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Title:
PLANT SEED OIL
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2009/130291
Kind Code:
A3
Abstract:
The invention relates to a plant seed oil, comprising arachidonic acid with a content of approximately 7 to 26 percent by weight in the total fatty acid content, the ratio of the weight percentages of arachidonic acid to gamma-linolenic acid being approximately 1:1 to approximately 5:1 and the ratio of the weight percentages of arachidonic acid to dihomo-gamma-linolenic acid being approximately 1:1 to approximately 5:1. The invention further relates to methods for producing said plant seed oil and to formulations and uses of said plant seed oil. The invention specifically makes available food items and baby food containing said plant seed oil.

Inventors:
REIN DIETRICH (DE)
SENGER TORALF (DE)
BAUER JOERG (DE)
Application Number:
PCT/EP2009/054916
Publication Date:
May 06, 2010
Filing Date:
April 23, 2009
Export Citation:
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Assignee:
BASF PLANT SCIENCE GMBH (DE)
REIN DIETRICH (DE)
SENGER TORALF (DE)
BAUER JOERG (DE)
International Classes:
A23L1/30; A23D9/00; C12N15/82
Domestic Patent References:
WO2009016202A22009-02-05
WO2008100545A22008-08-21
Foreign References:
US5972664A1999-10-26
US20080057495A12008-03-06
DE102004062543A12006-07-06
US20050132441A12005-06-16
US20070244192A12007-10-18
US20070067870A12007-03-22
Other References:
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KOLETZKO BERTHOLD ET AL: "Long-chain polyunsaturated fatty acids in diets for infants: Choices for recommending and regulating bodies and for manufacturers of dietary products", LIPIDS, vol. 34, no. 2, February 1999 (1999-02-01), pages 215 - 220, XP002567381, ISSN: 0024-4201
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BARRE D E: "POTENTIAL OF EVENING PRIMROSE, BORAGE, BLACK CURRANT, AND FUNGAL OILS IN HUMAN HEALTH", ANNALS OF NUTRITION AND METABOLISM, KARGER, CH, vol. 45, no. 2, 1 March 2001 (2001-03-01), pages 47 - 57, XP001027476, ISSN: 0373-0101
BELITZ, GROSCH, SCHIEBERLE: "Food Chemistry", 2009, SPRINGER-VERLAG, XP002567383
Attorney, Agent or Firm:
BASF SE (Ludwigshafen, DE)
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Claims:
Ansprüche

1. Pflanzensamenöl, umfassend Arachidonsäure mit einem Gehalt von ungefähr 7 bis ungefähr 26 Gewichtsprozent am Gesamtfettsäuregehalt, wobei das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Gamma-Linolensäure ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 und das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Dihomo- Gamma-Linolensäure ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 beträgt.

2. Pflanzensamenöl nach Anspruch 1 , wobei das Verhältnis der Gewichtsprozente von Linolsäure zu alpha-Linolensäure ungefähr 3:1 bis ungefähr 12:1 beträgt.

3. Pflanzensamenöl nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Eicosapentaensäure ungefähr 3:1 bis ungefähr 7:1 beträgt.

4. Pflanzensamenöl nach einem der Ansprüche 1 bis 3, weiterhin umfassend Stearidonsäure.

5. Pflanzensamenöl nach Anspruch 4, wobei Stearidonsäure mit einem Gehalt von ungefähr 0,1 bis ungefähr 1 Gewichtsprozent am Gesamtfettsäuregehalt vorliegt.

6. Pflanzensamenöl nach einem der Ansprüche 1 - 5, erhältlich aus einer transgenen Pflanze, wobei die transgene Pflanze mit einem Nukleinsäurekonstrukt wie in den SEQ ID NOs. 15, 16 oder 17 gezeigt transformiert ist.

7. Pflanzensamenöl, umfassend ein Fettsäurespektrum enthaltend Palmitinsäure, Stearinsäure, ölsäure, Linolsäure, Gamma-Linolensäure, Alpha-Linolensäure, Stearidonsäure, Dihomo-Gamma-Linolensäure, Arachidonsäure und Eicosapentaensäure.

8. Pflanzensamenöl nach Anspruch 7, umfassend ungefähr 3,2-5,3% Palmitinsäure, ungefähr 2,2-5,3% Stearinsäure, ungefähr 10-25% ölsäure, ungefähr 22-36% Linolsäure, ungefähr 4-12% Gamma-Linolensäure, ungefähr 3-8% Alpha-Linolensäure, ungefähr 0,2- 1 % Stearidonsäure, ungefähr 3-9% Dihomo-Gamma-Linolensäure, ungefähr 12-25% Arachidonsäure und ungefähr 1-4% Eicosapentaensäure, bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt.

9. Formulierung oder Mischöl, umfassend ein Pflanzensamenöl nach den Ansprüchen 1 bis 8 und mindestens ein weiteres öl ausgewählt aus der Gruppe Pflanzenöl, mikrobielles öl und Fischöl, wobei das Pflanzenöl, mikrobielle öl oder Fischöl Docosahexaensäure enthält.

10. Nahrungsmittel, umfassend ein Pflanzensamenöl nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eine Formulierung oder ein Mischöl nach Anspruch 9.

1 1. Babynahrung, umfassend ein Pflanzensamenöl nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eine Formulierung oder ein Mischöl nach Anspruch 9.

12. Verfahren zur Herstellung eines Pflanzensamenöls nach den Ansprüchen 1 bis 8, umfassend die Schritte: a) Herstellung einer transgenen Pflanze durch Transformation mit dem Nukleinsäurekonstrukt wie in den SEQ ID NOs. 15, 16 oder 17 gezeigt; b) Kultivierung der transgenen Pflanze aus Schritt a) unter Bedingungen, die die Biosynthese des Pflanzensamenöls erlauben; und c) Ernten der Pflanzensamen, Extraktion und Raffination des Pflanzensamenöls.

13. Verfahren nach Anspruch 12, weiter umfassend den Schritt d) des Formulierens des Pflanzensamenöls als öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die öI-. Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung weiter formuliert wird zu einem Nahrungsmittel, bevorzugt zu Babynahrung.

15. Verwendung des Pflanzensamenöls nach den Ansprüchen 1 bis 8 oder wie nach dem Verfahren der Ansprüche 12 bis 14 hergestellt oder der Formulierung oder des Mischöls nach Anspruch 11 zur Herstellung von Nahrungsmitteln, bevorzugt Babynahrung, Kosmetik, Futtermitteln, bevorzugt Fischfutter, oder Arzneimitteln.

Description:

Pflanzensamenöl

Die Erfindung bezieht sich auf ein Pflanzensamenöl, umfassend Arachidonsäure mit einem Gehalt von ungefähr 7 bis ungefähr 26 Gewichtsprozent am Gesamtfettsäuregehalt, wobei das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Gamma-Linolensäure ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 und das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Dihomo- Gamma-Linolensäure ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 beträgt. Die Erfindung betrifft des weiteren Verfahren zur Herstellung dieses Pflanzensamenöls sowie Formulierungen und Verwendungen des Pflanzensamenöls. Insbesondere stellt die Erfindung auch Nahrungsmittel und Babynahrung zur Verfügung, die das angeführte Pflanzensamenöl enthalten.

Arachidonsäure (ARA) ist eine langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure der Omega-6 (n-6)- Klasse (C20:4 5,8,11 ,14-Eicosatetraensäure). Im folgenden werden mehrfach ungesättigte Fettsäuren als PUFA, PUFAs, LCPUFA oder LCPUFAs bezeichnet (poly unsaturated fatty acids, PUFA, mehrfach ungesättigte Fettsäuren;Jong chain poly unsaturated fatty acids, LCPUFA, langkettige mehrfach ungesättigte Fettsäuren).

ARA ist die am häufigsten vorkommende C20-PUFA im menschlichen Blut Plasma (Siguel and Schaefer (1988) Aging and nutritional requirements of essential fatty acids. In: Dietary Fat Requirments in Health and Development (Beare-Rogers, ed.) pp 163-189, American OiI Chemist's Society, Champaign, IL.). Sie ist vor allem im Organ-, Muskel- und Blutgewebe vorhanden, wo sie eine wichtige Funktion als Strukturlipid erfüllt, das vorwiegend mit Phospolipiden in Blut, Leber, Muskeln und anderen wichtigen Organsystemen assoziiert ist. Neben ihrer hauptsächlichen Funktion als Strukturlipid dient ARA auch als direkte Vorstufe für eine Reihe von zirkulierenden Eicosanoiden wie Prostaglandin E2(PGE2), Prostacyclin I2(PGI2), Thromboxan A2(TxA2) und die Leukotriene B4(LTB4) und C4(LTC4). Diese Eicosanoide beeinflussen die Wachstumssteuerung, die Entzündungsabwehrreaktion, die Blutrheologie, den Gefäßtonus, die Leukocytenfunktion und die Plättchenaktivierung (Calder 2006, Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 75:197-202; Roland et al. 2004, Mini Rev Med Chem. 4:659-68).

Die menschliche Muttermilch enthält in allen Stadien der Laktation einen beträchtlichen Anteil an ARA. Dieser beträgt etwa 0,2 bis 1 ,0% des Gesamtgehalts an Fettsäuren (Brenna et al. 2007 AJCN 85:1457). Die Konzentration hängt vom Laktationsstadium, vom Ernährungszustand der Mutter und von Umweltbedingungen ab. Daher empfehlen Organisationen wie die „World Association of Perinatal Medicine", die „Early Nutrition

Academy", die „Child Health Foundation", die „World Health Organization", die „British Nutrition Foundation", die „European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition", und die „International Society for the Study of Fatty Acids and Lipids", in Fällen in denen Brustfütterung keine Option ist, die Nutzung von Babynahrung, die unter anderem mit ARA supplementiert ist (Koletzko et al. 2008, J Perinat Med. 2008;36:5-14; Diersen-Schade et al. 2005 Lipid Technology 17:225). ARA wird mittlerweiler auch von immer mehr Herstellern der Säuglingsnahrung zugesetzt, um diese der Muttermilch anzugleichen. Interessanterweise schwankt die Konzentration von ARA in der Muttermilch im Allgemeinen weniger als die von

Docosahexaensäure (DHA, 0,1 bis mehr als 1 ,0% des Gesamtgehalts an Fettsäuren) (Diersen- Schade 2005 LipTech 17:225; Innis 2007 ProcNutrSoc 66:397; Brenna et al. 2007 AJCN 85:1457), was auf eine genauere physiologische Regulierung hinweist, damit der für die Säuglingsernährung notwendige ARA-Gehalt zur Verfügung steht. Die potenziellen gesundheitlichen Vorteile, die die ARA für Säuglinge im prä-, peri- und postnatalen Stadium bietet, liegen in der Unterstützung der Gehirnentwicklung und -funktionen sowie in einer verbesserten Entwicklung der Augen (Diersen-Schade et al. 2005 Lipid Technology 17:225). Die übereinstimmenden Empfehlungen und praktischen Richtlinien für die Gesundheitsfürsorge, die von der „World Association of Perinatal Medicine" (Weltvereinigung für Perinatalmedizin), der „Early Nutrition Academy" (Akademie für frühkindliche Ernährung) und der „Child Health Foundation" (Stiftung für die Gesundheit der Kinder) unterstützt werden, unterstreichen die Wichtigkeit einer ausreichenden Aufnahme von ARA mit der Säuglingsnahrung (Koletzko et al. 2008, J Perinat Med. 2008;36:5-14). Insbesondere der Fötus und das Neugeborene sollten LC-PUFA in ausreichender Menge erhalten, um die optimale visuelle und kognitive Entwicklung zu unterstützen. Es wird angenommen, dass sich für das Neugeborene bis zum Alter von ungefähr zwei Jahren Vorteile durch die Nahrungsergänzung mit ARA ergeben.

Ab Mai 2001 war die durch ARA ergänzte Säuglingsnahrung kein Nischenprodukt mehr, denn ARA entwickelte sich in den hoch entwickelten Ländern zu einem fast obligatorischen Bestandteil der Säuglingsmilch. Diese Entwicklung wurde auch dadurch unterstützt, dass die US „Food and Drug Administration" (FDA) eine positive Bewertung zu Martek's GRAS- Einstufung bezüglich der Verwendung von DHASCO®- (DHA, Crypthecodinium cohnii) und ARASCO®- (ARA, Mortierella alpina) ölmischungen in Säuglingsnahrungen abgegeben hatte. Die Abkürzung „GRAS" bezeichnet hierbei die Einstufung „Generally Recognized as Safe" , i.e. als sicher für den Einsatz in Nahrungsmitteln. Der Zusatz von ARA zur Säuglingsmilch und somit auch der ARA-Markt wurde einerseits durch Martek's Einflussnahme und andererseits dadurch vorangetrieben, dass die potentiellen gesundheitlichen Vorteile von ARA für die Entwicklung von Säuglingen zunehmend anerkannt wurden. Außer der ARA ist auch die DHA (Docosahexaensäure) eine wichtige Fettsäure, die der Säuglingsnahrung zugesetzt werden sollte. DHA kommt in menschlicher Muttermilch vor, und es wird angenommen, dass sie die Entwicklung des Gehirns, des Nervengewebes und der Augen des wachsenden Säuglings unterstützt. Es wurde nachgewiesen, dass der Zusatz von DHA in wirksamen Konzentrationen sowohl bei zum berechneten Termin als auch bei zu früh geborenen Säuglingen die kognitive Entwicklung der Sehschärfe verbessert. Neben der ARA und der DHA beinhaltet die Muttermilch noch weitere hochgradig ungesättigte Fettsäuren, die weniger erforscht sind, jedoch auch eine große Rolle für die Entwicklung des Säuglings spielen. Bei diesen Fettsäuren handelt es sich beispielsweise um Gamma- Linolensäure (GLA, 0,1-0,2% des Gesamtgehalts an Fettsäuren), Dihomo-Gamma- Linolensäure (DGLA, 0,2-0,4% des Gesamtgehalts an Fettsäuren), Stearidonsäure (SDA, bis zu 0,1 % des Gesamtgehalts an Fettsäuren) und Eicosapentaensäure (EPA, 0,05-0,3% des Gesamtgehalts an Fettsäuren) (Yuhas et al. 2006 Lipids 41 :851-8). Um die Ersatznahrung möglichst gut an die Muttermilch anzugleichen, ist es wichtig, diese hochgradig ungesättigten Fettsäuren in den Lipidanteil der Säuglingsnahrung zu integrieren.

Die Rolle der hochgradig ungesättigten n-6-Fettsäuren GLA und DGLA wird gerade untersucht. Das Vorhandensein von GLA und DGLA in der Muttermilch spricht dafür, dass sie unabhängig von der ARA für die Entwicklung des gestillten Säuglings wichtig sind. Die Forschung zeigt, dass die n-6-Fettsäuren des Säuglings bei der physiologischen Integration in die menschlichen Gewebelipide miteinander konkurrieren (AI et al. 2008, Am J Clin Nutr 71 :285S-91 S). Daher ist es wichtig, dass ein ausgeglichenes Fettsäurenmuster mit bei werdenden und stillenden Müttern ermöglicht wird (Geppert et al. 2008, Br. J. Nutrition 99: 360-9). Zu den potentiellen Vorteilen der frühzeitigen zusätzliche Gabe von GLA zählt ein reduzierter IgE-Gesamtwert im ersten Lebensjahr bei Säuglingen, die an atopischer Dermatitis oder atopischen Ekzemen, eine häufige vererbte Hauterkrankung, leiden (Demmelmair H., FeIdI F., Horvath I. et al. Influence of formulas with borage oil or borage oil plus fish oil on the arachidonic acid Status in premature infants, Lipids 2001 ; 36:555-66. Kitz R., Rose MA., Schonborn H., Zielen S., Bohles HJ. Impact of early dietary gamma-linolenic acid supplementation on atopic eczema in infancy. Pediatr. Allergy Immunol. 2006, 17:112-7). Es zeigt sich auch die Tendenz, dass durch die zusätzliche Gabe von GLA bei Kindern mit einem hohen familiären Risiko für eine atopische Dermatitis die Erkrankung im späten Kleinkindalter eingedämmt werden kann (van Gool et al. 2003, Am J Clin Nutr 77:943). Obwohl sich durch die mit der Nahrung zugeführte GLA die Häufigkeit der atopischen Ekzeme nicht beeinflussen oder verringern lässt (Kritz et al. 2006), scheint bei Säuglingen, die an atopischen Ekzemen leiden, durch die zusätzliche Gabe von GLA im ersten Lebensjahr der IgE-Gesamtwert zu sinken (Kritz et al. 2006). DGLA ist eine Vorstufe bei der Synthese des Prostaglandins E1 (PGE1) und auch der Serie-3-Prostaglandine (Das 2008, Lipids in Health and Disease 7:9). Auch andere Vorzüge von DGLA Supplementation in der Babymilch wurden gezeigt. Zum Beispiel beeinflusst DGLA die Zytokin Produktion in humanen Peripheren Blut Mononukleären Zellen unabhänig von Zykloogygenase Aktivierung (Dooper et al. 2003 Immunology 110:348-57). Dies deutet auf eine Stärkung der Immunfunktion durch DGLA hin, die auch für Neugeborene von entscheidender Bedeutung ist. Darüber hinaus reduziert eine Erhöhung der Konzentration von DGLA und ARA in der Neugeborenennahrung das Risiko der HIV Virus übertragung zwischen Mutter und Kind (Villamor et al. 2007 Am J Clin Nutr 86:682-689).

Es besteht somit ein Bedarf an Babynahrung, die dem Baby eine ausreichende Aufnahme von langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren erlaubt, um die optimale Entwicklung des Babys zu unterstützen.

Dieses technische Problem wird gelöst durch ein Pflanzensamenöl, umfassend Arachidonsäure mit einem Gehalt von ungefähr 7 bis ungefähr 26 Gewichtsprozent am Gesamtfettsäuregehalt, wobei das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Gamma-Linolensäure ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 und das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Dihomo-Gamma-Linolensäure ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 beträgt.

Im Unterschied zu bisher durchgeführten Versuchen zur Herstellung von Arachidonsäuren in transgenen Pflanzen, wie z.B. in WO2005/083093 oder Kajikawa et al. (Biosci. Biotechno. Biochem., 72, 70549-1-10, 2008), oder von ölen aus Microorganismen, wie z.B. ölen aus

Mortierella alpina, weist das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl überraschende, neue Eigenschaften auf. Insbesondere weist das angeführte Pflanzensamenöl der Erfindung Mengenverhältnisse zwischen den Fettsäuren Arachidonsäure (ARA) und Gamma-Linolensäure (GLA) sowie Arachidonsäure und Dihomo-Gamma-Linolensäuren (DGLA)) auf wie sie auch in der Muttermilch vorliegen. In der Muttermilch beträgt das Verhältnis zwischen Arachidonsäure (ARA) und Gamma-Linolensäure (GLA) etwa 2:1 bis 4:1 und zwischen Arachidonsäure und Dihomo-Gamma-Linolensäuren (DGLA) etwa 1 :1 bis 2:1 (Yuhas et al. 2006 Lipids 41 :851-8). Figur 7 gibt hierzu einen überblick über die Fettsäureverhältnisse in der Muttermilch. In dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl liegt das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Gamma-Linolensäure bei ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 und das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Dihomo-Gamma-Linolensäure bei ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1.

Soweit nicht anderweitig angegeben, beziehen sich die hierin angeführten Verhältnisse auf die Verhältnisse der Gewichtsprozente der jeweiligen Fettsäuren.

Somit bietet das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl neben einem hohen Gehalt an Arachidonsäure mit ihrer physiologisch positiven Wirkung auch ein günstiges Verhältnis von Arachidonsäure zu GLA und Arachidonsäure zu DGLA. GLA und DGLA sind neben Arachidonsäure wichtige Komponenten der Fettfraktion von Muttermilch (Wang et al. Pediatrics International 2000, 42(1):14-20; Yuhas et al. 2006 Lipids 41 :851-8). Die jüngste Forschung zeigt zudem, dass die n-6-Fettsäuren des Säuglings bei der physiologischen Integration in die menschlichen Gewebelipide miteinander konkurrieren (Geppert et al. 2008, Br. J. Nutrition 99: 360-9). Deshalb ermöglicht erst ein ausgewogenes Verhältnis der Fettsäuren in der Säuglingsnahrung ein optimales Wachstum und eine optimale Entwicklung des Säuglings. Mit dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl konnte somit eine Zusammensetzung erhalten werden, die sehr nahe an der Fettsäurekomposition in der Muttermilch ist. Dieses der Muttermilch sehr nahe kommende Verhältnis von Arachidonsäure zu GLA und Arachidonsäure zu DGLA konnte durch die Herstellung von transgenen Pflanzen, die eine Acyl- CoA abhängige Delta-6 Desaturase exprimieren, erreicht werden. Diese Delta-6 Desaturase stammt aus Ostreococcus tauri. Erst die Verwendung dieses Enzyms in der spezifischen Promoter-Gen Kombination wie sie in den erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten vorliegt ermöglichte die Herstellung eines Pflanzensamenöls, das sich durch im Vergleich zum im Stand der Technik beschriebenen öle erstmals durch niedrige Gehalte an Gamma-Linolensäure und Dihomo-Gamma-Linolensäure auszeichnet. Bekannte Delta 6-Desaturasen, wie zum Beispiel in WO2005/083093 verwendet und beschrieben, verwenden Linolsäure verestert an der sn-2 Position mit Phospholipiden, wie etwa Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol, oder Phosphatidylglycol, als Substrat. Für die Delta 6-Desaturase aus Ostreococcus tauri konnte in Hefemodellstudien eine unterschiedliche Substratverwertung gezeigt werden, wie in WO2006/069710 beschrieben. Es wurden nun die weiter unten und den Beispielen beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte für die Transformation von Raps (Brassica napus) erstellt und transgene Raps-Pflanzen mit dieser Eigenschaft erzeugt. überraschenderweise zeigen Samenöle dieser Pflanzen niedrige Gehalte an GLA und

DGLA (Figur 3B und Tabelle 3), aus denen die folgende Syntheseabfolge abgeleitet werden kann: Die Delta 6-Desaturase verwendet Linolat-CoA als Substrat. Das Produkt Gamma- Linolat-CoA wird direkt von der δ6-Elongase als Substrat in Dihomo-Gamma-Linolenat-CoA umgesetzt. Das Produkt der Elongationsreaktion wird durch Acyltransferasen in die sn2- Position von Phospholipiden überführt und durch die Delta 5-Desaturase in Arachidonsäure- Phosphatidylcholin, oder andere, oben beschriebene Phospholipide umgesetzt. Durch Acyltransferasen wird Arachidonsäure in Triacylglyceride (i.e. öl) überführt und ist damit eine Komponente des Samenöls. Es konnte insbesondere gezeigt werden, dass die Zwischenprodukte der Synthese entsprechend der Promoter- und Genaktivität in ihrer Konzentration beeinflusst werden können. Die Erfindung identifiziert in den hier beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten Promoter-Gen-Kombinationen zur Herstellung von Pflanzensamenölen mit einer Fettsäurekomposition, die ähnlich der Muttermilch ist und sich deshalb vorteilhaft zur Produktion von Babynahrung eignet. Dies konnte erst mit den in den erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten der SEQ ID NOs. 15, 16 und 17 vorliegenden spezifischen Promoter-Gen-Kombinationen erreicht werden.

Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl kann in verschiedenen Konzentrationen für Säuglingsmilch oder andere Ernährungsprodukte für Säuglinge verwendet werden. Bei den hierin angegebenen Konzentrationen und Formulierungen verfügt das erfindungsgemäße

Pflanzensamenöl über ein Fettsäureprofil, das dem der Muttermilch näher kommt als sämtliche der früher verwendeten Produkte. Somit erlaubt das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl eine direkte Integration der hochgradig ungesättigten Fettsäuren in den Lipidanteil der Säuglingsnahrung, um die Ersatznahrung möglichst gut an die Muttermilch anzugleichen. Durch seinen günstigen Anteil an ARA, GLA und DGLA eignet sich das erfindungsgemäße

Pflanzensamenöl besonders für die Ernährung von Frühgeborenen und Babys bis zum Alter von etwa 2 Jahren, um eine gesunde Entwicklung, besonders von Nervensystem und Augen sowie des Immunsystems, des Frühgeborenen oder Babys zu gewährleisten. Durch Mischen oder Formulierung des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls mit einer limitierten Anzahl an pflanzlichen und nicht-pflanzlichen ölen, wie mikrobiellen ölen oder Fischölen, kann eine noch bessere Angleichung der Ersatznahrung an das Fettsäuremuster der Muttermilch erreicht werden. Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl hat außerdem ein Hintergrund- Fettsäureprofil, das dem von Raps- oder Canolaöl ähnelt, welches unter anderem für Säuglingsnahrung verwendet wird. Dadurch ist das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl als ARA Quelle besser geeignet als die zur Zeit am meisten verwendete ARA Quelle ARASCO®. Beispielsweise enthält ARASCO® der Humanmuttermilch weitgehend fremde Fettsäuren wie zum Beispiel C22:0, C24:0 und C22:5 n-6 in Konzentrationen bis 3% (Australia New Zeland Food Authority 2002, Proposal P93 - Review Of Infant Formula, Supplementary Final Assessment (Inquiry - S.24), Report, 08/02). Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl liegt bei diesen Fettsäuren deutlich unter ARASCO® und weist zudem grosse Mengen an C18:1 n-9 auf, welche die häufigste Fettsäure in der Muttermilch darstellt (Innis & King, Am J Clin Nutr 1999, 70:383-90).

Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl zeichnet sich im Gegensatz zu den im Stand der Technik beschriebenen, herkömmlichen ölen, wie mikrobielle öle aus Mortierella alpina oder Crypthecodinium cohnii oder Fischöle aus Lachs, Wal oder Eidotter, dadurch aus, dass Arachidonsäure und Gamma-Linolensäure sowie Arachidonsäure und Dihomo-Gamma- Linolensäure erstmals in einem ausgewogeneren Verhältnis vorliegen, das dem der Muttermilch am nächsten kommt. Die Tabelle 4 in den folgenden Beispielen gibt eine exemplarische übersicht über die angeführten Mengenverhältnisse der Fettsäuren im erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl im Vergleich zu ölen aus verschiedenen Organismen, die entweder Arachidonsäure natürlicherweise produzieren oder in die Gene für den Stoffwechselweg übertragen wurden. So beträgt in dem in WO2005/083093 beschriebenen Samenöl aus

Brassica juncea das Verhältnis zwischen den Fettsäuren Arachidonsäure (ARA) und Gamma- Linolensäure (GLA) etwa 1 :1 und größer 1 :1 (d.h. mehr GLA als ARA), und zwischen Arachidonsäure und Dihomo-Gamma-Linolensäuren (DGLA) etwa 1 :5 und weniger (d.h. noch weniger DGLA als ARA als im Verhältnis 1 :5). In dem öl aus Marchantia polymorpha beträgt das Verhältnis zwischen der Fettsäure Arachidonsäure (ARA) und Gamma-Linolensäure (GLA) etwa 1 :4 bis 1 :5 und zwischen Arachidonsäure und Dihomo-Gamma-Linolensäuren (DGLA) etwa 1 :10 und mehr (d.h. noch weniger DGLA als ARA als im Verhältnis 1 :10). In dem öl aus Glycine max beträgt das Verhältnis zwischen der Fettsäure Arachidonsäure (ARA) und Gamma-Linolensäure (GLA) etwa 0,1 :1 bis 0,15:1 und zwischen Arachidonsäure und Dihomo- Gamma-Linolensäuren (DGLA) etwa 0,18:1 bis 0,2:1. Der Gehalt an Arachidonsäure in dem öl aus Glycine liegt bei 2-3%, da die bisherigen Verfahren keine kommerziell nutzbaren Arachidonsäure-Gehalte liefern konnten. In dem öl aus Mortierella alpina (Suntory TGA40) beträgt das Verhältnis zwischen der Fettsäure Arachidonsäure (ARA) und Gamma-Linolensäure (GLA) mehr als 10:1 und zwischen Arachidonsäure und Dihomo-Gamma-Linolensäuren (DGLA) ebenfalls mehr als 10:1.

In der Muttermilch beträgt dagegen das Verhältnis zwischen Arachidonsäure (ARA) und Gamma-Linolensäure (GLA) etwa 2:1 bis etwa 4:1 und zwischen Arachidonsäure und Dihomo- Gamma-Linolensäuren (DGLA) etwa 1 :1 bis etwa 2:1 (Yuhas et al. 2006 Lipids 41 :851-8). In dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl liegt das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Gamma-Linolensäure bei ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 und das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Dihomo-Gamma-Linolensäure bei ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 und somit erstmals in den Bereichen, die auch in der Muttermilch vorhanden sind.

Die Erfindung betrifft also insbesondere ein Pflanzensamenöl umfassend Arachidonsäure mit einem Gehalt von ungefähr 7 bis ungefähr 26 oder 7 bis 26 Gewichtsprozent am Gesamtfettsäuregehalt, wobei das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Gamma-Linolensäure ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 oder 1 :1 bis 5:1 und das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Dihomo-Gamma-Linolensäure ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 oder 1 :1 bis 5:1 beträgt.

Der Arachidonsäuregehalt in dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl beträgt zwischen ungefähr 7 und ungefähr 26 Gewichtsprozent oder zwischen 7 und 26 Gewichtsprozent,

vorzugsweise zwischen ungefähr 10 und ungefähr 26 Gewichtsprozent oder zwischen 10 und 26 Gewichtsprozent, noch mehr bevorzugt zwischen ungefähr 12 und ungefähr 26 Gewichtsprozent oder zwischen 12 und 26 Gewichtsprozent, oder zwischen ungefähr 15 und ungefähr 26 Gewichtsprozent oder zwischen 15 und 26 Gewichtsprozent, am Gesamtfettsäuregehalt. Besonders bevorzugt beträgt der Arachidonsäuregehalt in dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl 15 Gewichtsprozent am Gesamtfettsäuregehalt. Die Zusammensetzung eines solchen öls ist weiter unten und in den Beispielen beschrieben.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Pflanzensamenöls der Erfindung beträgt das Verhältnis der Gewichtsprozente von Linolsäure zu alpha-Linolensäure ungefähr 3:1 bis ungefähr 12:1 oder 3:1 bis 12:1 , vorzugsweise ungefähr 4:1 bis ungefähr 12:1 oder 4:1 bis 12:1 , noch mehr bevorzugt ungefähr 5:1 bis ungefähr 12:1 oder 5:1 bis 12:1 oder ungefähr 6:1 bis ungefähr 12:1 oder 6:1 bis 12:1.

Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl enthält wie die Muttermilch die essentiellen

Fettsäuren Linolsäure und Alpha-Linolensäure. Im Bezug auf das Verhältnis von Linolsäure zu alpha-Linolensäure ergänzt das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl die in Säuglingsnahrungsprodukten vorwiegend verwendeten öle, wie Sojaöl oder Sonnenblumenöl. Die durch das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl ergänzten Säuglingsnahrungsprodukte kommen den Linolsäure zu Alpha-Linolensäure Verhältnissen die in der Muttermilch vorliegen sehr nahe. Hier beträgt das Verhältnis ca. 7:1 bis 18:1 (Yuhas et al. 2006 Lipids 41 : 851-8).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Pflanzensamenöls der Erfindung beträgt das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Eicosapentaensäure ungefähr 3:1 bis ungefähr 7:1 oder 3:1 bis 7:1 , vorzugsweise ungefähr 4:1 bis ungefähr 7:1 oder 4:1 bis 7:1 und noch mehr bevorzugt ungefähr 5:1 bis ungefähr 7:1 oder 5:1 bis 7:1 , und spiegelt auch hier das in der Muttermilch vorliegende Verhältnis ARA:EPA von ca. 2:1 bis ca. 7:1 wieder (Yuhas et al. 2006 Lipids 41 : 851-8).

In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Pflanzensamenöl der Erfindung auch die

Fettsäure Stearidonsäure. Bevorzugt liegt Stearidonsäure mit einem Gehalt von ungefähr 0,1 bis ungefähr 1 oder 0,1 bis 1 Gewichtsprozent am Gesamtfettsäuregehalt (besonders wenn in der Säuglingsnahrung verwendet), vorzugsweise von ungefähr 0,3 bis ungefähr 1 oder 0,3 bis 1 Gewichtsprozent, oder ungefähr 0,4 bis ungefähr 1 oder 0,4 bis 1 Gewichtsprozent, besonders bevorzugt von ungefähr 0,5 bis ungefähr 1 oder 0,5 bis 1 Gewichtsprozent vor.

Für die Messungen der ölspezifikationen gelten immer Variatonsbereiche, die auf der individuellen Organismenentwicklung, dem Aufschluss- und Extraktionsverfahren und der Gerätemessgenauigkeit basieren. Es wurden die hierin angegebenen Verhältnisse aus diesem Grund mit den Begriffen „ungefähr", „ca.", oder „etwa" angeführt.

Dihomo-Gamma-Linolensäure, ARA und EPA sind Vorstufen der biologisch aktiven Eicosanoide (Das 2008 Lipids Health Dis. 7:9). Dies ist von besonderer Bedeutung für

Frühgeborene und Neugeborene, deren Stoffwechsel noch nicht genügend ausgereift ist. ARA und DHA sind wichtige Komponenten von spezifischen Membranphospholipiden und für die Entwicklung des Nervensystems, der Retina und Sehfunktionen von großer Bedeutung. SDA, ARA, EPA und DHA sind in der Muttermilch enthalten und daher wesentliche Bestandteile von Frühgeborenen- und Säuglingsanfangsnahrungen (Yuhas et al. 2006 Lipids 41 :851-8). Somit weist das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl nicht nur erstmals einen hohen Gehalt an ARA und ein ausgewogeneres Verhältnis von ARA zu GLA und DGLA auf als alle bisher im Stand der Technik beschriebenen öle. Es enthält mit den essentiellen Fettsäuren Linolsäure und Alpha-Linolensäure sowie den hochgradig ungesättigten Fettsäuren SDA und EPA weitere Komponenten, die auch in der Muttermilch vorkommen. DHA kann beispielsweise durch Mischen mit anderen ölen zugefügt werden, wie im folgenden genauer beschrieben. Das Hintergrund-Fettsäureprofil des erfindungsgemäßen öls kommt somit sehr nahe an die Fettsäurekomposition der Muttermilch.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Pflanzensamenöl aus einer transgenen Pflanze gewonnen.

Unter dem Begriff „transgen" ist zu verstehen, dass ein heterologes Polynucleotid, also ein in der jeweiligen Pflanze nicht natürlicherweise vorkommendes Polynucleotid, in die Pflanze eingebracht wird. Dies kann entweder durch zufällige Insertion des Polynucleotids oder durch homologe Rekombination erreicht werden. Selbstverständlich kann statt des Polynucleotids auch ein Vektor eingebracht werden. Verfahren zum Einbringen von Polynukleotiden oder Vektoren zwecks zufälliger Insertion oder homologer Rekombination sind im Stand der Technik bekannt und auch nachfolgend genauer beschrieben. Wirtszellen, die das Polynucleotid oder den Vektor enthalten, können ebenfalls in einen Pflanze eingebracht werden und so eine transgene Pflanze erzeugen. Bei einer solchen Pflanze handelt es sich dann aber um eine chimäre Pflanze bei der lediglich die Zellen, die sich von den eingebrachten Zellen ableiten, transgen sind, d.h. das heterologe Polynucleotid umfassen. Bevorzugt wird in die transgene Pflanze ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt wie in den SEQ ID NOs. 15, 16 oder 17 gezeigt eingebracht.

Bevorzugt sind die transgenen Pflanzen öl-produzierende Pflanzen, das heißt solche, die für die Herstellung von ölen verwendet werden.

Als transgene Pflanzen können grundsätzlich alle Pflanzen verwendet werden, d.h. sowohl zweikeimblättrige als auch einkeimblättrige Pflanzen. Vorzugsweise handelt es sich um ölfruchtpflanzen, die große Mengen an Lipidverbindungen enthalten, wie Raps, Canola, Färberdistel (Saflor, Carthamus tinctoria), Lein oder aber Feldfrüchte, wie Mais.

Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl in trangenem Raps, transgenem Soja, transgenem Lein, transgener Färberdistel oder transgenem Mais hergestellt, die mit einem Nukleinsäurekonstrukt wie in den SEQ ID NOs. 15, 16 oder 17 gezeigt transformiert sind.

Ganz besonders bevorzugt ist die transgene Pflanze trangener Raps.

Tabelle 1 in den folgenden Beispielen zeigt die vorzugsweise verwendeten Gene zur Synthese von ARA mit der bevorzugten Fettsäurekomposition.

Die Erfindung betrifft auch die Nukleinsäurekonstrukte wie in den SEQ ID NOs. 15, 16 und 17 gezeigt sowie transgene Pflanzen, die mit diesen Nukleinsäurekonstrukten transformiert sind und deren Nachkommen, die das Nukleinsäurekonstrukt stabil im Genom integriert haben.

Falls ein Pflanzensamenöl mit DHA hergestellt werden soll, enthalten die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte zusätzlich zu den oben angeführten Genen geeignete Promoter-Gen- Terminator-Kassetten, die vorzugsweise die für die Delta 5-Elongase kodierende DNA aus Ostreococcus tauri wie in SEQ ID NO. 18 gezeigt und oder die für die Delta 4-Desaturase kodierende DNA aus Traustochytrium ssp. wie in SEQ ID NO. 20 dargestellt enthalten. Die erwähnten DNAs und geeignete Kassetten sind z.B. in WO2005/083093 beschrieben.

Die Erfindung betrifft zudem ein Pflanzensamenöl umfassend ein Fettsäurespektrum enthaltend Palmitinsäure, Stearinsäure, ölsäure, Linolsäure, Gamma-Linolensäure, Alpha-Linolensäure, Stearidonsäure, Dihomo-Gamma-Linolensäure, Arachidonsäure und Eicosapentaensäure. Ein solches Fettsäurespektrum ist in beispielsweise Figur 3B gezeigt.

Noch mehr bevorzugt umfasst das Pflanzensamenöl der Erfindung ungefähr 3,2-5,3% Palmitinsäure, ungefähr 2,2-5,3% Stearinsäure, ungefähr 10-25% ölsäure, ungefähr 22-36% Linolsäure, ungefähr 4-12% Gamma-Linolensäure, ungefähr 3-8% Alpha-Linolensäure, ungefähr 0,2-1 % Stearidonsäure, ungefähr 3-9% Dihomo-Gamma-Linolensäure, ungefähr 12- 25% Arachidonsäure und ungefähr 1-4% Eicosapentaensäure bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt; oder das Pflanzensamenöl der Erfindung umfasst 3,2-5,3% Palmitinsäure, 2,2-5,3% Stearinsäure, 10-25% ölsäure, 22-36% Linolsäure, 4-12% Gamma- Linolensäure, 3-8% Alpha-Linolensäure, 0,2-1 % Stearidonsäure, 3-9% Dihomo-Gamma- Linolensäure, 12-25% Arachidonsäure und 1-4% Eicosapentaensäure bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt.

Besonders bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl die für die Säuglingsernährung wichtigen Fettsäuren in folgenden Gewichtsprozenten (Masse der Fettsäuren in Prozent vom Gesamtfettsäuregehalt)

Zielfettsäure %

Arachidonsäure (20:4 n-6) ca. 15

Essentielle Fettsäuren:

Linolsäure (18:2 n-6) ca. 20-25 Alpha-Linolensäure (18:3 n-3) ca. 3-7

Zusätzliche für den Säugling wertvolle Fettsäuren:

Gamma-Linolensäure (GLA) (18:3 n-6) ca. 6-1 1

Dihomo-Gamma-Linolensäure (DGLA)(20:3 n-6) ca. 4-8

Stearidonsäure (SDA) ca. 1-2 Eicosapentaensäure (EPA) ca. 2-4;

oder

Zielfettsäure % Arachidonsäure (20:4 n-6) 15

Essentielle Fettsäuren:

Linolsäure (18:2 n-6) 20-25

Alpha-Linolensäure (18:3 n-3) 3-7

Zusätzliche für den Säugling wertvolle Fettsäuren:

Gamma-Linolensäure (GLA) (18:3 n-6) 6-1 1

Dihomo-Gamma-Linolensäure (DGLA)(20:3 n-6) 4-8

Stearidonsäure (SDA) 1-2 Eicosapentaensäure (EPA) 2-4.

Die Erfindung betrifft des weiteren eine Formulierung oder ein Mischöl, umfassend ein erfindungsgemäßes Pflanzensamenöl und mindestens ein weiteres öl ausgewählt aus der Gruppe Pflanzenöl, mikrobielles öl und Fischöl, wobei das Pflanzenöl, mikrobielle öl oder Fischöl Docosahexaensäure enthält.

Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl kann mit einem oder mehreren ölen gemischt werden, um beispielsweise den Gehalt einer oder mehrerer Fettsäuren zu verändern, d.h. zur erhöhen oder zu verringern. Das beigemischte öl kann etwa ein weiteres natürlich vorkommendes oder transgenes Pflanzenöl oder Pflanzensamenöl sein. Als Beispiel kann Leinöl genannt werden, welches einen hohen Anteil an Alpha Linolensäure aufweist. Es kann auch ein mikrobielles öl, zum Beispiel ein öl aus Mortierella alpina oder aus Crypthecodinium cohnii, sein. Besonders geeignet sind hierbei DHASCO®- (DHA, Crypthecodinium cohnii) und ARASCO®- (ARA, Mortierella alpina) ölmischungen, die zum Beispiel in Säuglingsnahrungen verwendet werden. Durch die Beimischung von DHASCO®- (DHA, Crypthecodinium cohnii) zu dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl kann beispielsweise die Fettsäure DHA eingebracht werden. Es eignen sich aber auch Fischöle zur Formulierung des Pflanzensamenöls der Erfindung, zum Beispiel Lachsöl, Heringsöl, Makrelenöl, Thunfischöl oder Dorschöl (United States Department of Agriculture 2005, „Nutrition and Your Health: Dietary Guidelines for Americans" EPA and DHA Content of Fish Species, Data From NDB SR 16-1 ; siehe auch z.B. GRAS Notifications 94, 109 and 193), um etwa die Komposition der Fettsäuren in dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl zu verändern. Fischöle zeichnen sich unter anderem durch einen hohen Gehalt an langkettigen, mehrfach ungesättigten Omega-3 Fettsäuren aus. Das Pflanzensamenöl der Erfindung kann mit nur einem weiteren öl gemischt werden, aber

auch mit zwei, drei oder noch mehr ölen. Das eine öl oder die weiteren beigemischten öle können dabei aus dem gleichen Organismus stammen oder aus verschiedenen Orgsanismen. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl mit einem mikrobiellen öl, z.B. einem öl aus Mortierella alpina oder aus Crypthecodinium cohnii oder Schizochytrium sp. (Arterburn et al. 2007_Lipids 42-101 1-24), und/oder einem Fischöl (etwa Lachsöl oder Tunfischöl) formuliert werden. Formulierungen von Pflanzensamenölen sind im Stand der Technik beschrieben. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl auch mit dem BASF Pulver Produkt Nummer 30056967, „Dry n-3® 5:25 C Powder Microencapsulated fish oil rieh in DHA for Infant formula" in einer Säuglingsnahrung verarbeitet werden. Alternativ kann als Quelle für DHA auch DHASCO® (docosahexaenoie aeid-rich single-cell oil) wie in der GRAS Notice No. GRN 000041 beschrieben angewandt werden. Dabei kann das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl ähnlich dem o.a. BASF Produkt zunächst in ein mikroenkapsuliertes Pulver überführt werden oder direkt als prozessiertes und stabilisiertes Pflanzensamenöl angewandt werden. Beide dieser Pulver oder öle können dann gemischt oder einzeln in den gewünschten Mengen dem Säuglingsnahrungsprodukt zugegeben werden. Die Zugabe geschieht gegen Ende der Produktion des Säuglingsnahrungsproduktes unter Schutzmassnahmen vor Oxidation. Bevorzugte Konzentrationen zu welchen die Produkte der Säuglingsnahrung zugegeben werden hängen von verschiedenen Faktoren ab. Eine bevorzugte Menge der Zugabe des erfindungsgemäße Pflanzensamenöls bezogen auf das Endprodukt ist jene Menge des öls welche eine Konzentration von bis zu 1 g ARA/100 g des Gesamtfettes im Säuglingsnahrungsprodukt ergibt. Eine bevorzugte Menge der Zugabe des BASF Produkts Nummer 30056967 oder des DHASCO® öls bezogen auf das Endprodukt ist jene Menge des Pulver oder öls welche eine Konzentration von bis zu 1 g DHA/100 g des Gesamtfettes im Säuglingsnahrungsprodukt ergibt. Die bevorzugten Mengen des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls und des BASF Produkts Nummer 30056967 oder des DHASCO öls können abhängen unter anderem von der nationalen Gesetzeslage der einzelnen Länder in denen das Säuglingsnahrungsprodukt vertrieben wird, von den Herstellerproduktwünschen und von den Kundenwünschen.

Die Erfindung stellt zudem Nahrungsmittel, zur Verfügung welches ein erfindungsgemäßes Pflanzensamenöl umfasst.

Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl kann zum Beispiel direkt als kaltgepresstes öl, z.B. als Salatöl verwendet werden. Es kann beispielsweise auch in Milch oder Milchprodukten wie Käse oder Joghurt verwendet werden. Es kann aber auch Margarine, oder Brot oder Backwaren zugesetzt werden. Schließlich eignet es sich generell als Nahrungsergänzungsmittel (Supplement). Hierunter sind Produkte zur erhöhten Versorgung des menschlichen Stoffwechsels mit bestimmten Nähr- oder Wirkstoffen im Grenzbereich zwischen Arzneimitteln und Lebensmitteln zu verstehen. Rechtlich ist diese Produktgruppe der Nahrungsergänzungsmittel im EU-Recht durch die Richtlinie 2002/46/EG geregelt. Dabei sind insbesondere die zulässigen Mineralstoffe und Vitamine vorgegeben. In der hierauf basierenden Nahrungsergänzungsmittel-Verordnung ist ein Nahrungsergänzungsmittel:„ein Lebensmittel, das dazu bestimmt ist, die allgemeine Ernährung

zu ergänzen, ein Konzentrat von Nährstoffen oder sonstigen Stoffen mit ernährungsspezifischer oder physiologischer Wirkung allein oder in Zusammensetzung darstellt und in dosierter Form, insbesondere in Form von Kapseln, Pastillen, Tabletten, Pillen, Brausetabletten und anderen ähnlichen Darreichungsformen, Pulverbeutel, Flüssigampullen, Flaschen mit Tropfeinsätzen und ähnlichen Darreichungsformen von Flüssigkeiten und Pulvern zur Aufnahme in abgemessenen kleinen Mengen in den Verkehr gebracht wird." Da sie rechtlich zu den Lebensmitteln gehören, fallen sie in Deutschland unter die Regelungen des Lebensmittel- und Futtergesetzbuchs (LFGB). Die erlaubten Inhaltsstoffe sind in Anhang 1 der Nahrungsergänzungsmittelverordnung (NemV) aufgeführt.

Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl kann hierbei allein oder in Kombination mit einem öl oder weiteren ölen wie zum Beispiel mikrobiellem öl, etwa aus Mortierella alpina oder Crypthecodinium cohnii oder Fischöl zur Nahrungsergänzung verwendet werden. Es können auch Tocopherole z.B. Vitamin E und Tocotrienole und Ascorbyl Palmitat oder Pflanzenextrakte wie zum Beispiel Rosemarin und Pflanzensterole, oder Carotenoide wie zum Beispiel Lutein, Zeaxanthin, Astaxanthin und Lykopen, oder Koenzyme wie zum Beispiel Koenyzm Q zugesetzt werden. Geeignete Verabreichungsformen sind hierbei Kapseln, Pastillen, Tabletten, Pillen, Brausetabletten und andere ähnliche Darreichungsformen, Pulverbeutel, Flüssigampullen, Flaschen mit Tropfeinsätzen und ähnlichen Darreichungsformen von Flüssigkeiten und Pulvern zur Aufnahme des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls in abgemessenen kleinen Mengen. Die Dosierung der Fettsäuren zur Nahrungsergänzung ist im Stand der Technik hinlänglich beschrieben.

Die Erfindung betrifft hierbei bevorzugt Babynahrung, welche das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl umfasst.

Wenn nicht gestillt wird, dient Babynahrung in den ersten Lebensmonaten nach der Geburt der ausschließlichen Ernährung. Der Begriff „Babynahrung" wie hier verwendet umfasst zum Beispiel Frühgeborenennahrung, Säuglingsanfangsnahrung, Säuglingsnahrung, oder Kleinkindernahrung. Frühgeborennahrung bedeutet dabei Nahrung für Neugeborene, die vor dem errechneten Geburtstermin zur Welt kommen. Säuglingsanfangsnahrungen sind Lebensmittel, die für die besondere Ernährung von Säuglingen während der ersten vier bis sechs Monate nach der Geburt (also von Geburt bis zum Alter von vier bis sechs Monaten) bestimmt sind und für sich allein den Ernährungserfordernissen dieser Personengruppe entsprechen. Unter Säuglingsnahrung ist Nahrung für Säuglinge zu verstehen, wobei mit

Säuglingen Kleinkinder bis zu etwa zwölf Monaten gemeint sind (Geburt bis zum Alter von 12 Monaten). Unter Kleinkindernahrung wird Nahrung verstanden, die Kleinkindern bis zum Alter von etwa vierundzwanzig Monaten (Geburt bis 24 Monate) verabreicht wird. Die LC-PUFA- Gehalte für solche Anwendungen in der Ernährung von Babies oder Kleinkindern im Alter von ca. 4-6 Monaten bis 24 Monaten liegen im gleichen Bereich wie für

Säuglingsanfangsnahrungen bezogen auf den Fettgehalt der Nahrung. Die Zusammensetzung einer exemplarischen Säuglingsnahrung die das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl enthält ist in den folgenden Beispielen gezeigt. Die erfindungsgemäßen Pflanzensamenöle können

beispielsweise in der Mutterersatzmilch, in der Folgemilch (zum Beispiel nach dem Absetzen des Säuglings von der Mutterbrust) oder als Beikost eingesetzt werden, etwa als Zusatz von Babybrei, Gläschenkost, rekonstituierte Trockennahrung, Milch und Milchersatzgetränke, Saft und andere Warm- oder Kaltgetränke und Diätnahrungsmittel. Die Pflanzensamenöle der Erfindung finden aber auch Anwendungen in der Ernährung von schwangeren Müttern sowie stillenden Müttern, da die LC-PUFAs in die Muttermilch gelangen können. Zudem können sie auch für Nachrungsergänzungszwecke für Kinder im Alter bis 24 Monate, aber auch für ältere Kinder und Erwachsene benutzt werden. Nahrungsergänzungen können in jeglicher Form verabreicht werden beispielsweise in Form von Milch, Saft, Brei, Sirup, Süssigkeit, fermentiertem Produkt, Pillen, Kapseln, oder Dragees.

Babynahrung oder Säuglingsnahrung wie hierin verwendet ist als Oberbegriff für alle Lebensmittel zu verstehen, die für die Ernährung von Säuglingen oder Kleinkindern bis zu 24 Monaten besonders geeignet sind. Dazu gehört auch Muttermilch. Industrielle Babyfertignahrung wird in der Regel ohne Salz, Gewürze, Zucker und meistens auch ohne Färb- und Konservierungsstoffe hergestellt. Unterschieden wird hierbei lebensmittelrechtlich zwischen Säuglingsanfangsnahrung, Folgenahrung und Beikost (Lebensmittel-Lexikon Dr. Oetker, 4. Aufl. 2004, Artikel Säuglingsnahrung).

Hierbei kann unterschieden werden zwischen:

Säuglingsanfangsnahrung (0 bis 6 Monate)

Als Säuglingsanfangsnahrung werden lebensmittelrechtlich alle Lebensmittel und Produkte bezeichnet, die speziell für die Ernährung in den ersten sechs Lebensmonaten bestimmt sind und alle Nährstoffe enthalten, die der Säugling benötigt. Für die Zubereitung der Fertigprodukte wird in manchen Fällen noch Wasser hinzugefügt.

Folgenahrung (4 bis 24 Monate)

Folgenahrung für Säuglinge sind im Lebensmittelrecht alle Lebensmittel und Produkte, die speziell für Säuglinge etwa ab dem vierten Monat bestimmt sind und wie die Anfangsnahrung eine flüssige Konsistenz haben, aber mehr Kohlehydrate in Form von Stärke enthalten.

Beikost (4 bis 24 Monate)

Als Beikost werden alle Lebensmittel und Zubereitungen bezeichnet, die für Säuglinge als Ergänzung der Milchnahrung dienen, um die Umstellung auf feste Nahrung vorzubereiten.

Spezialnahrung (0 bis 24 Monate)

Für Babys und Kleinkinder von Allergikern die eine erhöhte erbliche Allergieneigung haben. Da bei Babys die Darmschleimhaut noch durchlässig ist und artfremdes Eiweiß, zum Beispiel aus Kuhmilch, eine Lebensmittelallergie auslösen kann, gibt es auf dem Markt so genannte hypoallergene Säuglingsnahrung. Auch sie sollte mit ARA ergänzt werden.

Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl eignet sich neben den oben angeführten

Anwendungen auch als Komplettnahrung. Unter Komplettnahrung ist hierbei eine Nahrung zu verstehen, die den kompletten Ernährungsbedarf eines tierischen oder menschlichen Individuums (z.B. eines Babys) abdeckt, so dass ein gesundes Wachstum optimal gewährleistet ist. Eine Komplettnahrung, der das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl zugesetzt ist, enthält Arachidonsäure (ARA) in ähnlichen Konzentrationen wie die Muttermilch. Die Komplettnahrung enthält auch Gamma-Linolensäure (GLA), Dihomo-Gamma-Linolensäure (DGLA), Stearidonsäure (SDA) und Eicosapentaensäure (EPA), sowie optional DHA, in ähnlichen Konzentrationen wie die Muttermilch. Sie eignet sich deshalb ganz besonders gut zur Herstellung von Babynahrung. Die oben angeführte Komplettnahrung kann zum Beispiel Säuglingsmilch, Folgemilch, Getränk fürs Kleinkind, Fruchtsaft, Breiprodukte, Milch, Joghurt oder fermentierte Produkte sein. Sie ist für die Ernährung von Säuglingen und Kindern bestimmt, um ihr normales Wachstum und ihre Entwicklung zu unterstützen. Beim Komplettprodukt kann es sich auch um feste Babynahrung, Süßigkeiten, Kekse oder Gelatineprodukte handeln. Der ARA-Gehalt in der Säuglingsnahrung wie in den Beispielen gezeigt wurde der

Gesamtmenge an ARA angeglichen, die in der Muttermilch während der ersten 0-12 Monate der Laktation gefunden wurde. Ein zusätzlicher Vorteil besteht darin, dass wenn das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl verwendet wird, um die Säuglingsmilch mit ARA zu ergänzen, somit auch die Werte für die GLA, DGLA und SDA im Bereich der Konzentrationen wie in der Muttermilch liegen. Das liegt daran, dass das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl die drei hochgradig ungesättigten Fettsäuren nahezu in den Anteilen enthält, die auch in der Muttermilch gefunden wurden. Wird also das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl als Bestandteil der Babynahrung verwendet, um die ARA-Konzentration anzugleichen, dann werden die GLA und die DGLA in den richtigen Konzentrationen mitgeliefert, um die entsprechenden Nährstoffe für die speziellen Baby- und Kindernahrungen bereit zu stellen. In diesem Fall ist keine Veränderung des öls wie etwa das Zumischen von beispielsweise weiteren GLA-, DGLA- und SDA- haltigen ölen notwendig.

Babynahrungen sind in Europa den diätetischen Lebensmitteln zugeordnet (siehe z.B. "Directive 91/321/EC") Die Qualitätsanforderungen an Säuglings- und Babynahrung sind deshalb sehr hoch und weltweit streng geregelt. Europa orientiert sich hierbei an der EG- Richtlinie 91/321/EG und dem Codex Alimentarius Alinorm 03/26a, welche innerhalb der EG inzwischen in nationales Recht umgesetzt wurden. Als wichtige neue europäische Richtlinien und Direktiven sind der Codex Alimentarius: International Code of Hygienic Practice for Foods for Infants and Children (2004), die VO 852/2004/EG Lebensmittelhygienegesetz , Anlage Il (GHP,GMP)(Novellierung des Hygienerechts in Deutschland, 29.04.2004), sowie die VO 178/2002/EG: Festlegung der allgemeinen Grundsätze und Anforderungen des Lebensmittelrechts, zur Festlegung von Verfahren zur Lebensmittelsicherheit. 28.02.2002 (Chain Control, Rückverfolgbarkeit von Rohstoffen) zu nennen. Auch Osteuropa orientiert sich an den EG-Richtlinien und hat nationale sehr strenge gesetzliche Vorschriften. Asien und

Australien: richten sich am WHO/FAO-Code, Codex Alimentarius und den FDA Regularien der USA aus. Die FDA Regularien der USA decken sich weitgehend mit WHO-Code und Codex Alimentarius. Die nationalen Gesetzgebungen in Süd- und Mittelamerika orientieren sich an der

US-Regulation, dem WHO-Code und Codex Alimentarius.

Wichtige gesetzliche Regelungen in Deutschland sind in der Diät-Verodnung (VO), in den §§ 14, 14b, 14c, 14d, 22a, 22b (Deutschland) angeführt. Die EG Verodnung (VO) 683/2004/EG betrifft Aflatoxine und Mykotoxine in Säuglings- und Kleinkindernahrungen. Die VO

1830/2003/EG regelt die Rückverfolgbarkeit von genetisch modifizierten Organismen (GMO) und von aus GMO Organismen hergestellten Lebensmitteln (22.09.2003). Die Höchstmengen- VO betrifft hierbei Rückstände von Pflanzenschutzmitteln odeer Schädlingsbekämpfungsmitteln (05.1 1.2003). Die VO 2377/90/EG betrifft die Festsetzung von Höchstmengen für Tierarzneimittelrückständen in Nahrungsmitteln tierischen Ursprungs (30.12.2000). Die Schadstoff-VO betrifft beispielsweise den maximal zulässigen Dioxin- und PCB-Gehalt.

Babynahrungen können beispielweise in Pulverform hergestellt werden. Hierzu werden sie zum Beispiel sprühgetrocknet, instantisiert, und agglomeriert. Die Verpackung erfolgt in Weißblechdosen (mit Stickstoff/Kohlendioxid begast) oder Aluminiumverbundfolienbeuteln (begast, nicht begast). Babynahrungen können aber auch in in flüssiger und emulgierter Form hergestellt werden. Hierzu werden sie zum Beispiel terminalsterilisiert in Glasflaschen oder Dosen abgefüllt. Weiter praktiziert kann auch eine aseptische Abfüllung in Glas (Brikpak) oder eine Abfüllung des terminalsterilisierten Konzentrates in Dosen werden.

Als Rohstoffe zur Herstellung von Babynahrung können beispielsweise die folgenden Komponenten verwendet werden:

Kuhmilch, Ziegenmilch (z.B. China, Australien), Casein/Caseinate, entmineralisiert.es Molkenpulver, Aminosäuren, Taurin, Carnitin; Pflanzenöle (Palmöl, Sojaöl, Sonnenblumenöl, hoch ölsäurehaltiges Sonnenblumenöl, Distelöl, Kokosöl, Rapsöl), Milchfett, Fischöle

(Thunfischöl, Dorschleberöl, Krillöl), Eilipide (Ovothin), ARASCO®, DHASCO®; Kohlenhydrate (Laktose, Maltodextrin, Stärke), andere Zuckerarten, Oligosaccharide (Prebiotika), Bakterienkulturen (Probiotika); Vitamine, Cholin, myo-lnositol; Mineralstoffe (Ca, Na, K, Mg, P, Cl), Spurenelemente (Fe, Zn, Cu, Mn, Cr, Se, F, J), Nucleotide.

Bei den wichtigsten Herstellverfahren erfolgt die Herstellung der Babynahrung durch Sprühtrocknung von fetthaltigen Halbfabrikaten und dem Nachmischen von Kohlenhydraten, Vitaminen und Mikronutrients. Die Herstellung der Babynahrung kann aber auch durch das Einarbeiten von LC-PUFAs in die Fettphase und dem Versprühen mit den Protein- und Kohlenhydratkomponenten zu einem Halbfabrikat erfolgen.

Figur 5 zeigt exemplarisch die Herstellung von Säuglingsnahrung in flüssiger Form, während Figur 6 ein Beispiel für die Herstellung von Säuglingsnahrung durch Komplettsprühung gibt.

Eine Stabilisierung der LC-PUFAs in dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl kann hierbei beispielsweise durch den Zusatz von Tocopherolen und Tocotrenolen erreicht werden. Der Zusatz von Tokopherolen, Ascorbylpamitat und Natriumascorbat führt zum Schutz der LC- PUFAs und zur Verbesserung der Haltbarkeit, indem die Produktstabilität erhöht und das

Ranziditätsrisiko verringert wird. Hiebei sei auf die ESPGHAN Empfehlung verwiesen, die den Vitamin E-Gehalt in Säuglingsnahrungen beleuchtet (J. Ped. Gastroenterology and Nutrition 26, S. 351-352, 1996). Weitere Zusätze zur Stabilisierung der LC-PUFAs können Pflanzenextrakte wie zum Beispiel Rosemarin und Pflanzensterole, oder Carotenoide wie zum Beispiel Lutein, Zeaxanthin, Astaxanthin und Lykopen, oder Koenzyme wie zum Beispiel verschiedene Formen von Koenyzm Q sein. Bei der Verwendung stabilisierender Zusätze sind regionale und nationale gesetzliche Bestimmungen zu beachten.

Um die in dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl enthaltenen LC-PUFA in Pulverform oder ölform für die Produktion von Babynahrung bereitzustellen eignen sich beispielsweise die folgenden Technologien. Für die Pulverform können einfache Trockenmischsysteme (z.B. Lödigemischer) zum Vermischen mit pulverförmigen Rohstoffen und Halbfabrikaten zum Endprodukt verwendet werden. Für die ölform (z.B. verpackt in begasten Containern) erfolgt die Einarbeitung in Fettmischungen zusammen mit Emulgatoren und Antioxydantien. Es folgt dann die Herstellung einer Emulsion mit der Wasserphase und die Trocknung zu einem Halbfabrikat (Sprühtrocknung). Das Halbfabrikat wird dann mit den restlichen Rezepturkomponenten trocken zum Endprodukt gemischt. Alternativ erfolgt die Herstellung einer Spezialfettmischung zusammen mit LC-PUFAs und die weitere Verarbeitung wie oben für die ölform beschrieben.

Für den Einsatz von LC-PUFAs in Pulverform bei der Herstellung von Babynahrung spricht die einfache Handhabung und die sichere Dosierung. Als Nachteil ist anzuführen, dass der Gehalt an LC-PUFAs nur ca. 25% und der Anteil an Mikroverkapselungsubstanzen ca. 75% beträgt. An grosseren ölbeladungen wird derzeit gearbeitet und Beladungen von weit über 50% öl erscheinen kommerziell möglich. Bei einem Einsatz von 1 % LCPUFA/100 g Produkt sind 4% Pulver (= 3 g Trägersubstanz/100 g) notwendig. Der Anteil der Trägerstoffe ist erheblich und bei der Rezeptur (vor allem bei Frühgeborenennahrungen) zu berücksichtigen. Als Trägerstoffe können zum Beispiel Gelatine, Saccharose, Stärke, Caseinat, Lecithin,Tricalciumphosphat, Vitamin C, Vitamin E, oder Natriumascorbat verwendet werden. Ein weiterer Nachteil ist in der fehlenden Homogenisierung (Fettkügelchengröße > 1 μm) zu sehen. Auch kann freies öl auf der Partikeloberfläche (durch Diffusion und unvollständige Verkapselung) zu Ranzidität führen. Der Einsatz von LCPUFAs in ölform bei der Herstellung von Babynahrung bringt als Vorteil eine einfache Verarbeitung zusammen mit der Fettmischung mit sich, die zu einer homogenen Verteilung führt. Auch können in der ölform Stabilisatoren ihre Wirkung besser entfalten. Die Homogenisierung führt zu einer vollständigen Lösung der LCPUFA in der Fettphase der

Nahrung. Ein weiterer Vorteil ist in dem Fehlen von Begleitstoffen sowie einer guten Haltbarkeit des Endproduktes zu sehen. Schliesslich bringt die ölform auch keine mikrobiologischen Probleme mit sich, da das Produkt in der Flüssigphase vor dem Trocknen erhitzt wird. Als Nachteil ist zu nennen dass die Viskosität zu erhöhtem Aufwand bei der Verarbeitung führen kann. Die Prozessführung kann bei der Sprühtrocknung und nachfolgenden Bearbeitung des Pulvers auch zu erhöhter Oxydation führen. Das sprühgetrocknete Halbfabrikat (mit LCPUFA) sollte nicht länger als 3-4 Wochen unbegast zwischengelagert werden. Es ist deshalb eine möglichst rasche weitere Verarbeitung zum Endprodukt und Abpackung in Dosen unter

Schutzgas (Stickstoff/Kohlendioxyd) wünschenwert.

Da das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl schon in ölform vorliegt, ist es zur Herstellung von Säuglingsnahrungen besonders geeignet. Die Verwendung von LCPUFA in ölform ist kostengünstiger und vorteilhafter, vor allem bei Produkten mit hohem Produktionsvolumen. Die Figur 6 zeigt die Verarbeitung des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls an einem Beispiel der Komplettsprühung, welche zu einem trockenen Endprodukt führt, und die Figur 5 an einem Beispiel der Herstellung eines flüssigen Babynahrungsproduktes.

Anspruch: Die Erfindung betrifft zudem ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls, umfassend die Schritte: a) Herstellung einer transgenen Pflanze durch Transformation mit dem Nukleinsäurekonstrukt wie in den SEQ ID NOs. 15, 16 oder 17 gezeigt b) Kultivierung der transgenen Pflanze aus Schritt a) unter Bedingungen, die die Biosynthese des Pflanzensamenöls erlauben c) Ernten der Pflanzensamen, Extraktion und Raffination des Pflanzensamenöls.

Nach der Ernte und Reinigung der Samen werden die gewonnenen Samen zur Gewinnung des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöles prozessiert. Die Prozessierung beginnt mit der Pressung der Samen, gefolgt von einer Extraktion und einer anschließenden Raffination des öls und einer Stabilisierung. Bevorzugt werden die Samen kalt gepresst und anschließend Vakuum filtriert. Dieser Prozess findet vorzugsweise unter innerter Atmosphäre, bevorzugt unter Stickstoff, statt. Etwa die Hälfte des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöles wird durch diesen Prozess gewonnen.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die Extraktion des Pflanzensamenöls in Schritt c) eine Hexan Extraktion.

Die anschließende Extraktion des aus der Pressung zurückbleibenden Pressrückstandes mit Lösungsmittel, vorzugsweise Hexan, erreicht eine Ausbeute des öls von über 90%.

Verschiedene Verfahren eignen sich für die Extraktion von Speiseölen, wie zum Beispiel kontinuierliche Verfahren mittels Hexan (Belitz & Grosch, 1999 „Edible Fats and OiIs" In: Food Chemistry, 2nd ed. Springer Verlag). Zur anschließenden Entfernung des Hexans unter die vorgeschriebenen Höchstmengen für Lebensmittelprodukte eignet sich eine Miscelladestillation. Anschließend wird das extrahierte öl mit dem Pressöl unter innerter Atmosphäre gemischt. Das Rohöl ist nun fertig für die Weiterverarbeitung durch Raffination. Die Extraktion mittels Hexan eignet sich für Speiseöle, als Zusatz in Margarine, aber auch für die Herstellung von Biodiesel. Ein Nachteil der Hexan Extraktion ist darin zu sehen, dass das extrahierte öl Hexan Rückstände enthalten kann, so dass sich ein solchermaßen extrahiertes öl nicht für alle Anwendungen, beispielsweise in der Babynahrung, gleich gut eignet.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die Extraktion des Pflanzensamenöls in Schritt c) deshalb eine superkritische CO2 Extraktion. Ein

solchermaßen extrahiertes öl enthält vorteilhaft keine Lösungsmittelrückstände, wie z.B. ein Hexan-extrahiertes öl. Insbesondere bevorzugt umfasst die Extraktion des Pflanzensamenöls in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens die folgenden Schritte: (i) Zerkleinern der Pflanzensamen durch Mahlen oder Pressen vorzugsweise unter inerter Athmosphäre auf eine Partikelgröße von weniger als 0,2 mm; und

(ii) Superkritische CO2 Extraktion, wobei der Druck mindestens 300 bar, die Temperatur zwischen 40 und 6OºC beträgt und der Extraktionslauf 60 kg CO2 pro Stunde durchsetzt und nach 30 bis 120 min abgeschlossen ist.

Superkritische Kohlendioxid (CO2) Extraktion basiert auf der Nutzung von Kohlendioxid in subkritischem oder superkritischem Zustand als Extraktionsmittel, wobei das Extraktionsmittel im Kreislauf geführt wird (Barthet und Daun 2002, JAOCS 79:245-51 ).

Dabei wird die gemahlene Saat der hierin beschriebenen Pflanzen direkt oder ein durch Auspressen des erfindungsgemäßen Pflanzenöls zur teilweisen Entfernung der öligen

Bestandteile gewonnener Presskuchen verwendet. Dieses Verfahren zur ölgewinnung aus Pflanzensamen hat den Vorteil, dass es besonders schonend unter innerter Atmosphäre und bei relativ geringen Temperaturen durchgeführt werden kann, was die oxidative Prozesse im öl verringert.

Zur möglichst vollständigen Gewinnung des erfindungsgemäßen Pflanzenöls wurde ein in den Beispielen beschriebenes Verfahren entwickelt, in dem die Samen zunächst auf eine definierte Größe zerkleinert und anschließend nahezu vollständig extrahiert werden. Zunächst wurde hierzu die Saat durch Mahlen oder Pressen auf eine Partikelgröße von weniger als 0,2 mm zerkleinert. Besonders vorteilhaft ist hier die Verwendung einer Rollenpresse mit Spaltgröße 0,15 mm. Bei der anschließenden superkritischen Extraktion liegt der bevorzugte Druck bei mindestens 300 bar, besonders bevorzugt bei 350 bar. Die Temperatur kann zwischen 40 und 6OºC gehalten werden, wobei bevorzugt eine möglichst niedrige Temperatur von 40 bis 50ºC oder noch besser 40 bis 45°C gewählt wird, um oxidative Prozesse im öl zu verringern. Eine optimale Ausbeute ist bei einem Extraktionslauf von 60 kg CO2 pro Stunde nach 120 min erreicht. Dabei liegt der optimale CO2 Massendurchsatz besonders bevorzugt bei 80- bis 100- mal der Masse des Substrats, um eine 90% Ausbeute der maximal erreichbaren Ausbeute zu erzielen. Kürzere Extraktionszeiten ergeben eine weniger vollständige Extraktion.

Die in der luftgetrockneten Saat verbliebene Feuchtigkeit (etwa 7%) geht in das Extraktionsöl über und erhöht vorteilhaft die gesamt ölausbeute bei der CO2 Extraktion verglichen mit gefriergetrocknetem Substrat. Daher ist eine Lufttrocknung des Substrats bevorzugt. Während des gesamten Extraktionsprozesses wird ein weitgehend gleich bleibendes öl bezüglich seiner Fettsäurenzusammensetzung und seiner Oxidationsparameter (Säurezahl, lodzahl) gewonnen. Die Extraktionseffizienz war bei der superkritischen CO2 Extraktion bei den hier angegebenen optimierten Bedingungen vergleichbar der Extraktionseffizienz einer konventionellen Soxhlet Extraktion mittels Hexan. Die im Pilotmaßstab durchgeführte superkritische Kohlendioxid (CO2) Extraktion kann ohne wesentliche Veränderungen auf den benötigten Industriellen Maßstab von

beispielsweise 800 Tonnen öl pro Jahr gesteigert werden.

Die superkritische CO2 Extraktion mittels des hierin beschriebenen Verfahrens eignet sich insbesondere zur Extraktion des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls, da es im Gegensatz zur Hexan Extraktion keine Rückstände des Lösungsmittels Hexan enthält. Somit findet ein solchermaßen extrahiertes erfindungsgemäßes Pflanzensamenöl besonders vorteilhaft Anwendung in der Babynahrung. Bevorzugt wird das öl über superkritische CO2 Extraktion nach dem in den Beispielen angeführten Verfahren gewonnen. Figur 4 zeigt exemplarisch eine Pilotanlagenskizze zur superkritische CO2 Extraktion für die erfindungsgemäßen Pflanzensamenöle.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die Raffination des Pflanzensamenöls in Schritt c) eine an das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl angepasste Alkali-Raffinationstechnologie, die in Großanlagen Verwendung findet und im folgenden näher beschrieben wird. Eine Raffination ist bei dem aus der Superkritischen CO2 Extraktion gewonnenen öl ist nicht in jedem Fall notwendig. Für einige der beschriebenen Anwendungen der erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls ist der direkte Einsatz des über SFE Superkritischen CO2 Extraktion gewonnenen öls möglich, d.h. hierzu ist keine anschließende Raffination notwendig. Zu diesen Produkten gehören Milch, Saft, Brei, Sirup, Süssigkeit und fermentiertes Produkt für das Kleinkind.

Für über Hexan Extraktion (optional auch für über Superkritische CO2 Extraktion) gewonnenes öl wird eine anschliessende Raffination durchgeführt. Die Raffination des rohen Pflanzenöles (Mischöl aus Preß- und Extraktionsöl) und die Abfüllung geschehen komplett unter Vakuum oder unter Stickstoff. Zunächst wird das Rohöl mit 10% Wasser hydratisiert (85°C, 45 min, 300 rpm). Die anschliessende Entschleimung mit 1 ,5 % Zitronensäure (20 %-ig) findet ebenfalls bei 85 ºC statt (45 min, 300 rpm, 10% Wasser). Es folgt die Neutralisation durch Waschen mit 7%- iger Natronlauge (90 - 95°C, 20 min, 250 rpm, 10% Wasser) und das Trocknen bei 90 ºC (1 1 min, 350 rpm bis 30 mbar). Die Bleichung geschieht mit 1 % Bleicherde (Tonsil Optimum 214 FF, 90 ºC, 20 min, 350 rpm, bis 20 mbar). Anschließend wird mittels eines Acetatfilters unter Druck und Stickstoff filtriert. Die Desodorierung wird bei 220ºC, 20 min, 1 - 2 mbar mit entionisiertem und entgastem Wasser durchgeführt.

Alternativ kann ein kaltgepresstes erfindungsgemäßes Pflanzenöl auch direkt zur Ernährung eingesetzt werden.

Das extrahierte erfindungsmäßige Pflanzenöl wird nun stabilisiert durch genau dosierten Zusatz einer Auswahl an stabilisierenden Zusätzen, welche beinhalten können: Tocopherole z.B. Vitamin E und Tocotrienole, Ascorbyl Palmitat, Pflanzenextrakte wie zum Beispiel Rosemarin und Pflanzensterole, Carotenoide wie zum Beispiel Lutein, Zeaxanthin, Astaxanthin und Lykopen, Phsopholipide wie zum Beispiel Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylserin und Phosphatidylglycol oder Coenzyme wie zum Beispiel Coenzym Q.

Nach einer anschließenden biochemischen Qualitätskontrolle ist das öl fertig zur Anwendung wie hierin beschrieben, etwa in Lebensmittelprodukten, dietätischen Produkten, insbesondere Babynahrung und Nahrungsergänzungsmitteln. Typische Werte für die biochemische Qualitätsparameter sind: Säurezahl 0,15; Peroxidzahl unter der Nachweisgrenze; Farbe AOCS 0,6 R und 22 Y.

Das durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte Pflanzensamenöl umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform Stoffe mit einer Struktur, die in der folgenden allgemeinen Formel I gezeigt wird

wobei die Variablen und Substituenten die folgenden sind R 1 = Hydroxyl, Coenzym A (Thioester), Lysophosphatidylcholin,

Lysophosphatidylethanolamin, Lysophosphatidylglycerol, Lysodiphosphatidylglycerol, Lysophosphatidylserin, Lysophosphatidylinositol, Sphingo- Base oder ein Radikal der Formel Il

R 2 = Wasserstoff, Llysophosphatidylcholin, Lysophosphatidylethanolamin,

Lysophosphatidylglycerol, Lysodiphosphatidylglycerol, Lysophosphatidylserin, Lysophosphatidylinositol oder gesättigtes oder ungesättigtes C2-C24-Alkylcarbonyl,

R 3 = Wasserstoff, gesättigtes oder ungesättigtes C2-C24-Alkylcarbonyl, oder R 2 und R 3 sind unabhängig voneinander ein Radikal der Formel Ia:

n = 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 9, m = 2, 3, 4, 5 oder 6 und p = 0 oder 3.

R 1 bedeutet in der allgemeinen Formel I Hydroxyl-, CoenzymA-(Thioester), Lyso- Phosphatidylcholin-, Lyso-Phosphatidylethanolamin-, Lyso-Phosphatidylglycerol-, Lyso-

Diphosphatidylglycerol-, Lyso-Phosphatidylserin-, Lyso-Phosphatidylinositol-, Sphingobase-, oder einen Rest der allgemeinen Formel Il

Die oben genannten Reste von R 1 sind immer in Form ihrer Thioester an die Verbindungen der allgemeinen Formel I gebunden.

R 2 bedeutet in der allgemeinen Formel Il Wasserstoff-, Lyso-Phosphatidylcholin-, Lyso- Phosphatidylethanolamin-, Lyso-Phosphatidylglycerol-, Lyso-Diphosphatidylglycerol-, Lyso- Phosphatidylserin-, Lyso-Phosphatidylinositol- oder gesättigtes oder ungesättigtes C2-C24- Alkylcarbonyl.

Als Alkylreste seien substituiert oder unsubstituiert, gesättigt oder ungesättigte C2-C24- Alkylcarbonyl-Ketten wie Ethylcarbonyl-, n-Propylcarbonyl-, n-Butylcarbonyl-, n-Pentylcarbonyl-, n-Hexylcarbonyl-,n-Heptylcarbonyl-, n-Octylcarbonyl-, n-Nonylcarbonyl-, n-Decylcarbonyl-, n- Undecylcarbonyl-, n-Dodecylcarbonyl-, n-Tridecylcarbonyl-, n-Tetradecylcarbonyl-, n- Pentadecylcarbonyl-, n-Hexadecylcarbonyl-, n-Heptadecylcarbonyl-, n-Octadecylcarbonyl-, n- Nonadecylcarbonyl-, n-Eicosylcarbonyl-, n-Docosanylcarbonyl- oder n-Tetracosanylcarbonyl- genannt, die eine oder mehrere Doppelbindung(en) enthalten. Gesättigte oder ungesättigte C10- C22-Alkylcarbonylreste wie n-Decylcarbonyl-, n-Undecylcarbonyl-, n-Dodecylcarbonyl-, n- Tridecylcarbonyl-, n-Tetradecylcarbonyl-, n-Pentadecylcarbonyl-, n-Hexadecylcarbonyl-, n- Heptadecylcarbonyl-, n-Octadecylcarbonyl-, n-Nonadecylcarbonyl-, n-Eicosylcarbonyl-, n- Docosanylcarbonyl- oder n-Tetracosanylcarbonyl-, die eine oder mehrere Doppelbindung(en) enthalten, sind bevorzugt. Besonders bevorzugt sind gesättigte und/oder ungesättigte C10-C22- Alkylcarbonylreste wie Cio-Alkylcarbonyl-, Cn-Alkylcarbonyl-, Ci2-Alkylcarbonyl-, C13-

Alkylcarbonyl-, C-u-Alkylcarbonyl-, Ciβ-Alkylcarbonyl-, Cis-Alkylcarbonyl-, C2o-Alkylcarbonyl- oder C22-Alkylcarbonylreste, die eine oder mehrere Doppelbindung(en) enthalten. Ganz besonders bevorzugt sind gesättigte oder ungesättigte Ci6-C22-Alkylcarbonylreste wie C16- Alkylcarbonyl-, Cis-Alkylcarbonyl-, C2o-Alkylcarbonyl- oder C22-Alkylcarbonylreste, die eine oder mehrere Doppelbindung(en) enthalten. Diese vorteilhaften Reste können zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen enthalten. Die besonders vorteilhaften Reste mit 20 oder 22 Kohlenstoffatomen in der Fettsäurekette enthalten bis zu sechs Doppelbindungen, vorteilhaft drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen, besonders bevorzugt fünf oder sechs Doppelbindungen. Alle genannten Reste leiten sich von den entsprechenden Fettsäuren ab.

R 3 bedeutet in der allgemeinen Formel Il Wasserstoff-, gesättigtes oder ungesättigtes C2-C24- Alkylcarbonyl.

Als Alkylreste seien substituiert oder unsubstituiert, gesättigt oder ungesättigte C2-C24- Alkylcarbonyl-Ketten wie Ethylcarbonyl-, n-Propylcarbonyl-, n-Butylcarbonyl-, n-Pentylcarbonyl-,

n-Hexylcarbonyl-, n-Heptylcarbonyl-, n-Octylcarbonyl-, n-Nonylcarbonyl-, n-Decylcarbonyl-, n- Undecylcarbonyl-, n-Dodecylcarbonyl-, n-Tridecylcarbonyl-, n-Tetradecylcarbonyl-, n- Pentadecylcarbonyl-, n-Hexadecylcarbonyl-, n-Heptadecylcarbonyl-, n-Octadecylcarbonyl-, n- Nonadecylcarbonyl-, n-Eicosylcarbonyl-, n-Docosanylcarbonyl- oder n-Tetracosanylcarbonyl- genannt, die ein oder mehrere Doppelbindungen enthalten. Gesättigte oder ungesättigte C10- C22-Alkylcarbonylreste wie n-Decylcarbonyl-, n-Undecylcarbonyl-, n-Dodecylcarbonyl-, n- Tridecylcarbonyl-, n-Tetradecylcarbonyl-, n-Pentadecylcarbonyl-, n-Hexadecylcarbonyl-, n- Heptadecylcarbonyl-, n-Octadecylcarbonyl-, n-Nonadecylcarbonyl-, n-Eicosylcarbonyl-, n- Docosanylcarbonyl- oder n-Tetracosanylcarbonyl-, die ein oder mehrere Doppelbindungen enthalten, sind bevorzugt. Besonders bevorzugt sind gesättigte und/oder ungesättigte C10-C22- Alkylcarbonylreste wie Cio-Alkylcarbonyl-, Cn-Alkylcarbonyl-, Ci2-Alkylcarbonyl-, C13- Alkylcarbonyl-, C-u-Alkylcarbonyl-, C 16 -Alkylcarbonyl-, C 18 -Alkylcarbonyl-, C2o-Alkylcarbonyl- oder C22-Alkylcarbonylreste, die ein oder mehrere Doppelbindungen enthalten. Ganz besonders bevorzugt sind gesättigte oder ungesättigte Ci6-C22-Alkylcarbonylreste wie C 16- Alkylcarbonyl-, C 18 -Alkylcarbonyl-, C2o-Alkylcarbonyl- oder C22-Alkylcarbonylreste, die ein oder mehrere

Doppelbindungen enthalten. Diese vorteilhaften Reste können zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen enthalten. Die besonders vorteilhaften Reste mit 20 oder 22 Kohlenstoffatomen in der Fettsäurekette enthalten bis zu sechs Doppelbindungen, vorteilhaft drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen, besonders bevorzugt fünf oder sechs Doppelbindungen. Alle genannten Reste leiten sich von den entsprechenden Fettsäuren ab.

Die oben genannten Reste von R 1 , R 2 and R 3 können mit Hydroxyl- und/oder Epoxygruppen substituierte sein und/oder können Dreifachbindungen enthalten.

Vorteilhaft enthält das im folgenden beschriebenen, erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Pflanzensamenöl mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit mindestens ein, zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen. Besonders vorteilhaft enthalten die Fettsäuren vier, fünf oder sechs Doppelbindungen. Die Fettsäuren haben vorteilhaft 18-, 20- oder 22-C-Atome in der Fettsäurekette, bevorzugt enthalten die Fettsäuren 20 oder 22 Kohlenstoffatome in der Fettsäurekette. Vorteilhaft werden gesättigte Fettsäuren mit den im Verfahren verwendeten

Nukleinsäurekonstrukten wenig oder gar nicht umgesetzt. Unter wenig ist zu verstehen, dass im Vergleich zu mehrfach ungesättigten Fettsäuren die gesättigten Fettsäuren mit weniger als 5 % der Aktivität, vorteilhaft weniger als 3 %, besonders vorteilhaft mit weniger als 2 %, ganz besonders bevorzugt mit weniger als 1 ; 0,9; 0,8; 0,7; 0;6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,25 oder 0,125 % umgesetzt werden. Diese nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Fettsäuren liegen im Pflanzensamenöl in einem Fettsäuregemisch vor.

Vorteilhaft bedeuten die Substituenten R 2 oder R 3 in den allgemeinen Formeln I und Il unabhängig voneinander gesättigtes oder ungesättigtes Ci8-C22-Alkylcarbonyl-, besonders vorteilhaft bedeuten sie unabhängig voneinander ungesättigtes C 18 -, C20- oder C22- Alkylcarbonyl- mit mindestens zwei Doppelbindungen.

Das im Verfahren hergestellte Pflanzensamenöl enthält mehrfach ungesättigte Fettsäuren, die vorteilhaft in Membranlipiden und/oder Triacylglyceriden gebunden sind, sie können aber auch als freie Fettsäuren oder aber gebunden in Form anderer Fettsäureester in den Pflanzen vorkommen. Dabei liegen sie vorteilhaft in Form von Mischungen verschiedener Fettsäuren oder Mischungen unterschiedlicher Glyceride vor. Die in den Triacylglyceriden gebundenen verschiedenen Fettsäuren lassen sich dabei von kurzkettigen Fettsäuren mit 4 bis 6 C-Atomen, mittelkettigen Fettsäuren mit 8 bis 12 C-Atomen oder langkettigen Fettsäuren mit 14 bis 24 C- Atomen ableiten, bevorzugt sind die langkettigen Fettsäuren, besonders bevorzugt sind die langkettigen Fettsäuren LCPUFAs von C 18 -, C20- und/oder C22-Fettsäuren.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird vorteilhaft ein Pflanzensamenöl mit Fettsäureestern mit ein- oder mehrfach ungesättigten Ciβ-, C20- und/oder C22-Fettsäuremolekülen mit mindestens einer oder zwei Doppelbindungen im Fettsäureester, vorteilhaft mit mindestens drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen im Fettsäureester, besonders vorteilhaft von mindestens fünf oder sechs Doppelbindungen im Fettsäureester hergestellt und führen vorteilhaft zur Synthese von Linolsäure (=LA, C18:2 δ9,12 ), Gamma-Linolensäure (= GLA, C18:3 δ6,9,12 ), Stearidonsäure (= SDA, C18:4 δ6,9,12,15) . Dihomo-Gamma-Linolensäure (= DGLA, 20:3 δ8,11,14 ), ω-3- Eicosatetraensäure (= ETA, C20:4 δ5,8,11,14 ), Arachidonsäure (ARA, C20:4 δ5,8,11,14 ), Eicosapentaensäure (EPA, C20:5 δ5,8,11,14, 1 7), ω -6-Docosapentaensäure (C22:5 δ4,7,10,13,16 ), ω-6- Docosatetraensäure (C22:4 δ7,10,13,16 ), ω-3-Docosapentaensäure (= DPA, C22:5 δ7,10,13,16,19) , Docosahexaensäure (= DHA, C22:6 δ4 ' 7 ' 10 ' 13 ' 16 ' 19 ) oder deren Mischungen. Das hergestellte Pflanzensamenöl umfasst bevorzugt ein Fettsäurespektrum enthaltend Palmitinsäure, Stearinsäure, ölsäure, Linolsäure, Gamma-Linolensäure, Alpha-Linolensäure, Stearidonsäure, Dihomo-Gamma-Linolensäure, Arachidonsäure und Eicosapentaensäure, wie auch in Figur 3B gezeigt.

Die Fettsäureester mit mehrfach ungesättigten C18-, C20- und/oder C22-Fettsäuremolekülen können aus den Pflanzen, die für die Herstellung der Fettsäureester verwendet wurden, in Form eines öls oder Lipids beispielsweise in Form von Verbindungen wie Sphingolipide, Phosphoglyceride, Lipide, Glycolipide wie Glycosphingolipide, Phospholipide wie

Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylinositol oder Diphosphatidylglycerol, Monoacylglyceride, Diacylglyceride, Triacylglyceride oder sonstige Fettsäureester wie die AcetylCoenzymA-Ester, die die mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei, drei, vier, fünf oder sechs bevorzugt fünf oder sechs Doppelbindungen enthalten, isoliert werden, vorteilhaft werden sie in der Form ihrer Diacylglyceride, Triacylglyceride und/oder in Form des Phosphatidylcholin isoliert, besonders bevorzugt in der Form der Triacylglyceride. Neben diesen Estern sind die mehrfach ungesättigten Fettsäuren auch als freie Fettsäuren oder gebunden in anderen Verbindungen in den Pflanzen enthalten. In der Regel liegen die verschiedenen vorgenannten Verbindungen (Fettsäureester und freie Fettsäuren) in den Pflanzen in einer ungefähren Verteilung von 80 bis 90 Gewichtsprozent (Gew.-%) Triglyceride, 2 bis 5 Gew.-% Diglyceride, 5 bis 10 Gew.-% Monoglyceride, 1 bis 5 Gew.-% freie Fettsäuren, 2 bis 8 Gew.-% Phospholipide vor, wobei sich die Summe der verschiedenen Verbindungen zu 100 Gew.-% ergänzt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die hergestellten LCPUFAs mit einem Gehalt von mindestens 3 Gew.-%, vorteilhaft von mindestens 5 Gew.-%, bevorzugt von mindestens 8 Gew.-%, besonders bevorzugt von mindestens 10 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 15 Gew.-% bezogen auf die gesamten Fettsäuren in einer transgenen Pflanze hergestellt. Dabei werden vorteilhaft C 18 - und/oder C2o-Fettsäuren, die in den Wirtsorganismen vorhanden sind, zu mindestens 10 %, vorteilhaft zu mindestens 20 %, besonders vorteilhaft zu mindestens 30 %, ganz besonders vorteilhaft zu mindestens 40 % in die entsprechenden Produkte wie ARA, EPA, DPA oder DHA, um nur einige beispielhaft zu nennen, umgesetzt. Vorteilhaft werden die Fettsäuren in gebundener Form hergestellt. Mit Hilfe der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren lassen sich diese ungesättigten Fettsäuren an sn1-, sn2- und/oder sn3-Position der vorteilhaft hergestellten Triglyceride bringen. Da im erfindungsgemäßen Verfahren von den Ausgangsverbindungen Linolsäure (C18:2) bzw. Linolensäure (C18:3) mehrere Reaktionsschritte durchlaufen werden, fallen die Produkte des Verfahrens wie beispielsweise Arachidonsäure (ARA), Eicosapentaensäure

(EPA), ω-6-Docosapentaensäure oder DHA nicht als absolute Reinprodukte an, es sind immer auch geringe Spuren der Vorstufen im Endprodukt enthalten. Sind in der Ausgangspflanze beispielsweise sowohl Linolsäure als auch Linolensäure vorhanden, so liegen die Endprodukte wie ARA, EPA oder DHA als Mischungen vor. Die Vorstufen sollten vorteilhaft nicht mehr als 20 Gew.-%, bevorzugt nicht mehr als 15 Gew.-%, besonders bevorzugt nicht als 10 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt nicht mehr als 5 , 4, 3, 2, 1 oder 0,5 Gew.-% bezogen auf die Menge des jeweilige Endproduktes betragen. Vorteilhaft werden in einer transgenen Pflanze wie hierin beschrieben als Endprodukte Palmitinsäure, Stearinsäure, ölsäure, Linolsäure, Gamma- Linolensäure, Alpha-Linolensäure, Stearidonsäure, Dihomo-Gamma-Linolensäure, Arachidonsäure und Eicosapentaensäure, wie auch in dem Fettsäurespektrum in Figur 3B gezeigt, gebildet.

Die in dem Pflanzensamenöl enthaltenen Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, enthalten vorteilhaft ungefähr 3,2-5,3% Palmitinsäure, ungefähr 2,2-5,3% Stearinsäure, ungefähr 10-25% ölsäure, ungefähr 22-36% Linolsäure, ungefähr 4-12% Gamma-Linolensäure, ungefähr 3-8% Alpha-Linolensäure, ungefähr 0,2-1 % Stearidonsäure, ungefähr 3-9% Dihomo-Gamma-Linolensäure, ungefähr 12- 25% Arachidonsäure und ungefähr 1-4% Eicosapentaensäure, bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt. Weiterhin können die in dem Pflanzensamenöl enthaltenen Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, vorteilhaft Fettsäuren ausgewählt aus der Gruppe der Fettsäuren Erucasäure (13-Docosaensäure), Sterculinsäure (9,10-Methylene octadec-9-enonsäure), Malvalinsäure (8,9-Methylen Heptadec-8-enonsäure), Chaulmoogrinsäure (Cyclopenten- dodecansäure), Furan-Fettsäure (9,12-Epoxy-octadeca-9,1 1-dienonsäure), Vernonsäure (9,10- Epoxyoctadec-12-enonsäure), Tarinsäure (6-Octadecynonsäure),6-Nonadecynonsäure, Santalbinsäure (t11-Octadecen-9-ynoic acid), 6,9-Octadecenynonsäure, Pyrulinsäure (t10- Heptadecen-8-ynonsäure), Crepenyninsäure (9-Octadecen-12-ynonsäure), 13,14- Dihydrooropheinsäure, Octadecen-13-ene-9,11-diynonsäure, Petroselensäure (cis-6-

Octadecenonsäure), 9c,12t-Octadecadiensäure, Calendulasäure (8t10t12c- Octadecatriensäure), Catalpinsäure (9t11t3c-Octadecatriensäure), Eleosterinsäure (9c1 1t13t- Octadecatriensäure), Jacarinsäure (8c10t12c-Octadecatriensäure), Punicinsäure (9c1 1t13c- Octadecatriensäure), Parinarinsäure (9c11t13t15c-Octadecatetraensäure), Pinolensäure (all- cis-5,9,12-Octadecatriensäure), Laballensäure (5,6-Octadecadienallensäure), Ricinolsäure (12- Hydroxyölsäure) und/oder Coriolinsäure (13-Hydroxy-9c, it-Octadecadienonsäure) enthalten. Die vorgenannten Fettsäuren kommen in den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Fettsäureester bzw. Fettsäuregemischen in der Regel vorteilhaft nur in Spuren vor, das heißt sie kommen bezogen auf die Gesamtfettsäuren zu weniger als 30 %, bevorzugt zu weniger als 25 %, 24 %, 23 %, 22 % oder 21 %, besonders bevorzugt zu weniger als 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7%, 6 % oder 5%, ganz besonders bevorzugt zu weniger als 4 %, 3 %, 2 % oder 1 % vor. Vorteilhaft enthalten die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische weniger als 0,1 % bezogen auf die Gesamtfettsäuren an einer der folgenden Fettsäuren, oder besser keine Clupanodonsäure (= Docosapentaensäure, C22:5 δ4 ' 8 ' 12 ' 15 ' 21 ) und keine Nisinsäure (Tetracosahexaensäure, C23'6 δ3 ' 8 ' 12 ' 15 ' 18 ' 21 )

Durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresekonstrukte bzw. die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäurekonstrukte kann eine Steigerung der Ausbeute an mehrfach ungesättigten Fettsäuren von mindestens 50 %, vorteilhaft von mindestens 80 %, besonders vorteilhaft von mindestens 100 %, ganz besonders vorteilhaft von mindestens 150 % gegenüber der nicht-transgenen Ausgangspflanze, beispielsweise Raps, Lein, Färberdiestel oder Soja, beim Vergleich in der GC-Analyse erreicht werden.

Auch chemisch reine mehrfach ungesättigte Fettsäurezusammensetzungen sind nach den vor beschriebenen Verfahren herstellbar. Dazu werden die Fettsäurezusammensetzungen aus den Pflanzen in bekannter Weise beispielsweise über Extraktion, Destillation, Kristallisation, Chromatographie oder Kombinationen dieser Methoden isoliert. Diese chemisch reinen Fettsäurezusammensetzungen sind für Anwendungen im Bereich der Lebensmittelindustrie zur Herstellung von Nahrungsmitteln, insbesondere Babynahrung, aber auch in der Kosmetikindustrie und der Pharmaindustrie vorteilhaft.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte sind in den SEQ ID NOs. 15, 16 und 17 gezeigt sowie oben und in den Tabellen 1 und 2 detailliert beschrieben. Im Prinzip können alle Gene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels vorteilhaft in Kombination mit den erfinderischen Nukleinsäurekonstrukten (im Sinne dieser Anmeldung soll der Plural den Singular und umgekehrt beinhalten) im Verfahren zur Herstellung von Pflanzensamenöl mit mehrfach ungesättigten Fettsäuren verwendet werden. Beispielsweise kann eine transgene Pflanze, die mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt transformiert ist, mit einem weiteren Expressionsvektor, mittels dessen ein oder mehrere Gene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels exprimiert werden können, zusätzlich über geeignete Transformationsverfahren in die transgene Pflanze eingebracht werden. Vorteilhaft werden Gene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ausgewählt aus der Gruppe Acyl-CoA-

Dehydrogenase(n), Acyl-ACP[= acyl carrier protein]-Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fettsäure-Acyl-Transferase(n), Acyl-CoAiLysophospholipid-Acyltransferasen, Fettsäure- Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A- Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n), Fettsäure-Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure-

Elongase(n) verwendet. Besonders bevorzugt werden Gene ausgewählt aus der Gruppe der δ- 5-Desaturasen, δ-6-Desaturasen, δ-8-Desaturasen, δ-12-Desaturasen, omega-3-Desaturasen in Kombination mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten verwendet, wobei einzelne Gene oder mehrere Gene in Kombination verwendet werden können. Besonders bevorzugt können, wie bereits erwähnt, in diesem Zusammenhang die δ-6-Desaturase mit SEQ ID Nr. 5 und 7, die δ-5-Desaturase mit SEQ ID Nr. 9, die δ-12-Desaturase mit SEQ ID Nr. 1 1 und 13, die δ-6-Elongase mit SEQ ID Nr. 1 und 3, die δ-5-Elongase mit der SEQ ID Nr. 18, und/oder die δ-4-Desaturase mit der SEQ ID NO. 20 eingesetzt werden.

Vorteilhaft setzen die im erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt verwendeten Desaturasen ihre jeweiligen Substrate in Form der CoA-Fettsäureester um. Dies führt, wenn vorher ein Elongationsschritt stattgefunden hat, vorteilhaft zu einer erhöhten Produktausbeute. Die jeweiligen Desaturierungsprodukte werden dadurch in höheren Mengen synthetisiert, da der Elongationsschritt in der Regel an den CoA-Fettsäureestern erfolgt, während der Desaturierungsschritt überwiegend an den Phospholipiden oder an den Triglyceriden erfolgt. Eine Ausstauschreaktion, die eine weitere möglicherweise limitierende Enzymreaktion erforderlich machen würde, zwischen den CoA-Fettsäureestern und den Phospholipiden oder Triglyceriden ist somit nicht erforderlich.

Durch die enzymatische Aktivität der durch das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt kodierten Polypeptide können unterschiedlichste mehrfach ungesättigte Fettsäuren im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden. Je nach Auswahl der für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Pflanzen lassen sich Mischungen der verschiedenen Fettsäuren wie Palmitinsäure, Stearinsäure, ölsäure, Linolsäure, Gamma- Linolensäure, Alpha-Linolensäure, Stearidonsäure, Dihomo-Gamma-Linolensäure,

Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und/oder DHA in freier oder gebundener Form herstellen. Je nachdem welche Fettsäurezusammensetzung in der Ausgangspflanze vorherrscht (C18:2- oder C18:3-Fettsäuren) entstehen so Fettsäuren, die sich von C18:2-Fettsäuren ableiten, wie GLA, DGLA oder ARA oder solche, die sich von C18:3-Fettsäuren ableiten, wie SDA, ETA oder EPA. Liegt in der für das Verfahren verwendeten Pflanze als ungesättigte Fettsäure nur

Linolsäure (= LA, C18:2 δ9,12 ) vor, so können als Produkte des Verfahrens nur GLA, DGLA und ARA entstehen, die als freie Fettsäuren oder gebunden vorliegen können. Ist in der im Verfahren verwendeten Pflanze als ungesättigte Fettsäure nur alpha-Linolensäure (= ALA, C18:3 δ9 ' 12 ' 15 ) vorhanden, wie beispielsweise in Lein, so können als Produkte des Verfahrens nur SDA, ETA, EPA und/oder DHA entstehen, die wie oben beschrieben als freie Fettsäuren oder gebunden vorliegen können. Durch Modifikation der Aktivität der an der Synthese beteiligten Enzyme δ-5-Desaturase, δ-6-Desaturase, δ-4-Desaturase, δ-12-Desaturase, δ-5-Elongase und/oder δ-6-Elongase lassen sich in den vorgenannten Pflanzen gezielt Pflanzensamenöle

mit einer gewünschten Fettsäurekomposition herstellen. Durch die Aktivität der δ-6-Desaturase und δ-6-Elongase entstehen beispielsweise öle mit GLA und DGLA bzw. SDA und ETA, je nach Ausgangspflanze und ungesättigter Fettsäure. Werden die δ-5-Desaturase, die δ-5- Elongase und die δ-4-Desaturase zusätzlich in die Pflanze eingebracht, so entstehen zusätzlich ARA, EPA und/oder DHA. Da es sich um Biosyntheseketten handelt, liegen die jeweiligen Endprodukte nicht als Reinsubstanzen in den Pflanzen vor. Es sind immer auch geringe Mengen der Vorläuferverbindungen im Endprodukt enthalten. Diese geringen Mengen betragen weniger als 20 Gew.-%, vorteilhaft weniger als 15 Gew.-%, besonders vorteilhaft weniger als 10 Gew.-%, ganz besonders vorteilhaft weniger als 5, 4, 3, 2 oder 1 Gew.-% bezogen auf die gewünschten Endprodukte zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure, ölsäure, Linolsäure, Gamma-Linolensäure, Alpha-Linolensäure, Stearidonsäure, Dihomo-Gamma- Linolensäure, Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und/oder DHA oder deren Mischungen.

Zur Steigerung der Ausbeute im beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Pflanzensamenölen mit einem vorteilhaft erhöhten Gehalt an mehrfach ungesättigten

Fettsäuren ist es vorteilhaft die Menge an Ausgangsprodukt für die Fettsäuresynthese zu steigern, dies kann beispielsweise durch das Einbringen einer Nukleinsäure in die Pflanze, die für ein Polypeptid mit δ-12-Desaturase codiert, erreicht werden. Dies ist besonders vorteilhaft in öl-produzierenden Pflanzen beispielsweise der Familie der Brassicaceae wie der Gattung Brassica z.B. Raps, die einen hohen ölsäuregehalt aufweisen. Da diese Organismen nur einen geringen Gehalt an Linolsäure aufweisen (Mikoklajczak et al., Journal of the American OiI Chemical Society, 38, 1961 , 678 - 681 ) ist die Verwendung der genannten δ-12-Desaturasen zur Herstellung des Ausgangsprodukts Linolsäure vorteilhaft.

Vorteilhaft werden im erfindungsgemäßen Verfahren die vorgenannten Nukleinsäurekonstrukte eingesetzt.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens einer Pflanzenzelle oder einer ganzen Pflanze, die die im Verfahren verwendeten Nukleinsäurekonstrukte enthält, wobei die Zelle und/oder die Pflanze mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt, wie beschrieben, allein oder in Kombination mit weiteren Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine des Fettsäure- oder Lipidsstoffwechsels codieren, transformiert wird. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst dieses Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens der öle, Lipide oder freien Fettsäuren aus der Pflanze oder aus der Kultur. Bei der Kultur kann es sich beispielsweise um eine Treibhaus- oder Feldkultur einer Pflanze handeln. Die so hergestellte Zelle oder Pflanze ist vorteilhaft eine Zelle eines öl-produzierenden Organismus, wie einer ölfruchtpflanze wie beispielsweise Raps, Canola, Lein, Soja, Färberdistel oder einer Feldfruchtpflanze wie Mais.

Unter Anzucht ist beispielsweise die Kultivierung im Falle von Pflanzenzellen, -gewebe oder - organe auf oder in einem Nährmedium oder der ganzen Pflanze auf bzw. in einem Substrat beispielsweise in Hydrokultur, Blumentopferde oder auf einem Ackerboden zu verstehen.

Als Organismen bzw. Wirtszellen für das erfindungsgemäße Verfahren sind solche geeignet, die in der Lage sind Fettsäuren, speziell ungesättigte Fettsäuren zu synthetisieren bzw. für die Expression rekombinanter Gene geeignet sind. Bevorzugt sind die Pflanzen Raps, Canola, Lein, Soja, Färberdistel oder Mais.

Transgene Pflanzen, die die im erfindungsgemäßen Verfahren synthetisierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren enthalten, können vorteilhaft direkt vermarktet werden, ohne dass die synthetisierten öle, Lipide oder Fettsäuren isoliert werden müssen. Unter Pflanzen im erfindungsgemäßen Verfahren sind ganze Pflanzen sowie alle Pflanzenteile, Pflanzenorgane oder Pflanzenteile wie Blatt, Stiel, Samen, Wurzel, Knollen, Antheren, Fasern, Wurzelhaare, Stängel, Embryos, KaIIi, Kotelydonen, Petiolen, Erntematerial, pflanzliches Gewebe, reproduktives Gewebe, Zellkulturen, die sich von der transgenen Pflanze ableiten und/oder dazu verwendet werden können, die transgene Pflanze hervorzubringen. Der Samen umfasst dabei alle Samenteile wie die Samenhüllen, Epidermis- und Samenzellen, Endosperm oder Embyrogewebe. Die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Verbindungen können aber auch aus den Pflanzen oder Pflanzenteilen wie etwa die Samen in Form ihrer öle, Fett, Lipide und/oder freien Fettsäuren isoliert werden. Durch dieses Verfahren hergestellte mehrfach ungesättigte Fettsäuren lassen sich durch Ernten der Pflanzen entweder aus der Kultur, in der sie wachsen, oder vom Feld ernten. Dies kann über Pressen oder Extraktion der Pflanzenteile, bevorzugt der Pflanzensamen, erfolgen. Dabei können die öle, Fette, Lipide und/oder freien Fettsäuren durch sogenanntes kalt schlagen oder kalt pressen ohne Zuführung von Wärme durch Pressen gewonnen werden. Damit sich die Pflanzenteile, speziell die Samen, leichter aufschließen lassen, werden sie vorher zerkleinert, gedämpft oder geröstet. Die so vorbehandelten Samen können anschließend gepresst werden oder mit Lösungsmittel wie warmes Hexan extrahiert werden. Anschließend wird das Lösungsmittel wieder entfernt. Im Falle von Pflanzenzellen werden diese nach Ernte beispielsweise direkt ohne weitere Arbeitsschritte extrahiert oder aber nach Aufschluss über verschiedene dem Fachmann bekannte Methoden extrahiert. Auf diese Weise können mehr als 96 % der im Verfahren hergestellten Verbindungen isoliert werden. Anschließend werden die so erhaltenen Produkte weiter bearbeitet, das heißt raffiniert. Dabei werden zunächst beispielsweise die

Pflanzenschleime und Trübstoffe entfernt. Die sogenannte Entschleimung kann enzymatisch oder beispielsweise chemisch/physikalisch durch Zugabe von Säure wie Phosphorsäure erfolgen. Anschließend werden die freien Fettsäuren durch Behandlung mit einer Base beispielsweise Natronlauge entfernt. Das erhaltene Produkt wird zur Entfernung der im Produkt verbliebenen Lauge mit Wasser gründlich gewaschen und getrocknet. Um die noch im Produkt enthaltenen Farbstoffe zu entfernen werden die Produkte einer Bleichung mit beispielsweise Bleicherde oder Aktivkohle unterzogen. Zum Schluss wird das Produkt noch beispielsweise mit Wasserdampf desodoriert.

Vorzugsweise enthält das durch das erfindungsgemäße Verfahren produzierte

Pflanzensamenöl PUFAs bzw. LCPUFAs, i.e. Ciβ-, C20- oder C22-Fettsäuremoleküle, vorteilhaft C18-, C20- oder C22-Fettsäuremoleküle mit mindestens einer Doppelbindung im Fettsäuremolekül, vorzugsweise zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen. Diese Ciβ-,

C20- oder C22-Fettsäuremoleküle lassen sich aus der Pflanze, speziell Pflanzensamen, in Form eines öls oder Lipids isolieren.

Eine Ausführungsform der Erfindung sind deshalb Pflanzensamenöle, Lipide oder Fettsäuren oder Fraktionen davon, die Arachidonsäure mit einem Gehalt von ungefähr 7 bis ungefähr 26 Gewichtsprozent am Gesamtfettsäuregehalt enthalten, wobei das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Gamma-Linolensäure ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 und das Verhältnis der Gewichtsprozente von Arachidonsäure zu Dihomo-Gamma-Linolensäure ungefähr 1 :1 bis ungefähr 5:1 beträgt. Diese Pflanzensamenöle, Lipide oder Fettsäuren oder Fraktionen davon können durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt werden unter Verwendung von transgenen Pflanzen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte wie in den SEQ ID NOs. 15, 16 oder 17 gezeigt in ihrem Genom integriert haben. Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl umfasst hierbei bevorzugt ein Fettsaürespektrum mit den Fettsäuren Palmitinsäure, Stearinsäure, ölsäure, Linolsäure, Gamma-Linolensäure, Alpha- Linolensäure, Stearidonsäure, Dihomo-Gamma-Linolensäure, Arachidonsäure und Eicosapentaensäure, wie auch in dem Fettsäurespektrum in Figur 3B gezeigt.

Die in dem Pflanzensamenöl enthaltenen Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische, enthalten vorteilhaft ungefähr 3,2-5,3% Palmitinsäure, ungefähr 2,2-5,3% Stearinsäure, ungefähr 10-25% ölsäure, ungefähr 22-36% Linolsäure, ungefähr 4-12% Gamma-Linolensäure, ungefähr 3-8% Alpha-Linolensäure, ungefähr 0,2-1 % Stearidonsäure, ungefähr 3-9% Dihomo-Gamma- Linolensäure, ungefähr 12-25% Arachidonsäure und ungefähr 1-4% Eicosapentaensäure, bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt. Weiterhin können die genannten Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische, vorteilhaft Fettsäuren ausgewählt aus der Gruppe der Fettsäuren Erucasäure (13-Docosaensäure), Sterculinsäure (9,10-Methylene octadec-9-enonsäure), Malvalinsäure (8,9-Methylen Heptadec-8-enonsäure), Chaulmoogrinsäure (Cyclopenten- dodecansäure), Furan-Fettsäure (9,12-Epoxy-octadeca-9,1 1-dienonsäure), Vernonsäure (9,10- Epoxyoctadec-12-enonsäure), Tarinsäure (6-Octadecynonsäure),6-Nonadecynonsäure, Santalbinsäure (t11-Octadecen-9-ynoic acid), 6,9-Octadecenynonsäure, Pyrulinsäure (t10- Heptadecen-8-ynonsäure), Crepenyninsäure (9-Octadecen-12-ynonsäure), 13,14- Dihydrooropheinsäure, Octadecen-13-ene-9,11-diynonsäure, Petroselensäure (cis-6- Octadecenonsäure), 9c,12t-Octadecadiensäure, Calendulasäure (8t10t12c- Octadecatriensäure), Catalpinsäure (9t1 1t13c-Octadecatriensäure), Eleosterinsäure (9c1 1t13t- Octadecatriensäure), Jacarinsäure (8c10t12c-Octadecatriensäure), Punicinsäure (9c11t13c- Octadecatriensäure),Parinarinsäure (9c1 1t13t15c-Octadecatetraensäure), Pinolensäure (all-cis- 5,9,12-Octadecatriensäure), Laballensäure (5,6-Octadecadienallensäure), Ricinolsäure (12- Hydroxyölsäure) und/oder Coriolinsäure (13-Hydroxy-9c,1 1t-Octadecadienonsäure), enthalten. Die vorgenannten Fettsäuren kommen in den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Fettsäureester- bzw. Fettsäuregemischen in der Regel vorteilhaft nur in Spuren vor, das heißt, sie kommen bezogen auf die Gesamtfettsäuren zu weniger als 30 %, bevorzugt zu weniger als 25 %, 24 %, 23 %, 22 % oder 21 %, besonders bevorzugt zu weniger als 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7%, 6 % oder 5%, ganz besonders bevorzugt zu weniger als 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5% oder 0,1 % vor. Vorteilhaft enthalten die o.a. Fettsäureester bzw.

Fettsäuregemische weniger als 0,1 % bezogen auf die Gesamtfettsäuren an einer der folgenden Fettsäuren, oder besser keine Clupanodonsäure (= Docosapentaensäure, C22:5 δ4 ' 8 ' 12 ' 15 ' 21 ) und keine Nisinsäure (Tetracosahexaensäure, C23:6 δ3,8,12,15,18,21 ).

Bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen Pflanzensamenöle ungefähr 7 bis ungefähr 26 Gewichtsprozent ARA und mindestens 1 %, 1 ,5%, 2%, 3%, 4% oder 5%, vorteilhaft mindestens 6%, oder 7%, besonders vorteilhaft mindestens 8%, 9% oder 10% EPA bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt des Produktionsorganismus, vorteilhaft einer transgenen Pflanze, besonders vorteilhaft einer ölfruchtpflanze wie Soja, Raps, Färbersafflor, Lein oder der Feldfrucht Mais. Zusätzlich kann das o.a. Pflanzensamenöl DHA in den für EPA angegebenen Mengen enthalten.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Verwendung des Pflanzensamenöls der Erfindung oder von daraus extrahierten LC-PUFAs in Futtermitteln, Nahrungsmitteln, bevorzugt Babynahrung, Kosmetika oder Pharmazeutika. Die erfindungsgemäßen

Pflanzensamenöle oder daraus extrahierten LC-PUFAs können in der dem Fachmann bekannten Weise zur Abmischung mit anderen ölen, Lipiden, Fettsäuren oder Fettsäuregemischen, beispielsweise pflanzlichen (wie oben beschrieben) oder mikrobiellen (z.B. aus Mortierella alpina oder Crythecodinium cohnii) oder tierischen Ursprungs (wie Fischölen) verwendet werden. Auch diese Gemische von ölen, Lipiden, Fettsäuren oder

Fettsäuregemische, die aus (i) pflanzlichen und mikrobiellen oder (ii) pflanzlichen und tierischen oder (iii) aus pflanzlichen und mikrobiellen und tierischen Bestandteilen bestehen, können zur Herstellung von Futtermitteln, Nahrungsmitteln bevorzugt Babynahrung, Kosmetika oder Pharmazeutika verwendet werden.

Unter dem Begriff "öl", "Lipid" oder "Fett" wird ein Fettsäuregemisch verstanden, das ungesättigte, gesättigte, vorzugsweise veresterte Fettsäure(n) enthält. Bevorzugt ist, dass das öl, Lipid oder Fett einen hohen Anteil an einfach und mehrfach ungesättigten vorteilhaft veresterten Fettsäure(n) hat. Vorzugsweise ist der Anteil an ungesättigten veresterten Fettsäuren ungefähr 30 %, mehr bevorzugt ist ein Anteil von 50 %, noch mehr bevorzugt ist ein Anteil von 60 %, 70 %, 80 %, 90%, 95%, 99% oder 99,5%. Zur Bestimmung kann z.B. der Anteil an Fettsäure nach überführung der Fettsäuren in die Methylestern durch Umesterung gaschromatographisch bestimmt werden. Das öl, Lipid oder Fett kann verschiedene andere gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren, z.B. Calendulasäure, Palmitin-, Palmitolein-, Stearin-, ölsäure etc., enthalten. Insbesondere kann je nach Ausgangspflanze der Anteil der verschiedenen Fettsäuren in dem öl oder Fett schwanken.

Bei den im Verfahren hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit vorteilhaft mindestens zwei Doppelbindungen, handelt es sich wie oben beschrieben beispielsweise um Sphingolipide, Phosphoglyceride, Lipide, Glycolipide, Phospholipide, Monoacylglycerin, Diacylglycerin, Triacylglycerin oder sonstige Fettsäureester.

Aus dem so im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Pflanzensamenöl mit mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit vorteilhaft mindestens einer, zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen lassen sich die enthaltenden mehrfach ungesättigten Fettsäuren beispielsweise über eine Alkalibehandlung beispielsweise wässrige KOH oder NaOH oder saure Hydrolyse vorteilhaft in Gegenwart eines Alkohols wie Methanol oder Ethanol oder über eine enzymatische Abspaltung freisetzen und isolieren über beispielsweise Phasentrennung und anschließender Ansäuerung über z.B. H2SO4. Die Freisetzung der Fettsäuren kann auch direkt ohne die vorhergehend beschriebene Aufarbeitung erfolgen.

Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäurekonstrukte können nach Einbringung in eine

Pflanzenzelle bzw. Pflanze entweder auf einem separaten Plasmid liegen oder vorteilhaft in das Genom der Wirtszelle integriert sein. Bei Integration in das Genom kann die Integration zufallsgemäß sein oder durch derartige Rekombination erfolgen, dass das native Gen durch die eingebrachte Kopie ersetzt wird, wodurch die Produktion der gewünschten Verbindung durch die Zelle moduliert wird, oder durch Verwendung eines Gens in „trans", so dass das Gen mit einer funktionellen Expressionseinheit, welche mindestens eine die Expression eines Gens gewährleistende Sequenz und mindestens eine die Polyadenylierung eines funktionell transkribierten Gens gewährleistende Sequenz enthält, funktionell verbunden ist. Vorteilhaft werden die Nukleinsäuren über Multiexpressionskassetten oder Konstrukte zur multiparallelen Expression in die Pflanze vorteilhaft zur multiparallelen samenspezifischen Expression von Genen in die Pflanzen gebracht.

Moose und Algen sind die einzigen bekannten Pflanzensysteme, die erhebliche Mengen an mehrfach ungesättigten Fettsäuren, wie Arachidonsäure (ARA) und/oder Eicosapentaensäure (EPA) und/oder Docosahexaensäure (DHA) herstellen. Moose enthalten PUFAs in Membranlipiden während Algen, algenverwandte Organismen und einige Pilze auch nennenswerte Mengen an PUFAs in der Triacylglycerolfraktion akkumulieren. Daher eignen sich Nukleinsäuremoleküle, die aus solchen Stämmen isoliert werden, die PUFAs auch in der Triacylglycerolfraktion akkumulieren, besonders vorteilhaft für das erfindungsgemäße Verfahren und damit zur Modifikation des Lipid- und PUFA-Produktionssystems in einem Wirt, insbesondere Pflanzen, wie ölfruchtpflanzen, beispielsweise Raps, Canola, Lein, Soja, Färberdistel. Sie sind deshalb vorteilhaft im erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar. Zur Herstellung des Pflanzensamenöls mit den langkettigen PUFAs im erfindungsgemäßen Verfahren unter bervorzugter Verwendung der Nukleinsäurekonstrukte mit den SEQ ID NOs. 15, 16 oder 17 müssen die mehrfach ungesättigten Cis-Fettsäuren zunächst durch die enzymatische Aktivität einer Desaturase desaturiert und anschließend über eine Elongase um mindestens zwei Kohlenstoffatome verlängert werden. Nach einer Elongationsrunde führt diese Enzymaktivität zu C2o-Fettsäuren, und nach zwei Elongationsrunden zu C22-Fettsäuren. Die Aktivität der erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Desaturasen und Elongasen führt vorzugsweise zu Ciβ-, C20- und/oder C22-Fettsäuren vorteilhaft mit mindestens einer Doppelbindung im Fettsäuremolekül, vorzugsweise mit zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen, besonders bevorzugt zu Ciβ-, C20- und/oder C22-Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise mit drei, vier, fünf oder sechs

Doppelbindungen, ganz besonders bevorzugt mit fünf oder sechs Doppelbindungen im Molekül. Nachdem eine erste Desaturierung und die Verlängerung stattfanden, können weitere Desaturierungs- und Elongierungsschritte wie z.B. eine solche Desaturierung in δ-5- und δ-4- Position erfolgen. Besonders bevorzugt als Produkte des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Palmitinsäure, Stearinsäure, ölsäure, Linolsäure, Gamma-Linolensäure, Alpha-Linolensäure, Stearidonsäure, Dihomo-Gamma-Linolensäure, Arachidonsäure und Eicosapentaensäure.

Der bevorzugte Biosyntheseort von Fettsäuren, ölen, Lipiden oder Fette in den vorteilhaft verwendeten transgenen Pflanzen ist beispielsweise im allgemeinen der Samen oder Zellschichten des Samens, so dass eine samenspezifische Expression der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren sinnvoll ist. Die Biosynthese von Fettsäuren, ölen oder Lipiden muss nicht auf das Samengewebe beschränkt sein, sondern kann auch in allen übrigen Teilen der Pflanze - beispielsweise in Epidermiszellen oder in den Knollen - gewebespezifisch erfolgen.

Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte, die u.a. für eine Elongase codieren, können im Verfahren die hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mindestens um 5 %, bevorzugt mindestens um 10 %, besonders bevorzugt mindestens um 20 %, ganz besonders bevorzugt um mindestens 50 % gegenüber dem Wildtyp der Pflanzen, die die Nukleinsäuren nicht rekombinant enthalten, erhöht werden.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren können die mehrfach ungesättigten Fettsäuren in den im Verfahren hergestellten Pflanzensamenöl prinzipiell auf zwei Arten erhöht werden. Es kann vorteilhaft der Pool an freien mehrfach ungesättigten Fettsäuren und/oder der Anteil der über das Verfahren hergestellten veresterten mehrfach ungesättigten Fettsäuren erhöht werden. Vorteilhaft wird durch das erfindungsgemäße Verfahren der Pool an veresterten mehrfach ungesättigten Fettsäuren in den transgenen Pflanzen erhöht.

Die Nukleinsäurekonstrukte der vorliegenden Erfindung, die am Stoffwechsel von Lipiden und Fettsäuren, PUFA-Cofaktoren und Enzymen oder am Transport lipophiler Verbindungen über Membranen beteiligt sind, werden im erfindungsgemäßen Verfahren zur Modulation der Produktion von PUFAs in transgenen Pflanzen, wie Mais, Soja, Linum Arten wie Lein, öl- oder Faserlein, Brassica-Arten, wie Raps, Canola und Rübsen, Färberdistelen entweder direkt (z.B. wenn die überexpression oder Optimierung eines Fettsäurebiosynthese-Proteins einen direkten Einfluss auf die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion der Fettsäure aus modifizierten Pflanzen hat) verwendet und/oder können eine indirekt Auswirkung haben, die dennoch zu einer Steigerung der Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion der PUFAs oder einer Abnahme unerwünschter Verbindungen führt (z.B. wenn die Modulation des Stoffwechsels von Lipiden und Fettsäuren, Cofaktoren und Enzymen zu Veränderungen der Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion oder der Zusammensetzung der gewünschten Verbindungen innerhalb der Zellen führt, was wiederum die Produktion einer oder mehrerer Fettsäuren beeinflussen kann).

Die Kombination verschiedener Vorläufermoleküle und Biosyntheseenzyme führt zur Herstellung verschiedener Fettsäuremoleküle, was eine entscheidende Auswirkung auf die Zusammensetzung der Lipide hat. Da mehrfach ungesättigte Fettsäuren (= PUFAs) nicht nur einfach in Triacylglycerin sondern auch in Membranlipide eingebaut werden.

Die Lipidsynthese lässt sich in zwei Abschnitte unterteilen: die Synthese von Fettsäuren und ihre Bindung an sn-Glycerin-3-Phosphat sowie die Addition oder Modifikation einer polaren Kopfgruppe. übliche Lipide, die in Membranen verwendet werden, umfassen Phospholipide, Glycolipide, Sphingolipide und Phosphoglyceride. Die Fettsäuresynthese beginnt mit der Umwandlung von Acetyl-CoA in Malonyl-CoA durch die Acetyl-CoA-Carboxylase oder in Acetyl- ACP durch die Acetyltransacylase. Nach einer Kondensationsreaktion bilden diese beiden Produktmoleküle zusammen Acetoacetyl-ACP, das über eine Reihe von Kondensations-, Reduktions- und Dehydratisierungsreaktionen umgewandelt wird, so dass ein gesättigtes Fettsäuremolekül mit der gewünschten Kettenlänge erhalten wird. Die Produktion der ungesättigten Fettsäuren aus diesen Molekülen wird durch spezifische Desaturasen katalysiert, und zwar entweder aerob mittels molekularem Sauerstoff oder anaerob (bezüglich der Fettsäuresynthese in Mikroorganismen siehe F. C. Neidhardt et al. (1996) E. coli und Salmonella. ASM Press: Washington, D. C, S. 612-636 und darin enthaltene Literaturstellen; Lengeier et al. (Hrsgb.) (1999) Biology of Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York, und die enthaltene Literaturstellen, sowie Magnuson, K., et al. (1993) Microbiological Reviews 57:522-542 und die enthaltenen Literaturstellen). Die so hergestellten an Phospholipide gebundenen Fettsäuren müssen anschließend wieder für die weiteren Elongationen aus den Phospholipiden in den FettsäureCoA-Ester-Pool überführt werden. Dies ermöglichen Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyl- transferasen. Weiterhin können diese Enzyme die elongierten Fettsäuren wieder von den CoA- Estern auf die Phospholipide übertragen. Diese Reaktionsabfolge kann gegebenenfalls mehrfach durchlaufen werden.

Vorläufer für die PUFA-Biosynthese sind beispielsweise ölsäure, Linol- und Linolensäure. Diese Cis-Kohlenstoff-Fettsäuren müssen auf C20 und C22 verlängert werden, damit Fettsäuren vom Eicosa- und Docosa-Kettentyp erhalten werden. Mithilfe der im Verfahren verwendeten Nukleinsäurekonstrukte die Desaturasen (wie die δ-12- und δ-15, omega-3-, δ-12, δ-4-, δ-5- und δ-6-Desaturasen) und/oder Elongasen (δ-5- und δ-6-Elongasen) können beispielsweise Arachidonsäure, Eicosapentaensäure, Docosapentaensäure oder Docosahexaensäure hergestellt werden und anschließend für verschiedene Zwecke bei Nahrungsmittel-, Futter-, Kosmetik- oder pharmazeutischen Anwendungen verwendet werden. Mit den genannten

Enzymen können C20- und/oder C22-Fettsäuren mit mindestens einer, vorteilhaft mindestens zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise C20- oder C22-Fettsäuren mit vorteilhaft vier, fünf oder sechs Doppelbindungen im Fettsäuremolekül hergestellt werden. Die Desaturierung kann vor oder nach Elongation der entsprechenden Fettsäure erfolgen. Daher führen die Produkte der Desaturaseaktivitäten und der möglichen weiteren Desaturierung und Elongation zu bevorzugten PUFAs mit höherem Desaturierungsgrad, einschließlich einer weiteren Elongation von C20 zu C22- Fettsäuren, zu Fettsäuren wie Gamma-Linolensäure, Dihomo-Gamma-Iinolensäure,

Arachidonsäure, Stearidonsäure, Eicosatetraensäure oder Eicosapentaensäure. Substrate der verwendeten Desaturasen und Elongasen im erfindungsgemäßen Verfahren sind C16-, Ciβ- oder C2o-Fettsäuren wie zum Beispiel Linolsäure, Gamma-Linolensäure, Alpha-Linolensäure, Dihomo-Gamma-linolensäure, Eicosatetraensäure oder Stearidonsäure. Bevorzugte Substrate sind Linolsäure, Gamma-Linolensäure und/oder Alpha-Linolensäure, Dihomo-Gamma- linolensäure bzw. Arachidonsäure, Eicosatetraensäure oder Eicosapentaensäure. Die synthetisierten C20- oder C22-Fettsäuren mit mindestens einer, zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen in der Fettsäure fallen im erfindungsgemäßen Verfahren in Form der freien Fettsäure oder in Form ihrer Ester beispielsweise in Form ihrer Glyceride an.

Unter dem Begriff "Glycerid" wird ein mit ein, zwei oder drei Carbonsäureresten verestertes Glycerin verstanden (Mono-, Di- oder Triglycerid). Unter "Glycerid" wird auch ein Gemisch an verschiedenen Glyceriden verstanden. Das Glycerid oder das Glyceridgemisch kann weitere Zusätze, z.B. freie Fettsäuren, Antioxidantien, Proteine, Kohlenhydrate, Vitamine und/oder andere Substanzen enthalten. Unter einem "Glycerid" im Sinne des erfindungsgemäßen

Verfahrens werden ferner vom Glycerin abgeleitete Derivate verstanden. Dazu zählen neben den oben beschriebenen Fettsäureglyceriden auch Glycerophospholipide und Glyceroglycolipide. Bevorzugt seien hier die Glycerophospholipide wie Lecithin (Phosphatidylcholin), Cardiolipin, Phosphatidylglycerin, Phosphatidylserin und Alkylacylglycerophospholipide beispielhaft genannt.

Ferner müssen Fettsäuren anschließend an verschiedene Modifikationsorte transportiert und in das Triacylglycerin-Speicherlipid eingebaut werden. Ein weiterer wichtiger Schritt bei der Lipidsynthese ist der Transfer von Fettsäuren auf die polaren Kopfgruppen, beispielsweise durch Glycerin-Fettsäure-Acyltransferase (siehe Frentzen, 1998, Lipid, 100(4-5):161-166).

Veröffentlichungen über die Pflanzen-Fettsäurebiosynthese, Desaturierung, den Lipidstoffwechsel und Membrantransport von fetthaltigen Verbindungen, die Betaoxidation, Fettsäuremodifikation und Cofaktoren, Triacylglycerin-Speicherung und -Assemblierung einschließlich der Literaturstellen darin siehe in den folgenden Artikeln: Kinney, 1997, Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 19:149-166; Ohlrogge und Browse, 1995, Plant Cell 7:957- 970; Shanklin und Cahoon, 1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:611 -641 ; Voelker, 1996, Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 18:1 11-13; Gerhardt, 1992, Prog. Lipid R. 31 :397-417; Gühnemann-Schäfer & Kindl, 1995, Biochim. Biophys Acta 1256:181-186; Kunau et al., 1995, Prog. Lipid Res. 34:267-342; Stymne et al., 1993, in: Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, Hrsgb.: Murata und Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiologists, 150-158, Murphy & Ross 1998, Plant Journal. 13(1 ):1-16.

Das im Verfahren hergestellte Pflanzensamenöl umfasst PUFAs, eine Gruppe von Molekülen, die höhere Tiere nicht mehr synthetisieren können und somit aufnehmen müssen oder die höhere Tiere nicht mehr ausreichend selbst herstellen können und somit zusätzlich aufnehmen

müssen, obwohl sie leicht von anderen Organismen, wie Bakterien, synthetisiert werden. Beispielsweise können Katzen Arachidonsäure nicht mehr synthetisieren.

Unter „Phospholipiden" im Sinne der Erfindung sind zu verstehen Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin und/oder

Phosphatidylinositol vorteilhafterweise Phosphatidylcholin. Die Begriffe „Produktion oder Produktivität" sind im Fachgebiet bekannt und beinhalten die Konzentration des Produktes (Verbindungen der Formel I), das in einer bestimmten Zeitspanne und einem bestimmten Volumen gebildet wird (z.B. kg Produkt pro Stunde pro Liter). Es umfasst auch die Produktivität innerhalb einer Pflanzenzelle oder einer Pflanze, das heißt den Gehalt an den gewünschten im Verfahren hergestellten Fettsäuren bezogen auf den Gehalt an allen Fettsäuren in dieser Zelle oder Pflanze. Der Begriff „Effizienz der Produktion" umfasst die Zeit, die zur Erzielung einer bestimmten Produktionsmenge nötig ist (z.B. wie lange die Zelle zur Aufrichtung einer bestimmten Durchsatzrate einer Feinchemikalie benötigt). Der Begriff „Ausbeute oder Produkt/Kohlenstoff-Ausbeute" ist im Fachgebiet bekannt und umfasst die Effizienz der Umwandlung der Kohlenstoffquelle in das Produkt (d.h. die Feinchemikalie). Dies wird gewöhnlich beispielsweise ausgedrückt als kg Produkt pro kg Kohlenstoffquelle. Durch Erhöhen der Ausbeute oder Produktion der Verbindung wird die Menge der gewonnenen Moleküle oder der geeigneten gewonnenen Moleküle dieser Verbindung in einer bestimmten Kulturmenge über einen festgelegten Zeitraum erhöht. Die Begriffe „Biosynthese oder Biosyntheseweg" sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Synthese einer Verbindung, vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine Zelle aus Zwischenverbindungen, beispielsweise in einem Mehrschritt- und stark regulierten Prozess. Die Begriffe „Abbau oder Abbauweg" sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Spaltung einer Verbindung, vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine Zelle in Abbauprodukte (allgemeiner gesagt, kleinere oder weniger komplexe Moleküle), beispielsweise in einem Mehrschritt- und stark regulierten Prozess. Der Begriff „Stoffwechsel" ist im Fachgebiet bekannt und umfasst die Gesamtheit der biochemischen Reaktionen, die in einem Organismus stattfinden. Der Stoffwechsel einer bestimmten Verbindung (z.B. der Stoffwechsel einer Fettsäure) umfasst dann die Gesamtheit der Biosynthese-, Modifikations- und Abbauwege dieser Verbindung in der Zelle, die diese Verbindung betreffen.

Durch den Einsatz der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte und optional weiterer Polynukleotide, die für Enzyme des Lipid oder Fettsäurestoffwechsels kodieren, in dem erfindungsgemäßen Verfahren können verschiedene vorteilhafte Effekte erzielt werden. So kann die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion der mehrfach ungesättigten Fettsäuren in einer Pflanze, bevorzugt in einer ölfruchtpflanze, beeinflusst werden. Die Anzahl oder Aktivität der Polypeptide bzw. Polynukleotide kann erhöht werden, so dass größere Mengen der Genprodukte und damit letztlich größere Mengen der Verbindungen der allgemeinen Formel I hergestellt werden. Auch eine de novo Synthese in einem Organismus, dem die Aktivität und Fähigkeit zur Biosynthese der Verbindungen vor dem Einbringen des/der entsprechenden Gens/Gene fehlte, ist möglich. Entsprechendes gilt für die Kombination mit weiteren Desaturasen oder Elongasen oder weiteren Enzymen aus dem Fettsäure- und

Lipidstoffwechsel. Auch die Verwendung verschiedener divergenter, d.h. auf DNA- Sequenzebene unterschiedlicher Sequenzen kann dabei vorteilhaft sein bzw. die Verwendung von Promotoren zur Genexpression, die eine andere zeitliche Genexpression z.B. abhängig vom Reifegrad eines Samens oder öl-speichernden Gewebes ermöglicht.

Durch das Einbringen eines erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruktes in eine Pflanze, allein oder in Kombination mit anderen Genen, kann nicht nur der Biosynthesefluss zum Endprodukt erhöht, sondern auch die entsprechende Triacylglycerin- Zusammensetzung erhöht oder de novo geschaffen werden. Ebenso kann die Anzahl oder Aktivität anderer Gene, die am Import von Nährstoffen, die zur Biosynthese einer oder mehrerer Fettsäuren, ölen, polaren und/oder neutralen Lipiden nötig sind, erhöht sein, so dass die Konzentration dieser Vorläufer, Cofaktoren oder Zwischenverbindungen innerhalb der Zellen oder innerhalb des Speicherkompartiments erhöht ist, wodurch die Fähigkeit der Zellen zur Produktion von PUFAs weiter gesteigert wird. Durch Optimierung der Aktivität oder Erhöhung der Anzahl einer oder mehrerer Polynukleotide bzw. Polypeptide, die an der Biosynthese dieser Verbindungen beteiligt sind, oder durch Zerstören der Aktivität einer oder mehrerer Gene, die am Abbau dieser Verbindungen beteiligt sind, kann es möglich sein, die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von Fettsäure- und Lipidmolekülen aus Pflanzen zu steigern. Das im Verfahren gewonnene Pflanzensamenöl eignet sich als Ausgangsmaterial für die chemische Synthese von weiteren Wertprodukten. Sie können beispielsweise in Kombination miteinander oder allein zur Herstellung von Pharmaka, Nahrungsmittel, insbesondere Säuglings- oder Babynahrung, Tierfutter oder Kosmetika verwendet werden.

Bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Verfahren einen weiteren Schritt d) des Formulierens des Pflanzensamenöls als öI-. Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung.

Noch mehr bevorzugt wird die öI-. Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung in dem erfindungsgemäßen Verfahren weiter formuliert zu einem Nahrungsmittel, bevorzugt zu Babynahrung.

In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahren wird die öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung weiter formuliert zu einem Arzneimittel, zu Kosmetik, zu einem Nahrungsmittel, zu einem Nahrungsergänzungsmittel, zu einem Futtermittel, vorzugsweise Fischfutter oder Futter für Legehennen, oder zu einem Nahrungsergänzungsmittel.

Schließlich betrifft die Erfindung grundsätzlich die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruktes, einer transgenen Pflanzenzelle oder einer transgenen Pflanze, die diese Nukleinsäurekonstrukte enthält, für die Herstellung einer öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung. Diese ist dann bevorzugt als Arzneimittel, Kosmetik, Nahrungsmittel, besonders Babynahrung, Futtermittel, vorzugsweise Fischfutter oder Futter für Legehennen, oder Nahrungsergänzungsmittel einzusetzen.

Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl neben den oben beschriebenen

Anwendungen für die Ernährung von Tieren, insbesondere als Nahrungsergänzungsprodukt für Futteranwendungen zur Verbesserung des Zuchtergebnisses verwendet werden. Ein Futterzusatz zur Verbesserung von Bestandszuchtergebnissen, zum Beispiel von Forellenfischen, Rindern, Schafen, Schweinen, Hühnern, und für die Gesundheit von Haustieren, zum Beispiel von Katzen und Hunden, enthält Arachidonsäure (ARA) in

Konzentrationen, die geeignet sind, um die Reproduktionsraten zu verbessern, wenn die Nahrung des Jungtieres oder des Muttertieres mit ARA ergänzt wird. Das Futtermittelprodukt enthält hierbei neben ARA auch Gamma-Linolensäure (GLA), Dihomo-Gamma-Linolensäure (DGLA), Stearidonsäure (SDA) und Eicosapentaensäure (EPA), um einen hochwertigen Futtermittelzusatz zu erhalten. Die Ergänzung von Ernährungs- und Futtermittelprodukten führt zu höheren Reproduktionsraten, besseren überlebenschancen für die Jungtiere, sowie zu einer verbesserten neurologischen und visuellen Entwicklung.

Weiterhin kann das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl auch für technische Zwecke eingesetzt werden, etwa in Form eines technischen öls. Ein solches öl enthält eine einzigartig hohe Konzentration an ungesättigten Fettsäuren mit Doppelbindungen als Polymerisationskomponente. Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl kann allein oder in Kombination mit einem Polymerisationsmittel für die folgenden technische Anwendungen eingesetzt werden: 1. Lacke und überzüge (Verwendung als oxidatives Trockenöl)

2. Polymere für Bodenbeläge oder Kunststoffe (Verwendung als oxidatives Trockenöl)

3. Andere chemische Anwendungen

4. Kosmetische Anwendungen

5. Anwendungen im Bereich Elektronik und Halbleitertechnik

Der Vorteil des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl liegt in seinen einzigartigen Polymerisationseigenschaften. Das öl polymerisiert schneller und gleichmäßiger und bildet eine festere dreidimensionale Struktur, die dort sinnvoll ist, wo Festigkeit, Strapazierfähigkeit und Elastizität des Netzwerks erforderlich sind (überzüge und Fußbodenbeläge oder Kunststoffe). Durch seine gleichmässige Verteilung der

Doppelbindungen auf die meisten Fettläuren im öl erhält das Produkt zudem eine hohe Elastizität.

Der Inhalt sämtlicher in dieser Patentanmeldung zitierten Literaturstellen, Patentanmeldungen, Patente und veröffentlichten Patentanmeldungen ist hiermit durch Bezugnahme auf den jeweiligen speziellen Offenbarungsgehalt aufgenommen.

Figuren

Figur 1 : Stoffwechselwege zur Synthese von LC-PUFA.

Figur 2A-C: Plasmidkarten der konstruierten T-Plasmide für die Transformation in Brassica napus. Die zugehörigen Sequenzen sind in den SEQ ID NOs. 15 (Figur 2A), 16 (Figur 2B) und 17 (Figur 2C) gezeigt.

Figur 3A: Chromatogramm der gaschromatographischen Fettsäureanalyse von nicht- transgenem Raps (Brassica napus). Die Peaks sind mit den zugeordneten Fettsäuren annotiert, die Nomenklatur ist in Tabelle 5 erläutert.

Figur 3B: Chromatogramm der gaschromatographischen Fettsäureanalyse von transgenem Raps (Brassica napus), transformiert mit dem Konstrukt VC-LJB913-1qcz (SEQ ID NO. 15). Die Peaks sind mit den zugeordneten Fettsäuren annotiert, die Nomenklatur ist in Tabelle 5 erläutert.

Figur 4: Pilotanlagenskizze zur superkritischen CO2 Extraktion für öle.

Figur 5: Herstellung von Säuglingsnahrung in flüssiger Form.

Figur 6: Herstellung von Säuglingsnahrung durch Komplettsprühung (Gesamtprodukt).

Figur 7: Fettsäure-Verhältnisse in der Muttermilch: Die Werte wurden für die einzelnen Länder gemittelt und das jeweilige Maximum oder Miminum der Verhhältnise im Ländermittel dargestellt ( Yuhas et al. 2006 Lipids 41 :851-8).

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als beschränkend aufgefasst werden sollten.

Beispiel 1 : Allgemeine Klonierungsverfahren

Die Klonierungsverfahren wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarose-Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylon Membranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von Escherichia coli Zellen, Anzucht von Bakterien und die Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) (CoId Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben durchgeführt.

Beispiel 2: Lipidextraktion und -analyse von Pflanzensamenölen

Die Auswirkung der genetischen Modifikation in Pflanzen oder auf die Produktion einer gewünschten Verbindung (wie einer Fettsäure) kann bestimmt werden, indem die modifizierte Pflanze unter geeigneten Bedingungen (wie den vorstehend beschriebenen) gezüchtet werden

und das Medium und/oder die zellulären Komponenten auf die erhöhte Produktion des gewünschten Produktes (d.h. von Lipiden oder einer Fettsäure) untersucht wird. Diese Analysetechniken sind dem Fachmann bekannt und umfassen Spektroskopie, Dünnschichtchromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art, enzymatische und mikrobiologische Verfahren sowie analytische Chromatographie, wie Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie (siehe beispielsweise Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89-90 und S. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A., et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: "Product recovery and purification", S. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A., et al. (1988)

Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J. F., und Cabral, J. M. S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A., und Henry, J. D. (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Kapitel 1 1 , S. 1-27, VCH: Weinheim; und Dechow, FJ. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).

Neben den oben erwähnten Verfahren werden Pflanzenlipide aus Pflanzenmaterial wie von Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96 (22): 12935-12940, und Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152:141-145, beschrieben extrahiert. Die qualitative und quantitative Lipid- oder Fettsäureanalyse ist beschrieben bei Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: OiIy Press (OiIy Press Lipid Library; 2); Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide - Ayr, Scotland: OiIy Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (OiIy Press Lipid Library; 1 ); "Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952) - 16 (1977) u.d.T.: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN.

Ein Beispiel ist die Analyse von Fettsäuren (Abkürzungen: FAME, Fettsäuremethylester; GC- MS, Gas-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie; TAG, Triacylglycerin; TLC, Dünnschichtchromatographie). Das zu analysierende Material wurde durch Mahlen mit einer Stahlkugel (Retsch Mühle, 1 min) aufgebrochen. Das Material wurde nach dem Aufbrechen zentrifugiert und das Sediment in Aqua dest. resuspendiert, 10 min bei 100ºC erhitzt, auf Eis abgekühlt und erneut zentrifugiert, gefolgt von Extraktion in 0,5 M Schwefelsäure in Methanol mit 2 % Dimethoxypropan für 1 Std. bei 90ºC, was zu hydrolysierten öl- und Lipidverbindungen führt, die transmethylierte Lipide ergeben. Diese Fettsäuremethylester wurden in Petrolether extrahiert und schließlich einer GC- Analyse unter Verwendung einer Kapillarsäule (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 mikrom, 0,32 mm) bei einem Temperaturgradienten zwischen 170°C und 240ºC für 20 min und 5 min bei 240°C unterworfen. Die Identität der erhaltenen Fettsäuremethylester wurde unter Verwendung von Standards, die aus kommerziellen Quellen erhältlich sind (z. B. Sigma), definiert.

Beispiel 3: Kombination der am Stoffwechselweg beteiligten Gene und deren Zusammenbau in ein T-Plasmid.

Zur Synthese von LC-PUFA im Samen von Raps wurden die im Stoffwechselweg notwendigen Gene (Tabelle 1 ), kombiniert mit Expressionselementen (Promotoren, Terminatoren, Tabelle 2), in Transformationsvektoren übertragen.

Ausgehend von den Genen und den Expressionselementen wurde das Gateway- Klonierungsverfahren (Invitrogen) entsprechend der Herstellerangaben verwendet, um Mehrfachkassetten in pENTR-Vektoren in das binäre T-Plasmid pSUN zu kombinieren. Eine

übersicht über binäre Vektoren und ihre Verwendung gibt Hellens et al, Trends in Plant Science (2000) 5: 446^451. Durch die Rekombinationsreaktion der pENTR Vektoren wurden die binären T-Plasmide VC-LJB913-1 qcz (SEQ ID 15), VC-LJ B1327-1 qcz (SEQ ID 16) und VC-LJB1328- 1 qcz (SEQ ID 17) erhalten. Die Abfolge der funktionellen Expressionskassetten (Promoter, Gen, Terminator) sind in den Figuren 2A, 2B und 2C für die erhaltenen Vektoren dargestellt.

In ähnlicher Weise können auch funktionelle Expressionskassetten zur Synthese eines Pflanzensamenöls, welches die mehrfach ungesättigte, langkettige Fettsäure Docosa- hexaensäure (DHA) enthält, hergestellt werden. DHA stellt eine weitere wichtige Komponente der Muttermilch dar. Für die Synthese von DHA in Pflanzen können Konstrukte in Raps transformiert werden, wie sie in WO2005/083093 beschrieben wurden. Falls ein Pflanzen- samenöl mit DHA hergestellt werden soll, enthalten die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- konstrukte zusätzllich zu den oben angeführten Genen vorzugsweise Gene, die die Delta 5- Elongase aus Ostreococcus tauri wie in SEQ ID NO. 18 gezeigt und die Delta 4-Desaturase aus Traustochytrium ssp. wie in SEQ ID NO. 20 dargestellt kodieren. Als Promoter eignen sich hierbei SEQ ID Nr. 22, 24, 26, 28, 30 und 33 als Terminatoren können SEQ ID Nr. 23, 25, 27, 29, 31 , 32 und 34 eingesetzt werden.

Beispiel 4: Erzeugung transgener Rapspflanzen (verändert nach Moloney et al., 1992, Plant Cell Reports, 8:238-242)

Zur Erzeugung transgener Rapspflanzen (Brassica napus) wurden binäre Vektoren wie die weiter oben beschrieben pSUN Plasmide mit den entsprechend kombinierten Genen in Agrobacterium tumefaciens C58C1 :pGV2260 transformiert (Deblaere et al, 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4788). Zur Transformation von Rapspflanzen wurde eine 1 :50 Verdünnung einer übernachtkultur einer positiv transformierten Agrobakterienkolonie in Murashige-Skoog Medium (Murashige und Skoog 1962 Physiol. Plant. 15, 473) mit 3 % Saccharose (3MS-Medium) benutzt. Petiolen oder Hypokotyledonen frisch gekeimter steriler Rapspflanzen (zu je ca. 1 cm 2 ) wurden in einer Petrischale mit einer 1 :50 Agrobakterienverdünnung für 5-10 Minuten inkubiert. Es folgte eine 3-tägige Co-Inkubation in Dunkelheit bei 25°C auf 3MS-Medium mit 0,8 % Bacto- Agar. Die Kultivierung wurde nach 3 Tagen mit 16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit weitergeführt und in wöchentlichem Rhythmus auf MS-Medium mit 500 mg/l Claforan (Cefotaxime-Natrium), 50 mg/l Kanamycin, 20 mikroM Benzylaminopurin (BAP) und 1 ,6 g/l Glukose weitergeführt. Wachsende Sprosse wurden auf MS-Medium mit 2 % Saccharose, 250 mg/l Claforan und 0,8 % Bacto-Agar überführt. Bildeten sich nach drei Wochen keine Wurzeln, so wurde als Wachstumshormon 2-lndolbuttersäure zum Bewurzeln zum Medium gegeben.

Regenerierte Sprosse wurden auf 2MS-Medium mit Kanamycin und Claforan erhalten, nach Bewurzelung in Erde überführt und nach Kultivierung für zwei Wochen in einer Klimakammer oder im Gewächshaus angezogen, zur Blüte gebracht, reife Samen geerntet und auf Expression der Desaturase- bzw. Elongase-Gene mittels Lipidanalysen untersucht wie beispielhaft in Qiu et al. 2001 , J. Biol. Chem. 276, 31561-31566 beschrieben.

b) Herstellung von transgenen Leinpflanzen

Die Herstellung von transgenen Leinpflanzen können zum Beispiel nach der Methode von Bell et al., 1999, In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. 35(6):456-465 mittels particle bombartment erzeugt werden. Agrobakterien-vermittelte Transformationen können zum Beispiel nach Mlynarova et al. (1994), Plant Cell Report 13: 282-285 hergestellt werden.

Beispiel 5: Lipidanalyse von transgenen Rapspflanzen, transformiert mit den dargestellten T- Plasmiden.

Die Plasmide, die unter Beispiel 3 hergestellt wurden, wurden wie in Beispiel 4 beschrieben in Raps (Brassica napus) transformiert. Nach Auswahl der transgenen Pflanzen mittels PCR wurden diese zur Samenreife angezogen (Tag-Nachzyklus: 16h, 20OmE, 21ºC, 8h dunkel, 19ºC) und die Samen geerntet.

Geerntete Samen wurden wie unter Beispiel 2 beschrieben extrahiert und einer gaschromatographischen Analyse unterworfen. Tabelle 3 zeigt die Resultate von verschiedenen Linien dieser Konstrukte. Tabelle 5 zeigt die verwendete Nomenklatur für die Fettsäuren. Tabelle 6 zeigt die Verhältnisse von ARA zu den Mittelwerten aller gemessenen Fettsäuren. überraschenderweise konnte dabei gefunden werden, dass im Unterschied zu bisher durchgeführten Versuchen zur Herstellung von Arachidonsäuren in transgenen Pflanzen (z.B. WO2005/083093 oder Kajikawa et al. Biosci. Biotechno. Biochem., 72, 70549-1-10, 2008) oder aus ölen von Microorganismen (z.B. Mortierella alpina) neue Eigenschaften erzielt werden konnten. Insbesondere wurden neue Verhältnisse zwischen der Fettsäuren Gamma- Linolensäure (GLA) und Arachidonsäure (ARA) und Dihomo-Gama-Linolensäuren (DGLA) und Arachidonsäure erhalten. Tabelle 4 gibt eine übersicht über die Verhältnisse im Vergleich zu verschiedenen Organismen, die entweder Arachidonsäure natürlicherweise produzieren oder in die Gene für den entsprechenden Stoffwechselweg übertragen wurden. Neben der physiologisch positiven Wirkung von Arachidonsäure sei an dieser Stelle auch das in den Pflanzen erhaltene günstige Verhältnis zu GLA und DGLA nochmals erwähnt. GLA und DGLA sind neben Arachidonsäure wichtige Komponenten der Fettfraktion von Muttermilch. Die in dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl vorliegenden Verhältnisse liegen sehr nahe an denen in der Muttermilch. Zudem ist die Fettsäurekomposition in dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl sehr ähnlich wie die in der Muttermilch vorliegende; vergleiche Figur 7.

Tabelle 4: Verhältnisse von ARA:GLA, ARA:DGLA und LA:ALA in verschiedenen Organismen.

Tabelle 5: Verwendete Nomenklatur

Beispiel 6: Prozessierung des Pflanzensamenöls

Nach der Ernte, Reinigung und Lufttrocknung der Samen (etwa 7% Restfeuchtigkeit) der in Beispiel 4 hergestellten transgenen Rapspflanzen sowie von Wildtyp Rapspflanzen wurden die gewonnenen Samen zur Gewinnung des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöles und des Wildtypöls prozessiert. Die Prozessierung begann mit der Zerkleinerung und Pressung der Samen, gefolgt von einer Extraktion. Extrahiert wurde einmal mittels Hexan und zum anderen mittels der Superkritischen CO2 Extraktion. Anschließendend wurde eine Raffination des Hexan- extrahierten öls sowie eine Stabilisierung durchgeführt.

Im folgenden werden die Extraktionsprozesse und der Raffinationsprozess detaillierter beschrieben.

Die superkritische Kohlendioxid (CO2) Extraktion basiert auf der Nutzung von Kohlendioxid in subkritischem oder superkritischem Zustand als Extraktionsmittel, wobei das Extraktionsmittel im Kreislauf geführt wird (Barthet und Daun 2002, JAOCS 79:245-51). Für die Extraktion mittels Superkritischer Flüssigkeitsextraktion (SFE) wurde die Saat transgener Rapspflanzen wie in Beispiel 4 beschrieben und die Saat eines Brassica napus Wildtyps verwendet. Die Saaten wurden vor der Extraktion mit SFE zunächst mittels einer Vorpressung (Walzenpresse) unter Stickstoffatmosphäre auf 0,15 mm oder 0,05 mm zerkleinert.

Zum Vergleich wurde eine klassische Soxhlet-Extraktion mittels Hexan durchgeführt. Für diese organische Extraktion wurden weitgehend Standardbedingungen gewählt. 10 g vorgepresste Saat wurde in einen Zellulosefilter platziert. Ein Destillationskolben mit 200 ml_ des organischen Lösungsmittels (Hexan) wurde erhitzt. Verdampftes Lösungsmittel kondensierte im über dem Kolben angebrachten Kondensator. Das Kondensat tropfte in den mit der vorgepressten Saat bestückten Filter und löste die fettlöslichen Bestandteile. Sobald der Flüssigkeitspegel die Grenze des Absaugrohres erreicht hatte, floss das Lösungsmittel mit Unterdruck zurück in den Destillationskolben. Die Soxhlet-Extraktion wurde als vollständig erachtet und gestoppt, sobald die Farbtransparenz des Extraktionslösungsmittels in der Filtereinheit konstant blieb. Das Extrakt wurde daraufhin vom Lösungsmittel durch Verdampfung des Lösungsmittels im Vakuum entfernt und die Masse des Extrakts bestimmt.

Für die SFE wurde CO2 mit einer Reinheit von 99.95 % verwendet (Sigma Aldrich). Die diskontinuierliche SFE wurde zum einen im Labormaßstab mittels "Spe-ed SFE" (25-50 mL, Dimension 15,8 cm x 1.4 cm i.D., Hersteller: Applied Chemistry, Allentown, US) durchgeführt, zum anderen wurde eine Pilotanlage (Hersteller: Nova, Schweiz, Kapazität 4 L, Dimension des Extraktionszylinders 22 cm Höhe x 7,5 cm i.D.) verwendet (siehe Figur 4).

Die Experimente wurden zunächst im Labormaßstab auf der "Spe-ed SFE" Testeinheit

durchgeführt, um Parameter wie Druck, Temperatur, Extraktionszeit, CO2 Durchsatz (Flussrate) und Zerkleinerungsgrad der Saat flexibel variieren zu können. Die besten experimentell ermittelten Parameter wurden nun auf den Pilotmaßstab übertragen.

Der Extraktionszylinder der Pilotanlage, dessen Boden mit Glaswolle ausgelegt wurde, wurde mit vorgepresster Saat bestückt. Vor Verschluss des Zylinders wurde auf die vorgepresste Saat Glaswolle platziert. Die Zylindereinheit wurde daraufhin mit Ein- und Ausflussventilen verbunden und in einen vorgewärmten Ofen (4 L Autoklavierofen) platziert. Das komprimierte CO2 konnte nun durch die mit Glaswolle fixierte vorgepresste Saat gepumpt werden. Hinter dem Ausfluss des Extraktionszylinders wurde der Druck vom mit Extrakt beladenen CO2 mittels eines Expansionsventils entnommen und in einen Separator entlassen. Probenmaterial wurde hier gesammelt. Das Expansionsventil entliess den Druck im Laborsystem auf 1 Bar, in der Pilotanlage auf 50-70 Bar. CO2 konnte im Laborsystem nicht aufgefangen werden. In der Pilotanlage wurde das CO2 über eine Rückführung vom Separator wieder der Hochdruckpumpe zugeführt (Figur 4) und bildete daher ein geschlossenes System.

Das schrittweise Herangehen zeigte folgende optimierte Parameter für die möglichst vollständige und schonende Extraktion eines Brassicasamenöls. Vorpress-Partikelgröße von weniger als 0,2 mm mittels Rollenpresse mit Spaltgröße 0,15 mm, SFE mit bevorzugtem Druck von mindestens 300 bar, besser 350 bar. Die Temperatur konnte zwischen 40 und 6OºC gehalten werden. Eine möglichst niedrige Temperatur von 40ºC ist hierbei vorzuziehen, um oxidative Prozesse im öl zu verringern. Eine optimale Ausbeute war bei einem Extraktionslauf von 60 kg CO2 pro Stunde nach 120 min erreicht. Dabei lag der optimale CO2 Massendurchsatz bei 80- bis 100-mal der Masse des Substrats um 90% Ausbeute der maximal erreichbaren Ausbeute zu erzielen. Kürzere Extraktionszeiten ergaben eine weniger vollständige Extraktion, könnten jedoch Vorteile für die Extraktionskosten bieten.

Die Vorteile der hier weiterentwickelten SFE Technologie für die Extraktion von Brassica Samen können wie folgt zusammengefasst werden. Die Extraktionseffizienz ist bei dem hier im Pilotmaßstab entwickelten Verfahren, gegenüber dem Stand der Technik, deutlich optimiert. Mittels der CO2 SFE wurde überraschenderweise bei den hier gezeigten Bedingungen eine, der konventionellen Soxhlet Extraktion mittels Hexan, vergleichbare Extraktionseffizienz erreicht. Die im Pilotmaßstab durchgeführte CO2 SFE kann somit ohne wesentliche Veränderungen auf den benötigten Industriellen Maßstab von beispielsweise 800 Tonnen öl pro Jahr skaliert werden. Ein solchermaßen extrahiertes erfindungsgemäßes Pflanzensamenöl enthält keinerlei Lösungsmittelrückstände und ist deshalb insbesondere zur Nahrungsmittelherstellung, bevorzugt zur Herstellung von Babynahrung, geeignet.

Für das über die Hexan Extraktion gewonnene Pflanzensamenöl wurde eine anschliessende Raffination durchgeführt. Die Raffination des rohen Pflanzenöles (Mischöl aus Preß- und

Extraktionsöl) und die Abfüllung geschahen komplett unter Vakuum oder unter Stickstoff. Zunächst wurde das Rohöl mit 10% Wasser hydratisiert (85°C, 45 min, 300 rpm). Die anschliessende Entschleimung mit 1 ,5 % Zitronensäure (20 %-ig) fand ebenfalls bei 85 ºC statt (45 min, 300 rpm, 10% Wasser). Es folgte die Neutralisation durch Waschen mit 7%- iger Natronlauge (90 - 95°C, 20 min, 250 rpm, 10% Wasser) und das Trocknen bei 90 ºC (1 1 min, 350 rpm bis 30 mbar). Die Bleichung geschah mit 1 % Bleicherde (Tonsil Optimum 214 FF, 90 ºC, 20 min, 350 rpm, bis 20 mbar). Anschließend wurde mittels eines Acetatfilters unter Druck und Stickstoff filtriert. Die Desodorierung wird bei 220ºC, 20 min, 1 - 2 mbar mit entionisiertem und entgastem Wasser durchgeführt.

Eine Raffination ist bei dem aus der Superkritischen CO2 Extraktion gewonnenen Pflanzensamenöl nicht in jedem Fall notwendig. Für einige der beschriebenen Anwendungen der erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls ist der direkte Einsatz des über SFE Superkritischen CO2 Extraktion gewonnenen öls möglich, d.h. hierzu ist keine anschließende Raffination notwendig. Zu diesen Produkten gehören Milch, Saft, Brei, Sirup, Süssigkeit und fermentiertes Produkt für das Kleinkind. Eine Raffination des über Superkritischen CO2 Extraktion gewonnenen Pflanzensamenöls empfiehlt sich aber aus den o.a. Gründen für den Einsatz in Babynahrung.

Beispiel 7: Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls

Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl enthält die für die Säuglingsernährung wichtigen Fettsäuren in folgenden Gewichtsprozenten (Masse der Fettsäuren in Prozent vom Gesamtfettsäuregehalt)

Zielfettsäure %

Arachidonsäure (20:4 n-6) 15

Essentielle Fettsäuren:

Linolsäure (18:2 n-6) 20-25 Alpha-Linolensäure (18:3 n-3) 3-7

Zusätzliche für den Säugling wertvolle Fettsäuren:

Gamma-Linolensäure (GLA) (18:3 n-6) 6-1 1

Dihomo-Gamma-Linolensäure (DGLA)(20:3 n-6) 4-8 Stearidonsäure (SDA) 1-2

Eicosapentaensäure (EPA) 2-4

Beispiel 8: Säuglingsnahrung , die das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl enthält Der ARA-Gehalt in der hierin beschriebenen exemplarischen Säuglingsnahrung wurde der Gesamtmenge an ARA angeglichen, die in der Muttermilch während der ersten 0-12 Monate der Laktation gefunden wurde. Ein zusätzlicher Vorteil besteht darin, dass wenn das

erfindungsgemäße Pflanzensamenöl verwendet wird, um die Säuglingsmilch mit ARA zu ergänzen, somit auch die Werte für die GLA, DGLA, SDA und EPA im Bereich der Konzentrationen wie in der Muttermilch liegen. Das liegt daran, dass das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl die drei hochgradig ungesättigten Fettsäuren nahezu in den Anteilen enthält, die auch in der Muttermilch gefunden wurden. Wird also das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl als Bestandteil der Säuglingsnahrung verwendet, um die ARA-Konzen- tration anzugleichen, dann werden die GLA, DGLA SDA und EPA in den richtigen Konzentrationen mitgeliefert, um die entsprechenden Nährstoffe für die speziellen Säuglings-, Baby- und Kindernahrungen bereit zu stellen. In diesem Fall ist keine Veränderung des öls wie etwa das Zumischen von beispielsweise weiteren GLA-, DGLA-, SDA- und EPA- haltigen ölen notwendig.

Das ARA-haltige erfindungsgemäße Pflanzensamenöl wurde der Säuglingsnahrung zugesetzt (0,5-7,5 g ARA-haltiges öI/100g Gesamtfettgehalt in der Säuglingsnahrung). Diese zugefügte ARA-Menge macht einen Teil der Gesamtfettmenge aus (Gesamtfettgehalt von ungefähr 28g pro 100g Trockenmasse). Durch den Zusatz des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls wird das Fettsäuremuster der Säuglingsnahrung bezüglich der LCPUFA der Muttermilch entscheidend angenähert, wie aus folgender Tabelle 7 ersichtlich. Die Tabelle 7 vergleicht das durchschnittliche Fettsäuremuster von Säuglingsnahrung dreier unabhängiger Hersteller, wie dokumentiert in der Ernährungsdatenbank der USA (USDA National Nutrient Database for Standard Reference, Release 20 (2007)).

Tabelle 7: Durchschnittliche Fettsäuremuster der Fettmischung von drei kommerziellen Säuglingsnahrungen die als Trockenpulver zum Zubereiten einer Mutterersatzmilch vermarktet werden und die nicht mit ARA ergänzt wurden (Kolonne 2, Säuglingsnahrungen: Mead Johnson, Enfamil, with iron, powder, NDB No: 03805; Ross, Similac, Isomil, with iron, powder, NDB No: 03843; Nestle, Good Start Supreme, with iron, powder NDB No: 03802), drei kommerziellen Säuglingsnahrungen die mit ARA ergänzt wurden (Kolonne 3, Säuglingsnahrungen: Mead Johnson, Enfamil, Lipil, with iron, powder (NDB No: 03808); Ross, Similac, Isomil, Advance with iron, powder (NDB No: 03954); PBM Products, Ultra Bright Beginnings, powder (NDB No: 03883)) und eine exemplarische Säuglingsnahrung (Kolonne 4) die mittels des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls (beschrieben in Kolonne 5) mit ARA ergänzt wurde. Kolonne 6 beschreibt die durchschnittlichen Gehalte der wichtigsten LCPUFA der Muttermilch aus verschiedenen Ländern (Yuhas et al. 2006 Lipids 41 :851-8).

NDB steht hierbei für Nutrients Data Base.

Die Obergrenze von 0.75% ARA als Teil der täglichen Fettaufnahme für Säuglinge wird in US GRAS GRN 80 empfohlen (www.cfsan.fda.gov/~rdb/opa-g080.html). Um die Zielkonzentration von 0.75% ARA am Gesamtfettsäuregehalt der Säuglingsnahrung zu erreichen ist eine Zugabe von 5% des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls notwendig, welches 15% ARA bezogen auf seinen Gesamtfettsäuregehalt enthält. Dadurch errechnet sich eine Gesamtzugabe von 1.36% des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls bezogen auf Säuglingsnahrungstrockenmasse. Eine höhere oder eine geringere Zielkonzentration an ARA in der Säuglingsnahrung kann durch entsprechende Erhöhung oder Verringerung des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls in der Gesamtfettmischung erreicht werden.

Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl kann nicht nur in Säuglingsnahrung eingesetzt werden, sondern auch in Komplettnahrung. Eine Komplettnahrung, der das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl zugesetzt ist, enthält Arachidonsäure (ARA) in ähnlichen Konzentrationen wie die Muttermilch. Die Komplettnahrung enthält auch Gamma- Linolensäure (GLA), Dihomo-Gamma-Linolensäure (DGLA), Stearidonsäure (SDA) und Eicosapentaensäure (EPA) in ähnlichen Konzentrationen wie die Muttermilch. Die angeführte Komplettnahrung kann zum Beispiel Säuglingsmilch, Folgemilch, Getränk fürs Kleinkind, Fruchtsaft, Getreidebrei, Milch, Joghurt oder ein fermentiertes Produkt sein. Beim

Komplettprodukt kann es sich auch um feste oder breiartige Babynahrung, Süßigkeiten, Kekse oder Gelatineprodukte handeln. Sie ist beispielsweise für die Ernährung von Säuglingen, Keinkindern und Kindern bestimmt, um ihr normales Wachstum und ihre

gesunde Entwicklung zu unterstützen.

Durch die Zugabe des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls zur Säuglingsnahrung oder Komplettnahrung wird ein der Muttermilch sehr ähnliches Verhältnis der wichtigsten ungesättigten Fettsäuren erreicht (Tabelle 8).

Tabelle 8: Vergleich der Verhältnisse der wichtigsten PUFA (mit Ausnahme von DHA) in Säuglingsnahrung und Muttermilch. Kolonne 2 zeigt die durchschnittlichen Verhältnisse der wichtigsten PUFA in drei kommerziellen Säuglingsnahrungen (Trockenpulver zum Zubereiten einer Mutterersatzmilch) die mit ARA und DHA ergänzt wurden (Säuglingsnahrungen: Mead Johnson, Enfamil, Lipil, with iron, powder (NDB No: 03808); Ross, Similac, Isomil, Advance with iron, powder (NDB No: 03954); PBM Products, Ultra Bright Beginnings, powder (NDB No: 03883)), die wichtigsten PUFA Verhältnisse einer exemplarischen Säuglingsnahrung (Kolonne 3) die mittels des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls mit ARA (Kolonne 4) ergänzt wurde. Kolonne 5 beschreibt die durchschnittlichen PUFA Verhältnisse der Muttermilch aus verschiedenen Ländern (Yuhas et al. 2006 Lipids 41 :851-8).

Das gewählte Beispiel zeigt, dass sich die günstigen Verhältnisse der wichtigen PUFA ARA, GLA, DGLA, SDA und EPA des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls (Tabelle 8, Kolonne 4) direkt in der Säuglingsnahrung wieder spiegeln (Tabelle 8, Kolonnen 3 und 5). In dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl liegt das Verhältnis von Arachidonsäure zu Gamma- Linolensäure bei etwa 1 :1 bis etwa 5:1 und das Verhältnis von Arachidonsäure zu Dihomo- Gamma-Linolensäure bei etwa 1 :1 bis etwa 5:1. Die mit dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl erreichten Verhältnisse decken daher sehr vorteilhaft die in der Muttermilch vorliegende Verhältnisse zwischen Arachidonsäure (ARA) und Gamma-Linolensäure (GLA) 2:1 bis 4:1 und zwischen Arachidonsäure und Dihomo-Gamma-Linolensäuren (DGLA) 1 :1

bis 2:1 (Yuhas et al. 2006_Upids 41 :851-8); siehe Tabelle 8, Kolonne 5 und Figur 7.

Im Pflanzensamenöl der Erfindung beträgt das Verhältnis von Arachidonsäure zu Stearidonsäure 14:1 bis 38:1 und spiegelt auch hier das in der Muttermilch vorliegende Verhältnis (ARA:SDA ca 7:1 bis 45:1) wieder (Yuhas et al. 2006 Lipids 41 :851-8). Außerdem beträgt das Verhältnis von Arachidonsäure zu Eicosapentaensäure im erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl 3:1 bis 7:1 und spiegelt auch hier das in der Muttermilch vorliegende Verhältnis (ARA:EPA ca. 2:1 bis 7:1 ) wieder (Yuhas et al. 2006 Lipids 41 :851-8).

Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl enthält zudem wie die Muttermilch die essentiellen Fettsäuren Linolsäure und Alpha-Linolensäure. Auch im Bezug auf das Verhältnis von Linolsäure zu alpha-Linolensäure kommt das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl der Muttermilch sehr nahe (Tabelle 8, Kolonnen 3 und 5). In der Muttermilch beträgt das Verhältnis ca. 7:1 bis 18:1 (Yuhas et al. 2006 Lipids 41 :851-8).

Vorteilhaft wird Säuglingsnahrung mit dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl ergänzt um die wichtigen PUFA ARA, GLA, DGLA, SDA und EPA, um die Konzentrationen und Verhältnisse an die in der Muttermilch vorliegenden anzugleichen. Darüber hinaus kann die so ergänzte Säuglingsnahrung weiter mit einer Quelle an DHA ergänzt werden.

Für DHA wird die Obergrenze von 0.5% DAH als Teil der täglichen Fettaufnahme für Säuglinge wird in US GRAS GRN 80 empfohlen (www.cfsan.fda.gov/~rdb/opa-g080.html). Um die Zielkonzentration von 0.5% DHA am Gesamtfettsäuregehalt der Säuglingsnahrung zu erreichen ist beispielsweise eine Zugabe von 1.2 g DHASCO® per 100 g Gesamtfett erforderlich, welches 40% DHA bezogen auf seinen Gesamtfettsäuregehalt enthält

(Arterburn et al. 2007, Lipids 42:101 1-24). Dadurch errechnet sich eine Gesamtzugabe von 0.32% DHASCO® bezogen auf Säuglingsnahrungstrockenmasse. Eine höhere oder eine geringere Zielkonzentration an DHA in der Säuglingsnahrung kann durch entsprechende Erhöhung oder Verringerung des für das Produkt bestimmten DHA-haltigen Inhaltsstoffes erreicht werden.

Der Säuglingsnahrung kann daher das ARA-haltige erfindungsgemäße Pflanzensamenöl (0,5-7,5 g/100g Fett) und DHASCO® zugefügt werden. Im Beispiel macht die zugefügte ARA-Menge 5% und die zugefügte DHA-Menge 1.2% der Gesamtfettmasse aus (bei einem Gesamtfettgehalt der Säuglingsnahrung von ungefähr 28g pro 100g Trockenmasse). Durch den Zusatz beider öle wird das Fettsäuremuster der Säuglingsnahrung bezüglich der LCPUFA der Muttermilch noch weiter angenähert, wie aus folgender Tabelle 9 ersichtlich. Die Tabelle 9 vergleicht das durchschnittliche Fettsäuremuster von Säuglingsnahrung dreier unabhängiger Hersteller wie dokumentiert in der Ernährungsdatenbank der USA (USDA National Nutrient Database for Standard Reference, Release 20 (2007))

Tabelle 9: Durchschnittliche Fettsäuremuster der Fettmischung von drei kommerziellen Säuglingsnahrungen (Trockenpulver zum Zubereiten einer Mutterersatzmilch) die nicht mit ARA und DHA ergänzt wurden (Kolonne 2, Säuglingsnahrungen: Mead Johnson, Enfamil, with iron, powder, NDB No: 03805; Ross, Similac, Isomil, with iron, powder, NDB No: 03843; Nestle, Good Start Supreme, with iron, powder NDB No: 03802), drei kommerziellen Säuglingsnahrungen die mit ARA ergänzt wurden (Kolonne 3, Säuglingsnahrungen: Mead Johnson, Enfamil, Lipil, with iron, powder (NDB No: 03808); Ross, Similac, Isomil, Advance with iron, powder (NDB No: 03954); PBM Products, Ultra Bright Beginnings, powder (NDB No: 03883)) und eine exemplarische Säuglingsnahrung (Kolonne 4) die mittels des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls beschrieben in Kolonne 5 mit ARA ergänzt wurde und die mittels DHASCO® (Arterburn et al. 2007, Lipids 42:1011-24) mit DHA ergänzt wurde (Kolonne 6). Kolonne 7 beschreibt die durchschnittlichen Gehalte der wichtigsten LCPUFA der Muttermilch in verschiedenen Ländern (Yuhas, loc.cit.).

Durch die Zugabe des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls und die gleichzeitige Ergänzung mit DHASCO® wird ein der Muttermilch noch ähnlicheres Verhältnis der wichtigsten ungesättigten Fettsäuren erreicht (Tabelle 9) als durch die alleinige Ergänzung mit dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl. Diese weitere Angleichung der Säuglingsnahrung an die Muttermilch durch die Zugabe von DHA kann auch mit anderen hoch-DHA enthaltenden ölen, wie beispielsweise dem BASF Pulver Produkt Nummer 30056967 (Dry n-3® 5:25 C Powder Microencapsulated fish oil rieh in DHA for Infant formula) erreicht werden.

Tabelle 10: Vergleich der Verhältnisse der wichtigsten PUFA in Säuglingsnahrung und Muttermilch. Kolonne 2 zeigt die durchschnittlichen Verhältnisse der wichtigsten PUFA in drei kommerziellen Säuglingsnahrungen die mit ARA und DHA ergänzt wurden (Säuglingsnahrungen: Mead Johnson, Enfamil, Lipil, with iron, powder (NDB No: 03808); Ross, Similac, Isomil, Advance with iron, powder (NDB No: 03954); PBM Products, Ultra Bright Beginnings, powder (NDB No: 03883)), die wichtigsten PUFA Verhältnisse einer exemplarischen Säuglingsnahrung (Kolonne 3) die mittels des erfindungsgemäßen

Pflanzensamenöls mit ARA (Kolonne 4) und mittels DHASCO® (Kolonne 5, Arterburn et al. 2007, Lipids 42:101 1-24) ergänzt wurde. Kolonne 6 beschreibt die durchschnittlichen PUFA Verhältnisse der Muttermilch aus verschiedenen Ländern (Yuhas et al. 2006_Lipids 41 :851- 8).

Tabelle 10 zeigt, dass sich die günstigen Verhältnisse der wichtigen PUFA ARA, GLA, DGLA, SDA, EPA und DHA des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls (Tabelle 10, Kolonne 4) direkt in der Säuglingsnahrung wieder spiegeln (Tabelle 10, Kolonne 3) und dass darüber hinaus besonders günstige Verhältnisse der Fettsäuren DHA und EPA erreicht werden.

Bei der Säuglingsnahrung, welche mit dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl und mit DHASCO® ergänzt wurde beträgt das Verhältnis von ARA zu DHA 1.5:1 und spiegelt hier das in der Muttermilch vorliegende Verhältnis (ARA:DHA ca 0.6:1 bis 7.2:1) wieder (Yuhas et al. 2006 Lipids 41 :851-8). Außerdem beträgt in einer bevorzugten Ausführungsform des Pflanzensamenöls der Erfindung das Verhältnis von DHA zu EPA bei 3.3:1 und spiegelt auch hier das in der Muttermilch vorliegende Verhältnis (DHA:EPA ca. 2.1 :1 bis 5.0:1) wieder (Yuhas et al. 2006_Lipids 41 :851-8)

Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl wurde entwickelt, um das optimale Wachstum, die visuelle und kognitive Entwicklung und die Entwicklung einer verbesserten Immunität von Neugeborenen, Babys und Kleinkindern zu unterstützen. Als Zusatz in der Babynahrung ist es vorzugsweise für frühgeborene Säuglinge als auch für Babys bzw. Kleinkindern im Alter

von: 0-6 Monaten (Säuglingsanfangsnahrung), 0-12 Monaten (Säuglingsnahrung), und 12-24 Monaten (Kleinkinder) geeignet.

Im Nachfolgenden werden beispielhaft Rezepturen aufgeführt, welche durch das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl besonders günstig ergänzt werden. Besonders günstig werden die Inhaltsstoffe der Rezepturen in Mengenverhältnissen gemischt, so dass die Säuglingsnahrung Hauptnährstoffe in folgenden Konzentrationen beinhaltet (Angaben in g/100kcal der Säuglingsnahrung): Fette, 3-7g; Proteine, 1-5g; Kohlenhydrate, 6-16g. Zusätzlich enthält die Säuglingsnahrung Vitamine und Mineralien in einer für das entsprechende Alter des Säuglings oder Kleinkindes empfohlenen Mengen, sowie ARA und DHA zu jeweils 0,025 bis 0,5 Prozent der Energie der Säuglingsnahrung oder in einer Konzentration von jeweils 0,05 bis 1 ,0g/100g Fett der Säuglingsnahrung. Die Säuglingsnahrung enthält darüber hinaus GLA, DGLA, SDA und EPA in Verhältnissen welche der Muttermilch besonders ähnlich sind. Die funktionellen Fettsäuren ARA, GLA, DGLA, SDA und EPA stammen hierbei aus dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl.

Die Säuglingsnahrung kann sich beispielsweise aus folgenden Bestandteilen zusammensetzen: Mineralienreduzierte Molke, entfettete Milch, Pflanzenöl (Palmolein, Soja, Kokosnuss, ölsäurereiche Sonnenblume und erucasäurearme Rapsöle), Laktose, das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl, Crypthecodinium cohnii-öI oder Fischöl, Vitamin-A- Palmitat, Vitamin D3, Vitamin-E-Acetat, Vitamin K1 , Thiaminhydrochlorid, Vitamin-B6- Hydrochlorid, Vitamin B12, Niacinamid, Folsäure, Kalziumpantothenat, Biotin, Natriumascorbat, Inositol, Kalziumchlorid, Kalziumphosphat, Eisensulfat, Zinksulfat, Mangansulfat, Kupfersulfat, Natriumchlorid, Natriumeitrat, Kaliumeitrat, Kaliumhydroxid, Natriumselenit, Taurin, Nucleotide (Adenosin-5-monophosphat, Cytidin-5-monophosphat, Dinatriumguanosin-5-monophosphat, Dinatriumuridin-5-monophosphat), eine Quelle für Carotinoide, eine Quelle für Prebiotika und eine Quelle für Probiotika.

Ein weiteres Beispiel für die Zusammensetzung einer Säuglingsnahrung mit dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl ist eine Säuglingsnahrung mit Probiotika und mit ARA, wahlweise kombiniert mit Prebiotika. ARA kann hierbei wahlweise mit Docosahexaensäure (DHA) kombiniert werden, wie weiter oben gezeigt. Wichtige Bestandteile dieser Säuglingsnahrung sind dabei modifizierte süße Molkeproteine intakt oder teilweise hydrolysiert, Probiotika in Form von Bifidobakterien und/oder Laktobazillen, wahlweise Prebiotika in Form von spezifischen Mono- und Disacchariden, Oligosacchariden oder Stärken und das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl. Diese Säuglingsnahrung enthält (pro 100kcal): Energiegehalt (kcal) (100), Protein (g) (Casein/Molke: 30/70) (1 ,83), Gesamtfettgehalt (g) (5,3) davon Linolsäure (g) (0,7-0,8), Alpha-Linolensäure (mg) (90-110), ARA (mg) (5-60), GLA (mg) (3-40), DGLA (mg) (2-30), SDA (mg) (1-6), EPA (mg) (1-12), DHA (mg) (5-60), Laktose (g) (1 1 ,2), Mineralien (g) (0,37), Na (mg) (23), K (mg) (89), Cl (mg) (64), Ca (mg) (62), P (mg) (31 ), Mg (mg) (7), Mn (μg) (8), Se (μg) (2), Vitamin A (μg RE) (105), Vitamin D

(μg) (1 ,5), Vitamin E (mg TE) (0,8), Vitamin K1 (μg)(8), Vitamin C (mg) (10), Vitamin B1 (mg) (0,07), Vitamin B2 (mg) (0,15), Niacin (mg) (16,7), Vitamin B6 (mg) (0,075), Folsäure (μg) (9), Pantothensäure (mg) (0,45), Vitamin B12 (μg) (0,3), Biotin (μg) (2,2), Cholin (mg) (10), Fe (mg) (1 ,2), I (μg) (15), Cu (mg) (0,06), Zn (mg) (0,75) als Nährstoffe.

Darüber hinaus ist ein weiteres Beispiel eine Säuglingsnahrung mit dem erfindungsgemäßen Pflanzensamenöl und den Carotinoiden beta-Carotin, Lycopen, Lutein und Zeaxanthin. Die Kombination von Lutein, Lycopen und beta-Carotin macht 0, 05-0, 8mg/100g des Gesamtfettgehalts oder der Nahrungsrezeptur aus. Die Masseanteile an der Gesamtölmenge in der Säuglingsnahrung betragen: 0,01-0,6 mg Beta-Carotin, 0,01-0,8 mg Lycopen und 0,01-0,5 mg Lutein plus Zeaxanthin. Der Anteil der mehrfach ungesättigten Fettsäuren beträgt 0,05- 20 Gewichts-% am Gesamtfeststoff der Säuglingsnahrung. Bei den mehrfach ungesättigten Fettsäuren handelt es sich um Arachidonsäure (bevorzugt), GLA, DGLA, SDA, Eicosapentaensäure, Docosahexaensäure, Linolsäure und/oder alpha Linolensäure. Die in der Säuglingsnahrung enthaltene ARA-Menge beträgt 0,1 bis 1 ,0g/100g des Gesamtfetts oder 0,05 bis 0,5 Prozent der Gesamtenergie. Die enthaltenen Mengen an GLA, DGLA, SDA und EPA betragen jeweils 0.06-0.7, 0.04-0.5, 0.01-0.1 and 0.02-0.2 g/100g des Gesamtfetts. Es wurde auch eine flüssige Säuglingsnahrung hergestellt. Wasser wurde dazu mit folgenden Trockenbestandteilen verarbeitet: Laktose 44.5%, erfindungsgemäßes Pflanzen- samenöl (15% ARA) 0.1 bis 1.5%, DHA-haltiges öl (40% DHA) 0.1 %, fettlose Trockenmilch 18.7%, ölsäurereiches Safloröl 10.7%, Mono- und Diglyceride 0.27%, Sojaöl 8.2%, Molkeprotein 4.6%, Kalziumcarbonat 0.35%, Kokosnussöl 7.58%, Zitronensäure 0.02%, Kaliumeitrat 0.40%, Ascorbinsäure 0.29%, Lecithin 0.27%, Magnesiumchlorid 0.04%, Kaliumchlorid 0.14%, Eisensulfat 0.04%, Carrageenan 0.22%, Cholinchlorid 0.04%, Nucleotid- und Cholin- Vorgemisch 0.22%, Riboflavin 0.002%, L-Carnitin 0.002%,

Kaliumhydroxid 1.65%, Luteinlösung (5%aktiv) 0.64%, wasserlösliches Vitamin-Vorgemisch 0.27%, Vitamin-ADEK-Vorgemisch 20%, Vitamin A 0.0007%, Beta-Carotinlösung (30%) 0.0001 %, Lutein (1.2 ppm), Lycopene (0.48 ppm),

Tabelle n :

Bereiche der Nährstoffzusammensetzung in Säuglingsnahrung enthaltend das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl (Quelle: USDA Nationale Nährstoffdatenbank für Standardreferenz, Veröffentlichung 20 (2007)

Beispiel 9: Anwendung des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls für die Ernährung von Tieren

Das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl ist auch als Nahrungsergänzungsprodukt für Futteranwendungen zur Verbesserung des Zuchtergebnisses geeignet. Es kann als Futterzusatz zur Verbesserung von Bestandszuchtergebnissen (zum Beispiel von Forellenfischen, Rindern, Schweinen, Hühnern) und für die Gesundheit von Haustieren (zum Beispiel von Katzen und Hunden) verwendet werden. Dazu enthält das erfindungsgemäße Pflanzensamenöl Arachidonsäure (ARA) in Konzentrationen, die geeignet sind, um die Reproduktionsraten zu verbessern, wenn die Nahrung des Jungtieres oder des Muttertieres mit ARA ergänzt wird.

Das Futtermittelprodukt erhält durch den Zusatz des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls neben ARA auch Gamma-Linolensäure (GLA), Dihomo-Gamma-Linolensäure (DGLA), Stearidonsäure (SDA) und Eicosapentaensäure (EPA). Die Ergänzung von Ernährungsprodukten mit dem Pflanzensamenöl der Erfindung führt zu höheren

Reproduktionsraten, besseren überlebenschancen für die Jungtiere, sowie zu einer verbesserten neurologischen und visuellen Entwicklung.

Beispiel 10: Technische Anwendungen des erfindungsgemäßen Pflanzensamenöls Der Zusatz des Pflanzensamenöls der Erfindung liefert ein technisches öl mit einer einzigartig hohen Konzentration an ungesättigten Fettsäuren mit Doppelbindungen als

Polymerisationskomponente für technische Anwendungen.

Das öl kann allein oder in Kombination mit einem Polymerisationsmittel für die folgenden

Anwendungen eingesetzt werden: 1. Lacke und überzüge (Verwendung als oxidatives Trockenöl)

2. Polymere für Bodenbeläge oder Kunststoffe (Verwendung als oxidatives Trockenöl)

3. Andere chemische Anwendungen

4. Kosmetische Anwendungen

5. Anwendungen im Bereich Elektronik und Halbleitertechnik

Der Vorteil des oben beschriebenen öls liegt in seinen einzigartigen Polymerisationseigenschaften. Das öl polymerisiert schneller, gleichmäßiger und bildet eine festere dreidimensionale Struktur, die dort sinnvoll ist, wo Festigkeit, Strapazierfähigkeit und Elastizität des Netzwerks erforderlich sind (wie etwa in überzügen und Fußbodenbelägen oder Kunststoffen).