La presente invención está relacionada con plantas que tienen resistencia mejorada a bajas temperaturas. Además, Ia presente invención describe un método para Ia producción de dichas plantas.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Las plantas se adaptan a diferentes tipos de estrés ambiental tales como Ia temperatura de su habitat. Sin embargo, en condiciones de estrés por temperatura, por ejemplo, las plantas son susceptibles al calor o a temperaturas frías cuando están expuestas a ambientes por encima o por debajo de su temperatura óptima de crecimiento máxima o mínima, Io que lleva a su debilidad debida a Ia pérdida gradual o súbita de las funciones fisiológicas de las células.

Se han realizado esfuerzos para ampliar Ia adaptación de las plantas a Ia temperatura mediante procedimientos de mejora tales como Ia selección o cruzamiento con el objeto de utilizar plantas silvestres adaptadas a diferentes temperaturas ambientales como cultivos comestibles, plantas de horticultura, y similares. El período en el que pueden cultivarse verduras, flores y plantas ornamentales, árboles frutales y similares se ha expandido mediante estos procedimientos de mejora, así como mediante horticultura protegida.

Las poliaminas, término general aplicado a hidrocarburos alifáticos con 2 o más grupos amino primarios, son sustancias naturales ubicuas en los organismos, con más de 20 tipos descubiertos hasta el momento. Las poliaminas típicas incluyen Ia putrescina, Ia espermidina y Ia espermina. Las enzimas conocidas relacionadas con el metabolismo de poliaminas implicadas en Ia biosíntesis de las poliaminas mencionadas incluyen Ia arginina descarboxilasa (ADC), Ia ornitina descarboxilasa (ODC), Ia S- adenosil-metionina descarboxilasa (SAMDC), Ia espermidina sintasa (SPDS), y Ia espermina sintasa (SPMS). Recientemente se ha publicado que algunas de las enzimas relacionadas con el metabolismo de poliaminas están implicadas en diferentes tipos de estrés ambiental. La solicitud de patente europea EP 1.329.153 enseña que en tejidos vegetales que exhiben resistencia a estrés por frío, se incrementa el contenido de espermidina y espermina. En esta solicitud de patente se ejemplifica que introduciendo el gen de Ia espermidina sintasa en una planta, se incrementan los niveles de espermidina y espermina. Cuando Ia planta transgénica se sometió a bajas temperaturas, se confirmó que tenía mayor resistencia a estrés por frío.

La solicitud de patente de número US 2006/0225154 enseña que los niveles de espermidina, espermina y putrescina están incrementados cuando una planta se transforma con un gen espermidina sintasa. Esta solicitud de patente indica que Ia defensa a estrés por bajas temperaturas puede ser implementada en Ia planta introduciendo el gen de Ia espermidina sintasa.

Respecto a Ia utilización del gen ADC para conferir resistencia a estrés por frío en plantas, es destacable el hecho de que en Ia familia de las Brassicaceae, el gen ADC parece estar duplicado, dando lugar así a dos parálogos, denominados generalmente ADC1 y ADC2 (cfr. Galoway et al., "Phylogenetic utility of the nuclear gene Arginine Decarboxylase: an example from Brassicaceae", Molecular Biology and Evolution, 1998, v. 15, p.1312- 1320). Se han estudiado las diferentes funciones desempeñadas por cada uno de los parálogos.

En Hummel I. et al. (cfr. Hummel etal, "Differetlal expresión oí ARGININE DECARBOXYLASE ADC1 y ADC2 in Arabidopsis thaliana: characterization of transcriptional regulation during seed germination and seedllng development", New Phytologist, 2004, v. 163, p. 519-531), se estudiaron las actividades de los promotores de ADCI y ADC2 en plantas transformadas de forma estable. En este estudio, se demostró que el frío tenía un poderoso efecto en Ia actividad de los promotores de ADC1 y ADC2. Se concluyó que en Arabidopsis Ia respuesta de poliaminas al frío se demuestra que correlaciona con Ia activación transcripcional del promotor del gen ADCI.

En Alcázar eí al. (Alcázar et al., "Overexpression of ADC2 in Arabidopsis induces dwarfism and late-flowering through GA deficiency", The Plant Journal, 2005, v. 43, p. 425-436) se generó una planta transgénica de Arabldopsis. La planta transgénica sobreexpresaba el gen ADC2, dando lugar a una acumulación de putrescina, sin afectar los niveles de espermidina o espermina. Además, las plantas sobreexpresoras de ADC2 mostraron enanismo y retraso en Ia floración.

A pesar de los esfuerzos previos realizados en el estado de Ia técnica, Ia búsqueda de nuevas plantas con resistencia mejorada a estrés y de métodos para su obtención es todavía un campo activo.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores de Ia presente invención han encontrado que introduciendo en una planta una secuencia del gen ADC1, Ia planta transgénica resultante presenta resistencia a estrés por baja temperatura. Además, el fenotipo de Ia planta transgénica no difiere del fenotipo de Ia planta de tipo silvestre, tal como se ¡lustra más abajo.

En Alcázar et al. (ver más arriba), se describió que sobreexpresando el gen ADC2 (el parálogo del gen ADC1), Ia planta transgénica resultante experimentaba cambios en su fenotipo (tales como enanismo) y en su crecimiento (retraso en Ia floración).

Por otra parte, en Hummel I. et al. (ver más arriba) se menciona que el efecto del frío estaba correlacionado con cambios en los niveles de RNAm, y era coherente con Ia presencia específica de dos copias de un elemento de respuesta a bajas temperaturas en el promotor de ADC1 y con el impacto potencial del elemento transponible en Ia expresión del gen, ya que una copia de este elemento de respuesta a temperaturas bajas forma parte del elemento transponible de ADC1.

Sorprendentemente, se encontró que Ia sobreexpresión de ADC1 confiere a Ia planta resistencia a estrés por las bajas temperaturas y no afecta al fenotipo o crecimiento de Ia planta transgénica.

Además, y tal como se ilustra más abajo, Ia resistencia a estrés por bajas temperaturas se consigue por sobreexpresión del gen ADC1, independientemente del promotor utilizado para su expresión. Tal como se muestra más abajo, Ia construcción utilizada para introducir el gen ADC1 en Ia planta comprendía un promotor constitutivo distinto al promotor ortólogo del gen. Por tanto, los inventores de Ia presente invención han encontrado que el factor relevante para conferir resistencia a estrés por bajas temperaturas es Ia sobreexpresión del gen ADC1, independientemente de si el promotor ortólogo de ADC1 está presente en Ia construcción utilizada para transformar Ia planta.

Por otra parte, los inventores han descubierto que cuando el gen ADC1 se sobreexpresa en Ia planta: a) hay una acumulación de putrescina; b) los niveles de espermidina casi no cambian; y c) los niveles de espermina se reducen (niveles comparados con una planta de tipo silvestre). Este descubrimiento contraviene las divulgaciones realizadas en el estado de Ia técnica utilizando otro gen de síntesis de poliaminas (i.e. el gen espermidina sintasa), en el que los efectos observados se basaban en un incremento de espermidina y/o espermina como consecuencia de una acumulación de putrescina, o una producción estable de las poliaminas mencionadas.

Así, en un primer aspecto Ia presente invención se refiere a un método de producción de plantas con resistencia mejorada a estrés por bajas temperaturas, que comprende el paso de Ia transformación de células de una planta con una secuencia exógena del gen ADC1 de Ia arginina descarboxilasa bajo el control de un promotor capaz de funcionar en Ia planta.

Los inventores creen que las plantas transgénicas resultantes no presentan alteraciones en su desarrollo debido a Ia diferente localización subcelular de ADC1 , incrementándose Ia productividad y el rendimiento, en comparación con las que sobreexpresan ADC2.

En un segundo aspecto, Ia presente invención se refiere a una planta transformada obtenible por el método definido de acuerdo con en el primer aspecto de Ia invención.

A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

FIG. 1 : Estructura de Ia construcción de expresión que contiene el gen de Ia biosíntesis de putrescina ADC1 bajo el control del promotor constitutivo CaMV35S.

FIG. 2: Niveles relativos de transcrito del gen de Ia biosíntesis de putrescina ADC1 en plantas trasgénicas (111 , 17, 19) y control (wt).

FIG. 3: Niveles de poliaminas en plantas de Arabidopsis de tipo silvestre (wt) y transgénicas sobreexpresoras de ADC1 (111 , 17, 19).

FIG. 4: Tolerancia a Ia congelación de plantas de tipo silvestre y transgénicas. Plantas de 3 semanas de edad se expusieron a diferentes temperaturas de congelación durante 6 horas: (A)- 5 ⁰ C (no aclimatadas), y (B) -12 ⁰ C (aclimatadas al frío). La tolerancia a Ia congelación se estimó como el porcentaje de plantas que sobreviven a cada temperatura específica después de 14 días de recuperación en condiciones de ausencia de estrés.

FIG. 5: Análisis por PCR del DNA genómico de tabaco preparado a partir de yemas de tipo silvestre (C-) y regeneradas resistentes a kanamicina. M marcador DNA λ digerido con Pstl. C+ plásmido pBI121-ADC1 , A1.1-A1.16 líneas resistentes a kanamicina.

FIG. 6: Análisis por transcriptasa reversa (RT-PCR) del transcrito ADC1 de Arabidopsis en plantas transgénicas de tabaco T ₀ . Se utilizaron cebadores específicos para ADC1 y Actina.

FIG. 7: Niveles de poliaminas en plantas de tobaco de tipo silvestre (wt) y transgénicas sobreexpresoras del gen ADC1 de Arabidopsis (A1.6, A1.13, A1.16).

FIG. 8: Resistencia a congelación de plantas de tabaco de tipo silvestre y

; HOJA RECTIFICADA (REGLA 91.1) i

W r i. -> transgénicas. Se expusieron plantas de tres semanas de edad a -3 ⁰ C durante 4 h. La resistencia a congelación se determinó como el porcentaje de plantas que sobrevivieron después de 14 días de recuperación en condiciones de ausencia de estrés.

FIG. 9: Análisis por PCR del DNA genómico de tomate preparado a partir de yemas de tipo silvestre y regeneradas resistentes a kanamicina.

FIG. 10: Niveles relativos de transcrito ADC1 de Arabidopsis en plantas de tomate transgénicas (847-2, 847-3, 847-4, 847-5) y control (ctrl).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PARTICULARES

En Ia presente invención "plantas con resistencia mejorada a estrés por temperaturas bajas" son plantas en las que Ia limitación de crecimiento o el daño ocasionados por el estrés por bajas temperaturas puede eliminarse o reducirse.

Como se usa aquí, 'exógeno', indica que no es intrínseco a Ia planta sino que se ha introducido externamente. De este modo, una "secuencia exógena del gen ADCf puede ser un gen que codifica Ia enzima ADC1 homólogo a Ia planta huésped (es decir, derivado de Ia planta huésped) que se introduce externamente por manipulación genética. El uso de un gen derivado del huésped que codifica Ia enzima ADC1 es preferible al considerar Ia identidad del uso de codones.

En una realización del primer aspecto de Ia invención, el método además comprende Ia regeneración de Ia planta a partir de las células transformadas que contienen Ia secuencia génica exógena del gen ADC1 bajo el control de un promotor capaz de funcionar en plantas.

La secuencia completa del gen ADC1 está disponible en Ia base de datos GenBank con Ia referencia génica ID 816149.

La secuencia codificante del gen ADC1 de Ia arginina descarboxilasa de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 1) está disponible en Ia base de datos GenBank. Su número de acceso es NM 127204. La secuencia de aminoácidos de Ia arginina descarboxilasa ADC1 (SEQ ID NO: 2) está disponible en Ia base de datos GenBank. Su número de acceso es Q9SI64.

En otra realización del primer aspecto de Ia invención, Ia secuencia exógena del gen ADC1 de Ia arginina descarboxilasa se selecciona de un grupo que consiste en: a) una secuencia de nucleótidos que comprende Ia secuencia SEQ ID NO: 1 ; b) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende Ia secuencia SEQ ID NO: 2; c) una secuencia de nucleótidos que híbrida con Ia SEQ ID NO: 1 o una secuencia complementaria de Ia misma en condiciones severas y que codifica una proteína con actividad arginina descarboxilasa, y d) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con actividad arginina descarboxilasa que comprende Ia secuencia (a) con una o más bases deleccionadas, sustituidas, insertadas o añadidas. Preferiblemente, Ia secuencia corresponde a Ia SEQ ID NO: 1.

La secuencia exógena del gen ADC1 puede ser introducida en las células por cualquier método de ingeniería genética. Ejemplos incluyen fusión de protoplastos con células vegetales heterólogas que tienen Ia secuencia del gen ADC1 , infección con virus de plantas con el genoma viral manipulado genéticamente para expresar el gen que codifica Ia enzima ADC1 , o transformación de células de Ia planta huésped usando un vector de expresión que contiene el gen que codifica Ia enzima ADC1.

Ejemplos de promotores capaces de funcionar en plantas incluyen el promotor 35S del virus del mosaico de Ia coliflor (CaMV) que se expresa de forma estructural en las células vegetales, el promotor del gen que codifica Ia nopalina sintasa (NOS), el promotor del gen que codifica Ia octopina sintasa (OCS), el promotor del gen que codifica Ia fenilalanína amonio liasa (PAL) y el promotor del gen que codifica Ia chalcona sintasa (CHS). También hay disponibles otros promotores de plantas bien conocidos además de los mencionados.

No sólo promotores que se expresan constitutivamente en todos los órganos como el promotor 35S, sino también promotores regulados por bajas

_, HOJA RECTIFICADA (REGLA 91.1) i temperaturas, estrés, sequía, luz, calor, hormonas, daño mecánico o similar pueden utilizarse para expresar el gen diana de acuerdo con el medio ambiente. Por ejemplo, se puede utilizar un gen que codifica Ia enzima ADC1 y un promotor que active su transcripción sólo cuando Ia planta se expone a bajas temperaturas, para controlar el metabolismo de poliaminas de Ia planta sólo en condiciones de bajas temperaturas y así mejorar Ia resistencia a estrés por bajas temperaturas. Un promotor específico de órgano o tejido también puede utilizarse para expresar el gen diana sólo en órganos o tejidos específicos.

Cuando Ia secuencia del gen exógeno ADC1 se introduce por infección con Agrobacterium tumefaciens, el cásete de expresión que incluye el gen que codifica Ia enzima ADC1 puede insertarse en Ia región T-DNA (región que se transfiere al cromosoma de Ia planta) en un plásmido Ti o Ri de las células. En Ia actualidad se utilizan sistemas de vectores binarios en los métodos de transformación estándar con Agrobacterium. Ejemplos de vectores binarios comerciales incluyen los plásmidos pBI101 y pBI121 (ambos comercializados por Clontech). La región Vir implicada en Ia incorporación del T-DNA tiene acción en trans en el plásmido Ti (o Ri), en un vector conocido como plásmido de ayuda o 'helper'.

Para Ia transformación de plantas pueden utilizarse varios métodos conocidos convencionales. Ejemplos incluyen el método del PEG, en el que los protoplastos se aislan de células vegetales por tratamiento con un enzima que degrada Ia pared celular como Ia celulasa o Ia hemicelulasa, y se añade el polietilenglicol a una suspensión de protoplastos junto a un vector de expresión que contiene el cásete de expresión del gen que codifica Ia enzima ADC1 mencionado antes, para incorporar el vector de expresión en los protoplastos por un proceso como Ia endocitosis; el método de liposomas en el que un vector de expresión se introduce por tratamiento de ultrasonidos o similar en vesículas de membranas lipídicas como fosfatidilcolina, y las vesículas se fusionan con los protoplastos en presencia de PEG; métodos de fusión en un proceso similar utilizando micelas; y por electroporación, en el que se aplican pulsos eléctricos a una suspensión de protoplastos y un vector de expresión para incorporar los vectores que se encuentran en Ia solución externa en los protoplastos. Sin embargo, estos métodos son complejos puesto que requieren técnicas de cultivo para Ia re-diferenciación de los protoplastos en plantas. Procesos para introducir el gen de interés en células intactas con pared celular incluyen Ia inyección directa como Ia microinyección en Ia que una micropipeta se inserta en las células para inyectar el DNA del vector por presión a gas o hidráulica, o el método del cañón de partículas en el que se aceleran micropartículas de metal cubiertas con DNA por Ia detonación de un explosivo o presión gaseosa y de esta forma se introducen en las células, y métodos que emplean Ia infección con Agrobacteríum. Los inconvenientes de Ia microinyección son la necesidad de una experiencia considerable y el pequeño número de células que se manipulan. Por ello es más aconsejable transformar plantas con métodos más prácticos tales como el método Agrobacteríum y el método del cañón de partículas. En el método del cañón de partículas, bolas diminutas de metal (normalmente oro) cubiertas con el DNA de interés se disparan directamente sobre Ia célula vegetal. El método del cañón de partículas es útil ya que los genes pueden ser introducidos directamente en el meristemo apical de las plantas mientras son cultivadas. Agrobacteríum tumefaciens es una bacteria del suelo que contiene, además de su cromosoma, un minicromosoma extra circular denominado plásmido inductor de tumores (Ti). Parte del plásmido Ti se transfiere a los cromosomas de Ia planta huésped donde queda integrado (T-DNA). Varios loci génicos del cromosoma bacteriano y un grupo de genes de virulencia (vir) localizados en el plásmido Ti codifican para funciones que intervienen en el reconocimiento de Ia célula vegetal y su unión, así como en Ia excisión, transferencia e integración del T-DNA en el genoma de Ia planta. En general el método de Agrobacteríum está más aceptado que el cañón de partículas por Ia mayor frecuencia de inserciones únicas en el DNA foráneo, siendo más fácil su monitorización.

Ejemplos ilustrativos no limitantes de células vegetales que pueden ser transformadas con el gen exógeno ADC1 de acuerdo con el primer aspecto de Ia invención, son las células derivadas de: callos, semillas, hojas, tallos, sarmientos, raíces, tubérculos de raíz o tallo, flores y similares.

Ejemplos de plantas que pueden ser transformadas con el procedimiento de acuerdo con el primer aspecto de Ia invención incluyen, pero no están limitadas a, dicotiledóneas, monocotiledóneas, plantas herbáceas y arbustos. Ejemplos incluyen patatas dulces, tomates, pepinos, calabaza, melones, sandías, tabaco (Nicotinia tabacum), Arabidopsis thaliana, pimientos, berenjena, judías, taro, espinaca, zanahorias, fresas, patatas blancas, arroz, maíz, alfalfa, trigo, cebada, soja, colza, sorgo, Eucaliptos, olmo, kenaf, Eucommia ulmoides, caña de azúcar, remolacha, cassaya, cica, Chenopodium álbum, lirios, orquídeas, claveles, rosas, crisantemo, petunias, Torenia fournierí, antirrhinum, ciclamen, gypsohila, geranio, girasol, Zoisia japónica, algodón, hongos matsutake, hongos shiitake, champiñones, ginseng, frutos cítricos, bananas y kiwi.

Las "secuencias de base con una o más bases deleccionadas, sustituidas, insertadas o añadidas" aquí referidas, son ampliamente conocidas para aquellas personas expertas en Ia materia, para retener algunas veces actividad fisiológica incluso cuando Ia secuencia de aminoácidos de una proteína que generalmente tiene dicha actividad fisiológica tiene uno o más aminoácidos sustituidos, deleccionados, insertados o añadidos. Los genes que tienen dichas modificaciones y que codifican una enzima ADC1 están incluidos en el ámbito de Ia presente invención. Sin embargo, es esencial que dichas modificaciones no resulten en una pérdida de actividad para Ia enzima mencionada.

Las "condiciones severas" aquí referidas, significan condiciones bajo las cuales sólo secuencias de bases que codifican un polipéptido con actividad enzimática ADC1 equivalente a Ia enzima ADC1 codificada por una secuencia génica específica de Ia enzima ADC1 forma híbridos con Ia secuencia específica (referido aquí como híbridos específicos), y secuencias de bases que codifican polipéptidos que no tienen dicha actividad equivalente no forman híbridos con Ia secuencia específica (referidos aquí como híbridos no específicos). Un experto en Ia materia puede seleccionar fácilmente tales condiciones variando Ia temperatura durante Ia reacción de hibridación y proceso de lavado, Ia concentración de sales durante reacción de hibridación y proceso de lavado, y así otras cosas.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 : Obtención de plantas transqénicas de Arabidopsis

A. Construcción del Plásmido El cDNA de ADC1 de Arabidopsis se amplificó por PCR a partir de DNA genómico, utilizando los siguientes cebadores: sentido directo 5'- ATGCCTGCTCTAGCTTTTG-3' (SEQ ID NO: 3), y sentido inverso 5'- ACCGAAATAAGACCAATTC-S ¹ (SEQ ID NO: 4). El fragmento de DNA amplificado se clonó en el vector pGEM (Stratagene, Heidelberg) y se comprobó por secuenciación. La construcción que contiene el cDNA de ADC1, flanqueado por el promotor constitutivo 35S del virus del mosaico de Ia coliflor (CaMV35S) y el terminador de Ia nopalina sintasa (NOS), en un vector binario (pBI121-/4DC7), se obtuvo reemplazando el gen GUS Smal/Sacl en el vector pBI121 (cfr. Chen et al., "Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application in cloning t-DNA ¡nsertion from transgenic plants", Molecular Breeding, 2003, v. 11 , p. 289-293; accession number AF485783), por el cDNA de ADOI, como un fragmento Xbal/Xbal (2.6 kb). Esta construcción se introdujo por electroporación en Agrobacterium tumefaciens C58C1 , que se utilizó para transformar diferentes especies vegetales, tal como se explica más abajo.

S. Transformación de Arabidopsis thaliana

Plantas de Arabidopsis thaliana CoIO se transformaron con A.tumefaciens, que contenía Ia contrucción pBI121-/4DC7 por inmersión floral (cfr. Clough S. J. et al., "Floral dip: a simplified method for/\gro¿>acter/um-mediated transformation oí Arabidopsis thaliana", Plant J., 1998, v. 16, p. 735-743). Las semillas producidas por estas plantas se recolectaron y se seleccionaron en medio de cultivo de Murashige and Skoog, abreviado a partir de ahora como "MS" (cfr. Murashige T. et al., "A revised médium for rapid growth and bioassays with tobáceo tissue culture", Physiol. Plant., 1962, v. 15, p. 473- 497), que contenía 50 mg/I de kanamicina como antibiótico para Ia selección de los transformantes. La progenie de las plantas resistentes a kanamicina se analizó para Ia segregación de resistencia a kanamicina. Las semillas de las plantas con una proporción de segregación 3:1 se cultivaron de nuevo y Ia progenie resultante se analizó de nuevo para Ia segregación de resistencia a kanamicina para identificar plantas homocigotas para el T-DNA insertado. Se seleccionaron tres líneas homocigotas (17, 19 e 111) para posteriores análisis.

C. Caracterización de las plantas transgénicas C.1. Estimación de RNAm de ADC1 por RT-PCR a tiempo real

El RNA total se obtuvo de toda Ia parte aérea de plantas de Arabidopsis thaliana de 4 semanas no transformadas (wt) y transformadas con el plásmido pBI12ΛADC1 (17, 19, 111) utilizando el reactivo TRIzol (lnvitrogen, Carlsbad, CA). Un microgramo de RNA total se trató con DNasa de grado amplificación (lnvitrogen) para eliminar Ia contaminación con DNA genómico. La hebra complementaria de cDNA se obtuvo con hexámeros degenerados utilizando el sistema de retrotranscripción SuperScript III (Invitrogen), siguiendo las especificaciones del fabricante. La RT-PCR a tiempo real con el método de mareaje SYBR Green I se llevó a cabo utilizando Ia primera hebra de cDNA como molde en un sistema detector de secuencias (modelo 7700; Applied Biosystems, Foster, CA). La eficiencia de Ia amplificación de cada muestra analizada se determinó utilizando Ia hoja de cálculo DART-PCR (cfr. Peirson S. N. et al. "Experimental validation of novel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis", Nucleic Acids Res., 2003, v. 31 , e73), que utiliza un algoritmo simple (cfr. Tichopad A. et al., "Standardized determination of real-time PCR efficieney from a single reaction set-up", Nucleic Acids Res., 2003, v. 31 , e122.) y los datos de fluorescencia sin tratar, Io cual permite obtener resultados comparables sin necesidad de curvas de calibración con patrones. Las eficiencias de amplificación se calcularon para cada reacción individual a partir de su perfil de amplificación y se comprobaron por ANOVA para detectar muestras anómalas (outliners) y diferencias entre grupos (equivalencia de amplificación) utilizando Ia misma hoja de calculo DART-PCR. La media de fluorescencia inicial (R ₀ ) obtenida a partir de Ia eficiencia media se normalizó utilizando RNAm de Actina2 como control interno en cada experimento. Estos análisis se llevaron a cabo dos veces en experimentos independientes con resultados muy similares. Se utilizaron los siguiente juegos de cebadores específicos para cada gen: ADC1 (sentido directo: 5'- GTGGTGATAAGGGGAACGACA-3' (SEQ ID NO: 5), sentido inverso: 5'- CAACCGAAATAAGACCA-ATTCTCAT-3' (SEQ ID NO: Q)), y Actinal (sentido directo: δ'-GATTCAGATGCCCAGAAGTCTTGT-S' (SEQ ID NO: 7), sentido inverso: 5'-TGGATTCCAGCAGCTT-CCAT-3' (SEQ ID NO: 8).

C.2. Análisis de poliaminas Las poliaminas (PAs) se analizaron por separación de los derivados de PAs con cloruro de dansilo mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Los métodos de extracción y determinación se habían descrito previamente (cfr. Mareé M. eí al., "Rapid high-perfomance liquid chromatographic method for quantitation of polyamines as their dansyl derivatives: Application to plant and animal tissues", J. Chromatogr. B. Biomed. Appl., 1995, v. 666, p. 329-33).

Como se muestra en Ia FIG. 3, los niveles de putrescina en las plantas transgénicas están incrementados, mientras que Ia espermidina no está afectada y el nivel de espermina está reducido. A partir de estos resultados, se puede concluir que Ia sobreexpresión de ADC1 incrementa Ia acumulación de putrescina.

C.3. Ensayos de congelación

En este ensayo se utilizaron plantas de 3 semanas (wt, 17, 19, 111). Para obtener las plantas, las semillas se sembraron en macetas que contenían una mezcla de tierra y vermiculita (3:1 v/v), se regaron con agua y una solución mineral de Hogland, y crecieron a 21±1°C en fotoperíodos de día neutro (12 horas de luz fluorescente blanca fría, flujo de fotones de 70-90 μmol m ^"2 seg ^'1 ).

Los tratamientos a bajas temperaturas se llevaron a cabo transfiriendo las plantas a cámaras de crecimiento programadas a 4±1°C durante diferentes períodos de tiempo en las condiciones de luz y fotoperíodo descritas más arriba.

Los ensayos de congelación se realizaron en un congelador de temperatura programable. Plantas de 3 semanas no-aclimatadas o aclimatadas a frío (7 días, 4°C) se expusieron a 4°C durante 30 min en Ia oscuridad y a continuación se bajó Ia temperatura 2°C por hora. La temperatura final de congelación (-5 ⁰ C para no aclimatadas, y -11 ⁰ C para aclimatadas a frío) se mantuvo durante 6 horas, y luego se incrementó de nuevo Ia temperatura hasta 4 ⁰ C a Ia misma velocidad. Tras descongelarlas a 4°C durante 12 horas en Ia oscuridad, las plantas se devolvieron a sus condiciones originales de crecimiento (ver arriba). La resistencia a congelación se determinó como Ia capacidad de las plantas para reanudar el crecimiento tras 14 días de recuperación en condiciones control.

Como se deduce de los resultados obtenidos, las plantas transgénicas que sobreexpresan el gen exógeno ADC1 son más resistentes a estrés por bajas temperaturas mostrando, al mismo tiempo, las mismas características fenotípicas que las plantas de tipo silvestre.

Ejemplo 2: Obtención de plantas transαénicas de tabaco

Discos de hojas de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum cv. Burley 21 ) se transforman con Agrobacteríum tumefaciens LBA4404 portador de Ia construcción de interés tal como se describe en Horsch et al. (cfr. R.B. Horsch et al., "A simple and general method for transferring genes into plants" Science 1985, vol. 227, pp. 1229-1231) . El medio para el desarrollo de yemas contiene sales minerales MS (Duchefa, ND), vitaminas B5 Gamborg (Duchefa), 1 mg/I de benziladenina (BA, Sigma), 0.1 mg/l de ácido naftalenacético (NAA, Sigma), 50 mg/l de kanamicina como antibiótico para Ia selección de células transformadas y 100 mg/l de Claforan para evitar el crecimiento de A. tumefaciens. Tras 6-7 semanas en este medio, se obtienen yemas del tamaño adecuado para ser transferidas a medio de enraizamiento. Las yemas regeneradas se separan y se transfieren a medio de enraizamiento: MS con 50 mg/l kanamicina pero sin hormonas (BA, NAA). Las plantas resistentes a kanamicina (3-10 cm alto) se transfieren a substrato con abono y se cultivan en invernadero. Después de 3 meses las plantas están floreciendo y se consigue Ia autopolinización cubriendo una inflorescencia entera y las yemas con una bolsa de papel. Normalmente, un mes más tarde las semillas están maduras y pueden utilizarse para germinación. Estas semillas se analizan para segregación por resistencia a kanamicina, y las plantas que son capaces de crecer en presencia de kanamicina se utilizan para posteriores análisis.

Los niveles de expresión de ADC1 en las plantas transgénicas, así como los niveles de putrescina, se determinan en Ia parte aérea de plantas de tabaco de 4 semanas como se describe en el protocolo de Arabidopsis.

La resistencia a congelación de 3 líneas transgénicas seleccionadas por sus elevados niveles de putrescina se determina como se describe para Arabidopsis.

Ejemplo 3: Obtención de plantas transαénicas de tabaco

A. Transformación de Nicotiana tabacum

El plásmido pBI121 -ADC7 descrito en el ejemplo 1 se introdujo en Agrobacterium tumefaciens LBA4404 por el método de transformación de choque térmico. Los Agrobacteria se cultivaron a 28 ⁰ C con agitación (200 rpm) en medio YEB que contenía 100 μg/ml de estreptomicina, 100 μg/ml de rifampicina y 50 μg/ml de kanamicina. Para Ia transformación se utilizó una suspensión bacteriana de OD ₆ oo = 0.80. Las plantas transgénicas de tabaco (Nicotiana tabacum cv. Xanthi) se generaron por el procedimiento estándar de transformación del disco de hoja (cfr. Horsch et al. supra). Se introdujeron discos de hoja estériles (0.5 x 0.5 cm ² ) de plantas de tabaco en una suspensión de Agrobacterium, que contenía Ia construcción pBI121-ADC1 , durante 5-10 min con agitación ocasional. Los discos de hoja infectados con Agrobacterium se cultivaron en medio MS a 25 ⁰ C durante 2 días y se transfirieron a medio de formación de yemas, que contiene mezcla de sales MS (Duchefa, ND), vitaminas B5 Gamborg (Duchefa), 1 mg/l de benzilaminopurina (BAP, Sigma), 0.1 mg/l de ácido naftalenacético (NAA, Sigma), 100 mg/l de kanamicina como antibiótico para Ia selección de células transformadas y 250 mg/l de Claforan para evitar el crecimiento de A. tumefaciens. Tras 7-8 semanas en este medio, las yemas regeneradas tenían un tamaño adecuado para ser escindidas y transferidas a medio de enraizamiento: MS con 100 mg/l de kanamicina pero sin hormonas (BAP, NAA).

Las plantas resistentes a kanamicina (5-10 cm de alto) se transfirieron a un sustrato de abono y crecieron en el invernadero (plantas To). Transcurridos A- 5 meses las plantas estaban florecidas y se consiguió Ia autopolinización cubriendo Ia inflorescencia entera y las yemas con bolsas de papel. Aproximadamente un mes más tarde las semillas estaban normalmente maduras y podían ser utilizadas para germinación. Estas semillas fueron analizadas para segregación por resistencia a kanamicina, y las plantas que fueron capaces de crecer en presencia de kanamicina se utilizaron para posteriores análisis (plantas T ₁ ).

El DNA genómico se extrajo de plantas transgénicas T ₀ de 5 a 6 semanas de edad, utilizando el kit Qiagen DNeasy Plant Mini, y aproximadamente 50 ng de DNA fueron utilizados para PCR. Las plantas putativas transgénicas se confirmaron amplificando el DNA genómico 35S-F (5'- GGCTTACGCAGCAGGTCTCA-3', SEQ ID NO: 9) como cebador directo, diseñado frente a Ia región promotora CaMV35S, y ADC1-R (5'- TCCGACTCCCCCGATTTAGA-3', SEQ ID NO: 10) como el cebador reverso, diseñado frente a Ia ORF de ADC1.

A partir del cribado de plantas regeneradas resistentes a kanamicina y Ia detección por PCR se obtuvieron un total de 11 líneas transgénicas independientes (FIG. 5). La progenie de estas plantas se analizó para segregación por resistencia a kanamicina. Las semillas de plantas con una proporción de segregación 3:1 , que se suponía que tenían una sola inserción del transgen, se cultivaron posteriormente y se utilizaron para análisis.

B. Caracterización de las plantas transgénicas

B.1. Estimación del nivel de expresión de ADC1 por RT-PCR semi- cuantitativa

El RNA total se aisló a partir de hojas de plantas de N. tabacum de 3 semanas de edad, transformadas o no con el plásmido pBI121-ADC1 , utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen) y se trató con DNAsa libre de RNasa (Invitrogen). Se utilizaron dos microgramos de RNA total para Ia síntesis de cDNA utilizando el kit "Superscript III first-strand synthesis" (Invitrogen) con hexámeros degenerados, en un volumen final de 25 μl. Las amplificaciones por PCR se realizaron tomando 1 μl de Ia solución de cDNA en un volumen total de reacción de 20 μl conteniendo 0.25 mM de cada dNTP, 1x de tampón de reacción, 0.5 U de Taq DNA polimerasa (Takara) y 0.5 μM del par apropiado de cebadores: AtADCI (directo: 5'- AGAAGCTGGTTCCAAGCCTG-3' SEQ ID NO: 11 , reverso: 5'- GCTTTCACGATCACCACGC-3' SEQ ID NO: 12) y NtActin (directo: 5'- CATTGGCGCTGAGAGATTCC-3' SEQ ID NO: 13, reverso: 5'- GCAGCTTCCATTCCGATCA-3' SEQ ID NO: 14). Las condiciones de PCR para la amplificación consistieron en una desnaturalización inicial a 95 ⁰ C durante 5 min, seguido de 35 ciclos de 95 °C/30 seg, 62 °C/30 seg y 72 °C/2 min, y finalmente 10 min de extensión a 72 ⁰ C. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1.5%, se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron bajo UV. La expresión se normalizó utilizando NtActin como control interno (FIG. 6).

El gen ADC1 de Arabidopsis se expresó en las líneas transgénicas, aunque el nivel de expresión varió en alguna medida (FIG. 6). En las plantas de tabaco que sobreexpresaban el gen ADC1 de Arabidopsis no se observaron fenotipos morfológicos ni de crecimiento/desarrollo anormales. Las líneas transgénicas independientes A1.6, A1.13 y A1.16 se seleccionaron para estudios posteriores porque estas líneas presentaban elevados niveles de expresión de ADC1.

B.2 Análisis de Poliaminas

Los niveles de PA se determinaron en Ia parte aérea de plantas de tabaco de 4 semanas de edad de Ia generación ^" Pi como se describe en el protocolo de Arabidopsis (apartado C.2). Puesto que ésta no es una población homogénea, se utilizó una mezcla de varias plantas (sobre 50) para Ia extracción y cuantificación de poliaminas. Como se muestra en Ia FIG. 7, los niveles de putrescina en las líneas transgénicas fueron más altos que en las plantas control, mientras que en los niveles de espermidina y espermina no se observaron diferencias significativas. A partir de los resultados obtenidos se puede concluir que en tabaco Ia sobreexpresión de ADC1 de Arabidopsis induce Ia acumulación de putrescina.

B.3 Ensayos de tolerancia a congelación

La tolerancia a congelación de las 3 líneas transgénicas seleccionadas por su elevada expresión de ADC1 de Arabidopsis (A1.6, A1.13, A1.16) se determinó de una forma similar a Ia descrita para Arabidopsis (apartado C.3), pero a diferente temperatura. Plantas de 3 semanas de edad crecidas a 24±1 ⁰ C bajo fotoperíodo de día largo (16 horas luz/8 horas oscuridad) se expusieron a 4 ⁰ C durante 30 min en Ia oscuridad y a continuación se bajó Ia temperatura 2 ⁰ C por hora hasta -3 ⁰ C. La temperatura de congelación se mantuvo durante 4 horas, y luego se incrementó de nuevo a 4 ⁰ C. Después de 12 h a 4 ⁰ C las plantas se devolvieron a las condiciones de crecimiento originales, y las plantas capaces de reanudar el crecimiento después de dos semanas se consideraron como resistentes.

Como se deduce de los resultados obtenidos (FIG. 8), las plantas transgénicas de tabaco que sobreexpresan el gen ADC1 de Arabidopsis son más resistentes a estrés por congelación, y presentan las mismas características fenotípicas que las plantas de tipo silvestre. El porcentaje de supervivencia en las líneas transgénicas es 10-14% superior que en las plantas control.

Como se indica en el apartado B.2 estos ensayos se realizaron con plantas de Ia generación T-i, por esta razón se analizó una gran cantidad de plantas, Io que supone 6 experimentos independientes con 40-50 plantas de cada línea por experimento. Por tanto, estos resultados son Ia media de aproximadamente 250 plantas por línea. Se esperan diferencias más significativas cuando se utilice una población de plantas más homogénea (plantas homocigotos). En el caso de tabaco no se observaron diferencias en Ia tolerancia a congelación entre plantas aclimatadas y no aclimatadas.

Ejemplo 4: Obtención de plantas transqénicas de tomate

A. Transformación de Licopersicum sculentum

El plásmido pB^2^-ADC1 se introdujo en Agrobacteríum tumefaciens LBA4404 por el método de transformación de choque térmico. Se inoculó una colonia aislada de A. tumefaciens transformado en 3 mi de medio AB que contenía 100 μg/ml de estreptomicina, 100 μg/ml de rifampicina y 50 μg/ml kanamicina. Tras 8 h de incubación a 28 ⁰ C con agitación (180 rpm), se incubó 1 mi del cultivo bacteriano toda Ia noche, en las mismas condiciones, en 50 mi de medio AB que contenía los antibióticos mencionados anteriormente y 2% de glucosa. Posteriormente, Ia suspensión bacteriana se centrifugó a 3000 rpm durante 15 min a temperatura ambiente y el precipitado, resuspendido en MSO a una concentración final de OD ₆ oo=0.6, se utilizó para Ia transformación de plantas. Para la transformación se utilizaron cotiledones de plántulas de tomate {Licopersicum sculentum cv. UC82) de 10- a12-días de edad crecidas in vitro. Los cotiledones se cortaron en dos o tres piezas transversales y se situaron sobre una solución diluida de Agrobacteríum tumefaciens que contenía Ia construcción pBI121 -ADC1 con el haz hacia abajo. Después de 10 min se sacaron los explantos y se secaron directamente, con el haz hacia abajo en papel de filtro estéril Whatman situado directamente sobre medio GCF10 que contenía 375 μM de acetosiringona en placas de Petri y se situó de nuevo en una cámara de cultivo en Ia oscuridad durante aproximadamente 48 horas. Después de 48 h de cocultivo, los cotiledones se transfirieron a medio GCF10 que contenía 500 μg/ml de carbenicilina y 40 μg/ml de kanamicina. Los cotiledones se situaron con el haz hacia abajo. Después de 3 semanas de incubación se vieron callos verdes o yemas que indicaban el éxito de Ia transformación. Los callos verdes se transfirieron a medio GCF11 que contenía 250 μg/ml de carbenicilina y 40 μg/ml de kanamicina.

Después de ocho semanas de cultivo las yemas se transfirieron para el enraizamiento a medio TRI2 suplementado con 250 μg/ml de carbenicilina y 25 μg/ml kanamicina, en cajas Magenta, a 25 ⁰ C con períodos de 8 h luz/16 h oscuridad. Después, se sacaron de las cajas Magenta, se pusieron en macetas y se transfirieron al invernadero.

La integración del gen ADC1 de Arabidopsis en el genoma de tomate de plantas T ₀ se confirmó amplificando un fragmento interno de 810 pb por PCR, utilizando el siguiente par de cebadores: ADC1-1 F (5'- CCAGCTTCTGCATTTTCACA-3' SED ID NO: 15) y ADC1-1 R (5'- CCATTGTTGTCCATCTCGTG-3 SEQ ID NO: 16). Hasta el momento se han obtenido 3 líneas transgénicas independientes (FIG. 9).

Tabla 1. Composición de los diferentes medios

MEDIO MSO TRM GCF10 GCF11 TRI2

Sales MS 4.3 g/L 2.2 g/L 4.3 g/L 4.3 g/L 2.2 g/L

Tiamina 0.4 mg/L 0.2 mg/L 0.4 mg/L 0.5 mg/L 0.2 mg/L

Mio-lnositol 100 mg/L 50 mg/L 100 mg/L 100 mg/L 50 mg/L

Glicina - - - 2.0 mg/L -

Piridoxina - - 0.5 mg/L 0.5 mg/L -

Acido Fólico * - - - 0.5 mg/L -

Biotina* - - - 0.05 mg/L -

Ribósido de Zeatina * - - 1.5 mg/L 1.9 mg/L -

NAA - - - - 0.1 mg/L

IAA - 0.2 mg/L 0.2 mg/L - -

Amcimidol* - - - - 0.5 mg/L

Acido Nicotínico - - 0.5 mg/L 4.9 mg/L -

Sacarosa 30 g/L 15 g/L 30 g/L 30 g/L 15 g/L

Carbenicilina* - - 500 mg/L 500 mg/L 250 mg/L

Kanamicina* - - 50+10 mg/L 50+10 25 mg/L mg/L

Agar - 8 g/L 8 g/L 8 g/L 8 g/L

PH 5.8 5.9 5.9 5.9 5.9

"(Esterilizado por filtración)

Tabla 2. AB (medio Agrobacterium)

K2HPO4 3.0 g/L

NaH ₂ PO ₄ 1.0 g/L

NH ₄ CI 1.0 g/L

MgSO ₄ -ZH ₂ O 0.3 g/L

KCI 0.15 g/L

CaCI ₂ 0.01 g/L

FeSO ₄ -7H ₂ O 2.5 g/L

Glucosa 5.0 g/L

Bacto-Agar 15 g/L

B. Caracterización de plantas transgénicas B.1. Estimación del nivel de expresión de ADC1 por RT-PCR a tiempo real

El RNA total se obtuvo de Ia parte aérea de plantas transformadas y no transformadas de Licopersicum sculentum como se describe en los ejemplos 1 y 2. El grado relativo de expresión de ADC1 se determinó por RT-PCR a tiempo real como se describe en el ejemplo 1 (apartado C.1). En este caso como control interno para normalizar los resultados se utilizó 18S RNA.

En las líneas transgénicas de tomate 847-3 y 947-4 se detectó un elevado nivel de expresión del gen ADC1 de Arabidopsis, aunque el nivel de expresión varió (FIG. 10). En las plantas de tomate sobreexpresoras del gen ADC1 de Arabidopsis no se observaron fenotipos anormales en Ia morfología ni en crecimiento/desarrollo.