction des protéines du complexe LIV21
Après culture de cellules MCF7 ( ATCC passage 15) et extraction cellulaire, 5 mg de protéines sont centrifugées après homogénéisation dans 10 ml de tampon RIPA additionné d'antiprotéase. Ces extraits protéiques sont passés en boucle pendant 7 heures à la pompe péristaltique sur une colonne d'affinité ( HITRAP NHS ACTIV HP 1x5 ml : article et catalogue 17071701) où a été fixé l'anticorps LIV 21. Lavages 3 fois
10 ml dans du tampon RIPA puis élution d'une quinzaine de fractions de 500 ni dans du tampon glycine PH2/ HCL, puis contrôle sur gel SDS Page 10% (dépôt de 25 ni de la fraction) suivi d'un immunobuvardage ( western blot) de vérification. Révélation d'une bande sur gel à 51 kD encadrée par deux autres bandes à 50 et 52 kD respectivement et trace d'une bande à 80 et 10OkD plus faibles en gel monodimensionnel fig IA). Par ailleurs révélation de 12 spots entre 50 kD et 7OkD en gel bidimensionnel (fig IB et 2 ) - PeptideLIV21a RVYGPLINPKPQ SEQ ID No I
- PeptideLIV2 Ib CYRSILHTKV SEQ ID No 2
- PeptideLIV21 c S YMSMFLLLMAISCVLAK SEQ ID No 3 - PeptideLIV21a PLMIIHHLDDCPHSQALK SEQ ID No 4
- PeptideLIV21 a KFFVFALILALMLSMCGADSHAKR SEQ ID No 5
EXEMPLE 2 : Spectrométrie de masse
Une spectrométrie de masse (MALDI) a été réalisée pour la protéine LIV21 et son complexe. La protéine LIV21 a été digérée par la trypsine. Les peptides issus de la digestion sont solubilisés dans un solvant : acétonitrile/eau (1/1) contenant 0,1 % TFA (acide trifluoro acétique). Une solution saturée de la matrice alpha cyano-4- hydroxycinnamique a été préparée dans le même solvant. On a prélevé un même volume des deux solutions, on a mélangé et déposé 1 μl sur la plaque de MALDI pour analyse. La spectrométrie de masse a montré que la protéine LIV21 et son complexe digérés par la trypsine met en évidence une centaine de peptides suivant la bande de gel extraite entre 49 et 54 KD et étudiée(cf. Figure 3 à 5). La protéine LïV21 a été caractérisée par un poids moléculaire de 50 kD, mise en évidence par Western Blot et par gel bidimensionnel SDS PAGE (Figure 2). Mais on trouve un produit de 10OkD à 130 kD qui pourrait être un dimère de LIV21.
Lorsqu'elle change de compartiment cellulaire et qu'elle est sumoylée, elle a un poids moléculaire de 6OkD environ. Lorsqu'elle est phosphorylée dans le cytoplasme, elle présente deux formes différant de quelques kilobases. On observe alors un doublon.
EXEMPLE 3 : Analyse des séquences dans les bases de données de protéomique Plusieurs peptides listés dans la demande de brevet la caractérisent : PeptideLF/21b FVFALDLALMLSMCG SEQ ID No 51
PeptideLIV21b KFFVFALILALMLSMCGADSHAKR SEQ ID No 5
Par exemple, l'inventeur a obtenu un score très significatif de 81, espéré :0,0012 pour un variant de l'histatine 3-2 avec 52% de recouvrement de séquences entre l'échantillon testé et l'histatine, cette séquence SEQ ED No 5 est commune à LIV21 et à FHS3- HUMAN (Figure 6 et 7). En Utilisant une banque différente et un ppm qui diffère de 20 à 50 ppm on obtient la séquence identique pour leur partie commune : SEQ ID No 51
EXEMPLE 4 :
Transcriptions réverses :
Après décongélation de cellules MCF7 (ATCC passage 15) et culture des cellules jusqu'à 200 Millions, les cellules ont été trypsinées et congelées à- 8O 0 C. Les ARN ont été extraits à partir de deux pools de 50 millions de cellules avec le kit Nucleospin RNA L (Macherey Nagel) réf. 740.962.20 aboutissant à un pool 1 de 318 μg et un deuxième de 182 μg.
Les ARN poly A+ ont été extraits à partir de 313 μg d'ARN totaux du pool 1 à l'aide du kit oligo Tex m RNA Midi kit (Qiagen) réf. 70042.
I Retrotranscription :
Les ARN ont été rétro transcrits avec la Revert Aid H minus M-MuLV Reverse Transcriptase Fermentas Réf. EP0451 lot 1124 avec 3,64 μg d'ARN totaux et 0,45 μg ARNm selon les conditions du fournisseur avec une amorce oligo dT. Réactions réalisées à 2 -températures différentes à 45°C et 55°C de façon à éliminer les structures des ARN pouvant gêner la retrotranscription.
H PCR
Les PCR ont été effectuées avec les transcriptions réverses comme matrices avec les amorces Al + oligo dT dans un premier temps. Des nested PCR ont été ensuite réalisées sur ces premières PCR avec les amorces Al + Splicing, Al + GDBRl, ou ATG + Splicing, ATG + GDBRl .
Amplification par PCR avec les amorces spécifiques des gènes à détecter à partir des ADNc obtenus après RT oligo dT.
Enzyme : polymérase Taq DNA polymerase Fermentas. Thermocycler : Bio-Rad iCycler.
La qualité des ADNc a été testée par une amplification de gènes de ménage GAPDH, b- actine et Histone H3.3
TABLEAU 1
Amorces
TABLEAU 2 Mix PCR
Cycles PCR
Dénaturation : 94°C 2 minutes
Dénaturation : 94°C 30 secondes
Annealing : 52-55°C 1 minute 35 cycles
Elongation : 72°C l'3O minute
Elongation finale : 72 0 C 7 minutes
Conservation : 4°C III CONTROLES
LES PRODUITS PCR ONT ETE ENSUITE CONTROLES SUR GELS D'AGAROSE ET ANALYSES AVEC LE LOGICIEL BIOCAPT 11,01 DE VILBER LOURMAT. GeIl cf Figure 7 : contrôle des ARN sur gel d'agarose
Figure 8 : PCR avec les gènes de ménage Figure 9 : Analyse des masses moléculaires
Figure 10 PCR avec les amorces montrant une bande à 1400pb Figure 11 Gel 2 avec analyse des masses moléculaires Figure 12 Gel 3 à 55° et analyse des masses moléculaires Figure 13 Gel 4 à 45° et à 55° et analyse des masses moléculaires Figure 14 criblage ligature bande 400pb clones Bl à BlO Figure 15 criblage ligature bande 1400 pb clones Cl à ClO Figure 16 Gel 5 : ligature criblage sur les cinq nouveaux clones Figure 17 Gel 6 Criblage des clones recombinants S55T et S55M et analyses des masses moléculaires.
Gel 2 :
PCR réalisées à partir de matrices PCR effectuées avec les amorces Al + oligo dT sur les RT réalisées à 45°C sur les ARN totaux et poly A+ (messagers). Les amorces utilisées pour ces PCR sont Al + GDBRl ou Al + Splicing reverse). . Sur les RT effectuées à partir des ARN totaux, il y a une amplification d'une bande de 1178-1253 pb avec les amorces Al + GDBRl et Al + Splicing reverse. Les ARN poly A ont été utilisés pour réaliser la RT et sont faiblement observés à la taille (figure 10) de 1400 pb pour une amplification avec les amorces Al+ GDBRl et de 415 pb avec les amorces Al + Splicing reverse. Dans le produit PCR Al + splicing il y a d'autres bandes de 860 et 233 pb (figure 11).
Gel 3 :
PCR réalisées à partir de matrices PCR effectuées avec les amorces Al + oligo dT sur les RT réalisées à 45°C sur les ARN totaux et poly A+ (messagers). Les amorces utilisées pour ces PCR sont Al + GDBRl ou Al + Splicing reverse).Figure 12
Pour les PCR réalisées à partir de RT faites à 55°C on retrouve globalement le même pattern de bandes que celui obtenu à partir des RT faites à 45 0 C. On n'observe pas d'amplification spécifique lorsque les ARN poly A ont été utilisés pour réaliser la RT. Sur les RT effectuées à partir des ARN totaux, on trouve une bande majeure de 1554-1609 pb avec les amorces Al + GDBRl et Al + Splicing reverse. Nous attendons une bande à la taille théorique de 1455 pb pour une amplification avec les amorces Al+ GDBRl et de 415 pb avec les amorces Al + Splicing reverse. Dans les 2 profils on trouve des bandes très nettes de 1900-2100 pb et de 1000-1300 pb mais d'intensité inférieure à celle de la bande de 1500-1600 pb. Dans le produit PCR Al + splicing reverse il y a une autre bande majeure de 263 pb. Gel 4 :
Nested PCR réalisées à partir des matrices PCR effectuées avec les amorces Al + GDBRl ou Al + Splicing reverse) sur les RT réalisées à 45°C sur les ARN totaux et poly A+ (messagers). Les amorces utilisées pour ces PCR sont ATG + GDBRl ou ATG + Splicing reverse). Figure 13
Les nested PCR réalisées avec les amorces ATG + GDBRl donnent des bandes à 1213 pb (RT 45°C) et 1559 + 1315 pb (RT à 55°C) la taille théorique attendue est de 1455 pb. Les PCR effectuées avec les amorces ATG + Splice reverse donnent des profils de bandes plus variés. Ces PCR réalisées à partir d'autres PCR faites avec les amorces Al + GDBRl ou Al +
Splicing reverse.
On note la présence d'une bande de 400 pb dans les profils obtenus à partir d'ARN messagers (la bande obtenue à partir de la transcription réverse réalisée à 55°C est de plus forte intensité). Les profils des PCR ATG + Splice reverse réalisées avec au départ des ARN totaux donnent une bande de 424-437 pb d'intensité très forte. On y trouve également de bandes de 614 et 783 pb de très forte intensité dans le profil de la RT 45 et des bandes plus nombreuses mais d'intensité moindre dans le profil de la RT 55 bandes à 1118, 936 et 749 pb. On a clone et séquence les produits de ces différentes PCR.
EXEMPLE 5 :
Les produits PCR des pistes 2, 4, 6, 7 et 8 ont été ligaturés avec le plasmide pGEMT
Easy Promega et criblage des clones recombinants.Figure 16
Piste 2 : ligatures G45T Piste 4 : ligatures S45T
Piste 6 : ligatures G55T
Piste 7 : ligatures S55M
Piste 8 : ligatures S55T
Les clones recombinants obtenus ont été criblés (après extraction de l'ADN plasmidique) par restriction avec l'enzyme Eco RI dont les sites encadrent le site d'insertion des produits PCR dans le vecteur pGEMT Easy.
Criblages des clones recombinants :
Les premières expériences avaient été faites à partir des dix clones B et des dix clones C Figure 14 et 15 et les résultats des séquences du clone B2 et C8 sont donnés dans
l'exemple suivant et ont par comparaison de séquences entre clones une grande homologie avec les clones de la deuxième série d'expériences. Gel 5 : criblage des clones recombinants S45 Tet G45 T Analyse des masses moléculaires Le criblage des clones par Eco RI montre que sur les 9 clones S45T, 3 possèdent des inserts de lOOpb, 216 pb et 410 pb.
Sur les clones G45T, sur les 6 clones testés, 3 possèdent des inserts de 57, 71 et 148 pb. Figure 17 : Criblage des clones recombinants S55T et S55M Analyse des masses moléculaires Le criblage par Eco RI montre que sur les 13 clones criblés, 7 possèdent des inserts de tailles comprises entre 239 et 637 pb.
Les clones G45T5 (148 pb), S45T9 (410 pb), S45T3 (100 pb), S55M1 (491 pb), S55T6 (251 pb) et S55T9 (637 pb) ont été extraits pour être séquences.
Amorces utilisées pour trouver les Séquences des différents clones :
ATG galgal 5'-atgtatattatatatctaa-3' INV COMP ttagatatataatatacat
Splicing reverse 5'-aaatataagcaatcccaaca-3'
Splicing reverse 5'-tgttgggattgcttatattt-3' inv comp
GDBRl reverse 5'-CTTTATTATTTTGTAAAT-3' GDBRl reverse 5'-ATTTACAAAATAATAAAG-S' inv comp
Séquences des différents clones :
S55M1 450 pb ml3 REVERSE
Compari son of :
I _seq S 55T9 - 1000 nt
70.9% identity in 891 nt overlap; score: 1973 E (10, 000): 4.9e-156 (Figure 18 suite)
Les différents clones ont une séquence de 450 pb en commun
(A) B2
(B) S55M1
94.632% identity in 857 nt overlap; mit: 3634, opt: 3955
Figure 18 (suite) Clone C8 de 1400 pb:
Bilan :
Le clone B2, la bande qui fait 400 pb environ est le même fragment que S55M1 qui lui même est le même fragment que S45T9 ces fragments font entre 400 et 450 pb environ. Cela n'est pas surprenant car ils ont été obtenus après une PCR nested réalisées avec
l'amorce splicing reverse et l'amorces Al (pour le fragment B2) et l'amorce ATG galgal pour les fragments S45T9 etS55 Ml. Ces fragments ont été obtenus avec des RT faites à différentes températures. Par contre le fragment S55T9, présente quand même environ 600 pb dont une partie (300 pb) présente une identité assez forte avec les autres fragments clones
EXEMPLE 6 : A partir du clonage du gène LIV21 décrit ci-dessus, les séquences nouvelles sont étudiées pour dessiner les si RNA (cf. listing des si RNA et figure 191 les plus spécifiques et efficaces pour créer le « silencing » du gène c'est-à-dire inhiber son expression. Sachant que l'efficacité de l'inhibition à chaque injection de siRNA reste courte c'est-à-dire le plus souvent moins d'une heure. L'inventeur a développé des produits diagnostiques et des produits thérapeutiques à partir de ce même outil qu'est le siRNA.
EXEMPLE 6.1 : L'inventeur utilise des si RNA marqués à la rhodamine ou fluoresceine ou tout autre marqueur pouvant être révélé et suivi par observation optique, par un microscope afin de localiser l'endroit dans les cellules, tissus ou échantillon marqué où va se diriger le si RNA marqué afin de s'accrocher à la séquence spécifique qui le caractérise et ainsi signaler le lieu de l'expression de PARN messager du gène d'intérêt. Ainsi le si RNA spécifique peut être utilisé comme marqueur diagnostic comme le serait un anticorps et permettre de localiser dans un cas particulier comme sur des extemporanés ou tout type d'échantillon prélevé sur un patient par exemple échantillon de tissu cancéreux, la fluorescence pou tout autre marquage utilisé sur le si RNA et retrouvé dans un compartiment cellulaire sur l'échantillon.
Ainsi un si RNA marqué de LIV21 (figure 19) se trouvant dans les noyaux cellulaires sous microscope à la périphérie d'une exérèse chirurgicale signerait un diagnostic d'exérèse totale du tissu cancéreux, en revanche, ce même marqueur retrouvé dans le cytoplasme ou les membranes de ce même échantillon obligerait le chirurgien à faire une exérèse élargie dans l'immédiat si ce test peut être pratiqué en salle d'opération en direct ce qui serait le meilleur cas pour retirer toutes les cellules cancéreuses visibles seulement à cette échelle moléculaire et cellulaire grâce à ce marqueur siRNA. Ce pourrait être une alternative plus rapide d'exécution que l'autre application que
l'inventeur a développé avec l'anticorps ou le peptide LIV21 qui peut être utilisé de la même manière.
EXEMPLE 6.2 : pour les produits thérapeutiques, l'inventeur utilise les si RNA du complexe LIV21 marqués dans un premier temps pour objectiver leur présence attendue dans le compartiment cellulaire et les visualiser puis les si RNA LIV21 non marqués dans un deuxième temps pour leur action purement thérapeutique, dans un cas particulier une injection de si RNA (fïg 19) dans un tissu en neurodégenerescence ou par une voie d'abord qui permette au si RNA d'atteindre le tissu en neurodégenerescence (exemple de l' oreille, de l'œil, du liquide céphalorachidien etc..) et d'agir en permettant la prolifération jusqu'à l'apoptose et donc la mort de la cellule en neurodégenerescence. EXEMPLE 7 : test pharmaco diagnostic
A partir des observations qui suivent en annexe à la fin de la description de l'exemple sur les propriétés du complexe LIV21, un design de test pharmaco-diagnostic applicable en clinique a été conçu par l'inventeur avec des moyens techniques connus qui peuvent être déclinés différemment suivant les utilisateurs et correspondre pour chaque mode a un produit nouveau. L'invention réside dans la fabrication de puces diagnostiques à ADN, protéines et à anticorps comprenant les anticorps connus des différentes protéines du complexe associé suivant les phases du cycle cellulaire à LIV21 c'est-à-dire les anticorps,peptides ou séquences nucléotidiques des gènes : de RJBP2, E2F4, E2F1,SUMO, INT2, CRB2, HDACl, TGFbeta, integrine_alpha5 beta2,Myob, MyoD, cycE/cdk2,cdkl, chkl , chk2, TNFalpha,CREBl et p300, Rb, plO7, pl30 de la familles des pockets protéines. Mais aussi NFkB , cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, RAS,Ki67, CAFl. Les puces à protéines (figure 20) permettront d'étudier les surexpressions ou sous expressions des produits des gènes, les interactions protéiques et les modifications post traductionnelles, plus particulièrement les phosphorylations et méthylations de certaines protéines, qui signent un état caractéristique de la cellule malade différent des interactions protéiques et du métabolisme de la cellule saine. L'état d'expression et de silencing de certains gènes étant différent. C'est l'analyse jumelée des résultats de
surexpressions ou sous expressions de la biopuce à ADN et de la puce à protéines qui permettront le meilleur ciblage thérapeutique.
Exemple 7.1 : puce pharmaco diagnostique (Figure 20) conçue à partir de séquences nucléotidiques ou peptidiques fixées sur les supports classiques et selon les techniques connues type Agilent ou Affymetrix ou Caliper sans restriction à celles-ci et correspondant aux séquences connues des gènes et des protéines suivantes et listées par ailleurs dans le brevet en utilisant de préférence les séquences qui en analyse 3D présentent une structure 3D de préférence type loop ou hélix loop hélix ou loop basique ou doigt de zinc ou encore une conformation 3D similaire à une hélice correspondant le plus souvent à des sites fonctionnels, ou encore des séquences nucléotidiques correspondant à une zone de méthylation d'une cytosine, méthylation de la région promotrice du gène entrainant un potentiel silencing (cf bibliographie générale) ainsi qu'aux séquences nouvelles de LIV21 listées dans la description et en annexe mais aussi des séquences communes à certains oncogènes et à certains virus qu'on pense impliqués en particulier dans le cancer du sein des populations chinoises : Mdm2 et HIVl : GAVTSSNIAA DLDQSV EGF et HPVlό EWWRLD KNSLD MHIESLDS Qui pourront aussi être testées en microfluidique fixés sur la lame d'or pour étudier les interactions protéiques avec les extraits cellulaires de la patiente.
Exemple 7.2 : test en microfluidique, par exemple type Biacore, utilisant la technique S.P.Rconnue- de l'homme de métier à base d'un support fixé avec une pellicule d'or permettant une fois le faisceau lumineux envoyé vers l'interface d'obtenir une énergie absorbée fonction de la présence et de la taille des complexes protéiques (si interaction protéine protéine ou protéine anticorps) ou des complexes protéiques ADN (si
interaction protéine ADN) protéine ou peptide, et une onde évanescente perpendiculaire à l'axe de l'interface. (L'inventeur fixe les séquences choisies peptide ou ADN sur les particules d'or et calcule pour chaque complexe d'interaction étudié, le nombre de rU fonction de la taille des molécules citées dans ce brevet. En microfluidique le liquide passant sur ces puces à lame d'or peut être aussi bien un extrait cellulaire (voir sélectif c'est-à-dire uniquement noyaux cellulaires ou uniquement cytoplasmes cellulaires ou uniquement protéines du cytosquelette etc .. suivant des techniques d'extraction et de séparation de fractionnement type Calbiochem :subcellular proteom extraction ou bien des extraits tissulaires ou cellulaires sans préparation autre que des anti protéases ou bien encore du sérum issu d'un prélèvement d'un patient pour étudier le marqueur circulant(cf liste des séquences nucléotidiques ou peptidiques décrite et / ou séquences connues des gènes impliqués dans le cycle de prolifération listés). EXEMPLE 7 : Etude de l'expression de LIV21 dans les biopsies de cancer du sein et de cancer du colon Pour déterminer si les observations obtenues précédemment sont applicables aux tissus humains, un grand nombre de biopsies de cancer obtenues de patients ont été étudié par réaction d'immunohistochimie avec des anticorps spécifiques du complexe protéique LIV21. La détermination immunohistochimique de l'expression de la protéine LIV21 a porté sur plusieurs biopsies de patients. Par ailleurs quelques lames paraffinées de patients atteints de cancer de sein ont aussi étaient étudiées.
Protocole d'analyse par Immunocytochimie :
Déparaffîner les lames ; Réhydrater les tissus ;Saturer les sites non spécifiques et perméabiliser les membranes ; Ajouter l'anticorps en chambre humide ; Révéler l'anticorps Puis Déparaffîner les lames sous hotte.
Deux bains successifs de toluène (rectapur Prolabo) 2x30' ou 2x20min ; puis déshydrater les tissus du rectapur alcool à 100% 15 min ; puis rectapur éthanol à 95% pendant 10 min ; puis rectapur 70% pendant encore lOmn. Décongeler l'anticorps pendant le même temps.
Réhydrater les tissus, Doucement dans du PBS additionné de 10% de sérum de veau foetal et 0,1% de Triton. Puis Saturer les sites non spécifiques (par exemple avec de l'ovalbumine) et perméabiliser les membranes. Réhydrater pendant une heure.
Déposer un ml de ce « PBS » par coupe afin de recouvrir la lame sans qu'elle sèche à aucun moment (quand il s'agit de lame avec des cellules et non pas des tissus, une demi heure suffit).
Mettre la vitre et le couvercle en inox et de l'eau en contrebas pour créer une chambre humide.
1 ) Aj outer l' anticorps en chambre humide. Diluer au 200ème le sérum du lapin dans 4 ml de PBS triton pour continuer à perméabiliser les membranes et SVF.
Mettre ImI sur chaque lame et éviter la lumière et l'évaporation. Laisser toute la nuit ou au minimum trois heures.
Puis rincer au PBS normal IX PH 7, faire deux lavages de 5 à 10 mn pour qu'il ne reste aucune trace du premier anticorps.
Pendant qu'on prépare la sonde Alexa 488 verte (au froid à 4° à l'abri de la lumière) au
250 e donc 10 " μlitre dans 2,5ml de PBS avec toujours 10%SVF et 0 ,1% Triton,
Reposer les lames sur la plaque. Recouvrir la coupe avec 2,5ml pour garder une chambre humide pendant une heure puis lavage au PBS IX PH 7. Lavage au Iodure de Propidium à 0,5 microgramme par microlitre à diluer à 20 microgramme par ml puis encore au 50 e mais cette fois, dilué dans du PBS seul IX ( 50 microlitre pour 2,5 ml de PBS). Egoutter en les sortant du PBS puis 2,5 ml de iodure de propidium reparti sur les quatre lames pendant une minute puis deux rinçage au PBS simple. Montage des lames au Moviol avant lecture. Pour un immuno marquage à la peroxydase il est indispensable de masquer les sites antigèniques par une étape au bain marie de 20 minutes afin d'avoir des résultats intéressants quand on travaille sur des lames parafinées.
La totalité des résultats est résumée dans le Tableau 1, ci dessous.
FIGURE 23 : Expression de la protéine LIV21 déterminée par immunohistochimie dans biopsies de cancer de colon et biopsies de tissus sains.
Ces résultats montrent que la localisation cytoplasmique de LIV21 est un indicateur de l'agressivité -et du potentiel métastatique du cancer. La détection de l'expression de LIV21 indique la présence de cellules cancéreuses invasives, agressives et métastatiques. Ces résultats montrent également que la localisation nucléaire de LIV21 est un indicateur de cellules quiescentes saines soit de tissus bien différentiés.
Annexe :
Etude de la translocation nucléaire de LFV21 dans les cellules MCF-7
L'étude de la distribution sub-cellulaire de LIV21 dans différentes lignées tumorales d'origines diverses a montré une localisation exclusivement cytoplasmique de cette protéine.
La présence de sites putatifs de phosphorylation par les Protéines Kinases C (PKCs) dans la séquence de LIV21 traduit une implication de ces protéines sur sa translocation nucléaire. La lignée MCF-7 traitée par le TPA, module les PKCs et est utilisée ici
L' effet du TPA sur la lignée MCF-7
Le TPA est un activateur connu des PKCs. Il active la croissance des cellules normales du sein, ne modifie pas la prolifération des cellules de tumeurs bénignes de ce même tissu, mais il inhibe de manière drastique la prolifération des cellules de lignées de tumeurs mammaires humaines telles que la lignée MCF-7. Il réduit la croissance cellulaire de cette lignée en contrôlant positivement le récepteur c-erb-2 et en contrôlant négativement le récepteurα de l'acide rétinoïque, qui sont tous deux exprimés de manière particulièrement importante dans ces cellules. Le TPA inhibe fortement et rapidement l'expression et la fonction des récepteurs aux œstrogènes (ER) et il induit la translocation, temps- et dose-dépendante, des protéines kinase C (PKCs) du cytosol vers les membranes.
D'autre part, le TPA augmente la capacité de migration des cellules MCF-7 in vitro et un court traitement de ces cellules par le TPA induit une expansion cellulaire et une organisation des microtubules caractéristiques de leur différenciation.
Expression de LIV21 dans les cellules MCF-7
Dans un premier temps, l'inventeur a vérifié l'expression de LrV21 dans ces cellules, au niveau transcriptionnel et au niveau protéique.
L'expression de l'ARNm de LIV21 a été mis en évidence par RT-PCR (amorce sens : CCTGACATCCCTACATCACCCAT (SEQ ID NO 3) et amorce antisens :
TCCTATGCTTGACTATTGC (SEQ ID NO 4)) dans ces cellules comparativement aux cellules des tissus mammaires (figure 2A). Un ARNm de même taille que l'ARNm détecté dans les tissus mammaires et spécifique de LFV21 a été détecté. Cependant, le niveau d'expression de LIV21 dans les cellules MCF-7 est plus faible que dans les tissus mammaires. Ce premier résultat montre que la lignée MCF-7 exprime l'ARNm
LIV21.
L'inventeur a abordé l'étude de l'expression de la protéine LFV21 par la technique du western blot, avec un anticorps anti-LIV21, dans les cellules MCF-7 par rapport aux tissus mammaires. Les anticorps anti-LIV21 ont été obtenues par la méthode décrite . Dans cette lignée, LIV21 s'exprime aussi bien dans les tissus mammaires que dans les cellules MCF-7, sous la forme d'un doublet migrant à un poids moléculaire apparent de 50 kDa (
Production du sérum purifié anti-LIV21
Les séquences peptidiques spécifiques sont les séquences n°l et n°2
Ces peptides ont été injectés aux lapins (NZ W ESD 75 femelle 2,3kg au jour 0)
En accord avec les procédures d'immunisation standard,
L'effet du TPA dans les cellules MCF-7
II a été décrit dans la littérature que le TPA induit l'arrêt de prolifération et la différenciation des cellules tumorales de la lignée MCF-7Au bout de 3 jours de traitement, les cultures contrôles présentent deux fois plus de cellules que les cultures traitées. Le TPA à la concentration de 25 nM inhibe donc bien la prolifération..
Parallèlement, les cellules traitées au TPA acquièrent rapidement des caractéristiques de cellules différenciées de glande mammaire : hypertrophie, protusions membranaires et tendance à se dissocier les unes des autres. Cependant, dans le laps de temps où les cellules ont été étudiées, le phénotype sécrétoire (apparitions de granules et de canalicules secrétaires) n'a pas été observé. .L'effet du TPA sur la localisation nucléaire de LIV21
L'expression de LIV21 dans des extraits nucléaires a été étudié et effectués après 12h, 24h, 48h, et 72h de traitement par le TPA . Lors de cette cinétique, un maximum d'immunoréactivité anti-LIV21 a été observé dès 12h, qui se maintient jusqu'à 48h et retrouve son intensité initiale après 72h de traitement L'immunoréactivité de LIV21 augmente significativement à 12h, temps où le nombre de cellules en phase S est minimal. Elle perdure jusqu'à la reprise du cycle cellulaire observée à 72h.
Les résultats de l'étude immunocytochimique réalisée à l'aide de l'anticorps anti-LIV21 montrent que la translocation nucléaire de LIV21 est maximale à 12h et la localisation de LIV21 est majoritairement cytoplasmique à 72h, ce qui est en accord avec les observations en western blot. Cependant, il est intéressant de noter que l'expression de LIV21 débute déjà dès Ih de traitement dans certaines cellules, car elles ne sont pas synchrones.
L'ensemble de ces observations montre que la translocation nucléaire de LIV21 est concomitante à la diminution du nombre de cellules en phase S.
Etude de l'influence des PKC sur la translocation nucléaire de LIV21 Effet du TPA sur l'expression de PKCε
étude en Western Blot : étant donné que la séquence protéique de LIV21 possède des sites putatifs de phosphorylation par les PKCs dont deux spécifiques de la PKCε , l'inventeur a testé la variation de l'expression de cette PKC en fonction de la durée de traitement par le TPA. Il a été observé que le TPA agit très rapidement sur l'expression de PKCε, qui diminue dès 30 min . L'expression de la PKCzeta (PKCζ) est utilisée en tant que contrôle interne car elle n'est pas sensible au TPA.
L'effet de l'inhibition sélective de l'activité de la PKCε sur la translocation nucléaire de LIV21 a été étudié par immunocytochimie. Ces expériences ont été réalisées sur des cultures traitées ou non pendant 12h, avec du TPA à 25 nM ou avec le peptide à deux concentrations différentes, 1 et 2 μM (. Le peptide utilisé à la concentration de 2 μM a un effet identique à celui du TPA sur la translocation nucléaire de LIV21.
Ces résultats ont été confortés par des expériences de fractionnement cellulaire sur des cultures traitées par le peptide inhibiteur de PKCε à 2 μM comparées à des cultures traitées par le TPA (. Le même profil d'expression de LIV21 a été observé sous la forme d'un doublet dans le cytoplasme et d'une bande unique dans la fraction nucléaire.
EXEMPLE : Analyse par Western Blot
Cet exemple décrit les conditions utilisées pour une analyse par Western Blot de cellules cancéreuses du sein.
Les extraits protéiques sont chauffés 5 minutes à 80°C dans le tampon Laemmli (pH 7.4, Tris 0,06M, SDS 3%, glycerol 10%, PMSF ImM, β-mercaptoéthanol). La migration est effectuée en SDS-PAGE (Sodium dodécyl sulfate-Poryacrylamide Gel Electrophorèsis). 10 à 20 μg de protéines migrent dans un gel de polyacrylamide 12% pendant Ih dans des conditions dénaturantes (Tampon de migration : Tris base 25mM, glycine 192mM, SDS 1%, pH 8.3). Les protéines sont ensuite transférées sur membrane
de nitrocellulose (Schleicher & Schuell) pendant une heure en transfert liquide, dans un tampon de transfert (Tris 25mM, glycine 192mM, méthanol 20%, pH 8.3). Les membranes, saturées dans du PBS-Tween 0,1% -Triton XlOO 0,1%-lait écrémé 5% pendant une heure sont mises en contact avec l'anticorps primaire dilué dans du PBS- Tween 0,1% -Triton X100 0,1%-lait 1% à température ambiante sous agitation douce pendant une heure à deux heures. Après lavage, l'anticorps secondaire couplé à la péroxydase est incubé Ih avec les membranes. La révélation se fait par une réaction de chimioluminescence grâce au kit ECL selon le protocole du fournisseur (Amersham).
Les anticorps primaires utilisés sont :
Le sérum anti-LIV21 qui a été fabriqué en utilisant des peptides synthétiques basés sur la séquence de LIV21 : PeptideLIV21a (SEQ DD No 1 et le peptide LIV21b (SEQ ID No 2 et/ou peptide LIV21e (SEQ ID N°51). Les peptides ont été couplés à l'hémocyanine avant d'être injectés à des lapins pour l'immunisation. L'anticorps polyclonal a été obtenu à partir de deux de ces peptides en ayant immunisé deux lapins et en ayant saigné un lapin pour avoir un sérum préimmun (afin d'être sûr que cet anticorps n'existait pas déjà chez ce lapin).
L'anticorps polyclonal anti-CDK2 de lapin (Santa-Cruz technology sc-163) dilué au 1/200. L'anticorps monoclonal anti-p21 de Souris ( DAKO, M7202) dilué au 1/150.
L'anticorps monoclonal anti-p27 de souris (Santa-Cruz technology sc-1641) dilué au
1/100.
Rôle antitumoral des corps PML : Au stade de prolifération, il y a dans les corps PML des modifications visualisées car ces corps PML se dissocient et se dégradent :(speekles), des protéines se mettent alors à disposition dans le noyau pour assurer la transcription, la prolifération, les réactions immunitaires et tout ce qui nécessite la transcription de gènes. Il a été démontré que PML s'associe à SUMO et à HDAC-I (histone déacétylase 1) et que son complexe agit sur l'expression d'E2Fl et PML agit ainsi sur l' arrêt de la prolifération en bloquant E2F1. Ainsi le complexe PML/
HDAC-I régule négativement l'expression d'E2Fl. PML associé à Rb (pl30) se fixe aux histones désacétylases et bloque E2F1 en se fixant sur la chromatine.
Dans les leucémies promyélocytaires aiguës, PML est tronquée et devient une protéine de fusion avec le récepteur de l'acide rétinoïque. Cette protéine de fusion
(PMLRARalpha) est due à une translocation chromosomique 15/17. Il a été rapporté dans la littérature un nouveau traitement de cette maladie par association d'arsenic et d'acide rétinoique pour induire les cellules cancéreuses en apoptose. La protéine PML régulerait la prolifération dans les cancers et les lymphomes. L'inventeur a montré par immunoprécipitation l' association SUMO-PML dans lequel est localisé LIV21.
Dans les brevets précédents, il a été montré que LIV21 est phosphorylée par PKCε et que le TPA est un inhibiteur des PKC. Les lignées MCF7 traitées par TPA montrent une inhibition de la prolifération cancéreuse et une différentiation cellulaire et LIV21 est transloquée dans le noyau. Si on a utilisé un peptide inhibiteur spécifique de PKCε, c'est l'activité et non pas l'expression de PKCε qui a été inhibée.
Lors de ce traitement par TPA (25 nM), lorsque l'on a étudié E2F4, pl30 et LIV21
(fluorescence verte) dans les noyaux marqués (ADN) au iodure de propidium (fluorescence rouge) , on a observé :
Au bout de 12h des signaux de fluorescence verte intranucléaire de même pattern pour
E2F4, pl3θ ët LIV21 ;
Au bout de 48 h quand la prolifération commence, E2F4 a une localisation comparable ; mais à 72 h, il disparaît du noyau (au profit d'E2Fl).
En observant la co-localisation par double marquage de PML et de LIV21 à 24 h de traitement par TPA (cf. merge : fluorescence jaune), on a observé qu'ils sont colocalisés dans les noyaux. A 48h, la co-localisation est aussi constatée entre LIV21 et SUMO (cf.
. L'hypothèse est que SUMO, qui se fixe sur LIV21, adresse en fait LIV21 dans les corps PML et que LIV21 est impliqué dans les complexes PML/SUMO/Rb/HDAC-1.
LIV21 est physiquement associé à PML et SUMO dans les corps nucléaires, par immunoprécipitation et par co-localisation en immunocytochimie ((Rb, pi 30 et pi 07 sont des protéines poches (pocket proteins) qui ont le même site de fixation). Les protéines Rb répriment la croissance cellulaire (Fabbro, Regazzi R Bioch
BiophysResComm 1986 Feb 2 ;135 (1) :65-73).
Interaction physique de LIV21 avec les protéines de la famille E2F
Des expériences de co-immunoprécipitations réalisées à l'aide d'anticorps anti-LIV21, anti-E2Fl et anti-E2F4 ont permis de mettre en évidence que LIV21 s'associe à E2F4.
Les membres de la famille E2F sont des facteurs de transcription dont le rôle a largement été décrit dans la littérature comme étant des molécules-clés dans le contrôle positif ou négatif du cycle cellulaire (Slansky JE et Farnham PJ 1996 ; Helin K 1998 et Yamasaki L. 1998), de par leur association avec la protéine pRb (WuCL, Zukerberg LR, Lees JA 1995) ou les protéines poches. E2F1, contrôle positivement le cycle cellulaire en transactivant le promoteur des gènes responsables de la prolifération cellulaire (ADN polymérase alpha, thymidine kinase, DHFR, etc.), tandis qu'E2F4 est décrit comme un des membres de la famille des E2Fs contrôlant négativement le cycle. De plus, il a été montré une forte expression d'E2Fl dans les tissus mammaires embryonnaires (Espanel X, Gillet G 1998), tandis qu'elle n'est plus exprimée dans les tissus mammaires post- mitotiques au profit d'une forte augmentation de l'expression d'E2F4 (Kastner A Brun G 1998).
L'identification d'antigènes a été faites dans des lysats cellulaires par immunoprécipitation. L'analyse de l'interaction physique de différentes protéines associées à E2F4 et E2F1 a été mise en évidence par co-immunoprécipitation de complexes protéiques. L'étude du complexe par μ MACS PROTEIN à MICROBEADS ( MILTENYIBIOTEC). Par ajout de lysats de S Aureus, les protéines A interagissent avec la partie Fc des anticorps spécifiques et les immuns complexes deviennent insolubles, on les récupère donc par centrifugation. Après rupture des liaisons (chauffage) entre AG AC et membranes riches en protéines A, on a réalisé un western
blot. Ces résultats suggèrent que le complexe LIV21/E2F4 semble jouer un rôle important dans l'établissement de la quiescence des cellules. Une étude de co immunoprécipitation est menée aussi avec les profound mammalian kit PIERCE.
Interaction fonctionnelle de LIV21 avec les protéines de la famille E2F.
Il a été mis en évidence que le blocage de l'expression de la protéine LIV21 était corrélé à une diminution de l'expression d'E2F4 et à une augmentation de l'expression d'E2Fl. Parallèlement, l'aspect fonctionnel de l'augmentation d'E2Fl a été vérifié par l'étude de la transcription de deux de ses gènes cibles, la DHFR et la ADN polymérase α.
En conclusion, ces résultats suggèrent que le complexe LIV21/E2F4 agit comme un complexe inhibiteur de l'expression du gène E2F1. Ce complexe pourrait correspondre à un nouveau point de contrôle dans l'arrêt de prolifération cellulaire.
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