Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft Pflanzen, insbesondere Nutzpflanzen, mit erhöhter Resistenz gegen Pathogene, sowie das Verfahren zu ihrer Herstellung.

Pflanzen sind ständig einer Gefahr des Befalls durch Krankheitserreger ausgesetzt. Pflanzenkrankheiten, die durch pathogene Organismen verursacht werden, können zum Totalverlust von Erträgen bei Nutzpflanzen führen. Eine konventionelle Methode zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten ist die Verwendung von chemischen Pflanzenschutzmitteln, wobei auch unter diesen Maßnahmen ein Teil des Ertrags regelmäßig verloren geht.

Der Einsatz chemischer Pflanzenschutzmittel bei Nutzpflanzen kann negative Auswirkungen auf Menschen und Umwelt haben. Diese Maßnahmen sind außerdem sehr kosten- und arbeitsintensiv. Darüber hinaus entwickeln die mit chemischen Pflanzenschutzmitteln zu bekämpfenden Krankheitserreger häufig

Anpassungsmechanismen, so dass solche Maßnahmen häufig nicht die gewünschte Schutzwirkung erzielen.

Eine Alternative zum Einsatz chemischer Mittel ist die Nutzung krankheitsresistenter Sorten. Eine Züchtung pathogenresistenter Sorten mittels der klassischen Selektion ist jedoch wegen zum Teil sehr komplexer Genome von Nutzpflanzen sehr langwierig

Eberhard Karls Universität Tübingen und schwierig. Für die Entwicklung möglichst effektiver und gezielter

Pflanzenschutzmaßnahmen werden somit neue Strategien und Technologien benötigt.

Die Pflanzen selber besitzen eine natürliche Immunität zur effektiven Verteidigung gegen Krankheitserreger. Ein besseres Verständnis molekularer Grundlagen für diese natürliche Immunität könnte zur Entwicklung neuer Pflanzenschutzmaßnahmen beitragen.

Die Mehrheit der Pathogene werden von der Pflanze an ihren sog. Pathogen- assoziierten molekularen Mustern erkannt (engl. Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs, auch MAMPs - Microbe-associated molecular patterns genannt). Das sind Strukturmotive oder Moleküle, die charakteristisch für ein breites Spektrum von Mikroorganismen sind und es der Pflanze ermöglichen, das Eindringen von pathogenen Keimen zu erkennen. In der Regel sind diese Strukturmotive essentiell für die Mikroorganismen und hoch konserviert. PAMPs werden durch

korrespondierende Pattern-Recognition Receptors (PRRs) erkannt, die als Teil der natürlichen Immunität die Gründläge der Breitspektrum-Resistenz bei Pflanzen gegen Pathogene bilden.

Die Modellpflanze Acker-Schmalwand (Arabidopsis thaliana), wie auch andere höhere Pflanzen, besitzt eine große Anzahl von Oberflächen-Rezeptorproteinen, die eine wichtige Rolle sowohl bei konstitutiven („angeborenen") als auch bei adaptiven Prozessen, wie Wachstumsregulation, Entwicklung, Organogenese und Antworten auf externe Stimuli spielen.

Die größte Familie der Oberflächen-Rezeptorproteine in A. thaliana, die von über 600 verschiedenen Genen kodiert werden, bilden die sog. receptor-like kinase proteins (RLK). Das sind transmembrane Proteine, die aus einer zytoplasmatischen Domäne, welche eine Kinase-Funktion bei einer intrazellulären Signaltransduktion ausübt, einer transmembranen Domäne, und einer extrazellulären Domäne, welche für eine Liganden-Bindung zuständig ist, besteht. Viele der RLK-Proteine weisen einen Abschnitt mit sog. leucine-rich repeats (LRR) auf, die bestimmte PAMPs aus pathogenen Organismen erkennen und binden können und somit an der Pathogenabwehr bei Pflanzen beteiligt sind.

SOBIR 1 ist ein LRR-RLK-Protein und besteht aus vier extracellulären LRRs, einer einzigen transmembranen Domäne und einer zytoplasmatischen Serin-Threonin- Proteinkinase-Domäne. Bisher war bekannt, dass eine SOBIR1 -Überexpression einen Zelltod bei Pflanzen aktivieren kann, vermutlich im Zusammenspiel mit dem Protein BIR1 (Gao et al., 2009, Cell Host & Microbe 6, 34-44). Es gibt außerdem Hinweise darauf, dass SOBIR1 die Funktion eines Inhibitors der Abszission hat (Leslie et al., 20 0, Development 137, 467-476), was primär für die Entwicklung der Pflanze, jedoch nicht für die Resistenz gegen Pathogene von Bedeutung ist.

Auch von den Vertretern der Familie der sog. Receptor-like proteins (RLP) ist bekannt, dass sie eine Rolle bei der Vermittlung der pflanzlichen Immunität spielen. Die Struktur von RLP-Proteinen ähnelt der von RLK-Proteinen, mit dem Unterschied, dass ihnen die zytoplasmatische Kinase-Domäne fehlt (Wang G, ei al., 2008, Plant Physiol 147(2):503-517). Bekannte Vertreter dieser Gruppe sind z. B. die Proteine LeEixl und LeEix2 aus Tomatenpflanzen, die die sog. Cell wall-derived ethylene- inducing xylanase (Eix) aus dem Pilz Trichoderma erkennen (Ron M & Avni A, 2004, Plant Cell 16(6): 1604-1615). Auch das RLP-Protein Ve1 , welches das Protein Ave1 aus verschiedenen Pilzarten erkennt, gehört zu dieser Gruppe (de Jonge R, ei al., 2012, Proc Natt Acad Sei U S A 109(13):5110-51 15).

Kürzlich konnte gezeigt werden, dass die RLP-Proteine Cf-4, Cf-2.2, Cf-4E, Cf-9, Peru2 (vermitteln Immunität gegen Cladosporium fulvum) und Ve1 (vermittelt Immunität gegen Verticillium dahliae) an der Pathogenabwehr in den Pflanzen der Gattungen Solanum und Nicotiana beteiligt sind, indem sie mit dem Protein SOBIR1 interagieren (Liebrand et al., 2013, Proc Natt Acad Sei USA, 1 10(24): 10010-5).

SOBIR1 interagiert außerdem mit den RLPs EIX2 (vermittelt Antwort auf den Elicitor „ethylene-inducing xylanase" aus Trichoderma viride), CLV2 (vermittelt Meristem- und Organentwicklung) und TMM (vermittelt Stomata-Entwicklung). Alle in Liebrand et al. getesteten immun-assoziierten RLP-Proteine sind für die Pflanzen der Familie Solänaceae arteigen und vermitteln somit die Immunität gegen die Pathogene (z.B. C. fulvum und V. dahliae), gegen die die Pflanzen ohnehin eine Immunantwort aufbauen können. Lösungen zur Erlangung der Resistenz gegen andere Pathogene, gegen die keine spezifische Immunität von den Pflanzen aufgebaut werden kann, wurden von Liebrand et al. nicht vorgeschlagen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Pflanzen mit erhöhter

Resistenz gegen spezielle Krankheitserreger, sowie ein Verfahren zur Herstellung solcher Pflanzen bereit zu stellen.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung einer Pflanze gelöst, bei der das Protein SOBIR1 aus Arabidopsis thaliana (Gao et al., 2009, Cell Host & Microbe 6, 34^44; Leslie et al., 2010, Development 137, 467-476), oder ein homologes Protein, welches in der Lage ist, mit mindestens einem der PRR-Rezeptorproteine RLP30 oder RLP1 zu interagieren, und mindestens eins der PRR-Rezeptorproteine RLP30 oder RLP1 im Vergleich zur Wildtyppflanze überexprimiert oder neu synthetisiert sind.

In der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, dass das Protein SOBIR1 mit Proteinen aus der PRR-Proteinfamilie, insbesondere mit RLPs interagiert, für die Lokalisation dieser Proteine in der Plasmamembran, und insbesondere für die Auslösung einer Immunantwort bei Pflanzen mit Beteiligung der PRR-Proteine notwendig ist (s. Ausführungsbeispiele).

Besonders bevorzugt werden die Proteine SOBIR1 und RLP in den Pflanzenarten heterolog exprimiert, denen der entsprechende SOBIR1 / RLP-Proteinkomplex fehlt.

RLP30 ist in A. thaliana für die Resistenz gegen Pilze notwendig. Insbesondere erkennt RLP30 SsE1 aus dem pathogenen Pilz Sclerotinia sclerotiorum und ist somit an der Immunabwehr gegen die dieses PAMP aufweisenden Pilzerreger beteiligt. Wie in der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal gezeigt, wird für die Ausbildung einer Resistenz zusätzlich zu RLP30 noch das Protein SOBIR1 benötigt. Einigen Pflanzenfamilien fehlt dieser Rezeptorkomplex, so beispielsweise den Vertretern der Familie Solanaceae, wie in der vorliegenden Erfindung gezeigt wurde. Aus diesem •Grund wird von diesen Pflanzen das SsE1 nicht erkannt, so dass sie eine Infektion durch diese Pilzart nicht erfolgreich abwehren können. Eine heterologe Expression der Proteine SOBIR1 und RLP30 wird erfindungsgemäß die Resistenz gegen pathogene Pilze in solchen Pflanzen etablieren bzw. erhöhen.

Außerdem deuten die in der vorliegenden Erfindung erzeugten Daten darauf hin, dass SOBIR1 zusammen mit einem weiteren RLP-Protein - RLP1 - an der

Immunabwehr bei Pflanzen beteiligt ist. Von RLP1 ist bekannt, dass es in A. thaliana EMAX (enigmatic microbe-associated molecular pattern of Xanthomonas) erkennt und bindet (Jehle et al., 2013, Plant Cell 25, 2330-2340). Somit scheint SOBIR1 auch an der Immunabwehr gegen pathogene Bakterien beteiligt zu sein. Eine Co- Expression von SOBIR1 und RLP1 wird erfindungsgemäß die Resistenz gegen pathogene Bakterien erhöhen.

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhter Resistenz gegen Pathogene. Bei diesem Verfahren werden das Protein SOBIR1 aus A. thaliana, oder ein homologes Protein, welches in der Lage ist, mit mindestens einem der PRR-Rezeptorproteine RLP30 oder RLP1 zu interagieren, und mindestens eins der PRR-Rezeptorproteine RLP30 oder RLP1 im Vergleich zur Wildtyppflanze überexprimiert oder neu synthetisiert.

Die Expression der Proteine kann durch herkömmliche, dem Fachmann bekannte Verfahren beeinflusst werden. Hierbei kommen z.B. eine ektopische Expression, insbesondere eine heterologe Expression, oder eine Mutagenese, eine RNA- Interferenz, eine DNA-Methylierung oder ein anderes molekularbiologisches

Verfahren in Frage.

Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung werden nachstehend anhand des unten beschriebenen Ausführungsbeispiels mit Bezug auf die Figuren beschrieben.

Fig. 1 : Ethylen-Antwort auf SsE1 in sob/rf-Mutanten im Vergleich zu anderen RLK-Mutanten. Blattscheiben 5 Wochen alter Arabidopsis-Pflanzen wurden zur Kontrolle nicht behandelt (control) oder mit einem partiell aufgereinigten Extrakt von S. sclerotioum (SsE1 ) behandelt. Nach dreistündiger Inkubation wurde die Produktion von Ethylen mittels Gaschromatographie gemessen. Jeweils zwei unabhängige T-DNA-Insertionslinien wurden getestet, zwei rlp30-Mutanten dienten als positive Kontrolle. Gezeigt sind die Mittelwerte aus zwei Werten ± S.D.

Fig. 2: SOBIR1 und RLP30 interagieren direkt. In N. benthamiana -Blättern wurden transient Konstrukte für RLP30-GFP und SOBIR1 -HA exprimiert.

Gesamtprotein aus Blättern (input) wurde einer Immunopräzipitation mit anti-HA- Agagose-beads unterzogen, gefolgt von einer Immunoblot-Analyse mit anti-GFP- Antikörpern (erkennen RLP30-GFP) bzw. anti-HA-Antikörpern (erkennen SOBIR1- HA).

Fig. 3: SOBIR1 ist nötig für die Resistenz gegenüber pilzlichen Pathogenen.

Col-0 wildtyp-Pflanzen oder rlp30 und sobirl Mutanten wurden mit ß. cinerea Sporen (5 μΙ Tropfen einer 2 x 10 ⁶ Sporem ml ^"1 Lösung) infiziert und die Läsionsgrößen nach 3 Tagen bestimmt. Gezeigt sind Mittelwerte (n = 2) ± S.E.M. (n = 20). Sterne zeigen signifikante Unterschiede bei Vergleich zu Col-0 an ( ( ^* * ^* P < 0,005, Student's t-test).

Fig. 4: sobirl Mutanten sind eingeschränkt in der Perzeption von SsE1 und emax.

Blattscheiben 5 Wochen alter Arabidopsis-Pflanzen wurden zur Kontrolle nicht behandelt (control) oder mit 500nM flg22, oder partiell aufgereinigten Extrakten von S. sclerotiorum (SsE1 ) oder Xanthomonas axonopodis pv. Citri (emax) behandelt. Nach dreistündiger Inkubation wurde die Produktion von Ethylen mittels

Gaschromatographie gemessen. Gezeigt sind die Mittelwerte aus zwei Werten ± S.D.

Fig. 5: Das SsE1-Perzeptionssystem existiert nicht in Solanaceen. Blattscheiben von Nicotiana benthamiana oder Solanum lycopersicum wurden mit SsE1 oder 500 nM flg22 behandelt und nach 3 Stunden die Ethylenproduktion mittels

Gaschromatographie gemessen. Gezeigt sind die Mittelwerte aus zwei Werten ± S.D.

Fig. 6: Co-expression von RLP30 und SOBIR1 vermittelt eine SsE1 Antwort in N. benthamiana. In N. benthamiana -Blättern wurden transient Konstrukte für RLP30-GFP und SOBIR1 -HA jeweils alleine oder in Kombination exprimiert. 2 Tage nach der Agrobakterien-Infiltration wurden Blattstücke entweder mit S. sclerotiorum- Extrakt (SsE1) oder 500 nM flg22 behandelt, oder zur Kontrolle unbehandelt gelassen (-) und nach 3 Stunden die Ethylenproduktion mittels Gaschromatographie gemessen. Gezeigt sind die Mittelwerte aus zwei Werten ± S.D.

Ausführungsbeispiele

Identifizierung von SOBIR1 als einem Interaktionspartner für RLP30

Auf der Suche nach einem potentiellen Interaktionspartner für RLP30, der an der Signaltransduktion bei einer Infektion durch einen Pathogen beteiligt ist, wurden bestehende Datenbanken für Membranprotein-Interaktionen durchsucht. In einem Yeast-two-hybrid Datenbestand

(http://www.associomics.org/Associomics/Home.html) wurden von den insgesamt 66 potentiellen Interaktionspartnern folgende RLKs identifiziert, die mit RLP30 interagieren:

Für drei der fünf mit RLP30 interagierenden RLKs wurden T-DNA-Insertionslinien vom Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) erhalten und auf SsE1- ausgelöste Ethylen-Produktion hin getestet. Nur die sobirl Mutanten (Suppressor of BIR1-1 , At2g31880, auch als EVR, Evershed bekannt) zeigten keine SsE1 -induzierte Ethylen-Produktion mehr, während die T-DNA-Insertionslinien der anderen RLKs eine normale Reaktion auf SsE1 zeigten (Fig. 1). Unter Zuhilfenahme der Agrobakterium-vermittelten transienten Co-Expression von Epitop-markierten SOBIR1 und RLP30 Konstrukten in Nicotiana benthamiana konnte gezeigt werden, dass SOBIR1 physikalisch mit RLP30 interagiert, und zwar in Liganden-unabhängiger Weise (Fig. 2). Dazu wurde SOBIR1-HA (HA-Epitop-Tag am C-Terminus) zusammen mit RLP30-GFP (GFP-Epitop-Tag am C-Terminus) in Blättern etwa 3 Wochen alter N. benthamiana-Pflanzen exprimiert und nach zwei Tagen Proteinextrakte aus den Blättern hergestellt. Aus Proteinextrakten wurde SOBIR1-HA immuno-präzipitiert (Anti-HA-Agarose) und über Westernblot-Analyse sowohl das Vorhandensein von RLP30-GFP (GFP-Antikörper) als auch SOBIR1-HA (HA-Antikörper) überprüft. Dabei wurde SOBIR1-HA im Komplex mit RLP30-GFP identifiziert, und zwar in Abwesenheit von SsE1 (Fig. 2).

Außerdem wurde die Resistenz von sobir 1 -Mutanten gegenüber Infektionen mit dem nekrotrophen Pilz B. cinerea untersucht. Es zeigte sich, dass ähnlich den rlp30 Mutanten auch die sobir -Mutanten hypersusceptibel reagieren und erhöhte

Läsionsdurchmesser nach Botrytis-Infektion aufwiesen (Fig. 3). Für die

Pflanzeninfektion wurde das B. cinerea-lsolat BO5-10 auf synthetischem Medium angezogen und die Blatt-Infektion von 4-5 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen wie bei Kemmerling et al. (2007, Current Biology) beschrieben durchgeführt. Zur

Quantifizierung pilzlicher DNA wurden vier mit B. cinerea infizierte Blätter pro Genotyp (Tag 2 oder 3 der Infektion) durch Einfrieren geerntet. Die Proben wurden unter flüssigem Stickstoff zu Pulver zerrieben und Total-DNA mit dem CTAB-Puffer (1 ,4 M NaCI, 20 mM EDTA (pH 8), 100 mM Tris-HCI (pH 8), 2% CTAB) isoliert.

Pilzliche Biomasse wurde über quantitative Real-Time PLCR mit dem SYBR Green qPCR Master Mix (Fermentas) bestimmt. Der relative Gehalt der genomischen DNA des Botyris Actin-Gens und der genomischen DNA des Arabidopsis Rubisco-Gens (Große Untereinheit) wurde verwendet, um die pilzliche Biomasse zu quantifizieren (Fradin et al., 2011).

Identifizierung von SOBIR 1 als einem Interaktionspartner für RLP1

Interessanterweise wurde beobachtet, dass SOBIR1 auch eine Funktion bei der kürzlich publizierten Erkennung des Xanthomonas-Elicitors EMAX über RLP1 hat. Geninaktivierung von SOBIR1 in Arabidopsis-Pflanzen resultierte in einer fehlenden Ethylen-Antwort nach emax-Behandlung, ähnlich wie nach Behandlung mit SsE1 (Fig. 4). Im Gegensatz dazu antworten die rlp30 Mutanten Antworten ganz normal auf EMAX, was darauf hindeutet dass die Erkennungspezifizität von SsE1 und EMAX vom jeweiligen RLP abhängt.

Heterologe Co-Expression von SOBIR1 und RLP30 in Solanaceae

In Tabak (N. benthamiana) und Tomate (S. lycopersicum) konnte SsE1 , anders als das 22 Aminosäure-Peptid flg22 aus Flagellin, nicht die Produktion von Ethylen induzieren (Fig. 5) was darauf hindeutet dass die Erkennung von SsE1 Arabidopsis- spezifisch ist. Unter Zuhilfenahme der Agrobakterium-vermittelten transienten Co- Expression von Epitop-markierten SOBIR1 und RLP30 Konstrukten in Nicotiana benthamiana konnte aber gezeigt werden, dass wenn beide Proteine zusammen exprimiert werden, eine SsE1 -induzierte Ethylenbildung auch in Tabak ausgelöst wird. Die Expression der einzelnen Komponenten (SOBIR1 oder RLP30 allein) führt zu keiner SsE1 Antwort. Dazu wurde SOBIR1 -HA (HA-Epitop-Tag am C-Terminus) oder RLP30-GFP (GFP-Epitop-Tag am C-Terminus) jeweils alleine oder in

Kombination in Blättern etwa 3 Wochen alter N. benthamiana-Pflanzen exprimiert und die jeweiligen Blätter nach zwei Tagen mit SsE1 (0,25 Mg/ml) oder flg22 (500 nM) infiltriert. Ethylenproduktion wurde 3 Stunden nach Infiltration des Elicitors mittels Gas-Chromatography gemessen (Fig. 6).