CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al desarrollo de formulaciones que contienen compuestos con actividad antimicrobiana presentes en plantas y que son utilizados como desinfectantes y conservadores para alimentos, por ejemplo de origen vegetal y animal; más particularmente a formulaciones acuosas a base de extractos de cálices de Jamaica {Hibiscus sabdariffa), el método mediante el cual se obtiene y sus usos como formulación efectiva para eliminar bacterias patógenas de alimentos de origen vegetal, como frutas y hortalizas, pero con la más alta efectividad para Manzana (Malus domestica).

ESTADO DE LA TÉCNICA

La Manzana {Malus domestica) es un producto agrícola ampliamente consumido en todo el mundo. En México es uno de los principales productos agrícolas, con un poco más de 60 mil hectáreas dedicadas a su siembra. Los tipos de Manzana más importantes que se siembran en México, tanto a campo abierto como en agricultura protegida, son: Golden Delicious (la que más se produce), Red Delicious, Criolla, Red Chief, Rome Beauty, Starking, Starking Delicious y Top Red (Sagarpa, 2013).

No obstante, se ha reportado que existen por lo menos entre 5 000 y 20 000 variedades/cultivares de manzanas que son cultivados en todo el mundo (Pijpers et al., 1986), y de dentro de estos los principales son: Akane, Ambrosia, Arkansas Black, Blackjohn Braeburn, Bramley, Carneo, Cortland, Cox's Orange, Pippin, Crabapple, Criterion, Egremont Russet, Empire, Esperiega, Fuji, Gala, Ginger Gold, Granny Smith, Gravenstein, Honeycrisp, Idared, Jazz, Jonagold, Jonathan, Lodi, Mclntosh, Newtown/Pippin, Oíd Apple, Pacific Rose, Pink lady, Pinova, Red El, Reineta, Rome Beauty, Royal Gala, Splendor, Spur, Starkrimson, Starking, Verde doncella, Willie Sharp, Winesap, Winter Banana, Worcester, Permain, entre muchos otros (Pijpers et al., 1986). Sin embargo, a la par con el incremento en el consumo de Manzana en todo el mundo, se han presentado brotes de enfermedades provocados por bacterias asociados al consumo de manzana o sus productos crudos (CDC, 2005). Por ejemplo, en el 1999 el jugo de manzana no pasteurizado fue el vehículo en un brote multi- estatal, es decir que afecto varios estados en la unión americana, el microorganismo implicado en este brote fue Escheríchia coli 0157:H7 (CDC, 2005). Desde 1970 hasta el momento se han reportado un poco más 50 brotes de enfermedad de etología microbiana en los Estados Unidos de Norte América (USA, por sus siglas en ingles) por el consumo de jugos de manzana crudos.

Este tipo de brotes ha provocado una regulación estricta dentro y fuera de USA para todos los productores de manzana y jugos no pasteurizados, y por supuesto, también para todos los productores de manzana que exportan a USA o a otras partes del mundo como México. Todo esto ha significado que con frecuencia se retengan embarques de manzana en las fronteras, cierre parcial o total de la exportación de este producto a los países y pérdidas económicas por parte de los productores al no cumplir con los estándares microbiológicos.

Cabe señalar que aunque en México no existen reportes de brotes de enfermedad de etiología microbiana asociados al consumo de manzanas crudas enteras o de sus productos crudos como los jugos, debido a las malas prácticas de higiene que generalmente ocurren durante el cultivo, cosecha, transporte y comercialización de las Manzanas, es desesperar la participación de estos productos crudos en brotes de enfermedad. Un hec!ho que sustenta esta observación, es la frecuencia con la que se ha aislado recientemente cepas de Salmonella, grupos patógenos de Escheríchia coli, y otras bacterias patógenas a partir de diferentes productos crudos en México (Castañeda-Ramírez et al., 2011 ; Castro-Rosas et al., 2012). Los recientes brotes de enfermedades alimentaria asociadas con manzana y subproductos crearon la necesidad de determinar las fuentes de contaminación de la manzana y comprender la sobrevivencia y/o crecimiento de microorganismos patógenos en ella; estos han conducido al desarrollo de tecnologías innovadoras de control. En general, los agentes patógenos en las manzanas se podrían controlar mediante la prevención de la contaminación durante el cultivo y la cosecha de los productos, también mediante el uso de desinfectantes con poder antimicrobiano en el producto cosechado, y por el almacenamiento de la manzana a baja temperatura. No obstante, se ha identificado a la desinfección como la etapa de mayor importancia para la inocuidad microbiana de la manzana cruda.

Por lo general las manzanas no se consumen directamente como se cosechan. Después de la cosecha ya sea en el campo o en la industria (y aún en el hogar) reciben tratamientos diversos que tienden a favorecer su conservación y/o inocuidad. La aplicación de lavado y desinfección de las manzanas mejora su imagen microbiana. No obstante, es difícil lograr de manera segura la inactivación o remoción de microorganismos patógenos aún en condiciones extremas de tratamientos que no dañen sensorialmente al las manzanas. La prevención de la contaminación de la manzana es también una estrategia de control porque no se requiere el crecimiento de patógenos para causar enfermedad. Por lo tanto, las medidas de control adicionales pueden ser de valor. Cabe señalar que el comportamiento de los microorganismos patógenos en las manzanas se ve afectado por la ubicación del patógeno en el producto, la calidad del producto, la temperatura de almacenamiento, tipo de embalaje, y la humedad relativa. La superficie de las manzanas, suele tener escasos nutrientes lo que limita el crecimiento de patógenos durante el almacenamiento a temperatura ambiente o de refrigeración.

No obstante, cabe destacar que los microorganismos patógenos como Salmonella o E. coli 0157:1-17 son capaces de sobrevivir por tiempo prolongado en la superficie de las manzanas tanto en refrigeración como a temperatura ambiente (Fisher et al. 1998). Además una vez sobre la manzana, patógenos como Salmonella podría producir polímeros extracelulares sobre la manzana lo que lleva a la formación de una biopelícula que los pueden proteger contra los desinfectantes (Kroupitski et al., 2009); este comportamiento de los microorganismos patógenos se ha observado en diferentes vegetales como por ejemplo en tomates (Iturriaga et al., 2007).

Un hecho a destacar es que los microorganismos patógenos como Salmonella o E. coli 0157:H7, por ejemplo, son capaces de multiplicarse en manzana picada o cortada o e jugo de manzana incrementando de forma muy significativa su concentración y haciendo mucho más peligroso al alimento (Changa y Fang, 2007).

Los microorganismos patógenos en la superficie de las manzanas pueden contaminar los tejidos internos e infiltrase y posteriormente durante el cortado del fruto podrían contaminar el producto picado y crecer en el (Changa y Fang, 2007). Varios hallazgos de la investigación indican que los patógenos bacterianos pueden infiltran en los productos vegetales, como las manzanas (Kroupitski et al., 2009; Bartz, 1982; Guo et al., 2002; Ibarra-Sanchez et al., 2004; Zhuang y Beuchat 1995) cuando hay un diferencial de temperatura entre el producto vegetal y el agua de lavado y por la presión hidrostática cuando los vegetales se sumergen en el tanque de recepción (Bartz, 1982; Bartz y Showalter, 1981).

La infiltración bacteriana aumenta en los vegetales crudos en presencia de heridas y pinchazos. Los patógenos infiltrados no se eliminan por las prácticas normales de lavado. El principal beneficio de la adición de productos químicos antimicrobianos (como los desinfectantes químicos a base de hipoclorito o a base de ácidos orgánicos) al agua de lavado de las manzanas es el control de la propagación de agentes patógenos, su inactivación y/o evitar su infiltración a las manzanas. No obstante, los desinfectantes químicos actualmente disponibles tienen beneficios limitados sobre los productos vegetales, como las manzanas. Se ha estudiado el efecto antimicrobiano de soluciones de hipoclorito, peróxido de hidrógeno, ácido peracético y el agua electrolizada en su capacidad para reducir los agentes patógenos en productos vegetales durante el proceso de lavado. No obstante, se ha concluido que estos tratamientos tienen un efecto limitado sobre los microorganismos patógenos, presumiblemente porque los agentes activos no tienen suficiente contacto con los microorganismos patógenos sobre los productos vegetales crudos.

El proceso de desinfección se refiere a la destrucción física de los microorganismos cuya actividad compromete la inocuidad o las características sensoriales de un alimento. El efecto puede lograrse a través de medios físicos o químicos, estando su eficacia en función de los microorganismos (tipo y número), el substrato sobre el cual se encuentran (presencia de materia orgánica), la estructura del material (que permita el acceso directo del germicida a los microorganismos) y el germicida (concentración, temperatura y tiempo de contacto) (Fernández, 2000). En el proceso de desinfección, la sustancia germicida participa en reacciones químicas, de manera que mientras mayor es el número de microorganismos mayor demanda del agente para lograr una inactivación total de la población. La susceptibilidad a un germicida específico varía entre los microorganismos; algunos se inactivan desde el primer momento de contacto, mientras que en el otro extremo pueden existir sobrevivientes. Finalmente hay que tener presente que entre los microorganismos es posible la selección de cepas con resistencia creciente al efecto de una agente germicida específico. En consecuencia, con el tiempo, llegan a requerirse concentraciones muy superiores del desinfectante a las iniciales para alcanzar el mismo nivel de inactivación (Fernández, 2000).

Diferentes estudios demuestran que los tratamientos de desinfección de productos agrícolas crudos con frecuencia tienen un efecto débil ó limitado. Por ejemplo el lavado y desinfección con 200 mg/L de cloro activo (hipoclorito), de yodo (yodóforo), de bióxido de cloro o de 100 mg/L de un producto comercial a base de extracto de semilla de toronja (citricidal) redujeron el contenido de germinado de alfalfa en sólo 1-2 logio; la disminución de S. typhi o de V. cholerae OI inoculados en el laboratorio no fue mayor a 1.5 logio UFC/g (Castro-Rosas y Escartín, 1999).

La industria de alimentos cuenta con una diversidad de agentes germicidas. Sus virtudes y limitaciones obligan a seleccionar cuidadosamente aquellos que mejor se ajusten a cada necesidad particular (Fernández, 2000). La inactivación de las bacterias patógenas en las plantas procesadores de alimentos es un requisito básico para controlarlas e impedir su acceso al producto terminado (Álvarez, 1998).

Lo común es que un germicida se considere efectivo cuando demuestra capacidad para inactivar al menos 3 Logio de una suspensión de microorganismos en 30s (Fernández, 2000).

Las soluciones a base de cloro son un desinfectante barato y disponible como hipoclorito o en sus formas de liberación lenta (cloraminas, por ejemplo) (Lelieveld et al., 2013). Los hipocloritos tienen un amplio espectro de actividad antibacteriana, aunque son menos efectivos contra esporas que contra bacterias no formadoras de esporas y tienen bajo efecto contra micobactenas (Russell et al., 2004). Las soluciones de cloro como hipoclorito de sodio ó bióxido de cloro, son ampliamente utilizadas por la industria de alimentos como desinfectante. Los dos son oxidantes fuertes que actúan a nivel de las membranas y otros constituyentes celulares (Harmon et al., 1987). No obstante, el primero presenta la desventaja de reaccionar fácilmente con la materia orgánica, por lo que se inactiva más rápido. En el segundo la interferencia es mínima (Castro-Rosas y Escartin, 1999). La principal desventaja del hipoclorito de sodio es que la humedad, el calor, la luz y sobre todo la presencia de materia orgánica, incrementan la tasa de pérdida de cloro libre. La actividad germicida del cloro generalmente ha sido atribuida al ácido hipocloroso (HOCI), el cual es generado en soluciones acuosas de hipoclorito de sodio y otros compuestos que contengan cloro.

Los desinfectantes se pueden incorporar al agua de lavado y de esta forma contribuir a la reducción de la carga microbiana. La efectividad del hipoclorito no solamente es afectada por el tiempo de exposición y la concentración del cloro libre, si no por otros factores como temperatura, pH, tipo de cepa, así como presencia y tipo de materia orgánica (Álvarez, 1998). No obstante, algunos autores señalan que la eficiencia del hipoclorito en la reducción de microorganismos patógenos presentes en verduras es limitada (Adams et al., 1997).

Compuestos químicos derivados del cloro, yodo y plata han sido típicamente usados como desinfectantes de verduras, como las manzanas. Sin embargo, recientemente diversos estudios muestran que los tratamientos de desinfección con estos compuestos resultan ineficientes en la eliminación o reducción de los niveles de patógenos microbianos. Por tal motivo, muchos países han abandonado el uso de hipoclorito o soluciones de yodo para la desinfección de verduras crudas.

Los ácidos orgánicos han sido utilizados tradicionalmente como conservadores de alimentos o en soluciones para desinfectar verduras crudas. Su efecto antimicrobiano se ejerce a través de la forma no disociada causando una baja del pH.

El ácido acético es una sustancia inocua; no existen límites oficiales para la ingesta diaria en el hombre. Cuando se incorpora ácido acético a un alimento se expresan dos efectos, uno acidulante y otro preservativo. A concentración de 1-2% inhibe casi toda la flora total dentro de límites razonablemente elevados de carga inicial. Al 0.1% actúa sobre la mayoría de los patógenos y esporulados; al 0.5% tiene efecto sobre los hongos toxigénicos. Se ha evaluado la eficacia del ácido acético contra algunos patógenos específicos utilizando como medio algunos alimentos. Los informes publicados a menudo son difíciles de comparar por que las concentraciones de ácido han sido variables expresadas como porcentaje, molaridad o pH final del medio de ensayo acidificado. La actividad antimicrobiana depende del tiempo de exposición, temperatura, tipo de ácido, concentración del ácido, nivel de disociación y pH (Harmon et al., 1987). No obstante, los resultados generales demuestran que la eficacia del ácido acético aumenta a medida que aumenta la concentración, disminuye el pH, la temperatura aumenta y la carga microbiana disminuye (Harmon et ai., 1987). Entre las bacterias, las Gram positivas suelen ser más resistentes que las bacterias Gram negativas (Rameshkumar et al., 2007). Las esporas bacterianas y los virus son más resistentes que las células vegetativas. Sin embargo, los ácidos orgánicos han mostrado también poca efectividad para desinfectar verduras crudas (Fernández, 2000).

La investigación reciente indica que los productos químicos antimicrobianos en la fase de vapor pueden reducir significativamente las poblaciones de patógenos en la superficie de vegetales. El uso de 5 mg / litro de gas dióxido de cloro durante 1 h fue significativamente más eficaz contra la Salmonella en la cicatriz del pedúnculo de tomates que eran soluciones acuosas de 200 ppm de hipoclorito de sodio (2 min de exposición) y 1200 ppm de hipoclorito de sodio acidificado (2 min de exposición) (Yuk et al., 2005). El uso de 10 mg / litro de ozono inactiva por completo 7 log UFC de Salmonella enterítidis de la superficie de tomates cherry después de 15 min, sin embargo, se afecta el color de los tomates (Das et al., 2003).

Debido a que los agentes antimicrobianos en fase vapor pueden ser eficaces contra bacterias adheridas a ubicaciones de los productos agrícolas crudos no alcanzadas por los agentes activos en solución acuosa, su uso en los productos envasados (en bolsas de plástico) o durante el procesamiento de productos (en la empresa) podría proporcionar un beneficio extra en el control de patógenos. Sin embargo, este tipo de tratamientos con vapor no sería un tratamiento opcional ni practico para los productores primarios de manzana en campo ya que por lo general los productores venden su producto empacado en cajas cartón o madera entre otras cosas por la facilidad y para evitar acumulación e humedad lo que ocurriría si se usaran bolsas de plástico. Además, este tampoco sería un tratamiento práctico para aplicarlo en los restaurantes o en los hogares.

El uso de sustancias químicas como desinfectantes de verduras crudas para mejorar o preservar su inocuidad, es un procedimiento universalmente utilizado por los productores. Sin embargo, algunos de estos antimicrobianos pueden resultar tóxicos para los consumidores; es el caso de las soluciones de hipoclorito. Reportes recientes señalan que el hipoclorito en solución puede formar precursores de cáncer. Además, muchos de los desinfectantes químicos, como las soluciones a base de yodo o plata coloidal, muestran limitado o variado efecto antimicrobiano en productos como las verduras crudas; una situación similar ocurre con los conservadores para alimentos. Debido a ello, los desinfectantes y conservadores obtenidos a partir de plantas recientemente han surgido como una alternativa viable, ya que estos podrían tener igual o mayor potencial antimicrobiano y con un mínimo riesgo para los consumidores.

La aplicación de extractos del ajo en fruta fresca contra enfermedades poscosecha han obtenido el control completo de la putrefacción marrón de los melocotones causados por el Monilinia fructicola (Roller, 2003). Yucel y Karapinar (2005) evaluaron la reducción de S. typhimurium en cebollas mediante la aplicación de jugo de limón, vinagre y sus mezclas, observando una reducción respectiva de 0.87- 2.93, 0.66-2.92 y 0.86-3.24 Log UFC/g.

Los aceites esenciales provenientes de plantas son capaces de inactivar los patógenos de interés en productos frescos. De 96 diferentes tipos de aceites esenciales examinados, sólo 3 resultaron eficaces contra £. co// ^' 0157:H7 y Salmonella entérica los cuales fueron de orégano, tomillo, y canela. En otro estudio se ensayaron 16 compuestos individuales de los aceites más eficaces contra E. coli 0157:H7 y Salmonella y se encontró que los compuestos más eficaces fueron timol, cinamaldehído, y carvacrol (Friedman et al., 2002). Esta información se obtuvo usando el aceite en la fase líquida. Existe limitada información disponible sobre la eficacia de los aceites esenciales en forma de vapor. En otro estudio, Muñoz (2003) evaluó el efecto de dos concentraciones de carvacrol y el desinfectante comercial Boradantix© (EVESA, Extractos Vegetales S.A.) en la sobrevivencia de L. monocytogenes, P. fíuorescens, E. coli, Erwinia caratovora y S. typhimurium en jugo de Manzana y zanahoria. Todos los microorganismos de estudio fueron inhibidos en ambas concentraciones del carvacrol. Las bacterias estudiadas mostraron mayor sensibilidad hacia el carvacrol que al Boradantix©. Lin et al., (2000) evaluaron el efecto del alil y metil isocianato (AITC/MITC) (componentes clave de mostaza verde) sobre L. monocytogenes, E. coli 0157:H7 y S. montevideo, inoculadas sobre la superficie de tomate. AITC fue más efectivo contra Salmonella y £. coli, lográndose 8 Log de reducción con un tratamiento de vapor generado de 400 μΙ de AITC después de 4 y 2 días, respectivamente sobre manzana. También se alcanzaron 8 Log de reducción de S. Montevideo sobre cutícula de tomate con 500 μΙ de AITC.

Han sido relativamente pocos los estudios de la acción antimicrobiana de los aceites esenciales en sistemas modelo de alimentos y en alimentos verdaderos. Sin embargo, la eficacia de aceites esenciales in vitro es a menudo mucho mejor que in vivo o in situ, es decir en alimentos. Generalmente al aplicar un antimicrobiano de plantas a un alimento o in vitro se necesitan de 10 a 100 veces más concentración de antimicrobiano que lo observado in vivo. Por ejemplo, el aceite esencial de la menta (Mentha piperita) ha demostrado inhibir el crecimiento de Salmonella enteritidis y L. monocytogenes en medios de cultivo por 2 días a 30°C. Sin embargo, el efecto del aceite esencial de la menta en el aperitivos griegos tzatziki (pH 4.5) y el taramasalata (pH 5.0) y en paté (pH 6.8) a 4°C y 10°C fue variable (Roller, 2003). Salmonella enteritidis fue eliminada en aperitivos bajo todas las condiciones examinadas pero no cuando fue inoculado en paté y mantenido a 10°C. En éste mismo estudio, L. monocytogenes se comportó de forma semejante, ya que la cuenta microbiana disminuyó en los aperitivos pero aumentó en el paté (Roller, 2003). El crecimiento de £. coli, Salmonella sp., L. monocytogenes y Staphylococcus aureus fueron inhibidos por el aceite esencial del orégano en caldos de cultivo. Sin embargo, cuando estos aceites se probaron en alimentos tales como berenjena, taramasalata ó mayonesa se observaron reacciones tales como incremento del pH, incremento de temperatura y para el caso de las emulsiones separación del aceite usado (Roller, 2003). En otro estudio L monocytogenes y S. typhimurium fueron inhibidos en carne tratada con aceite esencial de clavo y orégano, respectivamente. Una reducción marcada de Aeromonas hydrophila ha sido también reportada en carne de cerdo cocinada que fue tratada con aceites del clavo o cilantro, empaquetada a vacío o con aire y almacenada a 2°C y 10°C. (Roller, 2003). Las diferencias que se observan entre los estudios de efecto antimicrobiano cuando se aplican directamente los aceites extraídos de plantas sobre los microorganismos (microorganismos en suspensión acuosa) y aquellos en los que existe un alimento o materia orgánica de por medio, es posible que ocurra por la interferencia con los componentes del alimento o de la materia orgánica (proteínas, grasas, azúcares, sales). Por lo tanto, es muy posible que solamente una proporción del aceite esencial adicionado al alimento tenga actividad antibacteriana. Por otra parte, la distribución espacial de las diferentes fases (sólido/líquido) en un alimento y la carencia de homogeneidad de factores como el pH, a _w entre otros, pueden jugar un papel en la eficacia. Debido a todo lo anterior, en diversas partes del mundo se encuentran en curso estudios encaminados a la búsqueda de antimicrobianos alternativos (Jongen, 2005). Entre las nuevas alternativas de desinfectantes se ha optado por compuestos naturales con amplia capacidad antimicrobiana.

Cabe destacar que los extractos obtenidos de algunas plantas han mostrado efecto antimicrobiano contra cepas de patógenos multiresistentes a antibióticos, lo cual, abre todo un campo nuevo para el desarrollo de nuevos antimicrobianos para su uso en humanos y animales.

Como antecedente de la presente solicitud, se ha evaluado el efecto antimicrobiano de alrededor de 60 diferentes plantas usadas en la herbolaria (Cruz- Gálvez et al., 2013); donde algunas de éstas han mostrado un elevado poder antimicrobiano contra diferentes microorganismos patógenos, tales como Salmonella o Escheríchia coli 0157:H7, entre otros, así como contra microorganismos deterioradores de alimentos (Pseudomonas aeruginosas, por ejemplo), y la planta que mayor efecto antimicrobiano ha mostrado han sido los cálices de la flor de jamaica, siendo en algunos casos mayor el efecto antimicrobiano que el de desinfectantes comerciales a base de hipoclorito, yodo, plata coloidal o que el de antibióticos como la penicilina. Los extractos de los cálices de jamaica los hemos separado mediante cromatografía en columna para obtener fracciones con mayor poder antimicrobiano; con fracciones seleccionadas se han elaborado soluciones que han sido evaluadas para determinar su potencial antimicrobiano. De hecho, diferentes investigadores ha reportado también que los cálices de la flor de Jamaica (Hibiscus sabdaríffa L) poseen sustancias con elevado poder antimicrobiano (Aziz et al., 1998; Fernández et al., 1996; Kang er a/., 2007).

La jamaica es una de las plantas en las que recientemente se ha reportado presencia de compuestos antimicrobianos en cálices deshidratados (Aziz et al., 1998; Fernández et al., 1996; Kang et al., 2007). En los cálices de la flor de Jamaica se han detectado una gama de compuestos fitoquímicos que podrían ser los responsables del efecto antimicrobiano observado, tales como por ejemplo los polifenoles (Tajkarimi et al., 2010), entre ellos algunos ácidos fenólicos (Tajkarimi ef al., 2010), así como flavonoides, catequinas y epicatequinas (Friedman et al. 2002). No obstante, no existen estudios puntuales que muestren cuales son efectivamente las moléculas o compuestos químicos responsable del efecto antimicrobiano observado en los cálices de Jamaica. Diferentes investigadores coinciden en que es necesario realizar mayores estudios para identificar las moléculas específicas y responsables del efecto antimicrobiano provocado por los cálices de Jamaica en solución.

Escasos son los documentos de patente que describen extractos de los cálices de la flor de Jamaica (Hibiscus sabdaríffa ) y su uso como material con propiedades antimicrobianas.

Por ejemplo, la solicitud de patente JP2002128602 describe su uso en una composición agroquímica para proteger plantas en campos de sembradíos, mientras que la solicitud US20100323046 describe el empleo de un extracto crudo de los cálices de Jamaica para producir un medicamento para tratar infecciones urinarias causadas por Escherichia coli y Candida albicans.

En la solicitud de patente KR20080092186 se describe un extracto de Jamaica que es empleado para mejorar la calidad de la carne de res, puerco y pollo y para incrementar su estabilidad de almacenaje. El extracto es preparado mediante extracción con etanol y sometido a un proceso de secado en frío. La concentración del extracto en la composición es de 500 mg/ml y se trata la carne con una preparación del 0.5-al 3.0 % (por peso). Por otro lado, en la solicitud US20120015062 se describen composiciones que comprenden extracto de la planta Agapanthus afrícanus y composiciones que comprenden este extracto mas otros extractos de otras plantas diferentes, como por ejemplo plantas de la familia Rosa o de alfalfa para usarse como agentes en la protección biológica de otras plantas incluyendo sus semillas. A pesar de que en este documento de solicitud de patente se hace referencia al artículo publicado por Leksomboon et al. (Kasetsart, Journal Natural Science 35: 392-396, 2001.) en donde se menciona que extractos obtenidos de diversas plantas (Hibiscus sabdariffa, Psidium guctjava, Púnica granatum, Spondias pinnata and Tamaríndus indica) tienen una función antimicrobiana, dicho documento no aporta ninguna evidencia experimental que involucre los extractos de Hibiscus sabdariffa para el mismo uso que se le da a los extractos de Agapanthus afrícanus.

Por lo anterior, es necesario contar con composiciones antimicrobianas protectoras efectivas para evitar y/o combatir la contaminación microbiana de los alimentos, principalmente de aquellos que se consumen crudos, como por ejemplo las manzanas, con la finalidad de preservarlos y consumirlos sin el riesgo de adquirir enfermedades causadas por su contaminación con microorganismos patógenos.

Hasta antes de la presente invención, no había sido posible desarrollar composiciones efectivas para desinfectar eficientemente y sin daño al producto como las descritas aquí, y que al mismo tiempo permitieran conservar las propiedades nutritivas de frutas y verduras y no afectar, por ejemplo la calidad de las manzanas, con lo cual es posible con la presente invención obtener manzanas crudas inocuas. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Se muestra el espectro de resonancia magnético nuclear (RMN) de

PROTÓN ( ¹ H) del extracto acetónico seco obtenido de los cálices de jamaica que se utilizó en la presente invención. Figura 2. Se muestra el espectro de resonancia magnético nuclear (RMN) de PROTÓN ( ¹ H) de la colección de fracciones denominada como III que fue obtenida a partir de un extracto acetónico de los cálices de Jamaica y que fue la colección que se utilizó en la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

De acuerdo con los problemas mencionados anteriormente, existe la necesidad de proveer una formulación de mayor eficacia para inactivar o remover microorganismos patógenos de la manzana (Malus domestica) aún en condiciones extremas de tratamiento, pero que no dañen sensorialmente el alimento.

La presente invención se refiere a composiciones que contienen fitoquímicos presentes en extractos de plantas que son utilizados como desinfectantes de alimentos de origen vegetal y animal, por ejemplo dirigidos a la desinfección y preservación de frutas y hortalizas, particularmente a la desinfección y/o preservación de manzana (Malus domestica). Una modalidad de la presente invención se refiere a la obtención de un preparado vegetal que comprende un extracto metanólico de los cálices de la flor de Jamaica (Hibiscus sabdaríffa) ó fracciones cromatográficas especificas obtenidas del extracto acetónico de los cálices de Jamaica, los cuales son útiles para eliminar agentes patógenos presentes en los alimentos (efecto desinfectante) y para retrasar el deterioro de los alimentos o preservar su inocuidad (efecto conservador).

Otra modalidad de la presente invención se refiere a la obtención de extractos derivados de plantas que son utilizados como desinfectantes contra microorganismos patógenos presentes en los alimentos y para retrasar el deterioro de los alimentos y/o preservar su inocuidad, es decir, como conservadores para alimentos, los que constituyen una alternativa al uso de desinfectantes tradicionales que pueden llegar a ser tóxicos al ser humano, a los animales o al medio ambiente. Otra modalidad de la presente invención se refiere a la elaboración de composiciones que contengan el extracto de los cálices de jamaica (Hibiscus sabdaríffa L.) que tengan una función desinfectante y conservadora de alimentos conjuntamente con otros compuestos que tengan propiedades desinfectantes por ejemplo ácido acético, hipoclorito, etc.

Otra modalidad de la presente invención se refiere a la obtención de extractos obtenidos a partir de cálices de jamaica que tienen un efecto desinfectante o conservador cuando son aplicados a alimentos. Un aspecto de esta modalidad se refiere a la aplicación de extractos obtenidos a partir de cálices de la planta de jamaica (Hibiscus sabdaríffa L.) que tienen un efecto desinfectante o conservador cuando son aplicados a alimentos de origen vegetal, preferentemente manzana.

Otra modalidad de la presente invención es el desarrollo de un método para la obtención del extracto acetónico a partir de cálices de Jamaica, extracto que resulta ser útil como desinfectante y conservador de alimentos.

Otra modalidad de la presente invención se refiere al método para obtener fracciones cromatográficas especificas y con efecto antimicrobiano obtenidas del extracto acetónico de los cálices de jamaica, los cuales son útiles para eliminar agentes patógenos presentes en los alimentos (efecto desinfectante) y para retrasar el deterioro de los alimentos o preservar su inocuidad (efecto conservador).

Otra modalidad de la presente invención es un método de tratamiento y/o conservación de alimentos de origen animal y/o vegetal mediante la aplicación de composiciones que contienen extractos de cálices de jamaica que permiten la desinfección y su conservación de los mismos.

El uso de los extractos de cálices de jamaica como desinfectante y/o conservador de alimentos, es otra modalidad que se describe en la presente invención.

Los compuestos provenientes de los cálices de Jamaica pueden ser de utilidad en la elaboración de un desinfectante eficiente para eliminar a las bacterias patógenas presentes en las verduras crudas, tal como las manzanas. En la presente invención se describe un extracto de cálices de jamaica y una fracción especifica obtenida por cromatografía en columna a partir de un extracto acetónico de los cálices de jamaica, que comprende fitoquímicos, el cual puede ser utilizado como desinfectante y/o conservador de alimentos debido a su eficiencia en la eliminación de bacterias patógenas de verduras crudas tales como manzanas.

A diferencia de otras composiciones conocidas hasta ahora para el mismo fin, las composiciones de la presente invención son capaces de eliminar a las bacterias patógenas presente en verduras crudas, como por ejemplo manzanas per se, sin alterar sus propiedades alimenticias así como las características de calidad del producto. En consecuencia, la aplicación de las composiciones de la presente invención en verduras crudas, permite su conservación, así como su desinfección efectiva, lo que los convierte en alimentos seguros para su consumo. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Las composiciones de la presente invención comprenden extractos de plantas con conocida actividad antimicrobiana, como por ejemplo extractos acetónicos de Jamaica y fracciones cromatográficas especificas obtenidas del extracto acetónico de los cálices de jamaica, ya sean solos o en combinación con otros componentes con probada actividad desinfectante, tales como por ejemplo ácidos orgánicos que incluyen ácido acético y compuestos de cloro que incluyen hipoclorito de sodio. Para el caso de la desinfección de verduras crudas tales como por ejemplo manzanas, las composiciones de la invención que incluyen una mezcla de extractos acetónicos de plantas con actividad antimicrobiana así como ácido acético e hipoclorito de sodio y polisorbato, y una mezcla de fracciones cromatográficas especificas obtenidas del extracto acetónico de los cálices de jamaica así como ácido acético e hipoclorito de sodio y polisorbato, suelen ser muy efectivas para eliminar los microorganismos residentes en el vegetal, logrando al mismo tiempo que sus propiedades organolépticas y/o nutricionales no se vean afectadas y sin que se altere, por ejemplo la calidad comercial de las manzanas.

Para efectos de la presente invención, las composiciones descritas aquí, comprenden: a) Extractos derivados de plantas, los cuales exhiban propiedades antimicrobianas, como por ejemplo extractos derivados de cálices de jamaica (Hibiscus sabdariffa),

b) Fracciones cromatográfica obtenidas del extractos acetónicos derivados de plantas, las cuales exhiban propiedades antimicrobianas, como por ejemplo fracciones cromatográfica obtenidas de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa),

c) Un acido orgánico con actividad desinfectante, como por ejemplo ácido acético, ácido láctico, acido cítrico, ácido peracético, ácido octanoico, ácido peroxietanoico y ácido 1-hidroxietiliden-1,1-difosfónico, y mezcias de los mismos, en una concentración p/p de 0.01% a 10%, preferentemente de 0.1% a 1%,

d) Un compuesto de cloro con actividad desinfectante, como por ejemplo hipoclorito de sodio, hipoclorito de calcio, bióxido de cloro y mezclas de los mismos en una concentración p/p de 0.001% a 10%, preferentemente de 0.001% a 0.1%, y e) Un tensoactivo con actividad emulsificante de las grasas o ceras naturales que se encuentran en la superficie de las manzanas como por ejemplo, polisorbatos, Polisorbato 80, Polisorbato 20, alquil C12-C18 dimetil betaína (cocobetaína, alquil C10-C16 dimetilbetaína (laurilbetaína), Sulfobetaína acil (C10-C14 graso) amidopropilen(hidroxipropilen), sulfobetaína, Ciclodextrinas, B-ciclodextrinas y β- Cyclodextrin y mezclas de los mismos en una concentración p/p de 0.1% a 5%, preferentemente de 0.5% a 1%. Para efectos de la invención, las composiciones se agregan a los alimentos a desinfectar y/o preservar a través de métodos conocidos en el arte, tales como aplicación directa, a través de aerosoles, la inmersión completa de las frutas y verduras en las soluciones desinfectantes o bien mediante dispositivos que permitan su adecuada dispersión en los alimentos a tratar. Las composiciones de la invención pueden adicionarse o ponerse en contacto con los alimentos en una cantidad de 0.1 mL por 1000g de alimento, preferentemente de 0.1 a 1mL por 100g de alimento, o bien adicionarse en volúmenes mayores conforme a las necesidades que se tengan de desinfección del alimento. Después de aplicadas, las composiciones pueden permanecer el tiempo necesario hasta obtener el efecto desinfectante y/o de preservación deseado en las frutas y verduras. Previo a su consumo, las frutas y verduras tratadas con las composiciones descritas aquí simplemente se lavan con agua potable para eliminar dichas composiciones. Las composiciones descritas aquí, pueden ser obtenidas mediante la mezcla de sus componentes en las concentraciones deseadas, para posteriormente almacenarlas a temperatura ambiente, con lo que se encuentran listas para aplicarse a los alimentos cuando se considere necesario. Para efectos de la invención, las composiciones descritas aquí pueden contener solamente extractos vegetales con actividad antimicrobiana, como por ejemplo extractos derivados de cálices de Jamaica, o bien fracciones cromatográficas obtenidas a partir de los extractos acetónicos de los cálices de Jamaica, los cuales se ponen en contacto con los alimentos, por ejemplo a alimentos de origen vegetal crudos como las manzanas, con la finalidad de desinfectarlos y/o preservarlos. En la presente invención, se describe la actividad desinfectante de extractos derivados de Jamaica y de fracciones cromatográficas obtenidas a partir de los extractos de los cálices de Jamaica, en la desinfección y/o preservación de alimentos, por ejemplo frutas y verduras crudas, por lo que pueden usarse directamente o bien formando parte de composiciones que las contengan. En este sentido, los extractos o fracciones cromatográficas derivados de los cálices de Jamaica, pueden adicionarse o ponerse en contacto con los alimentos a desinfectar y/o preservar en una concentración p/p de 0.001% a 10%, preferentemente de 0.1% a 1%. La efectividad desinfectante y/o de preservación en los alimentos de las composiciones descritas aquí es tal, que inactiva o elimina a lasiiacterias patógenas al humano o deterioradoras de alimentos que puedan estar resentes en ellos, mientras que al mismo tiempo no afecta las propiedades organolépticas y/o nutritivas del alimento. En el caso de alimentos frescos como por ejemplo manzana, las composiciones de la invención desinfectan adecuadamente el alimento sin afectar sus propiedades alimenticias, mientras que al mismo tiempo no afectan las propiedades organolépticas o de calidad. Los extractos vegetales de la presente invención y las fracciones cromatográficas puede ser obtenidos mediante el método siguiente: a) Colocar la planta seca en un recipiente en condiciones asépticas, añadir acetona en proporción 1:9; preferentemente se colocan 100 g de la planta seca en un recipiente (matraz) en condiciones asépticas, se añaden 900 mi de metanol y se deja reposar durante 7 días;

b) Retirar los cálices y recuperar el extracto acetónico; preferentemente el extracto resultante se recupera previa presión en las paredes del matraz para retirar el exceso de líquido;

c) Pasar el extracto por un tamiz y recuperar el extracto filtrado; preferentemente el extracto se pasa por un tamiz No. 200;

d) Retirar la acetona del extracto mediante rota-evaporación a una temperatura de 40°C, una rotación de 80 rpm y una presión a vacío de 72 mbar;

e) Recuperar el extracto seco; preferentemente en un contener previamente estéril; f) Obtener fracciones de los extractos acetónico mediante cromatografía en columna empleando solventes de diferente polaridad;

g) Eliminar el solvente de las fracciones obtenidas mediante rota-evaporación a una temperatura de 40°C, una rotación de 80 rpm y una presión a vacío de 72 mbar; y h) Recuperar las fracciones secas; preferentemente en un contenedor.

Obtenidos los extractos y las fracciones, éstas se almacenan a temperatura ambiente hasta su uso. Una vez obtenidos los extractos y las fracciones cromatográficas, éstas puede utilizarse solas, o bien en combinación con otros desinfectantes para obtener las composiciones de la invención, las cuales pueden ser obtenidas mediante métodos conocidos en el arte donde implique la combinación de los diversos elementos que las conforman para formar soluciones y/o suspensiones capaces de ser aplicadas posteriormente a los alimentos a desinfectar y/o preservar, mediante métodos conocidos en el arte.

La presente invención constituye el primer reporte de la utilización y efectividad de composiciones que contienen extractos vegetales con actividad microbiana, ya sea solos o en combinación con otros desinfectantes, para la desinfección y/o preservación de alimentos, particularmente de frutas y hortalizas, como por ejemplo manzana. Como podrá observarse más adelante, las composiciones de la invención son capaces de desinfectar y/o eliminar microorganismos presentes en manzanas de forma muy eficiente, con lo que es posible contar con manzanas inocuos raÉctobiológicamente y seguros para su consumo.

A continuación se incluyen los siguientes ejemplos con la única finalidad de ilustrar la presente invención, sin que ello implique limitación alguna a su alcance. Ejemplo 1. Materiales y métodos.

1.1. Material vegetal.

Se usaron cálices secos de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) de la variedad criolla de Oaxaca, mientras que en el caso de la manzana {Malus domestica) se utilizó la variedad Golden Delicious. Las manzanas tuvieron un tamaño uftiforme.

1.2. Cepas bacterianas.

Se utilizaron cepas de E. coli 0157:H7 (P1C6, aislada de un brote de enfermedad), £ coli enteroinvasiva (4VC81-5, aislada de caso clínico) E. coli enterotoxigénica (1620 TL, aislada de caso clínico), E. coli enteropatógena (52 GM 291, aislada de caso clínico), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Salmonella choleraesuis (ATCC 10708), Listería monocytogenes (ATCC 19115), Listería monocytogenes Scott A, Staphylococcus epidermis (ATCC 12228), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Bordetella (ATCC 12741) Shigella sonnei (ATCC 25931) y Shigella flexneri (ATCC 12022), V. cholerae (87151 , serotipo Inaba aislada del ambiente) y Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853). Las cepas de E. coli 0157:H7 y la de V. cholerae OI fueron donadas por el Dr. Fernández Escartin de la Universidad Autónoma de Querétaro. Todas las cepas fueron marcadas con resistencia al antibiótico rifampicina (R+) para eliminar la interferencia de la flora microbiana nativa del extracto (Castro-Rosas y Escartín, 2000). Ésta resistencia al antibiótico se mantuvo en el transcurso durante todo el estudio. Las cepas se mantuvieron a 4 - 7°C en agar base sangre (ABS, Merck®, Alemania) con transferencias quincenales, activándose en caldo soya tripticaseína (CST, Bioxon®, México) con incubación a 35°C/24h. 1.3. Obtención de extracto acuoso a partir de los cálices de Jamaica.

Bajo condiciones asépticas 100 g de cálices de Jamaica fueron colocados en un matraz Erlenmeyer, a los cuales se les adicionó 900 ml_ de agua destilada, llevando a ebullición la mezcla durante 20 minutos. Una vez finalizado el tratamiento se dejó enfriar a temperatura ambiente. Los cálices fueron retirados del extracto (previa presión en las paredes del matraz para retirar el exceso de líquido de ello) y posteriormente el extracto se pasó por un tamiz No. 200 (MONTIMAX) para eliminar partículas. Finalmente se retiró toda el agua del extracto por rota evaporación empleado un rota evaporador (Buchi R-205) empleando las condiciones siguientes: temperatura de 40°C de la tina, rotación de 80 rpm y una presión a vacío de 72 mbar. El extracto seco se recuperó en un frasco estéril y se almacenó a temperatura ambiente hasta su uso.

1.4. Obtención de extracto metanólico y acetónico a partir de los cálices de Jamaica.

Bajo condiciones asépticas 100 g de cálices de Jamaica fueron colocados en un matraz Erlenmeyer, a los cuales se les adicionó 900 mL de metanol o acetona y se almacenaron durante 7 días a temperatura ambiente. Una vez finalizado el tratamiento los cálices fueron retirados del extracto (previa presión en las paredes del matraz para retirar el exceso de líquido de ello) y posteriormente el extracto se pasó por un tamiz No. 200 (MONTIMAX) para eliminar partículas. Finalmente se retiró todo el metanol o acetona del extracto por rota evaporación empleado un rota evaporador (Buchi R-205) empleando las condiciones siguientes: temperatura de 40°C de la tina, rotación de 80 rpm y una presión a vacío de 72 mbar. Los extractos secos (metanólico o acetónico) se recuperaron por separado en frasco estéril y se almacenó a temperatura ambiente hasta su uso.

1.5. Obtención de fracciones a partir del extracto metanólico mediante cromatografía en columna

Una vez que se ha obtenido el extracto seco (libre de solventes), éste se mezcló con silica (con el fin de hacer manejable el extracto, ya que este aun tenía humedad), este se agregó a la columna empaquetada. Se colocó algodón en el fondo de la columna con ayuda de una varilla para evitar que se desprendiera el gel de sílice cuando se abría la llave, se sujetó la columna con dos pinzas y se aseguró de tal manera que estuviera recta. Se mezcló el gel sílice con hexano aproximadamente 8:1g. (gel sílice: extracto), esta cantidad se mezcló con hexano hasta obtener una pasta fluida, se vertió la pasta en la columna, la cantidad de hexano agregada debió ser la suficiente para evitar que la silica se secará o ingresará aire a la pasta, posteriormente se agregó poco a poco el extracto, se le agregó una pequeña capa de sulfato de sodio (este sirve como secante), encima de este se le puso una capa de algodón para amortiguar la caída del disolvente al ser agregado y así evitar la dispersión del sulfato de calcio y el extracto, después de este procedimiento se llenó la columna con el disolvente (hexano) y se abrió la llave para comenzar a bajar las fracciones con las diferentes mezclas de solventes, recuperándolas en cantidades de 50 mi cada una, que posteriormente se evaporaron con ayuda del rotaevaporador, y estas fueron colocadas en viales, considerando cada una de estas como una fracción. Para cambiar la mezcla de solventes se realizó cromatografía en placa fina, y al encontrar diferencias claramente visibles (por la aparición de bandas distintas en tamaño y forma) entre fracciones la mezcla se cambiaron de menor a mayor polaridad (hexano, acetato de etilo y metanol) en la tabla 1 se muestran las mezclas de solvente utilizadas y con las que se eluyó.

Tabla 1. Solventes y mezclas utilizados para la obtención de fracciones a partir del extracto metanólico

De un total de 28.5 g de extracto metanólico se obtuvieron 193 fracciones de las cuales después de determinar la semejanza de las fracciones mediante cromatografía en capa fina se obtuvieron 7 colecciones de fracciones (Tabla 2). Tabla 2. Número de fracciones reunidas en cada colección obtenidas a partir del extracto metanólico

1.6. Obtención de fracciones a partir del extracto acetónico mediante cromatografía en columna.

Una vez que se ha obtenido el extracto seco (libre de solventes), éste se mezcló con silica (con el fin de hacer manejable el extracto, ya que este aun tenía humedad), este se agregó a la columna empaquetada. Se colocó algodón en el fondo de la columna con ayuda de una varilla para evitar que se desprendiera el gel de sílice cuando se abría llave, se sujetó la columna con dos pinzas y se aseguró de tal manera que estuviera recta. Se mezcló el gel sílice con cloroformo aproximadamente 8:1g. (gel sílice: extracto), esta cantidad se mezcló con cloroformo hasta obtener una pasta fluida, se vertió la pasta en la columna, la cantidad de cloroformo agregada debió ser la suficiente para evitar que la silica se secará o ingresará aire a la pasta, posteriormente se agregó poco a poco el extracto, se le agregó una pequeña capa de sulfato de sodio (este sirve como secante), encima de este se le puso una capa de algodón para amortiguar la caída del disolvente al ser agregado y así evitar la dispersión del sulfato de calcio y el extracto, después de este procedimiento se llenó la columna con el disolvente (cloroformo) y se abrió la llave para comenzar a bajar las fracciones con las diferentes mezclas de solventes, recuperándolas en cantidades de 50 mi cada una, que posteriormente se evaporaron con ayuda del rotaevaporador, y estas fueron colocadas en viáles, considerando cada una de estas como una fracción. Para cambiar la mezcla de solventes se realizó cromatografía en placa fina, y al encontrar diferencias entre fracciones la mezcla se cambiaron de menor a mayor polaridad (cloroformo-acetona) en la tabla 3 se muestran las mezclas de solvente utilizadas y con las que se eluyó. Tabla 3. Disolventes y mezclas utilizadas para la obtención de fracciones a partir del extracto acetónico

De un total de 20.5 g de extracto acetónico se obtuvieron 117 fracciones de las cuales después de determinar la semejanza de las fracciones mediante cromatografía en capa fina se obtuvieron 7 colecciones de fracciones (Tabla 4).

Tabla 4. Numero de fracciones reunidas en cada colección obtenidas a partir del extracto acetónico

Finalmente se retiró todo el metanol o acetona de cada colección por rota evaporación empleado un rota evaporador (Buchi R-205) empleando las condiciones siguientes: temperatura de 40°C de la tina, rotación de 80 rpm y una presión a vacío de 72 mbar. Las colecciones secas (metanólico o acetónico) se recuperaron por separado en frascos limpios y se almacenaron a temperatura ambiente hasta su uso. 1.7. Determinación de la actividad antimicrobiana de los extractos acuosos, metanólico y acetónico, del acido acético, hipoclorito y de las fracciones correspondientes provenientes de los cálices de Jamaica en medio de cultivo (estudios in vitro).

1.7.1. Preparación del inóculo de las cepas.

Tubos de ensayo con cultivos de 24 h en CST de cada cepa R+, fueron centrifugados a 3500 rpm por 20 min. Posteriormente se desechó el sobrenadante; el paquete celular se resuspendió agregando 3 mL de solución salina isotónica estéril y se agitó en vortex por 10 s. El procedimiento anterior se repitió dos veces más. Posteriormente, la concentración de cada cepa fue de aproximadamente 1x10 ⁹ UFC /mL. Finalmente cada cepa se diluyó decimalmente en solución salina isotónica una sola ocasión. 1.7.2. Preparación de las soluciones de los extractos o de las fracciones.

A partir de los extractos secos o fracciones (colecciones) secas se prepararon soluciones acuosas empleando agua destilada estéril o una solución de Polisorbato 80: agua en una proporción 20:80. Los extractos acuosos y metanólico y fracciones acetónicas (fracción III) y metanólicas (fracción IV) y se solubilizaron en agua destilada mientras que los extractos acetónicos y fracciones no polares o de polaridad baja fueron solubilizados en la solución de Polisorbato 80:agua. A el agua o a el polisorbato 80: agua se les agregaron los extractos secos o fracciones en una proporción 1 :10 y 1 :100 (agua:extracto ó agua:fracción) por separado y se depositarán en frascos estériles.

1.7.3 Efecto antimicrobiano de los extractos y las fracciones en medio de cultivo.

Por separado, 100 iL de la primera dilución de los cultivos de los patógenos fueron inoculados sobre cajas de AST suplementadas con 10 mg/L de el antibiótico rifampicina, el inoculo se distribuyó en toda la superficie del agar mediante la técnica de extensión por superficie. Sobre las cajas inoculadas, por separado, se colocaron alícuotas de 10 μί de la solución de los extractos (acuoso, metanólico o acetónico), o de las fracciones cromatográficas. Se realizaron cuatro repeticiones para cada tratamiento. Después de que el extracto o fracciones fueron absorbidos por el agar, las cajas de cultivo se incubaron a 35 ± 1°C, por 24 h. Finalmente se midió el diámetro de cada uno de los halos de inhibición formados en la superficie del medio inoculado.

1.8. Evaluación del efecto antimicrobiano de los extractos acuoso, metanólico, acetónico, fracciones cromatográficas y formulaciones especificas en la reducción de Salmonella y E. coli 0157:H7 en el manzana contaminada.

1.8.1. Preparación de las soluciones desinfectantes.

Las soluciones de extractos de cálices de Jamaica, mezclas a base de extractos y fracciones cromatográficas así como las mezclas conteniendo acido acético, hipoclorito y/o polisorbato 80 % fueron preparadas a las concentraciones, proporciones o mezclas que se describen en la Tabla 5. Por ejemplo, para preparar 100 mi de una solución conteniendo extracto metanólico de cálices Jamaica al 1 %, acido acético al 0.1 % y 100 mg/L de hipoclorito: a 100 mL de agua destilada se le agregó 1 g de extracto metanólico seco de cálices de Jamaica, además 1 mi de una solución de acido acético al 10 % y 0.2 mi de una solución de hipoclorito al 5 %.

18.2. Cepas.

Para éstos estudios se trabajó con 7 serotipos de Salmonella: (3 typhimuríum [ATCC 14028, uno aislado de tomate, J1 , y otro de semilla de alfalfa, GA1], Salmonella choleraesuis [ATCC 10708], typhi, geminara, y ontevideo) y 3 de E. coli 0157:H7 (dos aisladas en nuestro laboratorio a partir de carne cruda molida de res [P1C6 y M5C8] y otra aislada de un brote provocado por consumo de carne en los Estados Unidos de Norteamérica [E09]), esta cepa fue donada por el Dr. Eduardo Fernández Escartin de la Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo. A partir de las cepas nativas se obtuvieron cepas mutantes resistencia al antibiótico rifampicina (R+), esto para ser usadas en los estudios. Al incorporar el antibiótico al medio de cultivo para monitorear el comportamiento de las cepas mutantes se eliminaría la interferencia de la flora microbiana nativa de los extracto, fracciones y material vegetal de estudio (Castro- Rosas y Escartin, 2000).

1.8.3. Preparación del inóculo de las cepas.

Tubos de ensayo con cultivos de 24 h en CST de cada cepa R+, fueron centrifugados a 3500 rpm por 20 min. Posteriormente se desechó el sobrenadante; el paquete celular se resuspendió agregando 3 mL de solución salina isotónica estéril y se agitó en vortex por 10 s. El procedimiento anterior se repitió dos veces más. La concentración resultante de cada cepa fue de aproximadamente 1x10 ⁹ UFC /mL. Un mililitro de cada cepa de Salmonella fue mezclado en un tubo de ensaye vacío para tener una mezcla de las 7 cepas de Salmonella examinadas. Lo mismo se realizó con las cepas de E. coli 0157:H7, para tener una mezcla de las tres cepas de E. coli 0157.Ή7.

Tabla 5. Tratamientos a los que fueron sometidas por separado manzanas contaminadas con las mezclas de las cepas de Salmonella o E. coli OI 57:H7

No Tratamientos

^" 1 Sin tratamiento (control) ~ ^"

2 Extracto acuoso 1%

3 Extracto acetónico 1%

4 Extracto metanólico 1%

5 Fracción acetónica 1%

6 Fracción metanólica 1%

7 Hipoclorito de sodio 100 ppm

8 Ácido acético 0.1 %

9 Ácido acético 0.5 %

10 Extracto acuoso 1 % + ácido acético 0.1%

11 Extracto acuoso 1 % + ácido acético 0.5%

12 Extracto acetónico 1 % + ácido acético 0.1%

13 Extracto acetónico 1% + ácido acético 0.5%

14 Extracto metanólico 1 % + ácido acético 0.1%

15 Extracto metanólico 1 % + ácido acético 0.5%

16 Fracción acetónica 1 % + ácido acético 0.1%

7 Fracción acetónica 1 % + ácido acético 0.5%

18 Fracción metanólica 1 % + ácido acético 0.1 %

19 Fracción metanólica 1% + ácido acético 0.5%

20 Extracto acuoso 1% + ácido acético 0.1% + hipoclorito de sodio 100 ppm

21 Extracto acuoso 1% + ácido acético 0.5% + hipoclorito de sodio 100 ppm

22 Extracto acetónico 1 % + ácido acético 0.1 % + hipoclorito de sodio 100 ppm

23 Extracto acetónico 1% + ácido acético 0.5% + hipoclorito de sodio 100 ppm

24 Extracto metanólico 1% + ácido acético 0.1% + hipoclorito de sodio 100 ppm

25 Extracto metanólico 1% + ácido acético 0.5% + hipoclorito de sodio 100 ppm

26 Fracción acetónica 1% + ácido acético 0.1% + hipoclorito de sodio 100 ppm

27 Fracción acetónica 1% + ácido acético 0.5% + hipoclorito de sodio 100 ppm

28 Fracción metanólica 1 % + ácido acético 0.1 % + hipoclorito de sodio 100 ppm

29 Fracción metanólica 1% + ácido acético 0.5% + hipoclorito de sodio 100 ppm

30 Extracto acuoso 1%+ácido acético 0.1%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 80 2%

31 Extracto acuoso 1%+ácido acético 0.5%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 80 2%

32 Extracto acetónico 1%+ácido acético 0.1%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 80 2%

33 Extracto acetónico 1%+ácido acético 0.5%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 80 2%

34 Extracto metanólicol %+ácido acético 0.1%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 80 2%

35 Extracto metanólicol %+ácido acético 0.5%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 802% 36 Fracción acetónica 1%+ác¡do acético 0.1%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 80 2%

37 Fracción acetónica 1%+ácido acético 0.5%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 802%

38 Fracción metanólica1%+ácido acético 0.1%+hipoclorito de sodio100 ppm+Polisorbato 80 2%

39 Fracción metanólica1%+ácido acético 0.5%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato

80 2%

Para la elaboración de las soluciones se empleo como base:

A) el extracto seco de los cálices de Jamaica en la sección anterior, B) Solución de ipoclorito de sodio con el 5 % de hipoclorito libre, C) Ácido acético glacial al 10 %, d) Monooleato de Polioxietileno Sorbitan, o polisorbato 80 (Polisorbato 80), d) Agua destilada estéril a pH 6

1.8.4. Inoculación de las manzanas

Se utilizaron manzanas de la variedad Golden Delicious; los manzanas fueron obtenidos de un productor loca!. Previo a la inoculación, las manzanas fueron limpiadas con un paño limpio para retirar partículas de polvo. Se utilizaron Manzanas de un tamaño uniforme o semejante y que no presentaron daños visibles. Por separado, se inocularon manzanas individuales colocando en la parte central (no en pedúnculo) del fruto y gotas o alícuotas de 10 μί de una suspensión de cada tipo de mezcla de bacteria patógena (Salmonella ó E. coli 0157:H7) conteniendo aproximadamente 1 x 10 ⁷ UFC, los 5 inóculos estuvieron cercanos sin llegar a confluir las manzanas inoculadas se colocaron en una charolas y se introdujeron en una campana bioclimática por dos horas a una humedad relativa de 90±1% y 26.5±1 °C. La finalidad de este tratamiento fue la de provocar la adherencia o infiltración de las células de las bacterias patógenas de estudio para simular las condiciones naturales, en otras palabras, la de tener un modelo que se asemejase en lo posible a lo que ocurre cuando las manzanas se contaminan por las fuentes de contaminación naturales o comunes con las bacterias patógenas. 1.8.5. Tratamiento de desinfección de las manzanas.

Después de las dos horas en la cámara bioclimática, cada fruto se lavó por separado para eliminar los microorganismos que no se adhirieron, el lavado consistió en sumergir y agitar la parte inoculada de la manzana en agua destilada por 10 s, se dejó escurrir la parte lavada a temperatura ambiente hasta sequedad total y posteriormente por separado la parte inoculada de diferentes manzanas se sumergió por 10 min en las diferentes soluciones desinfectantes señaladas en la Tabla 5. Un tratamiento solo con agua destilada sirvió como control positivo. 1.8.6. Recuento de microorganismos sobrevivientes a ios tratamientos

Después del tratamiento, las manzanas se retiraron de la solución desinfectante y para eliminar el desinfectante remanente se sumergió la parte inoculada en agua destilada por 10 s, posteriormente se corto la parte inoculada (un cuadro de aproximadamente 2 x 2 cm y con una profundidad de aprox. 2 cm) con ayuda de un bisturí estéril, cada porción se colocó de manera independiente en una bolsas de plástico y se adicionaron 10 mi de diluyente de peptona. Posteriormente, los materiales se agitaron manualmente presionando y frotando con fuerza la parte inoculada y toda la porción de la manzana desde la parte exterior de la bolsa por un minuto. Después de este tiempo se realizó el recuento de cada bolsa mediante la técnica de vertido en placa empleando agar para métodos estándar (Bioxon, México) adicionado de 100 mg/L de Rifampicina (Sigma, México), las cajas se incubaron a 35°C/24- 8 h. Este procedimiento se realizó por duplicado para cada replica. Cada tratamiento se efectuó por quintuplicado.

1.8.7. Análisis estadístico

Los resultados obtenidos se analizaron estadísticamente con un análisis de varianza de una sola vía (ANOVA) comparando las medias con la prueba de Tukey, con un nivel de significancia del 0.05.

1.9. Resonancia Magnética Nuclear (RMN) del extracto y de la colección IV

Se determinó el espectro de RMN del protón ( ¹ H) tanto del extracto metanólico seco obtenido de los cálices de Jamaica como de de fracciones denominada como "IV" que fue obtenida a partir del extracto metanólico de los cálices de Jamaica y que fue la colección que se utilizó en las formulaciones.

También se obtuvo el espectro de RMN de Carbono ( ¹³ C) solo de la colección de fracciones denominada como "IV" que fue obtenida a partir extracto metanólico de los cálices de Jamaica.

El extracto metanólico secos y/o la colección IV se solubilizaron en agua deuterada. Los espectros de RMN se obtuvieron utilizando un espectrómetro de resonancia magnética nuclear (Varían NMR, 400 MHz). La espectroscopia de RMN estudia los núcleos atómicos. Esta técnica espectroscópica puede utilizarse sólo para estudiar núcleos atómicos con un número impar de protones o neutrones (o de ambos), para determinar las estructuras de los compuestos orgánicos. Esta situación se da en los átomos de ¹ H, ¹³ C, ¹⁹ F y ³¹ P. Este tipo de núcleos son magnéticamente activos, es decir poseen espín, igual que los electrones, ya que los núcleos poseen carga positiva y poseen un movimiento de rotación sobre un eje que hace que se comporten como si fueran pequeños imanes. El espectrómetro de RMN detecta estas señales y las registra como una gráfica de frecuencias frente a intensidad, que es el llamado espectro de RMN

Ejempio 2. Efecto antimicrobiano de los extractos de los cálices de Jamaica.

Los tres tipos de extractos (acuoso, metanólico y acetónico) mostraron un acentuado efecto antimicrobiano (Tabla 6). Todos los microorganismos ensayados fueron inhibidos desde los primeros instantes de contacto. El efecto inhibitorio observado sugiere la presencia de substancias antimicrobianas en los extractos. Este efecto puede provocar un daño letal a la célula o solo causar un efecto subletal ó estrés celular (Busta, 1976). Distintos componentes del vegetal podrían ser los responsables de éste efecto antimicrobiano. Con la finalidad de separar, aislar y/o concentrar las sustancias antimicrobianas presentes en los extractos de los cálices de Jamaica, los extractos se separaron en diferentes compuestos o grupos de compuestos con base en su polaridad; para esto se recurrió a la separación de los compuestos por cromatografía en columna, de esta manera se obtuvieron diferentes grupos de compuestos o grupos de fracciones (colecciones de fracciones, ver metodología). Posteriormente se probó el efecto antimicrobiano de las colecciones de fracciones obtenidas. Debido a que el extracto acetónico y el metanólico tuvieron mayor efecto antimicrobiano que el extracto acuoso, no se separaron por cromatografía los componentes del extracto acuoso. Tabla 6. Efecto antimicrobiano del extracto acuoso de Jamaica diluido 1:10 y el de una solución de penicilina (control) sobre diferentes microorganismos Diámetro de Diámetro de Diámetro de Diámetro de

Tipo de inhibición inhibición inhibición inhibición microorganismo Extracto Extracto Extracto Penicilina acuoso acetónico metanólico (control)

E. co// 11* 13* 14 25

E. co//O157:H7 11 14 14 22

£. coli enteroinvasiva 11 11 13 25

£ coff enteropatógena 10 12 11 20

E. co/; ^'

11 12

enterotoxigénica 12 20

S. aureus 11 13 14 26

V. cholerae OI 11 14 14 22

S. Typhimurium 12 14 14 24

S. Choleraesuis 11 12 12 20

P. aeruginosas 11 13 14 21

S. flexneri 10 12 14 22

S. sonnei 12 14 13 24

L. monocytogenes 10 ¹ 3 14 23

* (mm)

Ejemplo 3. Efecto antimicrobiano de diferentes fracciones cromatográficas.

En las Tabla 7 se muestra el efecto inhibitorio expresado en longitud del halo de inhibición en milímetros (mm), que se observó en cajas de petri sembradas con diferentes microorganismos, por el efecto de diferentes colecciones de fracciones cromatográficas agrupadas por polaridad obtenidas a partir del extracto acetónico de los cálices de Jamaica. Se observa que sólo las colecciones II y III provenientes de extracto acetónico muestran efecto antimicrobiano o inhibitorio. La colección III es la que mostró el mayor efecto antimicrobiano (Tabla 7). Esta fracción III se utilizó para realizar las mezclas o formulaciones que se utilizaron en los experimentos de desinfección de las manzanas. Tabla 7. Efecto antimicrobiano de colecciones acetónica Tipo de Colecció Colecció Colección Colecció Colecció Colecció Colección bacteria n i n ll III n IV n V n VI VII

S.

0 0 14 0 0 0 0

Choleraesuis

E. coli

0 9 * 8 0 0 0 0

0157:H7

S. flexneri 0 19 25 0 0 0 0

S. aureus 0 13 12 0 0 0 0

S.

0 22 18 0 0 0 0

Typhimurium

L

monocytogen 0 18 22 0 0 0 0 es

S. epidermis 0 13 21 0 0 0 0

P.

0 14 19 0 0 0 0 aeruginosas

Bordetella 0 0 12 0 0 0 0

S. sonnei 0 11 18 0 0 0 0 * Halo de inhibición expresado en milímetros (mm); el Cero (0) significa que no se observo efecto inhibitorio.

En las Tabla 8 se muestra el efecto inhibitorio en mm de diferentes colecciones de fracciones cromatográficas agrupadas por polaridad obtenidas a partir del extracto metanólico de los cálices de Jamaica. Se observa que todas las colecciones provocaron halos de inhibición lo cual se interpreta como efecto antimicrobiano de las colecciones. No obstante, la colección IV es la que ^¿ aosfcó- _^ el mayor efecto antimicrobiano (Tabla 8). Esta fracción IV se utilizó para realizar las mezclas o formulaciones que se utilizaron en los experimentos de desinfección de las manzanas. Ejemplo 4. Potencial desinfectante de los extractos y fracciones solos o en mezclas con ácido acético, hipoclorito de sodio y/ó Polisorbato 80.

Se encontró que todos los tratamientos tuvieron efecto antimicrobiano con respecto al control. Los datos de este estudio se encuentran reportados en la tabla 9. Se observa que aunque todos los tratamientos muestran efecto antimicrobiano sólo 4 combinaciones lograron eliminar a niveles no detectables la concentración de las mezclas de cada patógeno: los tratamientos 32, 33, 36 y 37 redujeron 5 log concentración de ambos patógenos (Tabla 9).

Tabla 8. Efecto antimicrobiano de colecciones metanólicas

Tipo de Colecció Colecció Colecció Colección Colecció Colecció Colección bacteria n i n II n III IV n V n VI VII

L

monocytogen 6 10 15 24 12 11 15 es

S. sonnei 8 11 10 30 10 12 6

P.

6 10 11 22 8 8 7 aeruginosas

s.

10 12 13 36 9 13 6

Choleraesuis

S. fíexnerí 14 29 10 12 8

S.

11 32 12 10 10

Typhimurium

Bordetella 10 23 9 13 6

E. co// ^'

17 20 26 14 11 6

0157.H7

S. aumus 13 22 17 30 11 10 7

S.

6 15 12 28 10 12 6 epidermidis

* Halo de inhibición expresado en milímetros (mm); el Cero (0) significa que no se observo efecto inhibitorio

En la presente invención, 4 combinaciones específicas (tratamiento 32, 33, 36 y 37) de tres antimicrobianos y un tensoactivo (polisorbato) se logró la eliminación total de los microorganismos patógenos inoculados sobre las manzanas; esto es un ejemplo de lo que actualmente se conoce como tratamiento de barreras múltiples. Las barreras múltiples son la combinación de tratamientos antimicrobianos que potencian el efecto antimicrobiano global, lo que da como resultado alimentos estables, seguros e inocuos. Por alguna razón, ya al aplicar los extractos acetónicos o las fracciones en o ©

O C C

CD a. (fí (fí Q.

3" 3

3 (ñ 3 <t> o O—i O

O

3 3

1.90 ±0.30

1.50 ±0.30 8 U s 3r

o a ·< ±0.30 1.50 ±0.30 o 8

±0.30 1.20 ±0.30 3 g- (fí CD

0.0 Q. 3 s 3r Q co

CD

1.40 ±0.20 C o ±0.30 CD

CD CD CD

Cabe señalar el posible papel potenciador del polisorbato 80 en el efecto antimicrobiano observado, ya que al ser un tensoactivo es posible que haya favorecido la emulsificación de la cera natural de las manzanas lo cual pudo incrementar el efecto de la solución desinfectante al eliminar o disminuir el efecto protector que la cera estaría proporcionando a los microorganismos inoculados sobre las manzanas

Por lo anterior, las composiciones de la presente invención son una excelente alternativa para la desinfección y/o preservación de alimentos, por ejemplo alimentos frescos, sin que alteren sus propiedades nutritivas. En este sentido, las composiciones descritas aquí, permiten la desinfección efectiva de microorganismos patógenos de frutas y hortalizas, preferentemente manzanas permitiendo el consumo seguro de tales productos.

Ejemplo 5. Espectro de resonancia magnético nuclear (RMN) obtenido del extracto acetónico seco.

El espectro de RMN obtenido del extracto acetónico seco de los cálices de Jamaica se presenta en la Figura 1. En el espectro se observan varios picos característicos del extracto que utilizamos en las formulaciones. Este espectro caracteriza el extracto acetónico usado en las formulaciones antimicrobianas de la tabla 9.

Ejemplo 6. Espectro de resonancia magnético nuclear (RMN) obtenido de la colección cromatográfica III proveniente del extracto acetónico.

De la colección cromatográfica III obtenida a partir del extracto acetónico, se obtuvo el espectro de RMN (Figura 2). Se observan varios y diferentes picos característicos de la colección cromatográfica que utilizamos en las formulaciones. Este espectro caracteriza a la colección cromatográfica III usada en las formulaciones antimicrobianas de la tabla 9. Referencias.

1. Adams M. R. 1997. Microbiología de los alimentos. Editorial Acribia S.A. 2. Álvarez M.B.L 1998. Contaminación, sobrevivencia y desarrollo de Listería monocytogenes durante el procesamiento de brócoli precocido y congelado. Tesis de maestría. Universidad Autónoma de Querétaro.

3. Aziz NH, Farag SE, Mousa LA, and Abo-Zaid MA. 1998. Comparative antibacterial and antifungal effects of some phenolic compounds. Microbios. 93:43-54.

4. Bartz, J. A. 1982. Infiltration of tomatoes immersed at different temperaturas to different depths in suspensions of Erwinia carotovora subsp. carotovora. Plant Dis. 66:302-306.

5. Bartz, J. A., and R. K. Showalter. 1981. Infiltration of tomatoes by aqueous bacterial suspensions. Phytopathology. 71 :515-518.

6. Castañeda-Ramírez, C, Cortes-Rodríguez, V., de la Fuente-Salcido, N., Bideshi, D.K., del Rincón-Castro, M.C., Barboza-Corona, J.E. 2011. Isolation of Salmonella spp. from lettuce and evaluation of its susceptibility to novel bacteriocins of Bacillus thuringiensis and antibiotics. J. Food Prot. 74(2):274-278.

7. Castro-Rosas, J. and Escartín, E.F. 1999. Incidence and germicide sensitivity of Salmonella typhi and Vibrio cholerae OI in alfalfa sprouts. J. Food Safety. 19:137- 146.

8. Castro-Rosas, J., Escartín, E.F., 2000. Survival and growth of V. cholerae 01 , S. typhi and £. coli 0157:H7 in alfalfa sprouts. J. Food Sci. 65:162-165.

9. Castro-Rosas, J., Cerna-Cortés, J.F., Méndez-Reyes, E., Lopez-Hernandez, D., Gómez- Aldapa, C.A., Estrada-García, T. 2012. Presence of faecal coliforms, Escheríchia coli and diarrheagenic E. coli pathotypes in ready-to-eat salads, from an área where crops are irrigated with untreated sewage water. Int. J. Food Microbiol.156: 176-180.

10. CDC (Centers for Disease Control and Prevention). 2005. Epidemiology of Escheríchia coli 0157:H7 Outbreaks, United States, 1982-2002 Available at: httD://wwwnc.cdc.aov/eid/article/11/4/pdfs/04-0739.pdf Consultado: Diciembre 1 , 2013.

11. Changa, J.M., and Fang T.J. 2007. Survival of Escheríchia coli 0157.Ή7 and Salmonella entérica serovars Typhimurium in iceberg lettuce and the antimicrobial effect of rice vinegar against E. coli 0157:H7 Food Microbiol. 24:745-751.

12. Cruz-Gálvez, A. M., C. A Gómez-Aldapa, J. R. Villagómez-lbarra, N. Chavarría- Hernández, J. Rodríguez-Baños, E. Rangel-Vargas, and J. Castro-Rosas. 2013. Antibacterial effect against foodborne bacteria of plants used in traditional medicine in central México: Studies in vitro and in raw beef. Food Control. 32:289-295.

13. Das, E., G. C. Gurakan, and A. Bayinirli. 2003. Effect of controlled atmosphere storage, modified atmosphere packaging and gaseous ozone treatment on the survival of S. enteritidis on cherry tomatoes. Food Microbiol. 23:430-438.

14. Fernández E.E. 2000. Microbiología e inocuidad de los Alimentos. Universidad Autónoma de Querétaro. México.

15. Fernández MA, García MD, and Sáenz MT. 1996. Antibacterial activity of the phenolic acids fractions of Scrophularia frutescens and Scrophutaría sambucifolia. J Ethnopharmacol. 53:11-14.

16. Fisher T,L, and David A. Golden. 1998. Fate of Escherichia co1i 0157:H7 in Ground Apples Used in Cider Production. J Food Protect. 61:1372-1374.

17. Friedman, M., P. R. Henika, and R. E. Mandrell. 2002. Bactericidal activities of plant essential oils and some of their isolated constituents against Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, and Salmonella entérica. J. Food Prot. 65:1545-1560.

18. Guo, X., J. Chen, R. E Brackett, and L. R. Beuchat. 2002. Survival of Salmonella on tomatoes stored at high relative humidity, in soil, and on tomatoes in contact with soil. J. Food Prot. 65:274-279.

19. Harmon, S. M., Kautter, D. A. y Solomon, H. M. 1987. Bacillus cereus contamination of seeds and vegetables sprouts grown in home sprouting kit. J. Food Prot. 50:62-65.

20. Ibarra-Sanchez, L. S., S. Alvarado-Casillas, M. O. Rodriguez-Garcia, N. E.

Martinez-Gonzales, and A. Castillo. 2004. Internalization of bacterial pathogens in tomatoes and their control by selected Chemicals. J. Food Prot. 76:1353-1358.

21. Iturriaga, M. H., M. L. Tamplin, and E. F. Escartín. 2007. Colonization of tomatoes by Salmonella Montevideo is affected by relative humidity and storage temperature. J. Food Prot. 70:30-34.

22. Jongen, W.M.F. 2005. Improving the Safety of Fresh Fruit and Vegetables.

Publication: Cambridge Woodhead Publishing.

23. Kang PS, Seok JH, Kim YH, Eun JS, and Oh SH. 2007. Antimicrobial and antioxidative effects of roselle (Hibiscus sabdariffa L.) flower extract and its fractions on skin microorganisms and oxidation. Food Sci Biotechnol. 16:409-414. 24. Kroupitski, Y., Pinto, R., Brandl, M.T., Belausov, E., and Sela, S. 2009. Interactions of Salmonella entérica with lettuce leaves. J. Appl. Microbiol. 106:1876-1885.

25. Lelieveld H.L.M., Holah, J., Napper, D. 2013. Hygiene in food processing: Principies and practice- Woodhead Publishing Limited.

26. Lin, C. M., J. J. Kim, W. X. Du, and C. I. Wei. 2000. Bactericidal activity of isothiocyanate against pathogens on fresh produce. J. Food Prot. 63:25-30.

27. Muñoz M. 2003. Aplicación de nuevos agentes antimicrobianos para controlar la seguridad de productos vegetales frescos precortados (IV gama). Tesis Doctoral,

Departamento de Química Física Aplicada, Universidad Autónoma de Madrid.

28. Pijpers, D., Constant, J. G., Jansen, K. 1986. The Complete Book of Fruit.

Multimedia Publications (UK) Ltd., London

29. Rameshkumar, K. B., V. George, and S. Shiburaj. 2007. Chemical constituents and antibacterial activity of the leaf oil of Cinnamomum chemungianum Mohán et Henry.

J. Essent. Oil Res. 19:98-100.

30. Roller, S. 2003. Natural Antimicrobials for the Minimal Processing of Foods.

Woodhead Publishing. Cambridge, England.

31. Russell A.D., Hugo W.B., Ayliffe G.A.J., Fraise, Adam P., Lambert, Peter A.,

Maillard J.Y. 2004. Principies and Practice of Disinfection, Preservation and

Sterilization. Malden, Mass Blackwell Publishing.

32. SAGARPA (Secretaria de Agricultura, Ganadería, Recursos naturales, Pesca y

Alimentación). 2013. Cierre de la producción agrícola por cultivo, México. Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera. Available at: http://wwv. siap.gob. mx/index. php?opti

50 consultado: Noviembre 23, 2013.

33. Tajkarimi MM, Ibrahim SA, and Cliver DO. 2010. Antimicrobial herb and spice compounds in food. Food Control. 21 :1199-1218.

34. Yucel S.l. and Karapinar M. 2005. Effectiveness of household natural sanitizers in the elimination of Salmonella Typhimurium on rocket (Enica sativa Miller) and spring onion (Allium cepaL). Int. J. Food Microbiol. 9:319-323.

35. Yuk, H.-G., J. A. Bartz, and K. R. Schneider. 2005. Effectiveness of individual or combined sanitizer treatments for inactivating Salmonella spp. on smooth surface, stem scar, and wounds of tomatoes. J. Food Sci. 70:M409-M414. Zhuang, R. Y., and L. R. Beuchat. 1995. Fate of Salmonella Montevideo on and in raw tomatoes as affected by temperature and treatment with chlorine. Appl Environ Microbiol. 61 :2127-2131.