Die Erfindung betrifft neue photoaktivierbare Biotinderivate, deren Herstellung, deren Ver¬ wendung zur Inaktivierung von Streptavidin oder Avidin, die Verwendung des inaktivierten Streptavidins zur Entstörung von Immunoassays und ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten unter Verwendung des inaktivierten Streptavidins.

Immunologische Nachweismethoden haben in den letzten Jahren eine große Bedeutung er¬ langt. Mit ihnen kann die Gegenwart von Arzneimitteln, Hormonen, Proteinen, infektiösen Organismen und insbesondere spezifischen Antikörpern in biologischen Proben schnell und genau nachgewiesen werden. Bei allen immunologischen Nachweismethoden kommt es zu einer spezifischen Bindungsreaktion zwischen einem ersten spezifischen Bindungspartner, der Substanz, die nachgewiesen werden soll ("Analyt") und einem zweiten spezifischen Bindungs¬ partner, der spezifisch mit dem Analyten reagiert oder bindet. Analyt und spezifischer Analyt- bindungspartner, die sogenannten Partner eines spezifischen Bindungspaares, bilden dabei ein spezifisches Bindungspaar, im allgemeinen einen Komplex zwischen einem Antigen und einem Antikörper oder Antikörperfragment. Dabei können mehr als ein Analyt oder ein Bindungs¬ partner in jeder Reaktion miteinander reagieren. Diese spezifischen Bindereaktionen werden auf verschiedene Weise detektiert. Im allgemeinen ist ein Teilnehmer der spezifischen Binde¬ reaktion markiert. Übliche Markierungsmethoden sind Radioisotope, Chromogene, Fluoro- gene, Enzymmarkierung oder Substanzen, die wiederum ein spezifisches Bindepaar bilden können (z.B. Biotin / Streptavidin). Bei heterogenen Immunoassays ist einer der Bindungs¬ partner an eine Festphase immobilisiert.

Ein schwerwiegendes Problem bei Immunoassays ist, daß zwischen spezifischen Bindungs¬ partnern des Immunoassays und der Probe, der in der Probe enthaltenden zusätzlichen Be¬ standteile und ggf. der Festphase unerwünschte Wechselwirkungen und unspezifische Binde¬ reaktionen erfolgen können. Derartige Wechselwirkungen bewirken im allgemeinen eine Er¬ höhung des Hintergrundsignals und auch eine stärkere Streuung der Signale und damit eine verringerte Sensitivität und Spezifität des betreffenden Testes.

Sowohl durch unspezifische Wechselwirkungen mit dem markierten Bindungspartner als auch durch unspezifische Bindungen von Testkomponenten und Probenbestandteilen können falsch¬ positive Messungen resultieren, d.h., es wird aufgrund des falsch erhöhten Meßsignals auf die Anwesenheit eines Analyten auch bei dessen Abwesenheit geschlossen.

Es wurden verschiedene Versuche unternommen, diese unspezifischen Wechselwirkungen in Immunoassays zu reduzieren Seit langem ist bekannt, daß unterschiedliche Kohlenhydrat- komponenten und unterschiedliche Proteine, Proteingemische oder Proteinfraktionen sowie deren Hydrolysate unspezifische Wechselwirkungen zwischen den Testkomponenten und dem Analyten im Immunoassay reduzieren können (beispielsweise Robertson et al., Journal of Immun Meth. 26, 1985, 195; EP-A-260 903; US-A-4,931,385)

Der Einsatz von Proteinrohfraktionen und Rohhydrolysaten hat den Nachteil, daß durch die darin enthaltenen Bestandteile wiederum andere Störungen des Tests ausgelost werden können Enzymatisch produzierte Hydrolysate können zudem mit den bei der Herstellung ver¬ wendeten Proteasen kontaminiert sein und weisen in der Regel keine einheitliche Qualität auf, da sich die Spaltung nur schwer steuern laßt Proteasekontaminationen können Testkomponen¬ ten angreifen und schon in geringen Mengen zur Beeinträchtigung der Testfunktion und Lager- stabilitat fuhren

Zur Verringerung unspezifischer Wechselwirkungen in Immunoassays wurde auch der Einsatz von chemisch modifizierten Proteinen, insbesondere von succinylierten oder acetylierten Proteinen beschrieben (US-A-5, 051,956, EP-A-0 525 916) Mit diesen Substanzen können je¬ doch viele der falsch-positiven Ergebnisse bei Tests auf Antikörper aus Serum nicht vermieden werden

EP-A-0 331 068 und WO 91/06 559 beschreiben den Einsatz von polymeπsiertem Immuno- globulin, insbesondere IgG, zur Reduktion spezifischer Storfaktoren wie zum Beispiel Rheumafaktoren Es lassen sich damit aber nicht alle störenden Wechselwirkungen zufrieden¬ stellend ausschalten Außerdem kann der Zusatz von unspezifischem humanem Immuno- globulin (monomere oder polymere Antikörper oder deren Fragmente) in Test auf humane Antikörper zu einer Erhöhung des Leerwertes fuhren Ferner ist die Gewinnung von humanem oder tierischem IgG aufwendig und teuer

Aufgabe der Erfindung war es daher, neue Entstorsubstanzen zur Verfugung zu stellen, die eine bessere Entstörung von unspezifischen Wechselwirkungen bei Immunoassays bewirken als aus dem Stand der Technik bekannt Unter unspezifischen Wechselwirkungen sind alle Wechselwirkungen zwischen Komponenten des Verfahrens zu verstehen, die zu Verfälschun¬ gen des Messergebnisses fuhren können Die Entstorsubstanzen sollen falsch-positive Ana¬ lysenergebnisse vermeiden, besonders bei der Analyse von Antikörpern Insbesondere soll eine Störung bei der Verwendung von Avidin oder Streptavidin als einem Bindepartner in einem Immunoassay vermieden werden

Gelost wurde diese Aufgabe durch spezifisch durch neue photoaktivierbare Biotinderivate inaktiviertes Avidin oder Streptavidin Durch die Verwendung dieser Substanzen konnte über¬ raschenderweise eine Entstörung bei Immunoassays, insbesondere bei Immunoassays, bei denen Avidin oder Streptavidin als ein Bindepartner eingesetzt wird, erzielt werden

Gegenstand der Erfindung sind neue photoaktivierbare Biotinderivate der Formel I

wobei R = [(CH ₂ ) _n -O _m ] _q -[(CH ₂ ) _r -O _s ] _t -(CH ₂ ) _p mit n,r = 2,3; m,s = 0, l; q-n = 1-4; p = 1-4, wobei die Summe aller CH ₂ -Gruppen höchstens 10 ist und wobei Rl als Ein- oder Mehrfachsubstituent Wasserstoff, C ι-C5-Alkyl, NH ₂ , COOH, F,

Cl oder Br bedeutet.

Besonders bevorzugt sind als R die folgenden Ketteneinschübe:

- (CH ₂ ) ₃ -O-(CH ₂ ) ₄ -0-(CH ₂ )3-

- (CH ₂ ) ₂ -O-(CH ₂ ) ₂ -0-(CH ₂ ) ₂ -

- (CH ₂ )4_ I Q -, insbesondere -(CH ₂ )4- und -(CH ₂ )g-

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen photoakti- vierbaren Biotinderivate zur Inaktivierung von Streptavidin oder Avidin. Die Inaktivierung von Streptavidin wird so durchgeführt, daß die erfindungsgemäßen Biotinderivate zusammen mit Streptavidin oder Avidin kontaktiert werden.Durch die sehr hohe Bindungsaffinität von Streptavidin zu Biotin wird Biotin an Streptavidin gebunden. Nach der Absättigung der Biotin- bindestellen mit dem erfindungsgemäßen Biotinderivaten wird die Photoreaktion initiiert und so Biotin kovalent am aktiven Zentrum fixiert. Dabei kuppelt die photoaktivierbare Gruppe des Biotins mit einem Aminosäurerest des Streptavidins außerhalb des aktiven Zentrums und bindet so das Biotin fest und kovalent an die Rezeptorstelle des Streptavidins. Als Photoquelle kann beispielsweise eine Hg-Dampflampe dienen, die Bestrahlungswellenlänge liegt insbesondere zwischen 250 und 450 nm. Die Zeitdauer der Bestrahlung kann zwischen 1 min. und 10 h liegen, bevorzugt zwischen 5 und 30 min.

Unter Avidin oder Streptavidin sind natürlich vorkommendes gereinigtes Protein oder rekom- binantes Avidin oder Streptavidin zu verstehen und deren chemisch modifizierte Derivate.

Es können alle Derivate der nativen Formen verwendet werden, die in der Lage sind, freies oder über die Carboxylgruppe kovalent konjugiertes Biotin zu binden. Solche Derivate können

beispielsweise durch chemische Modifizierung wie Alkylierung mit Alkylhalogeniden, Acylie- rung mit Carbonsaurechloriden oder -estern, Oxidation von Zuckerresten (Seitenketten) mit z.B. Periodaten oder durch Deletion von einzelnen Aminosäuren oder Aminosaureblöcken innerhalb der Primarsequenz mittels enzymatischen oder gentechnischen Methoden hergestellt werden. Auch Oligomere oder Polymere von SA/ Avidin (wobei auch SA mit Avidin gemischt sein kann), erzeugt durch chemische Vernetzung (z.B. mittels bifunktioneller Linker) sind möglich.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin erfindungsgemaß inaktiviertes Avidin oder Strepta¬ vidin der Formel II

in der R und R _j die vorne gegebene Bedeutung haben, wobei R\ zusatzlich noch N0 ₂ bedeu¬ ten kann und bei dem Biotin an das aktive Zentrum von Streptavidin oder Avidin gebunden und zusatzlich über eine kovalente Bindung außerhalb des aktiven Zentrums an Streptavidin oder Avidin gebunden ist.

Photoaktivierbare Biotinderivate sind bekannt. In EP-A-0 155 854 und EP-A-0 187 323 werden azid-substituierte Phenyle / Nitrophenyle beschrieben, die mit einem aminhaltigen Linker an Biotin gekoppelt sind. Im Boehringer Mannheim Biochemica Katalog, Ident. Nr 1292633 bzw 1292641 wird ein photoreaktives Biotinderivat der Formel

beschrieben

Diese Biotinderivate werden jedoch nur zur Markierung von DNA / RNA Molekülen, von Proteinen allgemein und von Kohlenhydraten beschrieben. Eine Kupplung speziell an Strepta¬ vidin ist nicht beschrieben und wäre auch nicht für den in diesen Literaturstellen beschriebenen Zweck der Markierung sinnvoll, da Streptavidin selbst eine Bindungsstelle für Biotin enthält und somit keine freie Markierung mit Biotin möglich ist.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäß inaktivierten Avidins oder Streptavidins zur Entstörung von Immunoassays. Besonders geeignet ist inakti¬ viertes Avidin oder Streptavidin zur Entstörung von Immunoassays, bei denen als eine Binde¬ komponente Avidin oder Streptavidin eingesetzt wird. Solche Immunassay sind beispielsweise aus U.S. Don et al., J. Histochem. Cytochem. 27 (1979), 1131 - 1 139 und Bayer und Wilchek, Analytical Biochemistry 171 (1988), 1-32 bekannt. Die Störungen können beispielsweise durch Antikörper gegen Avidin oder Streptavidin, die teilweise im humanen Serum vorkommen, ver¬ ursacht werden. Aber auch in Immunoassays, bei denen kein Avidin oder Streptavidin einge¬ setzt wird, bringt das erfindungsgemäße Entstörmittel eine vorteilhafte Wirkung. In diesen Immunoassays hat sich die Vewendung von inaktiviertem Streptavidin, das an ein weiteres Molekül gebunden ist, wie beispielsweise RSA oder Poly-RSA, als besonders vorteilhaft er¬ wiesen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein immunologisches Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe durch

1. Kontaktieren der Probe mit a) erfindungsgemäß inaktiviertem Avidin oder Strepavidin gemäß Formel II, b) einem oder mehreren spezifischen Bindepartnern des Analyten und

2. Messung des gebildeten Komplexes aus Analyt und spezifischen Bindepartner als ein Maß für die Anwesenheit des Analyten.

Als Analyt können alle Substanzen dienen, die mit mindestens einem spezifischen Bindepartner spezifisch zu einem Komplex reagieren, wie zum Beispiel Haptene, Antigene oder Antikörper. Bei dem Nachweis von Antikörpern, insbesondere Autoantikörpern, ist das erfindungsgemäße Verfahren besonders geeignet.

Als Probe dienen im allgemeinen Körperflüssigkeiten wie Blut, Plasma, Serum, Speichel oder Urin.

Als spezifischer Bindepartner kann jeder biologische oder chemische Bindepartner dienen, der spezifisch den Analyten zu binden vermag und mit diesem einen Komplex ausbilden kann. Hierzu zählen Antikörper, Antikörperfragmente, Antigene, Haptene, Hormone, Avidin, Biotin oder Derivate davon. Bevorzugt werden in der vorliegenden Erfindung als Bindepartner des Analyten Antikörper oder Antigene oder deren Fragmente eingesetzt.

Zum Nachweis des Komplexes aus Analyt und spezifischem Bindepartner können alle dem Fachmann gangigen Methoden eingesetzt werden. Es können homogene Verfahren, bei dem alle Bindepartner im Verfahren in löslicher Form vorkommen, beispielsweise Präzipitationsver¬ fahren mit tubidimetrischer oder nephelometrischer Bestimmung des gebildeten Komplexes oder Immunoassay nach dem CEDIA-, EMIT- oder FPIA-Prinzip verwendet werden. Geeignet sind ebenfalls heterogene Verfahren, bei denen mindestens ein Reagenz an eine feste Phase ge¬ bunden ist. Beispiele hierfür sind Agglutinationstest, bei denen ein Partner eines Bindepaares beispielsweise an Latex gebunden ist, Sandwichassays, ELISA zum Nachweis von spezifischen Antikörpern oder immunometrische Assays. Außer bei dem Präzipitationsverfahren ist bei allen diesen Verfahren mindestens einer der spezifischen Bindepartner markiert. Die Markierung kann direkt ein meßbares Signal liefern, beispielsweise ein Radioisotop, ein Chemilumineszenz, Fluoreszenz oder Elektrochemilumineszenzmarker oder ein gefärbter Partikel, beispielsweise ein Metallsolpartikel, oder gefärbter oder ungefärbter Latex Die Markierung kann auch ein indirektes Signal liefern, beispielsweise eine Enzymmarkierung wie Peroxidase, Glucoseoxi- dase, ß-Galaktosidase oder alkalische Phosphatase

Die Immunoassays können ebenfalls mittels Teststreifen oder Biosensoren durchgeführt werden, insbesondere wenn einer der Bindepartner über Streptavidin an die Festphase gekop¬ pelt ist. Auch Immunoassays nach dem Prinzip der Plasmonenresonanz können erfindungs¬ gemäß entstört werden.

Oft wird ein Reagenz des Verfahrens zum Nachweis des Analyten über ein spezifisch binden¬ des Bindepaar, beispielsweise Avidin bzw. Streptavidin / Biotin an die Festphase gekoppelt. Der Vorteil hierbei ist, daß die Festphase universell bei mehreren Nachweisverfahren eingesetzt werden kann Auch ist es möglich, die Markierung über ein spezifisches Bindepaar an eine Komponente des Assays zu binden Beispielsweise kann ein Enzym an Avidin oder Strepta¬ vidin gekoppelt sein und der Bindepartner, beispielsweise ein Antikörper, kann biotinyliert sein. Beispiele für solche Nachweisverfahren sind dem Fachmann bekannt. Für diese Falle ist das erfindungsgemaß inaktivierte Avidin oder Streptavidin besonders geeignet.

Zur Durchführung des Verfahrens wird der Analyt mit den einzelnen Testkomponenten und inaktiviertem Avidin oder Streptavidin inkubiert und der Immunoassay durchgeführt. Die Kon¬ zentration des erfindungsgemaßen Entstormittels liegt dabei bevorzugt zwischen 0,0001 und 1% (m/v), bevorzugt zwischen 0,01 und 1% (m/v)

Die einzelnen Reaktionskomponenten des Verfahrens zum Nachweis eines Analyten werden zweckmäßigerweise in Form einer Testkombination oder eines Testkits angeboten.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Testkit zum Nachweis eines Analyten in einer Probe mit a) einem erfindungsgemaß inaktivierten Avidin oder Streptavidin gemäß Formel II und b) mindestens einem spezifischen Bindepartner des Analyten.

Weiterhin können alle weiteren zur Durchführung des Nachweisverfährens notwendigen Reagenzien wie Puffer, Detergentien, Markierung,, Hilfsstoffe zum Nachweis der Markierung, wie Enzymsubstrate, Festphase usw. enthalten sein. Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Entstörmittel und der oder die Bindepartner des Analyten in getrennten Behältnissen abge¬ packt. Das Entstörmittel kann aber auch zu dem oder den Bindepartnern des Analyten direkt zugesetzt werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der photoaktivier- baren Biotinderivate der Formel I. Das Verfahren wird so durchgeführt, daß Biotin mit an sich bekannten Kondensationstechniken über seine Carboxylfünktion an eine primäre oder sekundäre Aminogruppe einer Diaminoverbindung gekuppelt wird. Danach wird die noch freie Aminofunktion über eine weitere Kondensationsreaktion oder Substitutionsreaktion (z.B. aromatische nucleophile Substituenten) an die photoaktivierbare Gruppe gebunden. Dieses Syntheseschema ist wahlweise umkehrbar.

Beispiel 1

Herstellung von photoaktivierbarem Biotin

Synthese von Biotin-[8-(4-azidobenzoyl)amino-3,6-dioxaoctyl]amid (Biotin-DADOO- AB) (4)

1 50 g (4 mmol) Biotinoyl-l,8-diamino-3,6-dioxaoctan (Biotin-DADOO, Boehringer Mannheim Nr 1 1 12074) werden unter Ruhren in 50 ml frisch destilliertem DMF gelost. Zu der Losung gibt man nacheinander 1 04 g (4 mmol) N-Hydroxysuccinimidyl-(4-azidobenzoat) (HSAB, Boehringer Mannheim Nr 1140051) und 0 55 ml (4 mmol) Triethylamin und laßt 2 h bei 20 C rühren Anschließend wird das Losungsmittel am Rotationsverdampfer unter Ol- pumpenvakuum entfernt und das verbleibende Rohprodukt durch Chromatographie an Kiesel¬ gel aufgereinigt Hierzu wird in möglichst wenig Chloroform/Methanol 2/1 (v/v) unter leichtem Erwarmen auf ca 40°C gelost und auf eine Kieselgel 60 (Fa Merck) Säule (4 x 60 cm) aufge¬ tragen Man eluiert mit Chloroform/Methanol 2/1 (v/v) und sammelt in 50 ml Fraktionen. Die das reine Produkt enthaltenden Fraktionen werden durch DC (System wie unten beschrieben) ermittelt und vereinigt Das Losungsmittel wird am Rotationsverdampfer entfernt und der halb¬ feste Ruckstand mit ca 50 ml Diisopropylether digeriert Das feinkristalline, farblose Produkt wird abgesaugt und über Nacht im Vakuumtrockenschrank (0 1-0 15 bar/40°C) getrocknet.

Ausbeute 1 24 g (60% d Th )

DC Kieselgel 60(Merck) F ₂₅ , Chloroform/Methanol 2/1 (v/v),

Rf= 0 71

^-NMROOOMHz/dö-DMSO) δ(pprn = 1 20-1 65(m, 6H), 2 07(tr, 2H), 2 60-3 65 (m,

15H), 4 05-4 20 (m, 2H), 6 38(d,br, 2H), 7 20 (d, 2H), 7.62 (tr.br, 2H), 7 91(d, 2H), 8 53 (tr,br, 2H)

UV(CH ₃ OH) λ(max) = 267nm

IR(KBr) υ = 2125 cm ^{" 1}

Figur 1

Beispiel 2:

Herstellung von Biotin

Prinzip:

Streptavidin wird mit einem photoaktivierbaren Biotinderivat (z.B. Biotin-DADOO-AB) um¬ gesetzt und zur Abtrennung des freien, nicht gebundenen Biotins dialysiert. Durch Bestrahlen mit Hg-Dampf-Lampe (350 - 700 nm) wird die Photoreaktion initiiert und das Biotin kovalent im Bindezentrum von Streptavidin fixiert.

Detaillierung:

Zu 1 g Streptavidin wird bei einer Proteinkonzentration von 20 mg / ml in PBS-Puffer pH 7,5 ein 10-facher molarer Überschuß von Biotin-DADOO-AB-Reagenz zugesetzt (3,5 ml einer 25 mg/ml Biotin-DADOO-AB-Stammlösung in DMSO). Nach Zugabe wird 2 Stunden bei 25° C unter Lichtausschluß gerührt.

Freies, nicht gebundenes Biotinderivat wird durch Dialyse (20 Std. 4° C) gegen >500-faches Volumen PBS-Puffer, pH 7,5 unter Lichtausschluß vollständig (nicht mehr nachweisbar) abge¬ trennt. Der Ansatz wird dann bei einer Schichtdicke der Lösung von < 5 cm mit einer Hg- Dampf-Lampe (350 - 700 nm) unter Rühren für 20 min. bestrahlt und anschließend erneut gegen > 500-faches Volumen PBS-Puffer, pH 7,5 dialysiert (16-18 Stunden, 4° C).

Beispiel 3

Reinigung von inaktiviertem Streptavidin

Prinzip:

Durch Chromatographie an Rinderserumalbumin-Biotin- und/oder Streptavidin-Adsorber auf Spherosil-Basis wird inaktiviertes SA von SA mit verbliebener Restaktivitat (Biotinbindung), von verbliebenem freiem Biotin oder von SA mit kovalentem an der Oberflache zuganglichem Biotin (im Gegensatz zum in der Bindetasche fixiertem Biotin) gereinigt

Detaillierung:

In den Reaktionsansatz wird pro 10 mg Protein 1 ml Streptavidin-Spherosil-Adsorber, aquili- biert in PBS-Puffer, pH7,5, gegeben und 2 Std bei RT gerührt Die Herstellung des Adsorbers erfolgt nach üblichen Verfahren durch Kopplung von Streptavidin an Gluthardialdehyd- aktiviertes Amino-Spherosil

Die Suspension wird dann in eine Säule überführt und das Saulenmaterial mit PBS-Puffer pH 7,5 gewaschen Dabei wird am Auslauf der Säule über UV-Monitor bei E ₂ gθnm der Protein- gehalt verfolgt Es wird bis zur Proteinfreiheit gewaschen Der protemhaltige Durchlauf wird in einer Fraktion aufgefangen

In den proteinhaltigen Durchlauf des Streptavidin-Adsorbers wird dann pro 10 mg Protein 1 ml Rinderserumalbumin-Biotin (RSA-Bi)-Spherosil-Adsorber, aquilibriert in PBS-Puffer, pH 7,5, gegeben und 2 Std bei RT gerührt Die Herstellung des Adsorbers erfolgt nach üblichem Ver¬ fahren durch Kopplung von RSA-Bi an Gluthardialdehyd-aktiviertes Amino Spherosil. Die Suspension wird in eine Säule überfuhrt und mit PBS-Puffer, pH 7,5 gewaschen Dabei wird am Auslauf der Säule über UV-Monitor bei E ₂ g0nm der Proteingehalt verfolgt Der proteinhaltige Durchlauf enthalt das Produkt und wird in einer Fraktion aufgefangen Das Produkt (inaktiviertes SA) wird auf eine Proteinkonzentration von 20 mg/ml konzentriert und nach Abfüllung lyophilisiert

Beispiel 4

Synthese von Bιotιn-( ^" 2-(4-Azιdobenzoy0amιnoethyl ^" lamιd (Biotin-EDA-AB) 4a

N-(4-Azidobenzoyl)ethylendiamin 2a

2 6 g (10 mmol) HS AB I werden in 70 ml THF gelost und innerhalb 1 h unter Ruhren und Eis- kuhlung zu einer Losung von 6 01 g (100 mmol) Ethylendiamm in THF getropft Danach ent¬ fernt man das Eisbad und laßt die Temperatur langsam auf Raumtemperatur kommen Das Losungsmittel wird am Rotationsverdampfer abgezogen und das überschüssige Ethylendiamm größtenteils am Hochvakuum entfernt Das verbleibende Rohprodukt wird durch praparative Saulenchromatographie an Kieseigel 60 (Fa Merck, Säule 4 x 68 cm, Laufmittel Essigester/ Eisessig/Wasser 6/3/1 (v/v/v)) gereinigt Die entsprechenden Fraktionen werden gesammelt und eingedampft Das Produkt 2a wird in ca 100 ml Methanol aufgenommen und nach Ab¬ ziehen des Losungsmittels am Rotationsverdampfer als leicht gelblicher Feststoff erhalten

Ausbeute 2 92 g (enthalt ca 2-3 Äquivalente CH3COOH)

DC Kieseigel 60 F 54 (Merck), Essigester/Eisessig/Wasser 6/3/1 (v/v/v), Rf= 0 49

Biotin-[2-(4-Azidobenzoyl)aminoethyl]amid 4a

1 03 g (5 mmol) 2a werden in 40 ml dest DMF suspendiert und unter Ruhren bei 20°C mit 1 4 ml Tπethylamin versetzt Anschließend gibt man 1 71g (5 mmol) Biotin-N-hydroxy- succimmidester (Boehringer Mannheim Nr 734250) 3 zu und laßt weitere 3 h bei 20°C rühren Danach wird das Losungsmittel am Rotationsverdamfer (Olpumpenvakuum, Wasserbad 50°C) entfernt und der Eindampfruckstand über Nacht mit gesättigter NaHC03 -Losung digeriert Das Produkt 4a wird abgesaugt, mit Wasser gewaschen und im Exsikkator getrocknet

Ausbeute 1 02 g (47 % d Th ) weißlich gelbes Pulver

DC Kieseigel 60 F954 (Merck), Essigester/Methanol 3/1 (v/v) + 1% Eisessig, Rf= 0 31

¹ H-NMR(100MHz/d ₆ -DMSO) δ(ppm) = 1 20-1 65(m, 6H), 2 08(tr, 2H), 2 60-3 45

(m, 7H), 4 05-4 20 (m, 2H), 6 40(d,br, 2H), 7 20 (d, 2H), 7 89(d, 2H), 7 90 tr,br, 1H), 8 49 (tr,br, 1H)

UV(CH ₃ OH) λ(max) = 268 nm

IR(KBr) υ = 21 17 cm ^{" 1}

Beispiel 5

Synthese von Biotin- 2-(4-Azidobenzoyl)aminohexyl]amid (Biotin-HMDA-AB) 4b

N-(4-AzidobenzoyI)hexamethylendiamin 2b

2.6 g (10 mmol) HS AB 1, werden in 70 ml THF gelöst und innerhalb 1 h unter Rühren und Eis¬ kühlung zu einer Lösung von 1 1.62 g (100 mmol) Hexamethylendiamin in THF getropft. Danach entfernt man das Eisbad und läßt die Temperatur langsam auf Raumtemperatur kommen. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer abgezogen und das überschüssige Hexamethylendiamin größtenteils am Hochvakuum entfernt. Das verbleibende Rohprodukt wird 20 min mit 100 ml Wasser digeriert und anschließend über Nacht im Exsikkator getrock¬ net. 2b wird als leicht gelblich-brauner Feststoff erhalten.

Ausbeute: 2.09 g (80 % d.Th).

DC: Kieselgel 60 F ₂ 54 (Merck); Essigester/Eisessig/Wasser 6/3/1 (v/v/v); R = 0.50.

Biotin-[2-(4-AzidobenzoyI)aminohexyl]amid 4b

1.30 g (5 mmol) 2b werden in 40 ml dest. DMF suspendiert und unter Rühren bei 20°C mit 1.4 ml Triethylamin versetzt. Anschließend gibt man 1.71g (5 mmol) Biotin-N-hydroxy- succinimidester 3 zu und läßt weitere 3 h bei 20°C rühren. Danach wird das Lösungsmittel am Rotationsverdamfer (Olpumpenvakuum, Wasserbad 50°C) entfernt und der Eindampfrückstand über Nacht mit gesättigter NaHCθ3-Lösung digeriert. Das Produkt 4b wird abgesaugt, mit Wasser gewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: 1.71 g (70 % d.Th.) weißlich gelbes Pulver.

DC: Kieselgel 60 F 54 (Merck); Essigester/Methanol 3/1 (v/v) + 3 % Eisessig; R = 0.38.

¹ H-NMR( 100MHz/d ₆ -DMSO): δ(ρpm) = 1.20-1.75(m, 14H); 2.06(tr, 2H); 2.60-.40

(m, 7H); 4.05-4.20 (m; 2H); 6.39(d,br, 2H); 7.19 (d, 2H); 7.73 (tr,br, 1H); 7.90(d, 2H); 8.44 (tr-br, 1H).

UV(CH ₃ OH) : λ(max) = 267 nm

IR(KBr): υ = 2121 cm ^{" 1}

Beispiel 6

Synthese von N-r3-(4-Azidobenzoyl)aminopropyl]-N-(3'-biotinoylaminopropyl )-methylamin

Acetat

4c (Stand der Technik gemäß EP-A-0 155 854)

N-(3-Aminopropyl)-N-[3'-(4-azidobenzoyl)aminopropyI]-meth ylamin 2c

0.52 g (2 mmol) HSAB J, werden in 20 ml THF gelost und innerhalb 45 min unter Rühren und Eiskuhlung zu einer Losung von 0 52 g (2 mmol) N,N-Bis-(3-aminopropyl)methylamin in 15 ml THF getropft Danach entfernt man das Eisbad und laßt die Temperatur langsam auf Raumtemperatur kommen Das Losungsmittel wird am Rotationsverdampfer abgezogen und das überschüssige N,N-Bis-(3-aminopropyl)methylamin unter Erwarmen des Kolbens größten¬ teils am Hochvakuum entfernt Das verbleibende Rohprodukt wird 20 min mit 100 ml Ether digeriert und anschließend über Saulenchromatographie an Kieselgel 60 (4 x 68 cm; Eluent: Chloroform/Methanol/ Ammoniak 2/2/1 (v/v/v)) gereinigt Die entsprechenden Fraktionen werden gesammelt, das Losungsmittel entfernt und das verbleibende Produkt 2c mehrere Stunden am Hochvakuum getrocknet

Ausbeute' 380 mg (66 % d Th) leicht gelblich-braunes 01

DC Kieselgel 60 F254 (Merck), Chloroform/Methanol/ Ammoniak 2/2/1 (v/v/v)), Rf= 0.82

N-[3-(4-Azidobenzoyl)aminopropyl]-N-(3'-biotinoylanιinop ropyl)-methylamin Acetat 4c

290 mg (1 mmol) 2c werden in 25 ml frisch destilliertem DMF gelost und mit 0 17 ml Triethylamin und 342 mg (1 mmol) Biotin-N-hydroxysuccinimidester _3 versetzt. Die Losung wird 1 h bei 20°C gerührt und anschließend am Hochvakuum eingedampft Das Rohprodukt wird über Saulenchromatographie an Kieselgel 60 (4 x 45 cm, Eluent Essigester/Eisessig/ Wasser 5/5/2 (v/v/v)) gereinigt Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und das Lösungsmittelgemisch am Rotationsverdampfer entfernt Der ölige Ruckstand wird in Methanol gelost, eingedampft und mit Diisopropylether digeriert Abschließend wird das Produkt 4c mindestens 6 h am Hochvakuum getrocknet

Ausbeute- 405 mg (70 % d Th ) zähes, leicht gelblich-braunes OI

DC: Kieselgel 60 F ₉ 54 (Merck), Essigester/Eisessig/Wasser 5/5/2 (v/v/v), Rf= 0 38

¹ H-NMR(100MHz d ₆ -DMSO): δ(ppm) = 1.20-1.85 (m, 10H); 1.89 (s, 3H); 2.05(tr, 2H); 2.20-3.40 (m, 14H); 4.05-4.20 (m; 2H); 6.39(d,br, 2H); 7.19 (d, 2H); 7.80 (tr,br, IH); 7.90 (d,2H); 8.52 (tr,br, IH).

UV(CH ₃ OH): λ(max) = 269 nm

IR(CHC1 ₃ ): υ = 21 12 cnr ¹

a : R = (CH ₂ ) ₂ b : R = (CH ₂ ) ₆ c : R = (CH ₂ ) ₂ N(CH ₃ )(CH ₂ ) ₂

Beispiel 7

Entstörung eines HCV-Testes mit Biotin(photoaktiviert)-SA.

Testnrinzin:

2-Schritt-Sandwichassay mit Streptavidinfestphase (Testführung und Reagenzien wie bei Boehringer Mannheim, Enzymuntest Anti-HIV)

1. Schritt: Biotinylierte Peptide plus Probe

2. Schritt: Reaktion der wandgebundenen Antikörper mit einem Anti-human-IgG-

POD Konjugat

3. Schritt: Indikatorreaktion mit ABTS als Substrat

Inkubationsnuffer:

Na-Phosphat 40 mmol/1, pH 7,4

NaC1 7, l g/1

Konservierungsmittel

Plasma-Diagnostic-Based 200 g/1

HCV-Peptide aus der Core , NS4 und NS5 Region

± inaktiviertes Streptavidin nach Beispiel 1 und 2

Konjugatniiffer:

Na-Phosphat 40 mmol/1, pH 7,4 NaCl 7, 1 g/1 Konservierungsmittel Rinderalbumin 1 g/1 Rinder-IgG 4 g/1 Triton X~l 00 l g/1 Anti-human IgG - POD 15 U/1

Inkubationszeiten:

1. Schritt 1 Stunde (Probe + Inkubationspuffer)

2. Schritt 1 Stunde (+ Konjugatpuffer)

3. Schritt 1 Stunde (Substratreaktion mit ABTS)

Proben:

3 negative Serumproben (Referenz 1)

6 falsch positive Anti-HCV-Negativproben

3 positive Anti-HCV-Proben (Referenz 2)

Volumina:

Probe 20 μl alle anderen Reagenzien jeweils 500 μl

Testdiirchfiihrung: am ES 600 bei 25°C Substratmessung:

Messung der Substratlösung bei 422 nm am ES 600 (Boehringer Mannheim GmbH) Die Extinktionen sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

* keine Angabe, da aufgrund des geringen Meßsignales nicht sinnvoll.

Beispiel 8

Vergleich von mit verschiedenen photoaktivierbaren Biotinen desaktiviertem Streptavidin.

Streptavidin wird mit photoaktivierbaren Biotinen gemäß Beispiel 4, 5 und 6 desaktiviert und gemäß Beispiel 7 miteinander verglichen. Die mit Bi-HMD-(HS) AB und Bi-D ADOO (HS) AB hergestellten Streptavidinreagenzien zeigen gegenüber dem mit einem Biotinderivat gemäß dem Stand der Technik hergestellten Streptavidin eine deutlich verbesserte Entstörwirkung

Proben ohne inakt. SA Signalabnahme nach Zugabe von 0,05 mg / ml SA im Inkubtions- inaktiv in Inkubations-Puffer Puffer

Bi-HMD- Bi-DADOO- Bi-DAPMA- (HS)AB (HS)AB (HS)AB

Neg. Serum 1 1,237 95% 96% 80%

Neg. Serum 2 0, 163 46% 50% 10%

Pos. Serum 1 3,945 10% 9% 12%