Die vorliegende Erfindung betrifft Phenalenon-Derivate, Verfahren zu deren Herstellung, und deren Verwendung als Arzneimittel.

Krebs ist eine zumeist tödlich verlaufende Erkrankung von Mensch und Tier, die durch das unkontrollierte Wachsen von körpereigenen Zellen verursacht wird. Krebs ist die Bezeichnung für die Bildung von bösartigen Geschwülsten (Malignome), von Neoplasmen (Tumoren bzw. Carcinoma) oder für die maligne Entartung sowie Reifungsstörung weißer Blutzellen (Leukämie, Blutkrebs). Krebs-oder Tumorzellen entstehen durch Umwandlung körpereigener Zellen. Die Bösartigkeit der Krebszelle drückt sich in der Autonomie des Wachstums aus, das heißt in ihrer Fähigkeit, ungehemmt und ohne Einordnung in den Bauplan der Organe und unter Gewebszerstörung infiltrierend zu wachsen. Ein sicheres Zeichen der Malignität ist die Bildung tumorferner Absiedlungen (Metastasen) nach hämatogener oder lymphogener Ausbreitung von Tumorzellen. Krebs gehört zu den häufigsten Todes-ursachen des Menschen und deshalb besteht ein großer Bedarf an Methoden und Mitteln zur Heilung oder Behandlung von malignen Entartungen.

Die Möglichkeit einer Therapie maligner Tumoren umfaßt neben der-wenn möglich radikalen-operativen Entfernung des Tumors, die radiologische Therapie mit Röntgenstrahlen, a-, ß-, y-Strahlen, die Immuntherapie und die Chemotherapie. Die Immuntherapie ist derzeit nur in eingeschränktem Maß anwendbar. Unter der Chemotherapie von Tumoren versteht man die Gabe von Zellgiften (Cytostatika) zur Behandlung von Tumoren und von verbliebenen Tumorzellen nach lokaler chirurgischer Behandlung oder Bestrahlung. Diese Stoffe greifen spezifisch in bestimmte Vorgänge der Zellteilung ein, so daß Gewebe mit hohem Anteil an sich teilenden Zellen, wie das rasch wachsende Tumorgewebe, empfindlicher reagieren.

Zum Einsatz kommen alkylierende Verbindungen, wie z. B. das Cyclophosphamid (The Merck Index, 12. Ed. Seite 463), Antimetabolite, wie das Methotrexat (The Merck

Index, 12. Ed. Seite 1025), Alkaloid, wie das Vincristin (The Merck Index, 12. Ed.

Seite 1704) und Antibiotika, wie das Daunomycin (The Merck Index, 12. Ed. Seite 479) sowie das Adriamycin (The Merck Index, 12. Ed. Seite 581-582). All diese Agenzien haben aber aufgrund von massiven Nebenwirkungen große Nachteile, so daß der Tod der Erkrankten nur hinausgezögert, nicht jedoch abgewendet wird. Zudem treten bei entarteten (Krebs-) Zellen Resistenzen gegen die angewandten Mittel auf, die derzeitigen Medikamente wirken dann nicht mehr cytostatisch, wohl aber toxisch infolge der Nebenwirkungen. Zudem hat sich gezeigt, daß eine kombinierte bzw. sequentielle Anwendung von Cytostatika die Wirksamkeit eines einzelnen Cytostatikums (Monotherapie) übertrifft und dadurch möglich ist, daß sich die erheblichen Nebeneffekte bei der Polychemotherapie nicht addieren. Aus all diesen Gründen werden neue Chemotherapeutika dringend benötigt und deshalb weltweit gesucht.

Es sind bereits Naturstoffe mit Phenalenon-Grundstruktur beschrieben worden.

Phenalen ist ein kondensiertes, nicht vollständig aromatisches Ringsystem, welches sich an der Luft zersetzt. Phenalenon ist dessen Oxidationsprodukt mit einer Carbonyl- Gruppe in 1-Position.

Die Patentanmeldung WO 99/60992 beschreibt generisch Phenalenone, die in allen Positionen außer C1 mit Wasserstoff oder C1-C4-Alkyl, bevorzugt Methyl, oder Ci-C4- Alkoxy, vorzugsweise Methoxy substituiert sein können, zur Verwendung als Haarfärbemittel.

Die japanische Patentanmeldung JP 60199849 beschreibt das Phenalenon-Derivat 2,7, 8, 9-Tetrahydroxy-4-methoxy-5-methyl-phenalen-1-on, das als PDE-Inhibitor wirksam ist und zur Behandlung von Arteriosklerose, Bronchialasthma, Diabetes und Krebserkrankungen verwendet werden kann.

D. A. Frost & G. A. Morrison ; J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1,20, 2388-2396,1973 beschreiben die Isolierung von Norxanthoherquein (2,3, 4,7, 8, 9-Hexahydroxy-5-methyl- phenalen-1-on) aus Penicillium herquei Bainer & Sartory.

D. H. R. Barton et al. (Tetrahedron, 6,48, 1959) beschreiben die Isolierung von Atrovenetin aus Penicillium atrovenetum sowie aus Penicillium herquei Bainer & Sartory. Atroventin wird in Y. Ishikawa et al. (J. Am. Oil Chem. Soc. 68,666-668, 1991) als Antioxidant, und in WO 00/45165 als anti-neoplastisch wirksames Cytostatikum beschrieben.

N. Narasimhachi et al. (J. Antibiotics, 25,155, 1972) und J. Simpson (Chem. Soc.

Perkin Trans. 1,1979, 1233-1238) beschreiben tautomeren Formen der Verbindung Desoxyherqueinon (2-0-Methyl-Atrovenetin), die aus Penicillium herquei isolierbar sind und antibiotische Wirksamkeit gegen Gram-positive Organismen zeigen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, alternative Phenalenon-Derivate bereitzustellen, die in der Tumortherapie verwendet werden können.

Die Erfindung betrifft eine Verbindung der Formel (I-A) oder eine Verbindung der Formel (I-B) wobei X entweder eine Gruppe der Formel (I-C)

oder der Formel (I-D) bedeutet, und R1 und falls vorhanden R2 gleichzeitig 1.0 H, oder 2.0 C1-C5-Alkyl C2-C6-Alkenyl oder C2-C6-Alkinyl bedeuten, worin Alkyl, Alkenyl und Alkinyl gerade oder verzweigt sind und gegebenenfalls ein-oder zweifach substituiert sind durch : 2.1-OH, 2.2 =O, 2. 3 -O-C1-C6-Alkyl, worin Alkyl gerade oder verzweigt ist, 2. 4-O-C2-C6-Alkenyl, worin Alkenyl gerade oder verzweigt ist, 2.5-Aryl, 2. 6 -NH-C1-C6-Alkyl, worin Alkyl gerade oder verzweigt ist, 2. 7-NH-C2-C6-Alkenyl, worin Alkenyl gerade oder verzweigt ist, 2. 8 -NH2 oder 2.9 Halogen, worin die Substituenten 2.1 bis 2.9 auch noch weiter substituiert sein können durch- CN, -Amid oder-Oxim-Funktionen, und/oder eine stereoisomere Form der Verbindung der Formel (I-A) oder der Formel (l- B) und/oder Gemische diese Form in jedem Verhältnis, und/oder ein physiologisch verträgliche Salz der Verbindung der Formel (I-A)_ oder (I-B).

Vorzugsweise sind RI und R2 H oder Ci-C6-Alkyl.

Chiralitätszentren können, wenn nicht anders angegeben, in der R-oder in der S- Konfiguration vorliegen. Die Erfindung betrifft sowohl die optisch reinen Verbindungen als auch Stereoisomerengemische, wie Enantiomerengemische und Diasteromerengemische, in jedem Verhältnis.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen unterscheiden sich von literaturbekannten Substanzen durch die Polarität, die chemische Struktur, die biologische Wirksamkeit oder durch weitere physikalischen Eigenschaften.

Der Stamm Penicillium herquei Bainer & Sartory, DSM 14142, bildet auf Glukose-, Stärke-, Haferflocken-oder Glycerinhaltigen Nährlösungen die Penilenon genannten Verbindungen der Formeln (II-A) und (II-B), die nachfolgend zusammenfassend als Verbindungen der Formel (II) bezeichnet werden, sowie Atrovenetin der Formeln (III-A) und (III-B), die nachfolgend zusammenfassend als Verbindungen der Formel (III) bezeichnet werden,

Verbindungen der Formeln (I-A) und (I-B), für die R1 ungleich H ist, sind isomere Formen, die getrennt voneinander isolierbar sind, und die ineinander überführt werden können, beispielsweise indem der Rest R1 abgespa) ten wird, wonach R1 gleich H ist, und anschliessend ausgehend vom jeweils anderen Tautomer zum anderen Isomer der Verbindung der Formel (I-A) oder (I-B) mit R1 ungleich H derivatisiert wird.

Nachfolgend werden die Verbindungen der Formeln (I-A) und (I-B) zusammenfassend als Verbindung der Formel (I) bezeichnet.

Die Verbindungen der Formeln (II-A) und (II-B) sind Tautomere und können unter üblichen Bedingungen (z. B. Raumtemperatur) nicht getrennt voneinander isoliert werden. Verbindungen der Formeln (II-A) und (II-B) werden nachfolgend zusammenfassend als Verbindung der Formel (II) bezeichnet.

Die Verbindungen der Formeln (III-A) und (III-B) sind ebenfalls Tautomere und können unter üblichen Bedingungen (z. B. Raumtemperatur) nicht getrennt voneinander isoliert werden. Verbindungen der Formeln (III-A) und (III-B) werden nachfolgend zusammenfassend als Verbindung der Formel (III) bezeichnet.

Verbindungen der Formeln (I-A) und (I-B), für die R1 gleich H ist, können gemäß der vorliegenden Erfindung selektiv derivatisiert werden, indem die Hydroxygruppen mit alkylierenden Agentien in an sich bekannter Weise zur Reaktion gebracht werden, wie sie beispielsweise von Jerry Märch im Buch Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, 4th Edition, 1992, beschrieben. Alkylierende Agentien sind beispielsweise Diazomethan-Derivate, vorzugsweise Trimethylsilyldiazomethan. Um Umsetzungen

selektiv durchzuführen, kann es vorteilhaft sein vor der Reaktion geeignete, in an sich bekannter Weise, Schutzgruppen einzuführen. Die Schutzgruppen werden nach der Reaktion abgespalten und anschließend wird das Reaktionsprodukt gereinigt.

Bisher wurde keine selektive Alkylierung von Phenalenonen zu den erfindungs- gemäßen Verbindungen beschrieben. Beispielsweise führt die Reaktion von Desoxyherqueinon mit Diazomethan laut Suga et al. (Bull. Chem Soc. Jpn., 56,3661- 3666,1983) zum Desoxyherqueinon-dimethylether bzw. zur isomeren Verbindung ent- Atrovenetin-trimethylether.

Verbindungen der Formeln (I-A) und (I-B), für die R1 gleich H ist, können beispielsweise durch Etherspaltung von Verbindungen der Formeln (I-A) und (I-B), für die R'ungleich H ist, hergestellt werden. Etherspaltungen können nach ansich bekannten Methoden durchgeführt werden, wie beispielsweise von Jerry March im Buch Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, 4th Edition, 1992, beschrieben.

Die Erfindung betrifft daher ferner ein Verbindung der Formel (I), dadurch gekennzeichnet, daß. sie die Formel (II) hat, oder ein pharmakologisch verträgliches Salz der Verbindung der Formel (II).

Die Erfindung betrifft daher weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (II), dadurch gekennzeichnet, daß 1. der Mikroorganismus Penicillium herquei Bainer & Sartory, DSM 14142, bzw. einer ihrer Varianten oder Mutanten in einem wäßrigen Nährmedium kultiviert wird, 2. eine Verbindung der Formel (II) isoliert und gereinigt wird, und 3. die Verbindung der Formel (II) gegebenenfalls in ein pharmakologisch verträgliches Salz überführt wird.

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I), dadurch gekennzeichnet, daß 1. der Mikroorganismus Penicillium herquei Bainer & Sartory, DSM 14142, bzw. einer ihrer Varianten oder Mutanten in einem wäßrigen Nährmedium kultiviert wird,

2. a) eine Verbindung der Formel (II) isoliert und gereinigt wird, oder b) die Verbindung der Formel (III) isoliert und gereinigt wird, 3. a) die Verbindung der Formel (II) zu einer Verbindung der Formel (I) derivatisiert wird, oder b) die Verbindung der Formel (III) zu einer Verbindung der Formel (I) derivatisiert wird, und 4. die Verbindung der Formel (I) gegebenenfalls in ein pharmakologisch verträgliches Salz überführt wird.

Der Stamm Penicillium herquei Bainer & Sartory, DSM 14142, bildet auf Glukose-, Stärke-Haferflocken-oder Glycerinhaltigen Nährlösungen das Penilenon sowie die Nebenprodukte.

Ein Isolat von Penicillium herquei Bainer & Sartory wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1B, 38124 Braunschweig, Deutschland nach den Regeln des Budapester Vertrages am 6. März, 2001 unter der folgenden Nummer hinterlegt : DSM 14142.

Der Pilz Penicillium herquei Bainer & Sartory, DSM 14142 besitzt ein grau bis leuchtend grünes Substratmycel und ganz wenig Luftmycel. Exudate werden auf Malz- Medium nicht gebildet und Farben werden nicht ins Medium ausgeschieden. Der Stamm bildet in Kultur die für Penicillium charakteristischen kompakten Sporangien, 200-400 x 3.5-4. 0 um, die rauh sind auf der Oberfläche. Die."Metulae"sind relativ kurz, meist 4-6 10-12 x 3.0-5. 0 um und keulenförmig. Die Phialiden sind in 6-10"verticilli" angeordnet, 7-10 x 3. 0 um, ampullenförmig. Die Konidien sind elliptisch bis"apiculate", 3.5-5. 0 x 3.0-3. 5 um, mit einer glatten Zellwand. Die Konidien werden in parallelen Ketten, bis 100 um lang, gebildet.

Das besagte Verfahren umfasst die Kultivierung von Penicillium herquei Bainer & Sartory, DSM 14142, seiner Mutanten und/oder Varianten unter aeroben Bedingungen in einem mindestens jeweils eine Kohlenstoff-und Stickstoffquelle, anorganischen Salze und gegebenenfalls Spurenelemente enthaltenden Kulturmedien.

Vorzugsweise wird die Kultivierung bei einer Temperatur zwischen 20° und 35°C und bei einem pH zwischen 2 und 9 durchgeführt.

Anstelle des Stammes DSM 14142 können auch deren Mutanten und Varianten eingesetzt werden, soweit sie die erfindungsgemäßen Verbindungen herstellen.

Solche Mutanten können in an sich bekannter Weise durch physikalische Mittel, beispielsweise Bestrahlung, wie mit Ultraviolett-oder Röntgenstrahlen, oder chemische Mutagene, wie beispielsweise Ethylmethansulfonat (EMS) ; 2-Hydroxy-4- methoxy-benzophenon (MOB) oder N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) erzeugt werden.

Als bevorzugte Kohlenstoffquellen für die Fermentation eignen sich assimilierbare Kohlenhydrate und Zuckeralkohole, wie Glukose, Laktose, Saccharose oder D-Mannit sowie kohlenhydrathaltige Naturprodukte, wie z. B. Malzextrakt oder Hefextrakt. Als stickstoffhaltige Nährstoffe kommen in Betracht : Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Casein, Peptone oder Tryptone, ferner Fleischextrakte, Hefeextrakte, gemahlene Samen, beispielsweise von Mais, Weizen, Bohnen, Soja, Reis oder der Baumwollpflanze, Destillations-rückstände der Alkoholherstellung, Fleischmehle oder Hefeextrakte, aber auch Ammoniumsalze und Nitrate, insbesondere aber auch synthetisch bzw. biosynthetisch gewonnene Peptide.

Als anorganische Salze kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate oder Phosphate der Alkali-oder Erdalkalimetalle, Eisen, Zink, Kobalt und Mangan enthalten.

Die Bildung der erfindungsgemäßen Verbindungen verläuft besonders gut z. B. in einer Nährlösung, die etwa 0,05 bis 5 %, bevorzugt 1 bis 2 % Malzextrakt ; und 0,05 bis 3 %, bevorzugt 0.05 bis 1 % Hefeextrakt ; 0,2 bis 5 %, bevorzugt 0,5 bis 2 % Glucose ; und 0,5 bis 3 %, bevorzugt 1.5% bis 3 % Haferflocken enthält. Die Angaben in Prozent sind jeweils bezogen auf das Gewicht der gesamten Nährlösung.

In dieser Nährlösung bildet Penicillium herquei Bainer & Sartory, DSM 14142, ein Gemisch der erfindungsgemäßen Verbindungen. Je nach Zusammensetzung der

Nährlösung kann der mengenmäßige Anteil eines oder mehrerer der erfindungs- gemäßen Verbindungen variieren. Außerdem kann durch die Medienzusammen- setzung die Synthese einzelner Verbindungen gesteuert werden, so daß ein Verbindung gar nicht bzw. in einer Menge unterhalb der Nachweisgrenze vom Mikroorganismus hergestellt wird.

Die Kultivierung des Mikroorganismus erfolgt aerob, also beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren in Schüttelkolben oder Fermentern oder auf Festmedium, gegebenenfalls unter Einführen von Luft oder Sauerstoff. Sie kann in einem Temperaturbereich von etwa 15 bis 30°C, vorzugsweise bei etwa 20 bis 30°C, insbesonders bei 25 bis 30°C durchgeführt werden. Der pH-Bereich sollte zwischen 4 und 10 liegen, vorzugsweise zwischen 6.5 und 7.5. Man kultiviert den Mikroorganismus unter diesen Bedingungen im allgemeinen über einen Zeitraum von 48 bis 720 Stunden, vorzugsweise 72 bis 350 Stunden. Vorteilhaft kultiviert man in mehreren Stufen, d. h. man stellt zunächst eine oder mehrere Vorkulturen in einem flüssigen Nährmedium her, die dann in das eigentliche Produktions-medium, die Hauptkultur, beispielsweise im Volumenverhältnis 1 : 10-1 : 100, überimpft werden. Die Vorkultur erhält man z. B., indem man das Mycel in eine Nährlösung überimpft und etwa 20 bis 120 Stunden, bevorzugt 48 bis 72 Stunden, wachsen läßt. Das Mycel kann beispielsweise erhalten werden, indem man den Stamm etwa 1 bis 42 Tage, bevorzugt 21 bis 35 Tage, auf einem festen oder flüssigen Nährboden, beispielsweise Hefe-Malz-, Agar, Haferflocken-Agar oder Kartoffeldextrose-Agar, wachsen läßt.

Der Fermentationsverlauf und das Screening nach Mutanten und Varianten, die die erfindungsgemäßen Verbindungen produzieren, kann entsprechend dem Fachmann bekannten Methoden, wie z. B. durch Austestung der biologischen Aktivität in Bioassays oder durch chromatographische Methoden wie Dünnschicht- chromatographie (DC) oder Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie (HPLC) verfolgt werden.

Der Pilz Penicillium herquei Bainer & Sartory, DSM 14142, kann die erfindungsgemäßen Verbindungen durch eine Oberflächen-oder Standkultur auf

festen Nährböden bilden. Feste Nährböden werden durch Zugabe zum Beispiel von Agar oder Gelatine zu wäßrigen Nährmedien hergestellt. Darüber hinaus ist es möglich, die erfindungsgemäßen Verbindungen durch Fermentation des Pilzes Penicillium herquei Bainer & Sartory, DSM 14142, im Submersverfahren, d. h. in wäßriger Aufschlämmung zu gewinnen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können sowohl im Mycel als auch im Kulturfiltrat vorkommen, gewöhnlich befindet sich die Hauptmenge in der Zellmasse. Es ist deshalb zweckmäßig, die Fermentationslösung durch Filtration oder Zentrifugation zu trennen. Das Filtrat wird mit einem Adsorptionsharz als feste Phase extrahiert. Das Mycel, aber auch die Oberflächenkultur wird zweckmäßiger. Weise mit einem organischen Lösungsmittel, beispielsweise Methanol oder Propanol-2 extrahiert.

Die Extraktionen können in einem weiten pH-Bereich durchgeführt werden, es ist jedoch zweckmäßig, im neutralen oder schwach sauren Milieu, vorzugsweise zwischen pH 3 und pH 7 zu arbeiten. Die Extrakte können z. B. im Vakuum konzentriert und getrocknet werden.

Die Verbindungen der Formel (II) und der Formel (III) sind Substanzen, die unbeständig sind, wenn nicht besondere Maßnahmen während des Isolierungs-und Reinigungsprozesses ergriffen werden. Es wurde gefunden, daß die Penilenone in sehr guten Ausbeuten aus den Kulturen des Stammes DSM 14142 gewonnen werden können, wenn 1) während des Isolierungs-und Reinigungsprozesses unter reduzierenden Bedingungen gearbeitet wird, z. B. stets in Gegenwart von Ascorbinsäure, 2) die Isolierung in saurem Milieu bei einem pH-Wert kleiner als 7, vorzugsweise im pH-Bereich von 2 bis 5, erfolgt, 3) während des Reinigungsschrittes nur milde Agentien verwendet werden, wie zum Beispiel Adsortionsharze als chromatographische Träger, und 4) die Gegenwart von Aminen während des gesamten Verfahrens ausgeschlossen wird.

Eine geeignete Methode der Isolierung der erfindungsgemäßen Verbindungen ist die Lösungsmittelverteilung in an sich bekannter Weise. Eine andere Methode der Reinigung ist die Chromatographie an Adsorptionsharzen wie z. B. an Diaion0 HP-20

(Mitsubishi Casei Corp., Tokyo), an Amberlite@ XAD 7 (Rohm and Haas, USA), an Amberchrom0 CG, (Toso Haas, Philadelphia, USA) oder an ähnlichen. Geeignet sind darüber hinaus unter den angegebenen Umständen zahlreiche Reverse-, Phase Träger, z. B. RP8 und RP18, wie sie z. B. im Rahmen der Hochdruckflüssigkeits- Chromatographie (HPLC) allgemein bekannt geworden sind. Eine weitere Reinigungsmöglichkeit besteht unter den angegebenen Umständen in der Verwendung von sog. Normal-Phasen-Chromatographie-Trägern, wie z. B. Kieselgel oder Al203 oder anderen in an sich bekannter Weise. Ein alternatives Isolierungsverfahren ist die Verwendung von Molekularsieben, wie z. B. Fractogel0 TSK HW-40, Sephadex@ G-25 und andere, in an sich bekannter Weise.

Es ist darüber hinaus möglich, die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) nach Anreicherung durch Kristallisation zu gewinnen, wobei beispielsweise organische Lösungsmittel und ihre Gemische, wasserfrei oder mit Wasserzusatz benutzt werden können.

Ein zusätzliches Verfahren zur Isolierung und Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen besteht in der Verwendung von Anionenaustauschern, vorzugsweise im pH-Bereich von 4 bis 7 ; und Kationenaustauschern, vorzugsweise im pH-Bereich von 2 bis 5. Besonders geeignet ist hierfür die Verwendung von Pufferlösungen, denen man Anteile von organischen Lösungsmitteln hinzugefügt hat.

Es ist aber auch möglich, die erfindungsgemäßen Verbindungen durch Sublimieren zu isolieren und/oder zu reinigen.

Eine besonders vorteilhafte Reinigungsmethode zur Isolierung der erfindungsge- mäßen Verbindungen ist die Kristallisation, die in an sich bekannter Weise durchgeführt wird.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) können nach dem Fachmann bekannten Methoden in die entsprechenden pharmakologisch verträglichen Salze übergeführt werden. Unter pharmakologisch verträglichen Salzen der erfindungs-

gemäßen Verbindungen versteht man sowohl anorganische als auch organische Salze, wie sie in Remingtons Pharmaceutical Sciences (17. Auflage, Seite 1418 [1985]) beschrieben sind. Als Salze kommen insbesondere Alkali-, Ammonium-, Erdalkalisalze, Salze mit physiologisch verträglichen Aminen und Salze mit anorganischen oder organischen Säuren wie z. B. HCI, HBr, H2S04, Maleinsäure, Fumarsäure in Frage. Es kommen aber auch Komplexe mit Metall-lonen, wie zum Beispiel mit Calcium, Magnesium, Zink, Eisen oder anderen in Frage. Die Verbindungen der Formel (I) haben eine ausgeprägte Neigung, lonen, vorzugsweise Kationen, komplex zu binden.

Es wurde überraschend gefunden, daß die erfindungsgemäße Verbindungen der Formel (I) starke cytostatische Wirkungen aufweisen, sie eignet sich daher zur Therapie und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, die durch unkontrolliertes Wachstum von Gewebe oder Zellen verursacht werden, oder Tumorerkrankungen. Es ist besonders bemerkenswert, daß die erfindungsgemäße Verbindungen keinerlei Kreutzresistenz mit herkömmlichen Cytostatika aufweisen.

Es ist gefunden worden, daß die Verbindungen der Formel (I) Protein-Kinasen hemmen. Die Kinasen gehören zu den Transferasen, die Phosphat-Reste von Adenosin-triphophat auf andere Substrate übertragen. Proteine und Enzyme werden durch die Proteinkinasen meist an Serin-, Threonin-oder Tyrosin-Seitenketten phosphoryliert und in ihrer Aktivität modifiziert, was als verbreitetes Regulations-prinzip im Stoffwechsel und der Signaltransduktion erkannt worden ist. Im Fall der Krebserkrankungen vermehrt sich das kranke Gewebe unkontrolliert ; ein Eingriff in die Regulation der Kinasegesteuerten Proliferation ist daher wünschenswert. In der Kaskade der Zellvermehrung sind eine Anzahl von Kinasen beteiligt. Mehrere dieser Kinasen werden durch die erfindungsgemäßen Verbindungen gehemmt.

Hervorzuheben ist darüber hinaus eine antimikrobielle Hemmwirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) auf Bakterien, wie beispielsweise Staphylococcus aureus, Streptomyces murinus und gegen Pilze, wie Aspergillus niger, die hartnäckige, lebensbedrohende Infektionskrankheiten verursachen können. Die

antimikrobielle Wirksamkeit kann zum Beispiel durch sogenannte Agar-diffusionsteste nachgewiesen werden. So bewirkt Penilenon auf einer Agarplatte mit Streptomyces murinus-Kultur in einer Lösung von 1 mg pro mL einen Hemmhof von 11 mm und in einer Lösung von 0.1 mg pro mL einen Hemmhof von 8 mm. Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) eignen sich daher ebenfalls zur Therapie und/oder Prophylaxe von bakteriellen Infektionen und/oder Pilzerkrankungen.

Die Verbindungen der Formel (I) können auch als Antioxidantien benutzt werden.

Antioxidantien (Oxidationsinhibitoren) sind organische Verbindungen, die unerwünschte, durch Sauerstoff-Einwirkungen bedingte Veränderungen in den zu schützenden Stoffen hemmen oder verhindern. Antioxidantien werden zum Beispiel benötigt in Kunststoffen zum Schutz gegen Alterung, in Fetten zum Schutz gegen Ranzigkeit, in Ölen gegen Verharzung, in Aromastoffen gegen Geruchsver- schlechterung, in Lebensmitteln, und in Arzneimitteln. Die Wirkung der Antioxidantien besteht meist darin, daß sie als Radikalfänger für die bei der Oxidation auftretenden freien Radikale wirken. Die antioxidative Wirkung von Atrovenetin (Verbindung der Formel (III)) wurde bereits beschrieben von Y. Ishikawa et al. J. Am. Oil Chem. Soc.

68,666-668, 1991. Mikrobielle Antioxantien sind aber in ihrer Wirkung häufig zu schwach oder nicht gut verträglich. Es besteht daher ein großer Bedarf an neuen, wirksamen und verträglichen Antioxidantien. Die Verbindungen der Formel (I) sind hoch aktive Antioxidantien, die das Atrovenetin in seiner Wirkung erheblich übertreffen : Während das Atrovenetin in Lösung und in fester Form mit Luftsauerstoff nur langsam reagiert (zum Beispiel in Stunden), verbindet sich beispielsweise das Penilenon der Formel (II) mit Sauerstoff innerhalb von Sekunden oder in wenigen Minuten. Diese erhöhte Affinität des Penilenons zu Sauerstoff ist aber für sehr oxidationsempfindliche Stoffe von entscheidendem Vorteil.

Eine andere chemische Eigenart der erfindungsgemäßen Verbindungen ist die Fähigkeit zur Komplexbildung mit mehrwertigen, vorzugsweise 2-und 3-wertigen Kationen, wie zum Beispiel mit Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe3+. Die Komplexbildungs-Fähigkeit kann für die Herstellung von Arzneimitteln von Vorteil sein, so sind zum Beispiel Inhibitoren der Matrix-Metallo-Proteasen (MMP's) bekannt geworden, die in der Lage

sind, das Zink dieser Enzyme zu binden. Es sind aber auch andere Einsatzmöglichkeiten bei Erkrankungen denkbar, deren Ausprägung sich in einer abnormalen Metallionen-Konzentration im Organismus manifestieren. Auch ist es möglich, die Komplexbildungsfähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen außerhalb der Medizin nutzbar zu machen, beispielsweise in der Wassertechnik, in Körperpflegemitteln, und in der Polymerisationstechnik (Ullmans Enzyklopädie der Technischen Chemie, 5. Auflage, A 10,95-100, 1985-1995).

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) können ebenfalls in der Behandlung von rheumatischen Erkrankungen, beispielsweise rheumatischer Arthritis wirken. Das Wirkprinzip der Verminderung von oxidativem Stress in rheumatischer Arthritis durch Radikalfänger oder Antioxidanzien wurde beispielsweise beschrieben von Ostrakhovitch und Afanas (Biochemical Pharmacology, 2001,743-746).

Die vorliegende Erfindung betrifft demzufolge auch die Verwendung der erfindungs- gemäßen Verbindungen der Formel (I) als Arzneimittel, inbesondere zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Tumorerkrankungen, bakteriellen Infektionen, Mycosen, rheumatischen Erkrankungen und von Erkrankungen, die sich durch die Hemmung von Matrix-Metallo-Proteasen behandeln lassen.

Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel mit einem Gehalt an mindestens einer der erfindungsgemäßen Verbindungen.

Das besagte Arzneimittel wird durch Mischung von mindestens einer Verbindung der Formel (I) mit einem oder mehreren physiologisch annehmbaren Hilfsstoffen hergestellt und in eine geeignete Darreichungsform gebracht.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können enteral (oral), parenteral (intramuskulär oder intravenös), rektal oder lokal (topisch) angewendet werden. Sie können in Form von Lösungen, Pulvern (Tabletten, Kapseln einschließlich Mikrokapseln), Salben (Cremes oder Gel), oder Suppositorien verabreicht werden. Als physiologisch annehmbare Hilfsstoffe für derartige Formulierungen kommen die pharmazeutisch

üblichen flüssigen oder festen Füllstoffe und Streckmittel, Lösemittel, Emulgatoren, Gleitstoffe, Geschmackskorrigentien, Farbstoffe und/oder Puffersubstanzen in Frage.

Als zweckmäßige Dosierung werden 0.1-1000, vorzugsweise 0.2-100 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Sie werden zweckmäßig in Dosierungseinheiten verabreicht, die mindestens die wirksame Tagesmenge der erfindungsgemäßen Verbindungen, z. B. 30-3000, vorzugsweise 50-1000 mg enthalten.

Die folgenden Beispiele sollen der näheren Erläuterung der Erfindung dienen, ohne die Breite der Erfindung in irgendeiner Weise begrenzen zu wollen.

Beispiel 1 Herstellung einer Glycerinkultur von Penicillium herquei Bainer & Sartory, DSM 14142 30 mi Nährlösung (Malzextrakt 2,0%, Hefeextrakt 0,2 %, Glucose 1,0 % (NH4) 2 HPO4 0,05 %, pH 6,0) in einem sterilen 100 ml Erlenmeyerkolben werden mit dem Stamm Penicillium herquei Bainer & Sartory, DSM 14142, beimpft und 6 Tage bei 25° C und 140 UpM auf einer rotierenden Schüttelmaschine inkubiert. 1, 5 mi dieser Kultur werden anschließend mit 2,5 ml 80 % igem Glycerin verdünnt und bei-135°C gelagert.

Beispiel 2 Herstellung einer Vorkultur im Erlenmeyerkolben von Penicillium herquei Bainer & Sartory, DSM 14142 100 ml Nährlösung (Malzextrakt 2,0%, Hefeextract 0,2 %, Glucose 1,0 % (NH4) 2 HP04 0,05 %, pH 6,0) in einem sterilen 300 ml Erlenmeyerkolben werden mit dem Stamm Penicillium herquei Bainer & Sartory, DSM 14142, beimpft und 4 Tage bei 25° C und 140 UpM auf einer rotierenden Schüttelmaschine inkubiert. 2 mi dieser Vorkultur werden anschließend für die Herstellung der Hauptkulturen beimpft.

Beispiel 3 Herstellung einer Hauptkulturultur von Penicillium herquei Bainer & Sartory, DSM 14142.

Ein steriler 300 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml der folgende Nährlösung Malzextrakt 2,0 %, Hefeextrakt 0,2 %, Glucose 1,0 % (NH4) 2 HP04 0,05 %, pH 6 wird mit einer auf einem Schrägröhrchen (gleiche Nährlösung, jedoch mit 2 % Agar) gewachsenen Kultur oder mit 2 ml einer Vorkultur (s. Beispiel 2) beimpft und auf einer Schüttelmaschine bei 140 UpM und 25° C inkubiert. Die maximale Produktion einer oder mehrerer Verbindungen der erfindungsgemäßen Penilenons ist nach ca. 144 Stunden erreicht.

Zum Animpfen von 10 bis 200 I Fermentern genügt eine 96 bis 144 Std. alte Submerskultur (Animpfmenge ca. 10 %) aus der gleichen Nährlösung. Die Bedingungen für diese Fermenter sind : Temperatur 25° C Rührergeschwindigkeit : 200 UpM Belüftung 15t Min' Durch wiederholte Zugabe von ethanolischer Polyollösung kann die Schaumbildung unterdrückt werden. Das Produktionsmaximum wird nach ca. 96 bis 144 Stunden erreicht.

Beispiel 4 : Isolierung der Verbindungen (II) und (III) 5 Liter Kulturlösung, gewonnen nach Beispiel 3, wurden zentrifugiert und die Zellmasse (0.5 Liter) mit 2 Liter Methanol, dem 0. 1% Ascorbinsäure hinzugefügt worden ist, extrahiert. Die klare filtrierte methanolische Phase wurde im Vakuum auf 1 L eingeengt und auf eine 1 Liter fassende, mit Adsorptionsharz MCI Get@ CHP20P gefüllte Säule aufgetragen. Säulenmaße : Breite x Höhe : 7 cm x 27 cm. Eluiert wurde mit einem Lösungsmittel-Gradienten von 10 % Propanol-2 bis 90 % Propanol-2 in 0. 1% wässriger Ascorbinsäure-Lösung. Der Säulenausfluß (140 mL/Minute) ist in Fraktionen je 250 mL aufgefangen worden. Die Penilenon-haltigen Fraktionen 23 bis 26 (Gemisch der Verbindungen der Formeln (II-A) und (II-B), zusammenfassend Verbindungen der Formeln (II) genannt) und die Atrovenetin beinhaltenten Fraktionen 43 bis 51 (Gemisch der Verbindungen der Formeln (III-A) und (III-B), zusammenfassend Verbindungen der Formeln (III) genannt), die durch HPLC- Analysen überprüft wurden, sind gesammelt und im Vakuum konzentriert worden. Die zusammengefassten Fraktionen wurden jeweils im Vakuum eingeengt und kalt

gelagert. Aus den Fraktionen 23 bis 26 kristallisierte das Penilenon (260 mg Verbindung der Formel (II)), die Fraktionen 43 bis 51 ergaben 1.2 g Atrovenetin (Verbindung der Formel (III)). Unter Argon-Schutzgasatmosphäre wurden die Kristallisate abfiltriert und unter Sauerstoff-Ausschluß in der Kälte gelagert.

Beispiel 5 : Isolierung bzw. Reinigung durch HPLC.

Säule : SuperspherlOORP-18e, 250-4, mit Vorsäule, Mobile Phase : 2 Minuten : 5 % Acetonitril in 0. 1% Phosphorsäure, 18 Minuten : Gradient von 5% bis 100% Acetonitril in 0. 1% Phosphorsäure, anschließend 100% Acetonitril gleichbleibend.

Flußgeschwindigkeit : 1 mL pro Minute, Detektion durch UV-Absorption bei 210 nm.

Es werden für die Verbindung der Formel (II) die Retentionszeit von 13.5 Minuten, und für die Verbindung der Formel (III) 20.5 Minuten gefunden.

Beispiel 6 : Charakterisierung der Verbindung der Formel (II).

Die physikalisch-chemischen sowie spektroskopischen Eigenschaften von Penilenon lassen sich wie folgt zusammenfassen : Aussehen : Gelbe, in mittelpolaren und polaren organischen Lösungsmitteln lösliche, in Wasser wenig lösliche kristalline Substanz. Der Schmelzpunkt ist wegen der Zersetzung nicht bestimmbar. Stabil in mild saurem Milieu unter reduzierenden Bedingungen. Unter Einfluß von Sauerstoff, in neutralem Milieu oder in Gegenwart von Aminen verfärbt sich Penilenon grün.

Summenformel : C14H1006 Molekulargewicht : 274.23

Durch ESI+ Massenspektrometrie wurde ein Molekül-kon 275.2 [M + H]+ gefunden, unter ESI (negativ)-Bedingungen 273 [M-H]- bzw. 271 [M-3H]-gemessen.

UV-Maxima: 215 nm, 248 (Sh) nm, 275 (Sh), 389nm.

5 Tabelle 1: NMR-Daten-1H-und 13C-chemische Verschiebungen von Penilenon der Formel (II) in DMSO-d6 bei 300K (in ppm ; Nummerierung zum Zwecke der NMR- Auswertung entspricht nicht der IUPAC-Nomenklatur).

¹H ¹³C 1 - a) 2 - 131.12 3 - a) 4 102. 22 ~ 170. 2 (breit) 6 6.44 99. 72 7-165. 89 7-OH 11.63 - 8 - 110.71 9-145. 42 9-Me 2.81 25.13 10 6. 81 116. 48 11 - #163. 0 (breit) 12-105. 04 13-124. 86

a) Für C3 und C5 wird im 13C-Spektrum kein Signal beobachtet.

Beispiel 7 : Gewinnung der Penilenon-monomethylether-Derivate der Formeln (IV-A) und (IV-B).

40 mg Verbindung der Formel (II) (Penilenon, isoliert entsprechend Beispiel 4) wurden in 30 mL Tetrahydrofuran gelöst und mit 0.5 mL 2.0 M (Trimethylsilyl)-diazomethan, gelöst in Hexan [Aldrich, Kat.-Nr. 36,283-2], versetzt. Nach einer Stunde wurde die Reaktion durch Wasserzugabe beendet und das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert. Das Reaktionsprodukt ist dann auf einer Nucleosil HD@-Säule (21 mm x 250 mm) aufgetrennt. Als Elutionsmittel diente ein Gradient von 10% bis 99% Acetonitril in 0. 1 %-Essigsäure. Der Säulendurchfluß, 20 mL pro Minute, wurde fraktioniert aufgefangen. Die Fraktionen, die das Methylierungsprodukt enthielten, wurden jeweils zusammengefaßt, im Vakuum eingeengt und kristallisiert.

Gewonnen wurden 6 mg des Penilenon-dimethylethers der Formel (IV-A), Summenformel : C16H1406, Molekulargewicht : 302.29, und 1 mg des Penilenon- dimethylethers der Formel (IV-B), Summenformel : C16H1406, Molekulargewicht : 302.29.

Penilenon-dimethylether der Formel (IV-A) : UV-Maxima : 216 nm, 242 nm, 280 nm (Sh), 387 nm.

Tabelle 2 : NMR-Daten-1H-und 13C-chemische Verschiebungen 5 des Penilenon- dimethylethers der Formel (IV-A) in DMSO-d6 bei 300K (in ppm ; Nummerierung zum Zwecke der NMR-Auswertung entspricht nicht der IUPAC-Nomenklatur).

¹H ¹³C 1 - 148.25 1-OMe 4.14 60. 97 - 137.12 2-OH #9. 3 (breit) - 174.13a) 4 104. 79 - 174.28a) 5-OH 17. 29- 6 6. 57 96. 82 7-168. 03 7-OMe 4.04 56. 45 8 - 111.30 9 143. 18 9-Me 2. 74 25. 12 10 6. 88 117. 65 11 - 159.10 11-OH #10. 5 (breit) 12 105. 72 13 124. 58

a) C3 und C5 können nicht eindeutig unterschieden werden.

Penilenon-dimethylethers der Formel (IV-B) : UV-Maxima : 213 nm, 241 nm und 390 nm.

Tabelle 2 : NMR-Daten-1H-und 13C-chemische Verschiebungen 8 des Penilenon- dimethylethers der Formel (IV-B) in DMSO-d6 bei 300K (in ppm ; Nummerierung zum Zwecke der NMR-Auswertung entspricht nicht der IUPAC-Nomenklatur). ¹H ¹³C 1 - 176.16 2 - 136. 10 2-OH breit 3 - 149.54 3-OMe 4.18 61. 07 4 - 101. 12 5 162. 49 5-OH breit 6 6. 66 97. 44 7 - 163.72 7-OMe 4. 00 56. 17 8-110. 63 9 - 149. 31 9-Me 2.78 25.86 10 6. 87 117. 65 11 169. 56 11-OH 16. 74 12 108. 22 13 124. 51

Beispiel 8 : Gewinnung der Atrovenetin-Derivate (V-A) und (V-B).

100 mg Verbindung der Formel (III) (Atrovenetin, hergestellt gemäß Beispiel 4) wurden in 5 mL Tetrahydrofuran gelöst und mit 1 mL 2.0 M (Trimethylsilyl)-diazomethan, gelöst in Hexan [Aldrich, Kat. -Nr. 36,283-2], versetzt. Nach 15 Minuten wurde die Reaktion durch Wasserzugabe beendet und das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert. Das Reaktionsprodukt ist dann auf einer Nucleosil AB#-Säule (21 mm x 250 mm) aufgetrennt. Als Elutionsmittel diente ein Gradient von 10% bis 99% Acetonitril in 0.02% Trifluoressigsäure, welche mit Ammoniumhydroxyd auf pH 4.5 gestellt worden ist. Der Säulendurchfluß, 15 mL pro Minute, wurde fraktioniert aufgefangen. Die Fraktionen, die die Methylierungsprodukte enthielten, wurden jeweils zusammengefaßt, im Vakuum eingeengt und kristallisiert.

Gewonnen wurden 24 mg Atrovenetin-monomethylether (V-A), Summenformel : C20H2006, Molekulargewicht : 356.38, und 10 mg Atrovenetin-monomethylether (V-B), Summenformel C20H20O6, Molekulargewicht : 356.38.

Atrovenetin-monomethylether (V-A) : UV-Maxima : 218 nm, 260 nm (Sh), 394 nm.

Tabelle 3 : NMR-Daten-'H-und 13C-chemische Verschiebungen 5 des Atrovenetin- monomethylethers (V-A) in DMSO-d6 bei 300K (in ppm ; Nummerierung zum Zwecke der NMR-Auswertung entspricht nicht der IUPAC-Nomenklatur). ¹H ¹³C 1 - 147.64 1-OMe 4.16 60.94 137. 35 2-OH 9. 26 3 - 174.04 4 - 105.81 5 - 170.14 5-OH 17.45 - 6 - 117. 94 7 - 166.28 8 - 107. 35 9 - 142. 91 9-Me 2. 76 22. 90 10 6. 91 116. 71 11 - 159. 95 11-OH 10.63 12 105. 63 13 - 124. 10 14 4. 75 91. 03 14-Me 1. 46 14. 39 15 - 42. 57 15-Me 1. 51 25. 31 15-Me'1. 27 20. 42

Atrovenetin-monomethylether (V-B) : UV-Maxima : 222 nm, 282 nm, 385 nm.

Tabelle 4 : NMR-Daten-1H-und 13C-chemische Verschiebungen 5 des Atrovenetin- monomethylethers (V-B) in DMSO-d6 bei 300K (in ppm ; Nummerierung zum Zwecke der NMR-Auswertung entspricht nicht der IUPAC-Nomenklaur).

13C 173. 97 2 135. 31 2-OH 9. 21 3 - 149. 90 3-OMe 4. 27 61. 50 4 - 101. 74 158. 77 5-OH 10.63 6 - 118. 96 7 - 162. 55 106. 20 9 - 149. 30 9-Me 2.78 23.69 10 6. 88 117. 21 11 - 171. 98 11-OH 17.18 12 - 108. 14 13 - 123. 22 14 4. 68 90. 41 14-Me 1. 45 14. 25 15 43. 21 15-Me 1. 51 25. 13 15-Me' 1.26 20. 42