Pipβttenβinrichtung, Manipulationseinrichtung und Verfahren zur Manipulation biologischer Zellen

Die Erfindung betrifft eine Pipetteneinrichtung, die zur Manipulation biologischer Zellen, insbesondere unter Ultraschalleinwirkung, eingerichtet ist, eine Manipulationseinrichtung, die mit einer derartigen Pipetteneinrichtung aus- gestattet ist, und Verfahren zur Manipulation biologischer Zellen.

Es ist allgemein bekannt, Zellen mit einer enzymatisehen Behandlung (z. B. durch Behandlung mit Trypsin) von festen Oberflächen abzulösen. Ein Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es während der Einwirkzeit des Enzyms zu Zellschäden kommen kann. Des weiteren kann, falls nur ein Teil der Zellen aus einer Kultur abgelöst werden soll, die Ablösung nur mit einem erheblichen experimentellen Aufwand auf einen Teilbereich der Oberfläche beschränkt werden, da sich die enzymatische Behandlung typischerweise auf die gesamte Oberfläche z. B. eines Kultivierungssubstrates erstreckt.

Sehr häufig ist jedoch gerade die lokale Ablösung von Zellen (insbesondere Zellklonen) von Oberflächen erwünscht. Dies ist z. B. für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern erforderlich, wenn nur bestimmte antikörperproduzierende Zeilklone aus einer Petrischale entnommen werden sollen. Eine weitere Anwendung betrifft die gezielte Ablösung von transfizierten Zellen aus einem Zellrasen. Auch in diesem Fall ist es vorteilhaft, die ggf. durch einen Marker identifizierten Zellen gezielt aus einem Zellrasen zu entnehmen.

In DE 197 42 163 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung beschrieben, die das lokale Perfundieren von Zellen auf abgegrenzten Oberflächen ermöglichen. Dabei wird zunächst eine Perfusionsflϋssigkeit in eine Pipettenspitze aufgenommen und anschließend ein Perfusionsring auf die Pipettenspitze gesteckt. Der Perfusionsring wird mit der Pipettenspitze auf den Boden eines Kultivierungsgefäßes aufgesetzt, so dass der Perfusionsring einen zu behandelnden Bereich der Oberfläche eingrenzt. Durch Einwirken einer Enzymlösung und eine gleich- zeitige Perfusion des abgegrenzten Bereiches können die Zellen durch die Enzymlösung und durch Scherkräfte in der Flüssigkeit abgelöst werden.

Ein Nachteil des aus DE 197 42 163 bekannten Verfahrens kann darin bestehen, dass der Ablösevorgang wesentlich von der Einwirkzeit der Enzymlösung (Inkubationszeit) abhängig ist. Die erforderliche Inkubationszeit ist für verschiedene Zelltypen variabel, was eine schnelle Entnahme der Zellen erschwert. Durch lange Einwirkzeiten von Enzymlösungen kann es ferner zu Zellschädigungen kommen. Ein Nachteil kann auch darin bestehen, dass durch die variablen Inkubationszeiten (für verschiedene Zelltypen) der Ablöseprozess nicht standardisiert werden kann. Die Anwendung der in DE 197 42 163 beschriebenen Technik ist des Weiteren dahingehend beschränkt, dass ausschließlich eine Entnahme von Zellen vorgesehen ist. Eine weitere Bearbeitung der Zellen ist jedoch nur mit einem erheblichen Zusatzaufwand möglich.

Bei bestimmten Aufgaben in der Zellbiologie kann ein Interes- se an einer lokalen Behandlung der Zellen bestehen, z. B. für das Anfertigen von so genannten Zellarrays, bei denen ein Zellrasen an verschiedenen Stellen behandelt (z. B. transfi- ziert oder Wirkstoffen ausgesetzt) wird. Die Herstellung von Microarrays (siehe z. B. Chiosis et al. in "Trends in Bio-

technology", Bd. 23, 2005, S. 271) ist für viele Anwendungen in der Biologie erwünscht.

In DE 101 08 799 Al wird ein Verfahren zur Einführung von biologischem oder pharmakologischem Material in biologisches Zellmaterial unter der Wirkung von Ultraschallschwingungen beschrieben. Die Ultraschallschwingungen induzieren Kavitationen, die in Zellmembranen zu Poren führen, durch die das biologische oder pharmakologische Material eingeschleust wird. Die Ultraschallschwingungen werden durch eine schwingende Glasfaser erzeugt, die in einem Katheterrohr verläuft und am Ende des Katheterrohres vorragt. Bei Beaufschlagung der Glasfaser mit einer Ultraschallschwingung, die mit einem vom Katheterrohr getrennten Ultraschallgenerator erzeugt wird, breiten sich in der Umgebung des vorragenden Endes der Glasfaser die Ultraschallschwingungen aus.

Die in DE 101 08 799 Al beschriebene Technik hat als ersten Nachteil, dass eine lokale Einwirkung auf einzelne Zellen oder Zellgruppen praktisch nicht möglich ist, da die Ultraschallwellen allseitig vom Ende der Glasfaser in die Umgebung abgestrahlt werden. Ein weiterer Nachteil besteht in der geringen Effektivität der Ultraschallerzeugung. Ein großer Teil der Schwingungsenergie geht entlang der Länge der Glasfaser verloren. Des weiteren kann die Wirksamkeit der Erzeugung von Ultraschallwellen am biologischen Material von der Position des Katheterrohrs relativ zum Schwingungsgenerator abhängen. Der Betrieb der herkömmlichen Vorrichtung ist nachteilig, da eine Automatisierbarkeit, insbesondere unter sterilen Bedin- gungen ausgeschlossen ist. Schließlich ist die Anwendung der Technik gemäß DE 101 08 799 Al auf Transfektionsverfahren beschränkt .

Ein weiterer genereller Nachteil von aus der Praxis bekannten Techniken zur lokalen Perfusion von Zellen besteht im Auftreten von unerwünschten Totvolumina in den für die Perfusion verwendeten Einrichtungen. Für die Perfusion, z. B. zum Be- handeln oder Ablösen von Zellen sind Dosierungen im μl-

Bereich erforderlich. Die Dosiergenauigkeit ist jedoch erheblich eingeschränkt, wenn Totvolumina auftreten, die ggf. sogar durch Gaspolster gefüllt sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, verbesserte Vorrichtungen zur Manipulation biologischer Zellen bereitzustellen, mit denen Nachteile im Stand der Technik überwunden werden können. Der Erfindung liegt des Weiteren die Aufgabe zugrunde, verbesserte Verfahren zur Manipulation biologischer Zellen bereitzustellen.

Diese Aufgaben werden mit einer Pipetteneinrichtung, einer Manipulationseinrichtung und Verfahren mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Gemäß einem ersten Gesichtspunkt basiert die Erfindung auf der allgemeinen technischen Lehre, eine Pipetteneinrichtung bereitzustellen, die ein Pipettenrohr und eine Schwingungseinrichtung aufweist, wobei eine Schwingungsquelle der Schwingungseinrichtung an der Pipetteneinrichtung angebracht ist und ein Schwingelement der Schwingungseinrichtung im Pipettenrohr, in einer Pipettenspitze, die am Pipettenrohr vor- gesehen ist und/oder in einem an der Pipettenspitze oder dem Pipettenrohr befestigten Perfusionsring angeordnet ist. Vorteilhafterweise ist erfindungsgemäß ein kompakter Aufbau der Schwingungseinrichtung vorgesehen, die zur Erzeugung von mindestens einer Schwingung, vorzugsweise mindestens einer UIt-

raschallschwingung eingerichtet ist. Sowohl die Schwingungsquelle (Schwingungsgeber) als auch das Schwingelement, das zur Einführung der Schwingung in eine Umgebung der Pipetteneinrichtung und/oder in die Pipettenspitze eingerichtet ist, bilden mit dem Pipettenrohr und der Pipettenspitze oder mit dem Pipettenrohr, der Pipettenspitze und dem Perfusionsring einen Verbund. Der Verbund zeichnet sich vorteilhafterweise durch eine vereinfachte Handhabbarkeit aus. In jeder Betriebsposition der Pipetteneinrichtung sind die Bedingungen der Erzeugung und übertragung der Schwingung konstant, so dass sich die Pipetteneinrichtung durch stabile Schwingungsparameter auszeichnet. Der Weg zwischen der Schwingungsquelle und dem Ort der überführung der Schwingung in die Umgebung ist auf die Dimension der Pipetteneinrichtung beschränkt, wo- durch eine erhöhte Effektivität der Schwingungserzeugung erzielt wird. Vorteilhafterweise wird des weiteren durch die Positionierung des Schwingelements im Pipettenrohr oder der Pipettenspitze oder optional im Perfusionsring eine Lokalisierung der Schwingung auf einen eng begrenzten Raum er- reicht. Die Schwingung wird auf einen Bereich begrenzt, dessen Dimension dem Durchmesser einer Austrittsöffnung des Pipettenrohres oder der Pipettenspitze oder dem Durchmesser des Perfusionsrings entspricht.

Ein weiterer wichtiger Vorteil der erfindungsgemäßen Kombination einer Pipetteneinrichtung mit einer Schwingungseinrichtung ergibt sich aus der Möglichkeit, nach der Ablösung der Zellen von einem Zellträger diese mit der Pipetteneinrichtung aufzunehmen. Die Pipetteneinrichtung kann vorteilhafterweise sowohl als Trennwerkzeug als auch als Zellaufnahme zur überführung der Zellen für eine weitere Anwendung oder Bearbeitung verwendet werden.

Erfindungsgemäß wird die Schwingung in einem lokal begrenzten Teilbereich (so genannter Wirkbereich) der Oberfläche des Zellträgers zugeführt. Im Wirkbereich sind die Zellen bei Betrieb der Schwingungseinrichtung den Schwingungen ausgesetzt, während außerhalb des Wirkbereiches die Zellen von den

Schwingungen weniger beeinflusst oder unbeeinflusst bleiben. Vorteilhafterweise kann damit eine lokale, gezielte Beeinflussung adhärent wachsender Zellen erreicht und die Erzeugung von Zell-Arrays verbessert werden. Die Abgrenzung des Wirkbereiches gegenüber anderen Oberflächenbereichen des

Zellträgers erfolgt mit mindestens einer Komponente der Pipetteneinrichtung, vorzugsweise mit der Pipettenspitze oder dem optional vorgesehen Perfusionsring.

Gemäß einem zweiten Gesichtspunkt der Erfindung wird eine Manipulationseinrichtung bereitgestellt, die zur Manipulation mindestens einer biologischen Zelle eingerichtet ist und die Pipetteneinrichtung gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung und eine Positioniereinrichtung umfasst, mit der die Pi- petteneinrichtung in Bezug auf die mindestens eine biologische Zelle, insbesondere in Bezug auf einen Zellträger zur Aufnahme der Zelle positionierbar ist. Vorteilhafterweise ermöglicht die Kombination der Pipetten- und Positioniereinrichtungen eine genaue und reproduzierbare Einstellung der Position der Pipetteneinrichtung und damit des Bereichs der Einwirkung der Schwingung auf den Zellträger.

Die mindestens eine zu behandelnde biologische Zelle ist auf einem Zellträger in einer Konditionierungs- und/oder Kulti- vierungsflüssigkeit (im folgenden allgemein als Behandlungsflüssigkeit bezeichnet) angeordnet. Der Zellträger umfasst eine feste Oberfläche wie zum Beispiel ein Kultivierungssubstrat oder den Boden eines Kultivierungsgefäßes. Alternativ

kann der Zellträger ein Teil der Pipetteneinrichtung, insbesondere der Pipettenspitze sein.

Gemäß einem dritten Gesichtspunkt basiert die Erfindung auf der allgemeinen technischen Lehre, ein Verfahren zur Manipulation mindestens einer biologischen Zelle bereitzustellen, die in einer Flüssigkeit auf einem Zellträger angeordnet ist und unter Wirkung einer Schwingung behandelt wird, die mit der Pipetteneinrichtung gemäß dem oben genannten ersten Ge- Sichtspunkt in einem lokal begrenzten Teilbereich der Flüssigkeit erzeugt wird. Erfindungsgemäß kann eine Behandlung einer einzelnen Zelle, einer Zelle innerhalb einer Zellgruppe, einer einzelnen Zellgruppe oder einer Zellgruppe innerhalb eines größeren Zellverbandes auf dem Zellträger vorgese- hen sein.

Vorteilhafterweise ermöglicht die Erfindung eine gezielte Behandlung von einer oder mehreren Zellen auf Oberflächen mit Schwingungen, insbesondere Ultraschall. Mit der Schwingungs- einrichtung wird eine Pipetteneinrichtung mit einem Zusatzwerkzeug ausgestattet, mit dem die Anwendung herkömmlicher Manipulatoren zur Behandlung der Zellen mit Schwingungen erheblich erweitert wird.

Mit dem Begriff "Pipetteneinrichtung" (oder: "Pipette") wird hier allgemein eine Vorrichtung bezeichnet, die zur Aufnahme und/oder Abgabe von Flüssigkeiten aus oder in offene Flüssigkeitsreservoire eingerichtet ist. Die Pipetteneinrichtung ermöglicht die Aufnahme, die zeitweilige Speicherung und die spätere Abgabe einer Flüssigkeit, die ggf. mindestens eine suspendierte Zelle enthält. Die Pipetteneinrichtung weist ein Pipettenrohr und eine Flüssigkeitsleitung (Pipettenspitze) auf, durch die eine fluidische Verbindung mit dem Flüssigkeitsreservoir gebildet werden kann. Alternativ kann die Pi-

petteneinrichtung mehrere Pipettenspitzen aufweisen, die mit einem gemeinsamen Pipettenrohr verbunden sind. In diesem Fall ist vorzugsweise in mindestens einer der Pipettenspitzen ein Schwingelement der Schwingungseinrichtung angeordnet.

Mit dem Begriff "Schwingungseinrichtung" (oder: "Schwingungserzeuger") wird hier allgemein eine Vorrichtung zur Erzeugung mindestens einer mechanischen Schwingung bezeichnet. Die Schwingungseinrichtung weist ein Schwingelement auf, über das die Schwingung in die Umgebung übertragen wird. Das

Schwingelement ist dazu eingerichtet, in einer umgebenden Flüssigkeit eine mechanische Schwingung anzuregen. Die mechanische Schwingung kann allgemein eine Schwingung mit einer Frequenz umfassen, die im Bereich des Infraschalls, Hör- schalls oder Ultraschalls gewählt ist. Vorzugsweise ist das Schwingelement zur Anregung einer Ultraschallschwingung in der umgebenden Flüssigkeit eingerichtet, da mit dieser eine besonders hohe Wirksamkeit der Zellbehandlung erreicht werden kann. Die Ultraschallschwingung weist vorzugsweise eine Fre- quenz im Bereich von 1 kHz bis 1 GHz auf. Entsprechend um- fasst die Schwingungseinrichtung vorzugsweise eine Ultraschallquelle.

Die Schwingungseinrichtung ist z. B. eine piezoelektrische Schwingungseinrichtung, bei welcher die Schwingungsquelle durch einen piezoelektrischen Körper und das Schwingelement durch einen mit dem piezoelektrischen Körper verbundenen Schwingungstransmitter gebildet wird. Der Schwingungstrans- mitter ist z. B. ein Stift zur Einleitung des Schalls in eine Flüssigkeit oder ein festes Material) .

Vorzugsweise ist das Schwingelement im Bereich der Pipettenspitze positioniert. Mit der Positionierung des Schwingelements im Bereich der Pipettenspitze wird eine geometrische

Anordnung bezeichnet, bei der das Schwingelement in einer unmittelbaren Umgebung des Wandmaterials der Pipettenspitze positioniert ist. Das Schwingelement kann das Wandmaterial der Pipettenspitze berühren, um die Einkopplung der Schwingungen in das Wandmaterial zu verbessern. Alternativ kann das

Schwingelement mit Abstand von dem Wandmaterial der Pipettenspitze angeordnet sein, um die Schwingung bevorzugt in die Flüssigkeit einzukoppeln. Vorteilhafterweise kann die Schwingung durch die Flüssigkeit und/oder das Wandmaterial der Pi- pettenspitze an deren freies Ende und dessen Umgebung zu den zu behandelnden Zellen geleitet werden. Erfindungsgemäß werden die Zellen vorzugsweise außerhalb der Pipettenspitze mit der Schwingung beaufschlagt. Alternativ ermöglicht die Erfindung, dass die Zellen in der Pipettenspitze mit der Schwin- gung beaufschlagt werden.

Vorteilhafterweise bestehen keine Beschränkungen in Bezug auf den Ort der Befestigung der Schwingungsquelle an der Pipetteneinrichtung. Gemäß bevorzugten Alternativen ist die Schwingungsquelle am Pipettenrohr oder an der Pipettenspitze oder an dem optional vorgesehenen Perfusionsring angeordnet. Besonders bevorzugt ist die Verbindung der Schwingungsquelle mit dem Pipettenrohr oder dem Perfusionsring, da dies eine optimale Ausrichtung des Schwingelements, das mit der Schwin- gungsquelle verbunden ist, in Bezug auf die Pipettenspitze ermöglicht. Es wird insbesondere ermöglicht, dass das Schwingelement im Bereich der Pipettenspitze mit einem Abstand von der Pipettenspitze angeordnet ist.

Wenn das Schwingelement in der Pipettenspitze angeordnet ist, so ist das Schwingelement gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung vollständig von der Pipettenspitze aufgenommen. Das Schwingelement ist angeordnet, ohne in eine axiale Richtung aus einem freien Ende (Pipettenaustrittsöff-

nung) der Pipettenspitze herauszuragen. Durch die Anordnung des Schwingelements im Inneren der Pipettenspitze können die Schwingungen lokal in die Behandlungsflüssigkeit und zu den Zellen geleitet werden. Die Abgrenzung des Wirkbereiches er- folgt durch die Dämpfung der Schwingungen in der Umgebung der Pipettenspitze, eine Wand der auf dem Zellträger aufgesetzten Pipettenspitze und/oder den an der Pipettenspitze angebrachten Perfusionsring. Vorteilhafterweise wird damit die Lokalisierung der Schwingungswirkung verbessert.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist die Schwingungseinrichtung, insbesondere die Schwingungsquelle oder das Schwingelement mit einer Kopplungseinrichtung verbunden, welche die Pipettenspitze mit dem Pipettenrohr verbindet. Vorteilhafterweise kann damit die Schwingungseinrichtung so in der Pipetteneinrichtung angeordnet sein, dass die Schwingungsquelle im Pipettenrohr und das Schwingelement in der Pipettenspitze positioniert sind. Im Pipettenrohr ist mehr Platz vorhanden, um die Schwingungsquelle, wie zum Bei- spiel den piezoelektrischen Kristall, vollständig aufzunehmen, während mit dem sich in der Pipettenspitze erstreckenden Schwingelement eine Erzeugung der Schwingung in der Pipettenspitze nahe von deren öffnung ermöglicht wird.

Gemäß einer alternativen, bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Schwingungseinrichtung mit einer Halteeinrichtung verbunden, die im Pipettenrohr angeordnet ist. Mit dieser Variante der Erfindung kann vorteilhafterweise ein Austausch der Pipettenspitze vereinfacht werden. Die Pipet- teneinrichtung kann flexibel für verschiedene Aufgaben ange- passt werden. Ein weiterer Vorteil besteht in der Variabilität der Gestaltung der Halteeinrichtung, deren Aufbau in Abhängigkeit von der verwendeten Schwingungsquelle gewählt werden kann.

Die Halteeinrichtung kann vorzugsweise eines der folgenden Teile oder eine Zusammensetzung aus diesen Teilen umfassen. In einer ersten Variante umfasst die Halteeinrichtung einen Haltestab, der im Pipettenrohr befestigt ist und sich in einer axialen Richtung des Pipettenrohres erstreckt. Die Verwendung des Haltestabes hat den Vorteil, dass mit diesem die Positionierung der Schwingungsquelle leicht an die Länge des Pipettenrohres angepasst werden kann. In einer zweiten Vari- ante umfasst die Halteeinrichtung einen Haltestopfen. Der

Haltestopfen erstreckt sich in radialer Richtung über den Innenquerschnitt des Pipettenrohres. Vorteilhafterweise kann der Haltestopfen im Pipettenrohr in der Nähe von dessen distalem Ende, d. h. in der Nähe der Pipettenspitze positio- niert werden. Dies ermöglicht eine Verringerung des Totvolumens im Pipettenrohr. In einer dritten Variante kann die Halteeinrichtung einen Haltering umfassen, dessen Innendurchmesser zur Aufnahme der Schwingungsquelle eingerichtet ist und dessen Außendurchmesser dem Innendurchmesser des Pipettenroh- res entspricht. Die Kombination aus Haltering und Schwingungsquelle kann entsprechend einen Haltestopfen ersetzen. Eine Zusammensetzung der genannten Teile kann zum Beispiel einen Haltestopfen mit einem zur Pipettenspitze weisenden Haltestab oder einen Haltestopfen mit einem Haltering oder eine Kombination aus allen drei Teilen umfassen. Des weiteren können mehrere der genannten Teile, wie zum Beispiel mehrere Haltestäbe oder mehrere Halteringe vorgesehen sein.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfin- düng ist die Schwingungsquelle schwingungsgedämpft an der Pipetteneinrichtung befestigt. Ein größerer Anteil der mit der Schwingungsquelle erzeugten Schwingungen wird von der Schwingungsquelle über das Schwingelement in die Umgebung der Pipetteneinrichtung geleitet, während nur ein geringer Bruch-

teil an das Pipettenrohr übertragen wird. Vorteilhafterweise kann damit die Effektivität der Schwingungserzeugung verbessert werden. Es bestehen verschiedene Varianten, die Schwingungsquelle schwingungsgedämpft an der Pipetteneinrichtung, insbesondere im Pipettenrohr und/oder am Perfusionsring befestigen. Hierzu kann beispielsweise ein elastisch deformierbares Material verwendet werden, das an der Halteeinrichtung, insbesondere an dem Haltestab, dem Haltestopfen und/oder dem Haltering vorgesehen ist. Besonders bevorzugt wird die schwingungsgedämpfte Fixierung der Schwingungsquelle im Pipettenrohr durch einen Haltering aus elastisch deformierbarem Material, z. B. Gummi bereitgestellt.

Wenn gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform in der Erfindung die Pipetteneinrichtung eine Innenform aufweist, durch welche die Schwingung vom Schwingelement zu der Pipettenspitze und deren öffnung gerichtet wird, kann vorteilhafterweise die Effektivität der Schwingungserzeugung und die Lokalisierung der Schwingungswirkung verbessert werden. Die ge- richtete Leitung der Schwingung zu der Pipettenspitze wird vorzugsweise durch eine sich verjüngende Innenform der Pipettenspitze, des Pipettenrohres und/oder des optional vorgesehenen Perfusionsrings erreicht. Besonders bevorzugt ist eine Variante der Erfindung, bei der das Pipettenrohr einen koni- sehen Ansatz aufweist. Der konische Ansatz umfasst einen Abschnitt des Pipettenrohrs, in dem sich die Innen- und Außendurchmesser des Pipettenrohres hin zur Pipettenspitze verringern. Dies ermöglicht eine vereinfachte Aufnahme der Pipettenspitze auf dem Ende des Pipettenrohres und die Bereitstel- lung der sich zur Pipettenspitze hin verjüngenden Innenform.

Vorteilhafterweise kann die Fokussierung der Schwingung weiter verbessert werden, wenn gemäß einer weiteren Variante der Erfindung die Pipetteneinrichtung mit einer Fokussiereinrich-

tung ausgestattet ist. Mit der Fokussiereinrichtung ist die Schwingung in der Pipettenspitze auf deren öffnung fokussier- bar. Die Fokussiereinrichtung umfasst zum Beispiel mechanische Elemente in der Pipettenspitze, die zur gerichteten Lei- tung der Schwingung eingerichtet sind. Alternativ oder zusätzlich umfasst die Fokussiereinrichtung einen Oberflächenbereich des Schwingelements. Beispielsweise kann eine Schall- fokussierung mit einer parabolisch oder kugelförmig gebildeten Oberfläche des Schwingelements erreicht werden.

Die Pipettenspitze der erfindungsgemäßen Pipetteneinrichtung kann optional mit einem Perfusionsring ausgestattet sein. Mit „Perfusionsring" wird allgemein ein ringförmiges Bauteil bezeichnet, das die Pipettenspitze radial umgibt und in Rich- tung des freien Endes der Pipettenspitze eine abdichtende Auflagefläche aufweist, die auf den Zellträger aufsetzbar ist. Mit dem Perfusionsring wird um die Pipettenspitze ein Behandlungsvolumen geschaffen, auf das die erfindungsgemäße Schallbehandlung lokal begrenzt wird. Der Perfusionsring ist vorzugsweise so gebildet, wie der in DE 197 42 163 Al beschriebene Perfusionsring. DE 197 42 163 Al wird hinsichtlich des Aufbaus und der Handhabung des Perfusionsrings durch Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung eingeführt.

Der Perfusionsring ermöglicht vorteilhafterweise eine weitere Abgrenzung der Schwingungswirkung in der Umgebung der Pipettenspitze. Die Kombination der Pipettenspitze mit dem Perfusionsring ermöglicht insbesondere, dass die Herstellung von Zellarrays vereinfacht wird, da mit dem Perfusionsring die lokale Ultraschalleinwirkung verbessert wird. Die Zellen können mit der erfindungsgemäßen Schallbehandlung auf einen Zellträger lokal begrenzt Ultraschall-gestützt transfiziert werden.

Vorzugsweise ist der Perfusionsring an der Pipettenspitze lösbar befestigt. Erfindungsgemäß kann der Perfusionsring mit der Pipettenspitze fest verbunden sein. Gemäß einer bevorzugten Variante der Erfindung ist jedoch eine lösbare Verbin- düng, wie z. B. eine Steckverbindung vorgesehen, um den Perfusionsring bei Bedarf an die Pipettenspitze aufzustecken o- der nach der Schallbehandlung der Zellen von der Pipettenspitze zu trennen. Der Vorteil der Trennbarkeit des Perfusionsrings von der Pipettenspitze besteht in der Flexibilität bei der Anpassung der Pipetteneinrichtung an eine konkrete

Anwendung. Vorzugsweise weist der Perfusionsring einen inneren Halterungsbereich (Spitzenaufnahme) auf, in den die Pipettenspitze kraftschlüssig einsteckbar ist. Mit der Bereitstellung der Spitzenaufnahme wird die schnelle Verbindung und Trennung des Perfusionsrings und der Pipettenspitze vereinfacht.

Wenn die Pipetteneinrichtung mit dem Perfusionsring ausgestattet ist, kann gemäß einer weiteren bevorzugten Ausfüh- rungsform der Erfindung das Schwingelement außerhalb der Pipettenspitze im Perfusionsring angeordnet sein. In diesem Fall ergibt sich vorteilhafterweise ein vergrößerter, jedoch scharf abgegrenzter Bereich der Schwingungswirkung auf dem Zellträger. Beispielsweise kann die Schwingungsquelle der Schwingungseinrichtung am Perfusionsring befestigt sein, so dass das Schwingelement in den freien Innenraum des Perfusionsrings ragt. Vorzugsweise hat das Schwingelement einen Abstand sowohl zur Pipettenspitze als auch zum Perfusionsring, so dass die Schwingung bevorzugt in die Flüssigkeit auf dem Zellträger übertragen und auf die mindestens eine biologische Zelle auf dem Zellträger zugeführt wird.

Weitere Vorteile für die Anpassung der Pipetteneinrichtung an konkrete Anforderungen der Manipulation einer biologischen

Zelle werden erzielt, wenn die übertragung der Schwingung vom Schwingelement in die Umgebung durch die Form des freien Endes der Pipettenspitze beeinflusst wird. Beispielsweise kann die Pipettenaustrittsöffnung eine seitliche öffnung, wie z. B. eine Einkerbung aufweisen, die mehrere Funktionen erfüllen kann. Durch die seitliche öffnung können, wenn die Pipettenspitze mit der Pipettenaustrittsöffnung auf einem Zellträger aufgesetzt ist, Zellen in die Pipettenspitze aufgenommen und dort der Schwingungswirkung ausgesetzt werden. Des weiteren kann die Schwingung bevorzugt durch die seitliche öffnung in die Umgebung geleitet werden.

Gemäß einer weiteren Variante der Erfindung kann die Pipettenaustrittsöffnung relativ zur axialen Längsrichtung der Pi- pettenspitze schräg gebildet sein. Die Pipettenaustrittsöffnung weist eine Randkante auf, die in einer Ebene verläuft, die mit der Achse der Pipettenspitze einen Winkel ungleich 90° bildet. Die schräge Randkante ermöglicht vorteilhafterweise ein geneigtes Aufsetzen der Pipetteneinrichtung auf den Zellträger und damit eine gerichtete übertragung der Schwingung auf Zellen auf dem Zellträger und eine vereinfachte Aufnahme von Zellen, die unter der Wirkung der Schwingung vom Zellträger abgelöst wurden. Vorzugsweise bildet die schräge Randkante am freien Ende der Pipettenspitze einen Spitzenbe- reich, mit dem die Pipettenspitze auf den Zellträger aufgesetzt werden kann, so dass keine oder nur wenige Zellen auf dem Zellträger verletzt werden.

Gemäß weiteren bevorzugten Merkmalen ist die erfindungsgemäße Pipetteneinrichtung mit einer Federeinrichtung und/oder einer Dosiereinrichtung ausgestattet. Die Federeinrichtung ist vorzugsweise an dem Pipettenrohr angebracht. Ein Teil der Federeinrichtung ist mit dem Pipettenrohr fest verbunden, während ein anderes, relativ zum Pipettenrohr elastisch verschiebba-

res Teil einen Anschlag für eine Kraftwirkung, wie zum Beispiel eine manuelle Betätigungskraft oder eine Antriebskraft der Positioniereinrichtung bildet. Mit der Federeinrichtung ist eine Aufsetzkraft der Pipetteneinrichtung, insbesondere der Pipettenspitze und des optional vorgesehenen Perfusionsrings auf dem Zellträger einstellbar. Die Dosiereinrichtung ist zur Befüllung eines Innenraums des Pipettenrohres und der Pipettenspitze mit einer Betriebsflüssigkeit eingerichtet. Vorteilhafterweise kann mit der Dosiereinrichtung das Volumen der zugeführten Betriebsflüssigkeit eingestellt werden. Die Betriebsflüssigkeit umfasst vorzugsweise eine physiologische Salzlösung, eine Flüssigkeit mit mindestens einem Enzym, insbesondere zum enzymatischen Abbau adhärent auf dem Zellträger gewachsener Zellen, und/oder eine Flüssigkeit mit mindestens einem Schallkontrastmittel.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Manipulationseinrichtung ist diese mit einer Kameraeinrichtung ausgestattet. Die Kameraeinrichtung ist zur Bildaufnahme der Pipetteneinrichtung, insbesondere der Pipettenspitze und/oder des optional vorgesehenen Perfusionsringes, und/oder des Zellträgers eingerichtet. Die Kameraeinrichtung vereinfacht die Einstellung der Pipetteneinrichtung mit der Positioniereinrichtung. Insbesondere wird ein automatisierter Be- trieb der Manipulationseinrichtung ermöglicht, bei dem eine Steuereinrichtung in Abhängigkeit von Bildern der Pipettenspitze, des Perfusionsringes und/oder des Zellträgers die Positioniereinrichtung ansteuert.

Ein weiterer wichtiger Vorteil der Erfindung besteht in der Variabilität der möglichen Schwingungsbehandlungen. Die Behandlung der Zellen umfasst gemäß bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung eine Einführung mindestens einer Wirkkomponente in die Zellen (Transfektion) und/oder eine Ablösung der

Zellen vom Zellträger oder einer auf dem Zellträger gebildeten Zellkultur. Mit der Erfindung wird nicht nur ermöglicht, dass der Ablösevorgang von Zellen von den Oberflächen beschleunigt wird, sondern dass auch vorbestimmte Anordnungen (insbesondere Mikroarrays) von spezifisch behandelten, adhä- renten Zellen erzeugt werden.

Mit dem Begriff "Wirkkomponente" wird hier allgemein ein Material (z. B. Substanz, Substanz-Zusammensetzung oder Gasblä- sehen) bezeichnet, das durch eine Zellmembran in die Zelle einführbar ist und in der Zelle eine vorbestimmte Wirkung für den weiteren Zustand der Zelle (z. B. den Stoffwechsel oder die Zellteilung) oder eine Markierung (Nachweisbarkeit) der Zelle hat. Die Einführung der Wirkkomponente in die Zelle er- folgt vorzugsweise durch eine vorübergehende, reversible Unterbrechung der Zellmembran (Poration) .

Gemäß einer bevorzugten Variante der Erfindung wird ein Schallkontrastmittel als Wirkkomponente in die Zellen einge- führt. In diesem Fall können sich Vorteile für eine Beobachtung der Zelle mit einem bildgebenden Verfahren unter Verwendung von Ultraschall ergeben. Ein „Schallkontrastmittel" ist allgemein ein Material, das im Innern der Zellen in Bezug auf die Zellbestandteile Grenzflächen bildet, an denen eine Re- flektion von Schallwellen erfolgt. Die Transfektion eines

Schallkontrastmittels in die adhärent auf dem Zellträger angeordneten Zellen hat den Vorteil, dass die mit den Schwingungen behandelten Zellen bei der weiteren Manipulation mit schallbasierten Nachweisverfahren beobachtet werden können.

Besonders bevorzugt ist die Einführung eines mit mindestens einer Wirksubstanz beladenen Schallkontrastmittels, das zusätzlich zur Kontrastfunktion eine Transportfunktion erfüllt. Wenn gemäß dieser Variante der Erfindung das Schallkontrast-

mittel mindestens eine Wirksubstanz enthält, kann vorteilhafterweise neben der genannten Markierungsfunktion des Kontrastmittels eine zweite Wirkung, wie z. B. eine Beeinflussung der Zellbestandteile oder des Stoffwechsels in der Zelle erreicht werden. Besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform der Erfindung, bei der das Schallkontrastmittel mit biologischen Makromolekülen, wie z. B. DNS- oder RNS-Molekülen oder -Bestandteilen, Proteinen, Peptiden etc. beladen wird, mit denen vorteilhafterweise direkt zellbiologische Vorgänge in der Zelle beeinflusst werden können.

Beispiele für erfindungsgemäß verwendete Ultraschallkontrastmittel sind: freie Gasbläschen, Vorläufersubstanzen von Gasen, von organischen oder anorganischen Substanzen umkapselte Gasbläschen, Lösungen, kolloidale Lösungen, Suspensionen,

Dispersionen, Ionophoren, gelöste Mikropartikel, gelöste Polymer-Sphären, gelöste organische und/oder anorganische Moleküle, zuckerhaltige Lösungen, Mikropartikel, ferro- oder paramagnetische Metalle, Mikroaggregate, poröse Partikel von organische und/oder anorganischem Material, lipidhaltigen

Mikrosphären und/oder Emulsionen, wobei die Gasbläschen vorzugsweise Luft, Stickstoff, Sauerstoff, Kohlendioxid, fluoriertes Gas und/oder ein anderes biokompatibles Gas enthalten. Erfindungsgemäß werden besonders bevorzugt kohlenhydrat- basierte, Bläschen bildende Ultraschallkontrastmittel, wie z. B. Levovist (Handelsbezeichnung) oder Optison (Handelsbezeichnung, Octafluoropropangas verkapselt in einer Sphäre aus humanem Albumin) verwendet. Der Gaseinschluss in diesen Ultraschallkontrastmitteln führt vorteilhafterweise zu einer verbesserten Kraftübertragung.

Erfindungsgemäß können die in die Zellen eingeführten Partikel als solche eine zellbiologische Wirkung haben. Besonders bevorzugt ist jedoch eine Ausführungsform der Erfindung, bei

der die Partikel eine Wirksubstanz tragen, wie z. B. die oben genannten biologischen Makromoleküle. Mindestens eine Wirksubstanz kann beispielsweise als Schicht auf der Oberfläche der Nanopartikel gebunden sein, um mit den Nanopartikeln in das Innere der Zellen zu gelangen.

Vorzugsweise wird die mindestens eine Schwingung in der Flüssigkeit, welche die biologische Zelle umgibt, mit einer Energie derart erzeugt, dass in der Flüssigkeit Kavitationen auf- treten. Vorteilhafterweise wird in der Zellmembran mindestens eine Perforation gebildet, die eine Einführung des Schallkontrastmittels und/oder einer Wirksubstanz von der Flüssigkeit in die Zelle ermöglicht.

Wenn die erfindungsgemäße Zellbehandlung eine Ablösung der

Zellen vom Zellträger umfasst, wird gemäß einer weiteren bevorzugten Variante der Erfindung als Behandlungsflüssigkeit eine physiologische Lösung verwendet, die ein Enzym zur Förderung der Zellablösung enthält. Das Enzym umfasst vorzugs- weise Trypsin oder ein anderes proteolytisches Enzym, wie z. B. Kollagenase. Durch den Enzymzusatz wird die Schallwirkung unterstützt, so dass der Ablösungsvorgang vorteilhafterweise beschleunigt wird.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Ablösung der Zellen vom Zellträger berührungslos, d. h. ausschließlich unter der Einwirkung der auf dem Zellträger die Zellen überdeckenden Behandlungsflüssigkeit und ohne Kontakt mit festen Oberflächen von Trennwerk- zeugen. Die abgelöste Zelle ist frei von Berührungen durch mechanische Werkzeuge. Die Behandlungsflüssigkeit wird zur übertragung der Schwingungen auf die Zellen verwendet. Unter der Wirkung der Schwingungen wird eine Abtrennung der adhä- renten Zellkontakte mit dem Zellträger gefördert. Die Wirkung

der Behandlungsflüssigkeit kann optional gesteigert werden, indem eine Perfusionsströmung erzeugt wird. Um die Schwingung, insbesondere den Ultraschall unmittelbar von dem Schwingelement der Schwingungseinrichtung zu den Zellen zu leiten, ist das Schwingelement gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung in der Pipetteneinrichtung so angeordnet, dass das Schwingelement einen Abstand von Wänden der Pipettenspitze aufweist und von der Behandlungsflüssigkeit in der Pipettenspitze umgeben ist.

Alternativ können die Schwingungen mit der auf den Zellträger aufgesetzten Pipettenspitze direkt auf die Zellen geleitet werden. Die Zellen werden in diesem Fall durch die mechanische Schwingung der Pipettenspitze vom Zellträger abgezogen.

Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung zeichnet sich durch die Aufnahme der mindestens einen abgelösten biologischen Zelle in die Pipetteneinrichtung aus. Am Pipettenrohr und/oder der Pipettenspitze wird, vorzugsweise mit der Dosiereinrichtung ein Unterdruck gebildet, durch den Flüssigkeit mit der abgelösten Zelle durch die Pipettenaustrittsöffnung in die Pipettenspitze eingesogen wird. Vorteilhafterweise erfüllt die Pipetteneinrichtung somit eine Doppelfunktion, nämlich die Funktion der lokal begrenzten Beauf- schlagung der biologischen Zelle mit einer Schwingung und die Funktion der Aufnahme der abgelösten Zelle für weitere Manipulationen, wie zum Beispiel eine übertragung zu einem anderen Zellträger oder eine Perfusion.

Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindungen werden aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ersichtlich, die in den beigefügten Zeichnungen dargestellt sind. Es zeigen:

Figur 1 eine erste Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Pipetteneinrichtung;

Figuren 2 und 3: Varianten der Pipettenspitze der Pipetten- einrichtung gemäß Figur 1;

Figuren 4 bis 6: weitere Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Pipetteneinrichtung; und

Figur 7: eine Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Manipulationseinrichtung.

Figur 1 zeigt in schematischer Perspektivansicht eine erste Ausführungsform der erfindungsgemäßen Pipetteneinrichtung 10 mit der Pipettenspitze 11, dem Pipettenrohr 13 und der

Schwingungseinrichtung 20, die im Inneren der Pipetteneinrichtung 10, insbesondere in einem inneren Volumen innerhalb der Pipettenspitze 11 und/oder des Pipettenrohrs 13 angeordnet ist. Die Pipettenspitze 11 ist durch eine Kopplungsein- richtung 12 mit dem Pipettenrohr 13 verbunden. Die Komponenten 11, 12 und 13 sind bei der dargestellten Ausführungsform im wesentlichen so aufgebaut, wie es von herkömmlichen Flüssigkeitspipetten bekannt ist.

Die Pipettenspitze 11 hat eine Form, die sich von der Kopplungseinrichtung 12 zum freien Ende der Pipettenspitze 11 mit der Pipettenaustrittsöffnung 14 verjüngt. Das Wandmaterial der Pipettenspitze 11 besteht z. B. aus Kunststoff. Typische Dimensionen der Pipettenspitze 11 umfassen z. B.: axiale Län- ge: 5 cm, Durchmesser der Pipettenaustrittsöffnung 14: 0.1 mm bis 2 mm, und Durchmesser an der Kopplungseinrichtung 12: 6 mm. Die Kopplungseinrichtung 12 umfasst ein Verbindungsstück zur lösbaren Verbindung der Pipettenspitze 11 am Pipettenrohr 13. Es ist beispielsweise eine Schraubverbindung aus Kunst-

stoff vorgesehen. Das Pipettenrohr 13 umfasst beispielsweise ein Kunststoffrohr oder eine Leitung mit einem Durchmesser im Bereich von z. B. 1 mm bis 0.3 cm.

Die Schwingungseinrichtung 20 umfasst als Schwingungsquelle 21 einen Ultraschallschwinger zur Erzeugung von Ultraschall und als Schwingelement 22 einen Stift oder eine Nadel, der oder die zur übertragung des Ultraschalls auf die Flüssigkeit in der Pipettenspitze 11 vorgesehen ist. Die Schwingungsquel- Ie 21 ist über Verbindungsleitungen 23 elektrisch mit einer Steuereinrichtung (nicht dargestellt) verbunden. Die Schwingungsquelle 21 umfasst z. B. einen piezoelektrischen Kristall, der zur Erzeugung von Ultraschallschwingungen im Bereich von 0.1 bis 3 MHz eingerichtet ist. Das Schwingelement 22 ist mit der Schwingungsquelle 21 fest verbunden. Die

Schwingungseinrichtung 20 ist an der Kopplungseinrichtung 12 befestigt, so dass der Stift 22 in das innere Volumen der Pipettenspitze 11 ragt.

Das Schwingelement 22 kann als Fokussiereinrichtung einen parabolischen oder kugelförmigen Oberflächenbereich 24 aufweisen, der an der Spitze des Schwingelements 22 eine Hohlform bildet (siehe vergrößertes Teilbild in Figur 1) . Der hohlför- mige Oberflächenbereich 24 ist vorzugsweise an einer Oberflä- che der Spitze oder eines Zylinders mit einem Durchmesser von mindestens 10 mm gebildet.

Eine bevorzugte Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die folgenden Schritte. Zuerst wird die Pipettenein- richtung 10 in der Nähe der zu behandelnden Zellen 1 auf einen Zellträger 70 aufgesetzt. Die Zellen 1 bilden auf der Oberfläche des Zellträgers 70 eine adhärente Zellkultur, die mit einer Flüssigkeit (z. B. Behandlungs- und/oder Kultivierungsflüssigkeit, nicht dargestellt) überdeckt ist.

Bei der in Figur 1 dargestellten Variante der Erfindung wird die Pipetteneinrichtung 10 so angeordnet, dass die Pipettenaustrittsöffnung 14 mit einem Abstand von der Oberfläche des Zellträgers 70 positioniert ist. Der Abstand wird beispielsweise im Bereich von 50 μm bis 1 mm gewählt. In diesem Zustand ist die Pipettenspitze 11 in die Flüssigkeit auf dem Zellträger 70 eingetaucht.

Anschließend wird die Pipetteneinrichtung 10 betätigt, um die Flüssigkeit in die Pipettenspitze 11 einzusaugen. Hierzu wird am Pipettenrohr 13 ein Unterdruck gebildet, wie es von herkömmlichen Pipetten bekannt ist. Das Volumen der eingesaugten Flüssigkeit wird so gewählt, dass das Schwingelement 22 der Schwingungseinrichtung 20 mit der Flüssigkeit zumindest teilweise bedeckt ist. Vorzugsweise wird die Pipettenspitze 11 nicht vollständig gefüllt, sondern ein Abstand der Oberfläche 2 der Flüssigkeit von der Kopplungseinrichtung 12 gebildet. Dadurch kann vorteilhafterweise die bevorzugte Einleitung des Ultraschalls in die Flüssigkeit und die gezielte übertragung des Ultraschalls zu den Zellen 1 verbessert werden.

Die Positionierung und Betätigung der Pipetteneinrichtung 10 erfolgt mit einer Steuereinrichtung (nicht dargestellt) , wie sie beispielsweise in DE 197 42 163 als ein Manipulator beschrieben ist. DE 197 42 163 Al wird hinsichtlich des Aufbaus und der Handhabung des Manipulators durch Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung eingeführt.

Bei Betätigung der Schwingungseinrichtung 20 werden Ultraschallwellen 4 durch die Flüssigkeit innerhalb der Pipettenspitze 11 durch die Pipettenaustrittsöffnung 14 zu den Zellen 1 geleitet und auf deren Oberfläche und deren Grenze zum Zellträger 70 übertragen. Durch die mit der Pipettenspitze 11

auf einen Teilbereich der Flüssigkeit und des Zellträgers 70 begrenzte Beaufschlagung mit den Ultraschallwellen werden lokal Kontaktstellen zwischen den Zellen und der Oberfläche des Zellträgers 70 gelöst, so dass sich Zellen als abgelöste ZeI- len 3 in der Flüssigkeitsschicht über dem Zellträger 40 frei bewegen können. Im weiteren Verfahren können die abgelösten Zellen 3 mit der Pipetteneinrichtung 10 aufgesaugt werden.

Um die Aufnahme der Zellen in die Pipettenspitze 11 zu er- leichtern oder die Lokalisierung des Ultraschalls auf einen bestimmten geometrischen Bereich zu verbessern, kann die Pipettenaustrittsöffnung 14 gemäß den Figuren 2 und 3 gestaltet sein. Gemäß Figur 2 ist eine seitliche öffnung 15 vorgesehen, durch die bei Erzeugung eines Unterdrucks in der Pipettenein- richtung 10 die Flüssigkeit in die Pipettenspitze 11 eingesaugt wird. Die Flüssigkeitszufuhr wird durch die öffnung 15 ermöglicht, ohne dass die Pipettenspitze 11 von der Oberfläche des Zellträgers 70 abgehoben werden muss. Gemäß Figur 3 weist die Pipettenaustrittsöffnung 14 einen Umfangsrand 16 auf, der gegenüber der axialen Ausdehnung der Pipettenspitze 11 geneigt ist. Der Umfangsrand 16 bildet einen Spitzenbereich, der alternativ als unmittelbar auf die Zellen einwirkendes mechanisches Ultraschall-Werkzeug verwendet werden kann.

Figur 4 zeigt eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Pipetteneinrichtung 10 mit der Pipettenspitze 11 und dem Pipettenrohr 13. Das Pipettenrohr 13 weist an seinem Ende einen konischen Ansatz 17 auf, auf dem die Pipettenspitze 11 aufsteckbar ist. Die Pipettenspitze 11 kann im aufgesteckten Zustand mit dem Ansatz 17 eine Klemmpassung bilden. Zur Bildung der Klemmpassung weisen der Ansatz 17 und die Pipettenspitze 11 entsprechend gleiche äußere und innere Konuswinkel und mindestens eines der Teile eine elastische Deformierbar-

keit auf. Alternativ oder zusätzlich kann die Pipettenspitze 11 mit einer Kopplungseinrichtung (siehe Figur 1) auf dem Pipettenrohr 13 festgeschraubt sein. In Figur 4 sind die Pipettenspitze 11 und das Pipettenrohr 13 im getrennten Zustand gezeigt. Zur Verbindung beider Teile wird die Pipettenspitze 11 auf das Pipettenrohr 13 aufgeschoben (siehe Pfeil) .

Die Schwingungseinrichtung 20 mit der Schwingungsquelle 21 und dem Schwingelement 22 ist mit einer Halteeinrichtung 30 so in der Pipetteneinrichtung 10 angeordnet, dass ein Teil des Schwingelements 22 in die Pipettenspitze 11 ragt. Die Halteeinrichtung 30 umfasst einen Haltestab 31 und einen Haltestopfen 32. Der Haltestopfen 32 sitzt im Pipettenrohr 13, wobei eine Form- oder Presspassung gebildet ist. Der Halte- stab 31, an dem die Schwingungsquelle 21 fixiert ist, steckt auf der zur Pipettenspitze 11 weisenden Seite des Haltestopfens 32. Der Haltestab 31 besteht zum Beispiel aus einem Kunststoff oder einem anderen schwingungsdämpfenden Material, wie zum Beispiel Silikongummi, insbesondere gehärteter SiIi- kongummi .

Vorteilhafterweise kann der Haltestopfen 32 eine Mehrfachfunktion erfüllen. Neben der Haltefunktion für die Schwingungseinrichtung 20 wird das Pipettenrohr 13 an seinem rück- seitigen Ende mit dem Haltestopfen 32 dicht verschlossen. Des weiteren kann der Haltestopfen 32 zur Schwingungsdämpfung eingerichtet sein, so dass die Schwingungsübertragung von der Schwingungseinrichtung auf das Pipettenrohr 13 vermindert wird und bevorzugt zu der Flüssigkeit in der Pipettenspitze 11 erfolgt. Für die Abdichtungs- und Schwingungsdämpfungs- funktionen besteht der Haltestopfen 32 vorzugsweise aus einem elastisch deformierbaren Material, zum Beispiel aus Schaumstoff oder Silikongummi.

Da das Pipettenrohr 13 durch die Halteeinrichtung 30 rückseitig verschlossen ist, erfordert die in Figur 4 gezeigte Ausführungsform der Pipetteneinrichtung 10 eine weitere Komponente zur Flüssigkeitszufuhr im inneren Volumen der Pipetten- einrichtung 10. Für diese Funktion ist die Pipetteneinrichtung 10 vorzugsweise mit einer Dosiereinrichtung 50 ausgestattet, die einen Spritzenkolben mit einem Flüssigkeitsreservoir umfasst. Die Dosiereinrichtung 50 ist seitlich am Pipettenrohr 13 angebracht und dazu eingerichtet, bei Betätigung des Spritzenkolbens Flüssigkeit in das Pipettenrohr 13 und die Pipettenspitze 11 zuzuführen oder im inneren Volumen der Pipetteneinrichtung 10 einen Unterdruck zu bilden. Aus übersichtlichkeitsgründen ist die Dosiereinrichtung 50 schematisch verkleinert dargestellt. In der Praxis weist der Sprit- zenkolben der Dosiereinrichtung 50 ein Volumen von zum Beispiel 0,5 ml auf. Die Dosiereinrichtung 50 kann manuell oder durch eine Antriebseinrichtung (nicht dargestellt) betätigt werden. Die Dosiereinrichtung 50 kann insbesondere bei Betrieb der erfindungsgemäßen Manipulationseinrichtung (siehe Figur 7) automatisiert betätigt werden.

Die Integration der Halteeinrichtung 30 in das Pipettenrohr 13 hat den weiteren Vorteil, dass das Totvolumen im Innenvolumen der Pipetteneinrichtung 10 verkleinert werden kann. Mit der Dosiereinrichtung 50 können kleinste Flüssigkeitsvolumina mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit auf die zu behandelnden Zellen übertragen werden.

Gemäß einer weiteren Alternative kann die Halteeinrichtung 30 im Pipettenrohr 13 verstellbar angeordnet sein. Beispielsweise kann der Haltestopfen 32 über eine Schraubverbindung mit dem Pipettenrohr 13 verbunden sein. Vorteilhafterweise kann dadurch die Position des Schwingelements 22 verändert werden. Es kann insbesondere eine Eintauchtiefe des Schwingelements

22 in eine Flüssigkeit in der Pipettenspitze variiert und das Totvolumen in der Pipetteneinrichtung minimiert werden.

Die Figuren 5A und 5B zeigen eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Pipetteneinrichtung 10, die sich vorteilhafterweise durch ein weiter verringertes Totvolumen auszeichnet. Die Pipetteneinrichtung 10 umfasst die Pipettenspitze 11 und das Pipettenrohr 13, die über den konischen Ansatz 17 eine Steck- oder Schraubverbindung bilden. Die Schwingungseinrichtung 20 mit der Schwingungsquelle 21 und dem Schwingelement 22 ist im zusammengesetzten Zustand der Pipetteneinrichtung 10 in der Pipettenspitze 11 angeordnet. Das Schwingelement 22 umfasst eine spitz auslaufende Nadel, z.B. aus Edelstahl.

Die Halteeinrichtung 30 zur Positionierung der Schwingungseinrichtung 20 umfasst einen Haltestopfen 32, der sich im Pipettenrohr 13 bis in den konischen Ansatz 17 erstreckt. Der Haltestopfen 32 wird im Pipettenrohr 13 durch zwei Halteringe 33 fixiert. Die Halteringe 33 dienen der Abdichtung des Pipettenrohres 13 und der Schwingungsdämpfung. Im Haltestopfen 32 sind mehrere Kanäle 34, 35 enthalten, wie schematisch in der Längsansicht der Figur 5A und der Querschnittsansicht der Figur 5B gezeigt ist. Die Kanäle umfassen die axial verlau- fenden Kanäle 34, die zur Aufnahme der Verbindungsleitungen

23 der Schwingungsquelle 21 eingerichtet und zur Rückseite des Pipettenrohrs 13 mit Dichtungen 36 verschlossen sind. Die Dichtungen 36 umfassen zum Beispiel Klebstoff, mit dem das Innere der Kanäle 34 flüssigkeitsdicht von der Umgebung ge- trennt wird. Des weiteren umfassen die Kanäle einen radialen Kanal 35, der für eine Verteilung von Flüssigkeit von der Dosiereinrichtung 50 in die Pipettenspitze 11 oder zur Bildung eines Luftpolsters eingerichtet ist.

Der Haltestopfen 32 weist mindestens eine seitliche Ausnehmung 37 (siehe Figur 5B) auf, mit der vorteilhafterweise der mechanische Kontakt des Haltestopfens 32 mit dem Pipettenrohr 13 minimiert wird. Entsprechend kann die Schwingungsübertragung zum Pipettenrohr 13 minimiert werden.

Eine weitere Abwandlung der erfindungsgemäßen Pipetteneinrichtung 10 ist in Figur 6 gezeigt. Die Pipetteneinrichtung 10, die entsprechend der Ausführungsform mit Figur 4 aufge- baut ist, umfasst zusätzlich eine Federeinrichtung 60, mit der eine Aufsetzkraft einstellbar ist, mit der die Pipetteneinrichtung 10 auf dem Zellträger 70 aufsetzbar ist. Die Federeinrichtung 60 umfasst einen Führungsstab 61, der mit der Rückseite des Haltestopfens 32 verbunden ist und zur Führung einer Vortriebsplatte 62 eingerichtet ist. Die Vortriebsplatte 62 wird über eine Spiralfeder 63 von dem Haltestopfen 32 getragen. Bei Ausübung einer Vortriebskraft auf die Vortriebsplatte 62 wird die Vortriebskraft teilweise von der Spiralfeder 63 aufgenommen, so dass die Kraft, mit der die Pipetteneinrichtung 10 auf dem Zellträger 70 aufgesetzt wird, entsprechend verringert wird. Vorteilhafterweise wird damit eine Beschädigung der Pipettenaustrittsöffnung der Pipettenspitze 11 oder des optional vorgesehenen Perfusionsringes vermieden.

Bei der in Figur 6 gezeigten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Pipetteneinrichtung 10 ist zusätzlich auf der Pipettenspitze 11 ein Perfusionsring 40 angeordnet ist. Der Perfusionsring 40 umfasst eine Ringwand 41 mit einem inneren HaI- terungsbereich 42, der über Stege 43 mit der Ringwand 41 verbunden ist. Der Perfusionsring 40 besteht z. B. aus Kunststoff. Die Pipettenspitze 11 ist in den Halterungsbereich 42 eingesteckt, wie es in DE 197 42 163 Al beschrieben ist.

Optional kann bei der Ausführungsform gemäß Figur 6 die Schwingungseinrichtung 20' derart angeordnet sein, dass das Schwingelement 22' außerhalb der Pipettenspitze 11 im Perfusionsring 40 angeordnet ist (gestrichelt gezeigt) . Hierzu wird die Schwingungseinrichtung 20' am Perfusionsring 40 befestigt oder mit einer zusätzlichen Stelleinrichtung (nicht dargestellt) als separates, von den übrigen Teilen der Pipetteneinrichtung 10 getrenntes Bauteil in den Perfusionsring 40 eingeführt. Gemäß einer weiteren Variante (nicht dargestellt) kann die Schwingungseinrichtung derart angeordnet sein, dass das Schwingelement in direktem mechanischen Kontakt mit der Wand der Pipettenspitze 11 steht.

Figur 7 illustriert eine bevorzugte Ausführungsform der er- findungsgemäßen Manipulationseinrichtung 100, welche die Pipetteneinrichtung 10, die Positioniereinrichtung 200 und optional die Kameraeinrichtung 300 umfasst. Die in Figur 7 beispielhaft in Verbindung mit der Manipulationseinrichtung 100 gezeigte Pipetteneinrichtung 10 umfasst die Pipettenspitze 11 und das Pipettenrohr 13, das im Bereich des konischen Ansatzes 17 kompakt gebildet ist und eine axiale Durchgangsöffnung 18 zur Aufnahme des Schwingelements 22 und eine radiale Durchgangsöffnung 19 zur Zuführung von Flüssigkeit von der Dosiereinrichtung 50 aufweist. Durch den kompakten Aufbau des Pipettenrohrs 13 im Bereich des konischen Ansatzes 17 wird vorteilhafterweise das Totvolumen weiter vermindert. Die Schwingungseinrichtung 20 umfasst die Schwingungsquelle 21, die mit Halteringen 33 im Pipettenrohr 13 angebracht ist. Von der Schwingungsquelle 21 ragt das stiftförmige Schwingelement 22 durch die axiale Durchgangsöffnung 19 bis in die Pipettenspitze 11. Die Schwingungsübertragung auf das Pipettenrohr 13 wird durch ein Dämpfungselement, z. B. die Halteringe 33, die insbesondere aus Gummi bestehen, eingeschränkt.

Die Pipetteneinrichtung 10 gemäß Figur 7 umfasst zum Beispiel die folgenden Maße: axiale Länge a der Pipettenspitze 11: 35 bis 40 mm, Abstand b der Spitze des Schwingelements 22 von der Pipettenaustrittsöffnung 16: 25 bis 30 mm, und Abstand c der Pipettenaustrittsöffnung 16 vom Zellträger 70 (Betriebsposition zur Manipulation biologischer Zellen): 0,5 bis 1 mm.

Die Positioniereinrichtung 200 umfasst einen Träger, mit dem die Pipetteneinrichtung 10 relativ zum Zellkulturträger 70 verstellbar ist. Des weiteren kann die Positioniereinrichtung 200 einen Vortrieb für die Dosiereinrichtung 50 enthalten. Die Komponenten 200, 300 und 50 können mit einer gemeinsamen Steuereinrichtung (nicht dargestellt) gesteuert werden.

Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.