térmicamente

Sector de la técnica

La presente solicitud está dirigida al sector de la alimentación, farmacéutico, de la cosmética y de la agricultura .

Estado de la técnica

Recientes estudios demuestran que los fenoles son poderosos antioxidantes y poseen otras actividades biológicas que podrían explicar en parte los efectos saludables observados en la dieta Mediterránea. Estos compuestos también juegan un importante papel en la estabilidad, inhibiendo la peroxidación lipídica, y en las propiedades químicas y organolépticas de los productos de las aceitunas (aceite de oliva y aceituna de mesa), y tienen significativos efectos nutricionales , fisiológicos y farmacéuticos sobre la salud humana. Estudios epidemiológicos han asociado la baja incidencia de enfermedades coronarias, ateroesclerosis , y algunos tipos de cáncer (pecho y colon) con el consumo de aceite de oliva en la dieta Mediterránea (López-Miranda, J. et al., (2010), Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases, 20, 284-294) . La ingesta habitual de aceite de oliva proporciona un continuo aporte de antioxidantes, que pueden reducir el estrés oxidativo en el cuerpo humano. Numerosos estudios relacionan los efectos beneficiosos del aceite de oliva, con una gran variedad de antioxidantes fenólicos (fenoles simples, secoroideos, flavonoides, lignanos), y su contenido fenólico. Todas estas sustancias son potentes inhibidores del ataque de especies de oxígeno reactivas y en la actualidad hay evidencias que ponen de manifiesto que las especies oxidantes (oxígeno activo, radicales libres, etc.) están implicadas en la etiología de enfermedades tales como el cáncer (Menéndez, J.A. et al., (2007), BMC Cáncer, 7, 80) . Además, incrementan los niveles de disponibilidad de óxido nítrico, suprimen la agregación plaquetaria, disminuyen la presencia de moléculas de adhesión y promueven el contenido fenólico total de las LDL retrasando así su oxidación y, por tanto, la formación y el crecimiento de la placa de ateroma.

Las aceitunas poseen una composición fenólica característica. La existencia y cantidad de fenoles específicos en la aceituna dependen de la variedad y estado de madurez, condiciones climáticas, estacionales y geográficas. Sólo una pequeña cantidad (1-2%) entran a formar parte de la fase oleosa durante la extracción del aceite de oliva mientras que el resto permanece en el residuo o alperujo (Rodis, P.S., Karathanos, V.T. y Mantzavinou, A. (2002), J. Agrie. Food Chem. , 50, 596-601). Hasta el momento el alperujo no ha sido adecuadamente explotado debido en cierta manera a la dificultad que entraña su manipulación. Por lo tanto, la extracción de estos fenoles como productos de alto valor añadido podría ser considerada como una interesante alternativa para hacer provechosos los residuos de almazaras. Se han desarrollado y patentado diversos métodos y sistemas encaminados a la obtención de extractos que contienen compuestos fenólicos desde la aceituna y sus subproductos, así como la purificación de algunos de ellos (hidroxitirosol , tirosol y oleuropeína fundamentalmente) .

En muchos casos se utilizan técnicas de extracción con solvente o procedimientos de separación y concentración selectiva por ultrafiltración, osmosis inversa, evaporación, separación cromatográfica y extracción de fluidos supercríticos , a partir tanto de las aguas de vegetación separadas del alperujo, como de las aguas de procesado de la aceituna de mesa. Estas técnicas pueden ser usadas individualmente o de modo integrado. Así, después de efectuar una ultrafiltración de las aguas generadas en el procesado de la aceituna de mesa se procedía a efectuar un proceso de adsorción en resina no iónica (tipo XAD) para obtener un extracto rico en hidroxitirosol (ES 2186467) . También se han descrito técnicas de separación por membrana de microfiltración, ultrafiltración, nanofiltración y osmosis inversa, seguido de un proceso de purificación en columna (US 2006/0070953) .

Otros procedimientos emplean una extracción sólido- liquido sometiendo directamente el alperu o a una extracción con una mezcla de etanol-agua, para posteriormente la fase orgánica ser sometida a una extracción en fluido supercritico (WO 2007/013032) . Por otro lado también se obtienen extractos de hidroxitirosol a partir de las aguas de vegetación de la aceituna mediante fluidos supercriticos , tal como el dióxido de carbono (US 2002/0198415) .

Uno de los procedimientos más simple, práctico y económico de los descritos es el que permite obtener un hidroxitirosol con alto grado de pureza a partir de cualquier fuente acuosa (alpechín, fase acuosa del proceso hidrotérmico del alperujo, agua de lavado de la elaboración de las aceitunas de mesa, etc.) mediante una cromatografía en dos pasos, una primera con una resina de intercambio iónico y una segunda con una resina adsorbente del tipo XAD (US 2004/0102657) .

También se ha descrito la extracción del aglicón de la oleuropeína a partir del alpechín mediante una extracción con hexano : acetona (50/50, v:v) (US 2005/01037111), así como otros procedimientos que permiten obtener extractos polifenólicos mediante extracciones líquido-líquido a partir de productos derivados de la aceituna (concentrado de alpechín o fase acuosa de las aceitunas), utilizando acetato de etilo (ES 2051238) o mezcla de acetato de etilo y etanol o acetato de etilo, etanol y agua (ES 2311401) para posteriormente llevar a cabo tratamientos de la fase orgánica con una cromatografía de alta eficacia en fase reversa en el caso de la primera invención o en una resina del tipo XAD para la segunda, que permiten obtener unos extractos con una alta concentración de hidroxitirosol .

Descripción de la invención

El objeto de la presente invención es un nuevo extracto procedente de los residuos o subproductos generados a partir de la extracción del aceite de oliva o de la aceituna de mesa, una vez éstos han sido sometidos a un tratamiento térmico .

El nuevo extracto posee un contenido fenólico distinto a los extractos que se puedan obtener a partir de los mismos subproductos sin tratar térmicamente, y se caracteriza por aumentar significativamente ciertos fenoles y además por la presencia de compuestos que se forman durante dicho tratamiento y que contribuyen en gran medida a la mejora de sus propiedades (antioxidantes, anti-inflamatorias , secuestrante de radicales libres, etc.).

La aplicación de determinados procesos, como es el caso de tratamientos térmicos, ayuda a la solubilización de los fenoles y con ello facilita su posterior extracción. Se han estudiado procedimientos en un alto rango de temperaturas que facilitan sustancialmente no sólo la liberación de los fenoles y otros compuestos interesantes, sino que además, favorecen la hidrólisis en fenoles más simples y la aparición de otros nuevos con un alto valor añadido.

La novedad de la aplicación de tratamientos térmicos radica en la obtención de un extracto fenólico con una mayor cantidad de fenoles simples y nuevos, favorecido por el tratamiento térmico, al mismo tiempo que facilita la separación de fases y con ello se simplifica la extracción. A partir del extracto fenólico se pueden llegar a obtener distintas fracciones ricas en diferentes tipos de fenoles que proporcionan una amplia variedad de propiedades, o incluso aislar determinados compuestos de alto valor añadido. Descripción detallada de la invención

Partiendo de cualquier tipo de subproducto del aceite de oliva o de la industria de aderezo, ya sea el caso del alperujo, alpechín, orujo, mezcla de ellos, o salmueras, la aplicación de un tratamiento térmico favorece sustancialmente a la posterior extracción de compuestos fenólicos y de interés presentes en los mismos. Durante el tratamiento no sólo se facilita la extracción sino también la formación de nuevos y activos compuestos al mismo tiempo que se hidrolizan fenoles en su forma más activa. El resultado final es un extracto enriquecido en compuestos bioactivos y con una mayor actividad antioxidante que un extracto obtenido a partir de un subproducto del aceite de oliva sin tratar térmicamente.

La masa de subproducto se trata en un rango de temperatura de entre 50°C y 250°C, más preferentemente entre 70°C y 200°C, por aporte directo o indirecto de calor, ya sea a través de una entrada de vapor u otro gas inerte, o bien a través de una camisa calefactora o resistencia eléctrica que esté en contacto con el material a tratar. El tiempo de reacción puede ser muy variable dependiendo del tipo de calentamiento, la temperatura y diseño del reactor térmico, pero puede oscilar entre los dos minutos hasta tratamientos más largos de hasta 3 ó 5 horas.

Tras el tratamiento térmico puede procederse a una separación sólido-líquido con el fin de obtener el extracto de cada fase por separado, o bien se puede proceder a la obtención del extracto de ambas fases sin separarlas previamente. La separación facilita la extracción en el caso de llevarse ésta a cabo con disolventes orgánicos y es la vía para obtener el extracto concentrado de la fracción líquida como producto final rico en fenoles.

De manera preferente, la extracción se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 50°C y 100°C.

Por lo tanto se puede partir de cualquier subproducto de la aceituna, sólido o líquido. En una realización preferente de la invención, el proceso puede comprender una etapa adicional que puede consistir en la microencapsulación o nanoencapsulación del extracto fenólico; la absorción o adsorción del extracto fenólico en cualquier tipo de soporte; o la formación de una emulsión del extracto fenólico.

Adicionalmente , es objeto de la invención una formulación alimentaria, cosmética y/o farmaceútica caracterizada por que comprende un extracto fenólico según ha sido descrito.

Finalmente, es objeto de la invención el uso del extracto fenólico como antioxidante para la preparación de preparados tanto lipófilos como hidrófilos, los cuales pueden presentar uso alimentario, cosmético y/o farmaceútico . Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la inhibición de la agregación plaquetaria de un extracto de alperujo (EA) usando colágeno (a) y TRAP (b) como agentes agonistas o estimulantes de la agregación. La inhibición plaquetaria está expresada en % de disminución de las áreas bajo la curva control de agregación plaquetaria. El número de muestras n=12-13 incubaciones por test. Todos los valores muestran una alta inhibición estadísticamente significativa frente al control (p<0.05) . (-) Valor promedio.

Ejemplos de la invención

A continuación se muestran a modo de ejemplo ilustrativo y no limitativo tratamientos térmicos aplicados a una muestra de alperujo como subproducto del aceite de oliva y la obtención a partir de los mismos del extracto fenólico.

Ej emplo

Una muestra de 20 kg de alperujo fresco fue sometida a varios procesos de tratamientos térmicos . Las condiciones fueron en este caso de 160°C durante 30, 60 y 90 minutos mediante un calentamiento directo con vapor de agua.

Tras dicho proceso se obtiene una fracción sólida y otra liquida que son separadas mediante centrifugación, obteniéndose 51 litros de fracción liquida. Se toma una alícuota de 10 litros de la fracción líquida y se concentra a 1 litro. Se extraen los compuestos apolares (grasa) con hexano (2x100 mi por cada 200 mi de fracción soluble) .

A continuación se procede a la extracción de los compuestos fenólicos, para ello se realiza una extracción en caliente y a contracorriente con acetato de etilo durante 8 horas, empleándose 500 mi de acetato de etilo por cada 200 mi de muestra. De la fase orgánica se obtienen las cantidades señaladas en la tabla 1 de extracto fenólico seco (EF) .

La misma extracción se realiza directamente sobre la muestra original de alperujo sin tratar térmicamente (EFNT) para que sirva como control y poder establecer los efectos del tratamiento térmico:

Para ello se somete el alperujo sin tratar a una extracción con etanol (EtOH) al 80% (v/v) en agua. Se parte de 2.690 kg del alperujo fresco no tratado térmicamente, que ha sido previamente desgrasado con hexano. El alperujo desgrasado se pone en contacto bajo agitación suave con EtOH 80% a temperatura ambiente durante 30 minutos, empleando 15 mi de EtOH 80% por cada 10 g de alperujo, la extracción es repetida dos veces más, utilizando 10 mi de EtOH 80% por cada 10 g de alperujo. Las fracciones son filtradas a través de un filtro de papel en Buchner, reunidas y el EtOH es evaporado hasta obtener un extracto acuoso. Al concentrado obtenido se le extraen los compuestos fenólicos con acetato de etilo, para ello se realiza una extracción en caliente y a contracorriente con acetato de etilo durante 8 horas, se emplean 500 mi de acetato de etilo por cada 200 mL de muestra. De la fase orgánica se obtienen 15.56 g de extracto fenólico seco no tratado (EFNT) . La cantidad de extracto fenólico obtenido a partir del alperu o tratado y no tratado térmicamente se muestra en la tabla 1, en donde se aprecia un significativo aumento con el tratamiento. Tres de los extractos tratados más el control sin tratar han sido caracterizados en cuanto a su composición total en la tabla 2.

Tabla 1. Gramos de extracto obtenido por kilogramo de alperujo fresco tratado o no térmicamente (AFNT) .

Tabla 2. Composición de los extractos fenólicos obtenidos a partir de un alperujo sin tratar (EFNT) y tratado a 160°C para tres tiempos (n.d. , no detectado) . Fracción fenólica polimérica (FFP) .

Sin tratar Tratamiento térmico a 160°C

Componentes (%) AFNT 30 (min) 60 (min) 90 (min) ^"

Humedad 8, 62 12, 36 15, 60 13, 02

Fenoles 25,70 48,40 19, 93 22, 68

FFP n.d. 7, 32 1, 09 14,21

Proteínas 1,41 1, 81 3, 09 3, 90

Cenizas 0,01 0, 02 0, 04 0, 03

Azúcares 7,30 5,75 5,54 3, 52

Lípidos 52, 64 20,25 42, 64 35, 08

Ácidos urónicos n.d. n.d. n.d. n.d.

Total 95, 68 95, 91 87, 93 92, 44

El porcenta e en humedad es mayor en el caso de los extractos tratados térmicamente, mientras que el contenido en fenoles totales y lípidos no parece variar significativamente. Gracias al tratamiento térmico y posterior extracción aparece un nuevo componente que consiste en una mezcla de polímeros fenólicos (FFP), entre otros, que puede presentar importantes propiedades bioactivas . La cantidad de proteínas aumenta con los tratamientos mientras que la de azúcares disminuye. Para estos mismos extractos se llevó a cabo una caracterización más detallada sobre el contenido de compuestos fenólicos como se detalla en la tabla 3a y en la tabla 3b. Las notables diferencias de composición asi como la aparición de nuevos compuestos fenólicos y otros de degradación de azúcares marcan una importante diferencia con los extractos fenólicos que se pueden llegar a obtener a partir de los subproductos sin tratar. Estas diferencias se traducen en una mayor actividad por una mayor presencia de fenoles más activos y otros nuevos con importantes propiedades para la salud, entre otras. A continuación se detallan más a fondo las nuevas características de los extractos tratados térmicamente.

Tabla 3a. Componentes fenólicos y de degradación de azúcares presente en los diferentes extractos EF a distintas temperaturas y para el EFNT expresados en mg de compuesto por kilogramo de alperuj o fresco.

mg/Kg alperujo fresco

Cantidades totales EFNT 160°C/30 160°C/60 160°C/90

3, 4-Dihidroxi-

24, 907 123, 433 70,18 71, 64 fenilglicol

Hidroxitirosol 15, 733 1624, 825 776,548 1127, 53

Tirosol 14, 970 108, 072 80, 648 168, 038

Vainillina n . d . 0, 095 n . d 11,122

4-metilcatecol n . d . 1, 921 n . d n . d

Alcoholes fenólicos

55, 610 1858,347 927, 376 1378, 329 totales

Hidroximetil- n . d . 1, 325 4, 68 21,29 furfural

Ácido 3,4 Dihidroxi- n . d . 15, 563 n . d 19,59 fenilacetico

Ácido protocateico 9, 174 24, 464 18, 462 2,74

Ácido cafeico n . d . 7, 115 2, 658 0, 957

Ácido p-Ohbenzoico 0,4 1, 657 1, 432 1, 067

Derivados del ácido

n . d . 5, 137 n . d n . d protocateico

4-metilcatecol n . d . 1, 921 n . d n . d

Ácido p-cumárico 2, 929 n . d 1,496 n . d

Der ac p-cumárico n . d . n . d 0,049 n . d

Ácido clorogénico n . d . n . d n . d 19,572

Ácido siríngico n . d . n . d n . d 1,786

Ácido vainíllico 3, 362 n . d 5, 013 2,089 Ácidos fenólicos

15, 865 55, 857 29,11 47, 802 totales

Hemiacetal de la

aglicona de la n . d n . d 0, 019 n . d oleuropeina

Derivados de la

n . d 8,382 1,39 n . d oleuropeina 4C

Oleuropeina 2,743 0, 922 0, 461 n . d

Desmetiloleuropeina n . d n . d n . d 14, 535

Secologanosido n . d 7, 355 n . d n . d

Oleuropeina aglicón

n . d n . d 0, 196 n . d derivado

10-Hidroxi- n . d 4,277 n . d n . d metiloleuropeina

Derivados de la

2,743 20, 937 0, 676 14, 535 oleuropeina, totales

Derivado del ácido

1339, 749 664, 381 191, 299 527, 404 elenoico A

Derivado del ácido

n . d 294, 459 123, 562 n . d elenoico C

Derivado del ácido

n . d 26,48 0, 577 9,39 elenoico B

Derivados del ácido

1339, 749 985, 32 315, 438 536, 794 elenoico totales

Ligstrosido n . d n . d 0, 042 n . d

Desmetilligstrosido n . d 18,716 2, 207 111, 395

Derivados del

n . d 18,716 2,25 111, 395 ligstrosido, totales

Luteolin-7-Ο- n . d 1,34 0, 072 0, 125 Rutinosido

Apigenin-7-Ο- n . d n . d 0, 179 n . d Rutinosido

Luteolin-7-Ο-

3, 697 n . d 0,58 n . d Glucosido

Cianidina-3- n . d 0, 055 n . d n . d Oruriosido

Cfeoil-6 ' -0- n . d 8, 752 n . d 0, 809 Secologanosido

Flavonoides totales 3, 697 10, 147 0, 831 0, 934

1-Acetoxipinoresinol n . d 154, 671 59, 831 174, 922

Pinoresinol n . d 25, 021 5, 939 n . d

Lignanos totales n . d 179, 692 65, 77 174, 922 l-Fenil-6, 7- n . d 5, 097 36, 926 21,056 dihidroisocromona

Verbascósido n . d 2, 025 8, 432 n . d

6' -0- [ (2E) -2, 6-

Dimetil-8 -hidroxi- n . d 2, 141 n . d n . d

2octonoiloxi] secologanosido

Comsegolosido 184, 427 58, 93 22, 684 5, 121

Nuzherina n . d 2, 432 n .d n . d

Ácido 3-

Hidroximetil-2 , 3- dihidroxi-5- n . α 207, 18 n . α n . d

(metoxicarbonil ) -2- metil-2H-piran-4- acetico metil éster

Varios, totales 184, 427 277, 805 68, 042 26,177

FFP n . d 515, 823 77, 658 1286, 409

Tabla 4b . Componentes fenólicos y de degradación de azúcares presente en los diferentes extractos EF a distintas temperaturas y para el EFNT expresados porcentaje (gramos de componente por lOOg de extracto fenólico) .

% en el extracto

Cantidades totales EFNT 160°C/30 160°C/60 160°C/90

3, 4-Dihidroxi- 0, 431 1,754 0, 988 0, 792 fenilglicol

Hidroxitirosol 0,272 23, 088 10, 935 9, 58

Tirosol 0,259 1, 536 1, 136 1, 857

Vainillina n . d . 0, 001 n . d 0, 123

4-metilcatecol n . d . 0, 027 n . d n . d

Alcoholes fenólicos 0, 961 26, 406 13, 058 12, 351 totales

Hidroximetil- n . d . 0, 019 0, 066 0, 235 furfural

Ácido 3,4 Dihidroxi- fenilacetico

Ácido protocateico n . d 0,221 n . d 0, 217

Ácido cafeico 0, 159 0, 073 0,26 0, 03

Ácido p-Ohbenzoico n . d 0, 101 0, 037 0, 011

Derivados del ácido 0, 007 0, 024 0, 02 0, 012 protocateico

4-metilcatecol n . d 0,348 n . d n . d

Ácido p-cumárico n . d n . d n . d n . d

Der ac p-cumárico 0, 051 n . d 0, 021 n . d

Ácido clorogénico n . d n . d 0, 001 n . d

Ácido siringico n . d n . d n . d 0,216

Ácido vainillico n . d n . d n . d 0, 023

Ácidos fenólicos 0, 058 n . d 0, 071 0, 02 totales

Hemiacetal de la 0,274 0,766 0, 41 0, 528 aglicona de la

oleuropeina

Derivados de la n . d n . d n . d n . d oleuropeina 4C Oleuropeina n . d 0, 119 0, 02 n . d

Desmetiloleuropeina 0, 047 0, 013 0, 006 n . d

Secologanosido n . d n . d n . d 0, 161

Oleuropeina aglicón n . d 0, 105 n . d n . d derivado

10-Hidroxi- n . d n . d 0, 003 n . d metiloleuropeina

Derivados de la n . d 0, 061 n . d n . d oleuropeina, totales

Derivado del ácido 0, 047 0, 297 0, 029 0, 161 elenoico A

Derivado del ácido 23, 161 9, 441 2, 694 5,829 elenoico C

Derivado del ácido n . d 4, 184 1,74 n . d elenoico B

Derivados del ácido n . d 0, 376 0, 008 0, 104 elenoico totales

Ligstrosido 23, 161 14, 001 4,442 5, 933

Desmetilligstrosido n . d n . d 0, 001 n . d

Derivados del n . d 0,266 0, 031 1,231 ligstrosido, totales

Luteolin-7-Ο- n . d 0,266 0, 032 1,231

Rutinosido

Apigenin-7-Ο- n . d 0, 019 0, 001 0, 001

Rutinosido

Luteolin-7-Ο- n . d n . d 0, 003 n . d

Glucosido

Cianidina-3- 0, 064 n . d 0, 008 n . d

Oruriosido

Cfeoil-6 ' -0- n . d 0, 001 n . d n . d

Secologanosido

Flavonoides totales n . d 0, 124 n . d 0, 009

1-Acetoxipinoresinol 0, 064 0, 144 0, 012 0, 01

Pinoresinol n . d 2, 198 0, 842 1, 933

Lignanos totales n . d 0, 356 0, 084 n . d l-Fenil-6, 7- n . d 2, 553 0, 926 1, 933 dihidroisocromona

Verbascósido n . d 0, 072 0, 52 0, 233

6' -0- [ (2E) -2, 6- n . d 0, 029 0, 119 n . d

Dimetil-8 -hidroxi-

2octonoiloxi]

secologanosido

Comsegolosido n . d 0, 03 n . d n . d

Nuzherina 1, 198 0, 837 0,319 0, 057

Ácido 3- n . d 0, 035 n . d n . d

Hidroximetil-2 , 3- dihidroxi-5-

(metoxicarbonil ) -2- metil-2H-piran-4- acetico metil éster

Varios, totales n . d 2, 944 n . d n . d

FFP 1, 198 3, 947 0, 958 0, 2892342

Principales ventajas del nuevo extracto

De la caracterización se pueden destacar los siguientes puntos o ventajas del tratamiento térmico que diferencian al nuevo extracto obtenido:

La cantidad de extracto obtenido aumenta con el tratamiento térmico y en el caso del presente ejemplo aumenta con el tiempo de tratamiento;

En el EF obtenido tras el tratamiento térmico se produce un incremento de la concentración de los alcoholes fenólicos. El 3 , -dihidroxifenilglicol aumenta su concentración de 3 a 5 veces en el extracto. En el caso del hidroxitirosol la concentración aumenta hasta 100 veces con respecto a la concentración inicial. La concentración de tirosol se incrementa hasta más de 10 veces con respecto al EFNT. Por lo tanto, se observa que el extracto fenólico obtenido tras el tratamiento térmico se encuentra altamente enriquecido en estos antioxidantes naturales;

De forma global se experimenta un incremento de las concentraciones de los fenoles ácidos presentes en EF con respecto al EFNT, aumentando su porcentaje hasta 3.5 veces en el extracto. Hay que destacar que tras el tratamiento térmico se observa la presencia de ácido cafeico, el cual antes del tratamiento no había sido detectado. Aunque se encuentra presente en otras muestras su concentración aumenta notablemente tras el tratamiento térmico. Esta molécula se encuentra formando parte de estructuras más complejas como el comsegolosido, el cual puede sufrir una ruptura en el reactor liberando la especie. El ácido protocateico experimenta un aumento de la concentración y porcentaje de más del doble en el extracto; En el EF también destaca la nueva presencia de compuestos como el pinoresinol y 1 -acetoxipinoresinol (hasta un 0.36 y 2.2% respecti amente) que no han sido identificados en el EFNT. En el alperujo el pinoresinol y 1-acetoxipinoresinol solo han sido descritos por primera vez en un articulo reciente (Suárez, M. et al., (2009), J Agrie Food Chem. , 57, 1463-72.), aunque las concentraciones a las que se encuentran son mucho menores que las presentes en el extracto fenólico aquí tratado. Es importante señalar que prácticamente ningún autor identifica a estas especies en el alperujo, probablemente debido a las bajas concentraciones en las que se encuentran;

Se observa la presencia de nuevos compuestos en el EF obtenido tras el tratamiento térmico que no se observan en EFNT, tales como el hidroximetilfurfural y el l-fenil-6,7- dihidroisocromona, que alcanzan porcentajes de hasta un 0.24 y 0.52% en el EF respectivamente. El hidroximentil furfural no ha sido descrito como componente del alperujo. Su presencia se debe a la degradación de hexosas que tienen lugar en el reactor como consecuencia del calentamiento;

El 1-Fenil- 6, 7-dihidroisocromona pertenece a la familia de los hidroxi-isocromanos , los cuales forman parte de los componentes de naturaleza fenólica procedente del aceite de oliva (Bianco, A., et al., (2001), Food Chem. 77, pp . 405- 411, ⁾ . Sin embargo no han sido descritos con anterioridad en el alperujo;

Compuestos como el comsegolosido, verbascósido, los derivados de la Oleuropeina y del Ligstrosido sufren un descenso en su concentración. Este hecho se justifica debido a que el tratamiento térmico provoca la ruptura de estas moléculas complejas, provocando la liberación de otras de menor tamaño tales como el hidroxitirosol o el tirosol, que forman parte de su estructura, aumentando la concentración de éstas como ya se ha visto con anterioridad; El tratamiento térmico seguido por una extracción fenólica favorece la aparición de una nueva fracción fenólica polimérica (FFP) , hasta un 14% en el extracto y con interesantes propiedades para la salud.

El incremento tan importante que ocurre para los compuestos fenólicos con tan importantes propiedades bioactivas asi como la aparición de nuevos componentes hacen que el nuevo extracto presente nuevas y mejores propiedades beneficiosas para la salud. Éstas quedan claramente reflejadas en los ensayos de actividad que a continuación se muestran .

Ensayos de Actividad

Actividad de los nuevos extractos fenólicos tratados térmicamente (EF) y de sus fracciones.

El EF es rico en una gran variedad de compuestos que pueden presentar distintas actividades, contribuyendo todas ellas en suma a la actividad final del extracto. El fraccionamiento de dicho extracto puede resultar beneficioso para potenciar ciertas actividades concretas de los componentes fraccionados. Por ello, se ha realizado también un estudio sobre la actividad de las fracciones del EF tratado térmicamente. A modo de ejemplo se presentan las fracciones en las cuales se dividen el extracto 160°C/60min y se le realizan los ensayos de actividad antioxidante a cada una de ellas. La composición de las distintas fracciones obtenidas se muestra a modo de ejemplo en la tabla 4.

Se expone en la tabla 5 como ejemplo de la actividad in vitro de la actividad antioxidante y secuestrante de radicales libres del nuevo extracto y de sus distintas fracciones los siguientes ensayos cuyos resultados obtenidos son comparados con el extracto fenólico no tratado como control (EFNT) , la vitamina E (VE) , el hidroxitirosol (HT) y el 3, 4-dihidroxifenilglicol (DHFG) , siendo éstos últimos dos de los fenoles simples más activos presentes en la aceituna. Tabla 4: Composición de cada una de las fracciones en las cuales se divide el extracto fenólico obtenido tras tratar el alperujo a 160°C durante 60 minutos . Se especifica las especies de naturaleza fenólica presentes en cada fracción y la concentración de las mismas en ng/ul. (Fr.= Fracción)

Fr . Compuestos [ng/μΐ] Fr . Compuestos [ng/pL]

1 DHFG 2457, 377 3F Ácido protocateico 150, 142

Ácido p-

2A DHFG 74, 445 10, 663 hidroxibenzoico

Hidroximetilfu

93, 015 3G Ácido Cafeico 106, 863 rfural

Hidroxi-

99, 883 4A Glicol 5, 445 tirosol

Tirosol 664, 213 Hidroxitirosol 12, 276

2B DHFG 284, 163 Tirosol 2,775

Hidroximetilfr Derivado Ácido

53, 505 211,814 fural Elenoico A

Hidroxi- 29890, 67

4B Hidroxitirosol 78, 815 tirosol 4

Derivado Ácido 4967, 17

Tirosol 861, 222

Elenoico C 5

Ácido Derivado de

2C 534, 619 56, 105

Protocateico Oleuropeina

Hidroximetilfu

3A 38, 753 4C Hidroxitirosol 78, 820 rfural

Hidroximetilfu 1- 2260, 06

3B 2, 953

rfural Acetoxipinoresinol 6

Hidroxi-

9, 547 Oleuropeina 18,548 tirosol

Derivado Ácido

3639, 062 Ligstrosido 1, 705 Elenoico A

Hemiacetal de

la Oleuropeina

0, 760 7, 870 aglicona de la aglicon derivado

oleuropeina

Hidroxi-

3C 888,204 4D Hidroxitirosol 64, 102 tirosol

Derivado Ácido Derivado Ácido

582, 152 23, 194 Elenoico A Elenoico B

1-

Tirosol 1489, 292 153, 009

Acetoxipinoresinol

Pinoresinol 238, 763 4E FFP

Hidroxi-

3D 51, 951 4F Hidroxitirosol 42, 644 tirosol

Derivado del

Ácido p- 1, 964 Ácido Vainillico 107, 208 cumárico Apigenin-7-0

Tirosol 224,514 7, 191

Rutinosido

Derivado Ácido

2631, 371 Verbascósido 293, 091 Elenoico A

l-fenil-6, 7- dihidro- 1484,426 4G Ácido p-Cumárico 60, 168 isocromona

Luteolin-7-0

Verbascósido 45, 877 23, 298

Glucósido

Ácido

3E 53, 506 Comsegolosido 911, 887 protocateico

Ácido p- hidroxi- 46, 905

benzoico

Derivado ác.

625, 750

Elenoico A

Luteolin-7-0

2, 908

Rutinosido

Ác . Vainillico 94, 309

Tabla 5. Ensayos de actividad biológica de los extractos obtenidos tras distintos tratamiento térmicos y sus fracciones comparados con el extracto sin tratamiento y compuestos como el HT, el DHFG y la vitamina E. (1= Poder Reductor; 2= Actividad antirradical DPPH; 3= Captación de radicales libres ABTS; 4= Inhibición a la Oxidación I ^a ; 5= Inhibición a la Oxidación 2 ^a ; 6= Inhibición a la actividad tirosinasa)

1 2 3 4 5 6 mg/ml

EC50 TEAC EC 50 EC50 Abs trolox

EFNT 0, 15 5,59 0,22 1, 80 0,79 0, 84

EF (160/15) 0,45 1, 64 0, 53 1,46 0, 97 0, 48

EF (160/30) 0,34 1,50 0,46 1,31 1, 14 0,51

EF (160/45) 0,48 1, 11 0,51 1, 06 0, 94 0, 43

EF (160/60) 0,49 1,23 0,54 0, 96 1, 13 0, 44

EF (160/75) 0,42 1, 06 0, 42 1,38 1, 02 0, 35

EF (160/90) 0,50 1,72 0,51 1, 64 1, 05 0,51

Fracción 1 0, 32 1, 08 0, 40 1, 08 0, 60 -

Fracción 2A 0, 17 6, 03 0,20 6, 03 1, 06 -

Fracción 2B 1,29 0, 81 1,38 0, 80 0, 14 -

Fracción 2C 1,79 2,79 0,70 2,79 0, 08 -

Fracción 3A 0,06 1,75 0, 17 1,76 1, 66 -

Fracción 3B 0,09 3,22 0, 17 3,22 1, 88 -

Fracción 3C 0,78 0, 81 0,71 0, 81 0, 35 -

Fracción 3D 0, 97 0, 94 0,28 0, 94 0,29 -

Fracción 3E 0,84 0, 67 0, 67 0, 67 0, 16 -

Fracción 3F 0, 96 0, 60 0,29 0,59 0, 35 - Fracción 3G 0,43 7,24 0,28 7,24 0,34 -

Fracción 4A 0, 03 8,58 0, 06 8, 57 5, 65 -

Fracción 4B 0,24 3,29 0,24 3,29 0, 84 -

Fracción 4C 0,83 0, 32 0, 69 0, 32 0, 10 -

Fracción 4D 0, 66 1, 01 0, 47 1, 01 0, 11 -

Fracción 4E 0,54 0, 57 0, 45 0, 57 0,24 -

Fracción 4F 0,80 0, 44 1,29 0, 44 0, 33 -

Fracción 4G 0, 52 0,86 0, 95 0,86 0, 41 -

HT 1, 60 0, 11 1, 53 0, 68 0, 07 -

DHFG 1, 96 0, 17 0, 99 0, 83 0, 03 -

Vit E - 0, 83 0,50 0, 52 0,23 -

1. - Poder reductor : El poder reductor de los extractos estudiados se expresa como equivalentes en mg/ml de Trolox que se requieren para llevar a cabo una inhibición de la oxidación de igual magnitud a la que se produce con una concentración de 1 mg/ml de compuesto/extracto. Se observa (Tabla 5) que los extractos fenólicos obtenidos a partir de alperu o tratado térmicamente (EF) presentan una actividad muy superior al del obtenido a partir del alperujo no tratado térmicamente, e inferior en este caso a la actividad mostrada por el HT y el DHFG como compuestos control.

En cuanto a la actividad de las distintas fracciones se puede comprobar algunas como la 2B y 2C cuyo valor reductor se encuentra por encima del Trolox, siendo la 2B la más rica en hidroxitirosol , y la 2C está constituida exclusivamente por ácido protocateico . La mayoría de las fracciones poseen un valor superior al del propio EF tratado térmicamente, por lo que se verifica que en casos como éste un posterior fraccionamiento ayuda a aumentar las propiedades del extracto.

2. - Captación de radicales DPPH: Los resultados se expresan como EC ₅₀ , de forma que se indica la concentración de los extractos/compuestos necesarias para inhibir la oxidación en un 50%. Cuanta más capacidad antirradical posea la especie a estudio menos cantidad de la misma se requiere para disminuir la oxidación en un 50%. Como puede comprobarse en la tabla 5, los extractos obtenidos tras el tratamiento poseen mayor capacidad de captación que el extracto control sin tratar y a su vez los valores son próximos a los valores que proporciona la vitamina E.

Los resultados muestran que las fracciones 1, 2B, 3C, 3D, 3E, 3F, 4C, 4D, 4E, 4F y 4G son aquellas fracciones que presentan una mayor capacidad de captación de radicales DPPH, superando al propio EF tratado térmicamente. Estas fracciones son ricas en DHFG, hidroxitirosol , l-fenil-6,7- dihidroisocromona, ácido vainillico, 1-acetoxipinoresinol y comsegolosido . Hay que destacar que también presenta actividad la fracción 4E que es la que está formada por FFP . Los resultados de actividad antirradical son comparables a los resultados obtenidos con la vitamina E.

3.- La captación de radicales ABTS ⁺ es comparada con la capacidad del Trolox bajo las mismas condiciones. Los resultados se expresan como "Capacidad antioxidante en equivalentes de Trolox" (TEAC) . Como se puede comprobar en la tabla 5 la capacidad captadora de los EF tratados superan ampliamente al no tratado y presentan una actividad similar a la vitamina E. Por otro lado la actividad mostrada por los extractos tratados no solo de debe a la presencia de HT .

Los resultados muestran que las fracciones 2B, 4F y 4G poseen una capacidad de captación de radicales ABTS del mismo orden que el observado en el caso del HT y DHFG, y que junto con el 2C, 3C, 3E y 4C mejoran la actividad del extracto. La fracción 2B se caracteriza por poseer un elevado porcentaje de HT . La fracción 4F además de hidroxitirosol contiene otras especies como el ácido vainillico o el verbascósido que probablemente actúen de forma sinérgica. La fracción 4G se caracteriza por poseer un elevado porcentaje de comsegolosido. Por otro lado, las fracciones 2C, 3C, 3E, 4C, 4D y 4E poseen una capacidad de captación de radicales ABTS similar a la observada por la vitamina E, debido a la presencia de compuestos como el ácido protocateico, el ácido vainillíco, el 1-acetoxipinoresinol , el pinoresinol, el verbascósido, el comsegolosido y la FFP.

4. - Inhibición de la oxidación primaria: Se determina la inhibición a la oxidación primaria del ácido linoleico. Los resultados se expresan como EC50. En la Tabla 5 se muestra que los valores obtenidos para todos los EF tratados térmicamente superan al extracto no tratado y se encuentran próximos a los obtenidos con HT y DHFG. De nuevo se verifica que la actividad que presentan los extractos tratados no se puede justificar sólo por la presencia de H .

En la fracción 4C la capacidad de inhibición de la oxidación primaria se encuentra incluso por encima de los valores obtenidos para la vitamina E. Esta fracción es rica en 1-acetoxipinoresinol. Las fracciones 1, 2B, 3C, 3D, 3E, 3F, 4D, 4E, 4F y 4G también poseen una capacidad de inhibición de la oxidación primaria por encima del extracto tratado térmicamente. En la fracción 1, 2B y 3C este efecto se puede deber a las elevadas concentraciones de HT y DHFG. En los demás casos la actividad puede deberse al igual que en los casos previos a la presencia de l-fenil-6,7- dihidroisocromona, al ácido protocateico, ácido vainillico, 1-acetoxipinotesinol , verbascósido, comsegolosido y FFP.

5. Inhibición de la oxidación secundaria: Se basa en la medida de la cantidad de malondialdehido (MDA) , un subproducto formado en sistemas de lipoperoxidación . En la tabla 5 se muestran los resultados obtenidos de EC ₅₀ . Los resultados ponen de manifiesto que los valores obtenidos de los EF se encuentran por debajo de los compuestos de referencia y también del EFNT. A pesar de ello tras el fraccionamiento una gran cantidad de fracciones presentan valores de EC ₅₀ muy por debajo del extracto sin tratar térmicamente, mejorando bastante las propiedades en la prevención a la oxidación en medios lipidíeos.

6. - Inhibición de la actividad de la tirosinasa de hongos in vitro: Esta enzima cataliza las primeras dos reacciones de la síntesis de la melanina, la hidroxilación de la L- tirosinasa para dar 3, 4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) y la oxidación de la L-DOPA a dopaquinona. Esta quinona es altamente reactiva y puede polimerizar espontáneamente a melanina. Los efectos de los extractos sobre las actividades de monofenolasa, utilizando L-tirosinasa como sustrato y de difenolasa sobre L-DOPA, se siguieron mediante la inhibición de la formación de dopacromo mediante medidas espectrofotométricas . Se muestran los resultados de absorbancia mostrados a 300 segundos, como tiempo final, para concentraciones de 0.75mg/ml de los extractos en la tabla 5. Cuanto menor sea la absorbancia desarrollada mayor es la capacidad de inhibición. Todos los extractos tratados térmicamente se encuentran dentro del mismo rango y poseen mayor capacidad de inhibición que el extracto fenólico no tratado térmicamente.

7. Inhibición de la agregación plaquetaria: Se estudió un rango de concentraciones de entre 50-2000 mg/1 del extracto EF, usando colágeno y TRAP (péptido agonista del receptor de la trombina) como agonistas o estimulantes de la agregación. Los porcentajes de inhibición observados (Figura 1) son bastante altos, incrementándose éstos con la concentración usada de EF, los cuales llegan hasta un 90% en el caso de usar colágeno o de un 70% para el TRAP, o de un 10% en el caso de concentraciones de EA a las que sus componentes lo están a nivel fisiológico (100-200 mg de EA/1) .

El alto porcentaje de inhibición muestra al nuevo extracto fenólico como un posible agente para la prevención de enfermedades cardiovasculares.