PLANTES PRESENTANT UNE RESISTANCE ACCRUE AUX STRESS

BIOTIQUES ET ABIOTIQUES

La présente invention concerne des plantes ou des parties de plantes présentant une résistance accrue aux stress environnementaux, biotiques et abiotiques, ainsi que des procédés pour obtenir de telles plantes ou parties de plantes.

Les cytochromes P450 sont des protéines membranaires impliquées dans de nombreuses réactions d'hydroxylation chez les plantes. Le séquençage complet du génome d'Arabidopsis thaliana a permis de mettre en évidence l'existence de 273 gènes codant des cytochromes P450 répartis en 45 familles et sous familles. La fonction d'un grand nombre de ces gènes reste inconnue. Parmi ces gènes, la famille CYP98, qui semble être impliquée dans le processus de lignification (Franke et al. (2002) Plant J. 30 : 47; Abdulrazzak et al. (2006) Plant Physiol. 140 : 30), est constituée de trois membres, CYP98A3, CYP98A8 et CYP98A9. CYP98A8 et CYP98A9 présentent 69% d'identité entre elles et 52% d'identité avec CYP98A3. CYP98A3 code la p-coumaroyl 3' ester-hydroxylase (Schoch et al. (2001) J. Biol. Chem. 276), cependant, la fonction de CYP98A8 et de CYP98A9 reste inconnue à ce jour.

La présente invention découle de la mise en évidence, par les Inventeurs, que l'expression du gène CYP98A9 était augmentée chez Arabidopsis thaliana lorsque celle-ci est soumise à un stress de nature biotique, comme une infection microbienne, ou abiotique, comme un stress hydrique, un stress oxydant, ou un stress thermique, et que des plantes ayant une expression accrue de ce gène présentaient une résistance accrue auxdits stress.

La présente invention concerne donc l'utilisation d'un acide nucléique comprenant ou étant constitué par : a) une séquence codant une protéine CYP98A9 représentée par SEQ ID NO : 2, ou b) une séquence codant une protéine homologue à CYP98A9 présentant au moins 60 % d'identité avec SEQ ID NO : 2, sous réserve que ladite protéine homologue présente une activité similaire à celle de CYP98A9, ou c) une séquence s'hybridant dans des conditions stringentes à la séquence codant la protéine CYP98A9 ou à sa séquence complémentaire, sous réserve

que ladite séquence hybridante code une protéine présentant une activité similaire à celle de CYP98A9, pour la production de plantes, ou de parties de plantes, présentant une résistance accrue à des stress environnementaux par rapport aux plantes, ou parties de plantes, correspondantes qui n'ont pas été produites à l'aide dudit acide nucléique.

Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'acide nucléique défini ci-dessus est compris dans une cassette d'expression au sein de laquelle ledit acide nucléique est lié de façon opérationnelle à au moins une séquence régulatrice, notamment promotrice, et/ou au moins une séquence terminatrice.

Dans un mode de réalisation plus particulier, la séquence promotrice de la cassette d'expression ci-dessus est un promoteur constitutif de plante.

La présente invention concerne également une cassette d'expression telle que définie ci-dessus.

De préférence, la cassette d'expression comprend un acide nucléique tel que défini ci-dessus lié de façon opérationnelle à au moins une séquence régulatrice, notamment promotrice, et/ou au moins une séquence terminatrice.

La présente invention concerne également un vecteur d'expression comprenant une cassette d'expression telle que définie ci-dessus.

En particulier, l'invention concerne un vecteur d'expression représenté par SEQ ID NO : 7.

L'invention concerne également une cellule comprenant une cassette d'expression telle que définie ci-dessus ou un vecteur d'expression tel que défini ci- dessus. La cellule peut être de toute origine. En particulier, elle peut être d'origine bactérienne ou végétale.

L'invention concerne également une plante, ou partie de plante, dont le génome comprend au moins un acide nucléique tel que défini ci-dessus, sous réserve que ledit acide nucléique soit hétérologue par rapport à ladite plante, ou partie de plante, c'est-à-dire qu'à l'état naturel ou sauvage le génome de ladite plante, ou partie de plante ne comprend pas ledit acide nucléique. Autrement dit, si la plante à l'état naturel ou sauvage, ne possède pas un acide nucléique tel que défini ci-dessus, la plante, ou partie de plante, selon l'invention, comprendra au moins un exemplaire de l'acide nucléique tel que défini ci-dessus. Par ailleurs, si la plante, ou partie de plante, à l'état naturel ou sauvage possède une ou plusieurs copies d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus (par exemple, chez Arabidopsis thaliana, il

existe naturellement un acide nucléique codant pour CYP98A9), la plante ou partie de plante selon l'invention comprend au moins une copie supplémentaire dudit acide nucléique.

L'invention concerne également une plante, ou partie de plante, dont le génome comprend au moins une cassette d'expression telle que définie ci-dessus ou un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus.

La présente invention concerne également un procédé de production de plantes modifiées, ou de parties de plantes modifiées, présentant une résistance accrue à des stress environnementaux par rapport aux plantes, ou parties de plantes, non modifiées correspondantes, consistant à exprimer au moins un acide nucléique tel que défini ci-dessus dans les plantes modifiées, ou parties de plantes modifiées, ou à augmenter l'expression dudit acide nucléique dans les plantes modifiées, ou parties de plantes modifiées, par rapport aux plantes, ou parties de plantes, non modifiées correspondantes.

Dans un mode de réalisation particulier, le procédé ci-dessus comprend une étape de régénération de plantes modifiées, ou de parties de plantes modifiées, à partir de plantes, ou de parties de plantes, telle qu'une cellule de plante, transformées par un acide nucléique tel que défini ci-dessus, une cassette d'expression telle que définie ci-dessus, ou un vecteur tel que défini ci-dessus.

La présente invention concerne également une plante modifiée, ou partie de plante modifiée, susceptible d'être obtenue selon le procédé défini ci-dessus.

La présente invention concerne également une plante, ou une partie de plante, transformée par un acide nucléique tel que défini ci-dessus.

CYP98A9 et homologues

La protéine CYP98A9 est une protéine de 487 acides aminés représentée par SEQ ID NO : 2 isolée chez Arabidopsis thaliana, elle est notamment référencée par AAG52373 dans la base de donnée GenBank. Cette protéine peut en particulier être codée par SEQ ID NO : 1. Dans la suite, CYP98A9, écrit en italique, représente la séquence nucléotidique codante de CYP98A9.

Par « homologue » on entend toute protéine dont la séquence présente au moins 60%, de préférence au moins 70%, plus préférentiellement au moins 80%, encore plus préférentiellement au moins 90% d'identité avec SEQ ID NO : 2.

Ces séquences homologues sont notamment obtenues par délation, insertion ou substitution d'au moins un acide aminé de SEQ ID NO : 2.

Le pourcentage d'identité d'une séquence par rapport à SEQ ID NO : 2 est calculé en dénombrant le nombre d'acides aminés identiques entre ladite séquence et SEQ ID NO : 2 pour l'ensemble des positions d'un alignement de séquence optimal entre ladite séquence et SEQ ID NO : 2 et en divisant ce nombre par le nombre total d'acides aminés de ladite séquence.

L'alignement de séquences peut être réalisé manuellement, éventuellement en introduisant des espaces entre les acides aminés, ou à l'aide de logiciels d'alignement de séquences bien connus de l'homme du métier, tel que le logiciel BLAST (Altschul et al. (1997) NucleicAcids Res 25 : 3389-402).

Par « conditions stringentes », on entend des conditions d'hybridation sélectives. Des conditions d'hybridation stringentes vis-à-vis d'une séquence d'acide nucléique particulière peuvent être mise au point de façon routinière par l'homme du métier. A titre d'exemple de conditions stringentes selon l'invention, on peut citer une température d'hybridation de 65 ⁰ C, dans un tampon 2OxSCC, et une température de lavage de 5 à 10 ⁰ C sous la température d'hybridation dans un tampon 2x à 0,2x SCC.

Une protéine présente « une activité similaire à celle de CYP98A9 » lorsqu'elle catalyse une même réaction enzymatique et/ou qu'elle intervient dans une même étape d'une voie métabolique que CYP98A9. Cette activité similaire peut, en particulier être évaluée dans une plante, ou partie de plante, à travers l'expression de I ¹ ARN messager (ARNm) codant cette protéine. Ainsi, une protéine présente « une activité similaire à celle de CYP98A9 » lorsque une plante qui exprime l'ARNm messager codant cette protéine ou cette protéine en elle-même à un niveau donné présente une résistance équivalente aux stress environnementaux auxquels elle est soumise par rapport à une plante qui exprime l'ARNm de la protéine CYP98A9 ou la protéine CYP98A9 au même niveau. Les niveaux relatifs d'expression d'un ARNm dans une plante peuvent être mesurés par PCR (réaction de polymérisation en chaîne) comme cela est décrit dans l'Exemple 1. Une résistance équivalente aux stress environnementaux peut être évaluée comme cela est indiqué dans les Exemples 3 à 5. En particulier, les plantes, ou parties de plantes, exprimant l'ARNm de la protéine ayant une activité similaire à celle de CYP98A9 doivent présenter un aspect phénotypique semblable aux plantes, ou parties de plantes, exprimant

CYP98A9, après exposition desdites plantes aux stress dans les mêmes conditions ; lorsque les résultats de mesure de la résistance aux stress sont quantifiables numériquement, les résultats obtenus pour la plante exprimant I ¹ ARNm de la protéine ayant une activité similaire à celle de CYP98A9 sont du même ordre de grandeur que ceux obtenus pour la plante exprimant CYP98A9, en particulier ces résultats sont compris dans une gamme d'environ ± 10 à 20% par rapport à ceux obtenus pour la plante exprimant CYP98A9. Plus particulièrement, dans le test de dénombrement de colonies bactériennes à la surface de feuilles décrit dans l'Exemple 3, les plantes exprimant la protéine ayant une activité similaire à celle de CYP98A9 ne présentent pas plus de 20%, notamment 10%, de colonies en plus que les plantes exprimant CYP98A9 en moyenne. De même, dans le test de mesure du diamètre des zones d'infection fongique à la surface d'une feuille donné dans l'Exemple 4, les plantes exprimant la protéine ayant une activité similaire à celle de CYP98A9 ne présentent pas un diamètre d'infection supérieur de plus de 20%, notamment de plus de 10%, à celui des plantes exprimant CYP98A9 en moyenne.

Alternativement, une protéine qui présente une activité similaire à CYP98A9 peut être détectée par immunodétection à l'aide d'anticorps dirigés contre CYP98A9.

On désigne par « expression d'un acide nucléique » la synthèse d'un ARN, notamment d'un ARNm et/ou d'une protéine à partir de l'information génétique portée par ledit acide nucléique.

En particulier, dans le procédé défini ci-dessus, l'acide nucléique est exprimé dans des plantes modifiées, ou parties de plantes modifiées, qui ne comprennent pas ledit acide nucléique à l'état non modifié, notamment à l'état naturel ou sauvage.

Plante ou partie de plante

Selon l'invention, le terme « plante » désigne tout végétal, en particulier tout végétal de type gymnosperme ou angiosperme monocotylédone ou dicotylédone. En particulier, parmi les dicotylédones, les plantes selon l'invention sont préférentiellement sélectionnées dans le groupe constitué des crucifères, des solanacées, des cucurbitacées, des composées, des ombellifères, des violacées, des malvacées, des rosacées et des capparales, et parmi les monocotylédones, les plantes selon l'invention sont préférentiellement sélectionnées dans le groupe constitué des graminées et les liliacées. De manière préférentielle, la plante est

choisie parmi les céréales telles que le maïs, le blé ou le riz, ou parmi les oléoprotéagineux tels que le colza ou le tournesol.

Par « partie de plante » on entend tout fragment d'une plante contenant au moins une cellule de plante, par exemple un organe de plante (tel qu'une feuille, un bourgeon, une fleur, une racine, un fruit, ou une graine), un tissu de plante (tel qu'un méristème), un cal végétal ou encore une cellule de plante.

Par « production de plantes, ou de parties de plante » on désigne toute activité humaine de préparation, de modification ou de sélection d'une plante ou d'une partie de plante.

Par « plantes, ou parties de plantes, correspondantes qui n'ont pas été produites à l'aide dudit acide nucléique » on désigne des plantes, ou des parties de plantes qui sont génétiquement identiques aux plantes, ou parties de plantes, de l'invention avant la mise en œuvre de l'utilisation selon l'invention ; il s'agit donc de plantes « naturelles » ou « sauvages ».

A l'état sauvage, Arabidopsis thaliana ne contient qu'un seul locus pour le gène CYP98A9 dans son génome, (Schoch et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 : 36566- 36574 ; http://www.p450.kvl.dk/7p450. shtml), c'est-à-dire qu'elle contient deux acides nucléiques essentiellement représentés par SEQ ID NO : 1 dans son génome considéré à l'état diploïde.

L'expression « génome, considéré à l'état diploïde » signifie que pour un génome donné, qui peut être haploïde, diploïde, ou polyploïde, on considère les chromosomes homologues en paires.

De préférence, les plantes produites selon l'utilisation ou le procédé de l'invention sont telles qu'elles présentent une expression accrue de la protéine CYP98A9 par rapport aux plantes correspondantes non produites selon l'invention. Ceci a pour conséquence que les plantes produites selon l'invention présentent une résistance accrue aux divers stress environnementaux définis ci-dessus. Les Inventeurs ont montré que l'expression accrue de CYP98A9 était liée à une expression accrue de camalexine, un dérivé indolique impliqué dans la défense des plantes contre de nombreux agents stressant, notamment des agents pathogènes (Thomma et al. (1999) Plant J. 19 : 163-171. ; Denby et al. (2005) Plant J. 41 : 673- 684).

Stress environnementaux

Par « stress environnementaux », ou agents stressants environnementaux, on désigne l'ensemble des facteurs extérieurs à une plante susceptibles d'affecter le métabolisme normal de cette plante et d'induire chez celle-ci une réaction d'adaptation et/ou de défense. Les stress environnementaux, peuvent provenir d'êtres vivants, il s'agit de stress biotiques, ou de facteurs autres, on parle alors de stress abiotiques. Les stress biotiques regroupent notamment l'ensemble des agents pathogènes microbiens, tels que les agents pathogènes fongiques, bactériens ou viraux, et les infections dont ils sont responsables. Les stress abiotiques regroupent l'ensemble des stress de nature physique ou chimique et notamment les stress oxydatifs ou climatiques ; il s'agit notamment des stress hydriques, comme le manque d'eau, ou les stress thermiques, comme le froid ou la chaleur. Les stress oxydatifs regroupent l'ensemble des stress aboutissant à l'augmentation de la concentration d'agents oxydant dans une plante ou une partie de plante.

Cassette d'expression et vecteur d'expression

L'expression « lié de façon opérationnelle » signifie que l'expression de l'acide nucléique est sous le contrôle d'une séquence régulatrice, notamment promotrice, et/ou d'une séquence terminatrice.

De préférence, les séquences promotrices et/ou terminatrices selon l'invention sont des séquences promotrices et/ou terminatrices de plante, notamment issues de plantes. Par « séquences promotrices et/ou terminatrices de plante » on désigne des promoteurs et/ou des terminateurs fonctionnels au sein de tissus de plante. Par « séquences promotrices issues de plantes » on désigne des promoteurs et/ou des terminateurs fonctionnels au sein de tissus de plantes et susceptibles d'être trouvés à l'état naturel au sein de plantes.

Les séquences promotrices sont bien connues de l'homme du métier. Il s'agit de séquences qui contrôlent le niveau de transcription des séquences nucléotidiques qui sont placées sous leur dépendance. Les séquences promotrices selon l'invention regroupent aussi bien les promoteurs en tant que tels que les séquences de type amplificateur (enhanceή. Les séquences promotrices selon l'invention peuvent être aussi bien inductibles par certains facteurs, que spécifiques d'un tissu, ou constitutives.

Les promoteurs inductibles ou spécifiques d'un tissu n'induisent l'expression des acides nucléiques sous leur contrôle que dans certaines conditions

environnementales, ou dans certains tissus-cibles, comme par exemple, les tiges, les feuilles, les graines, les racines, ou les fleurs. A titre de promoteurs inductibles selon l'invention on peut citer les promoteurs inductibles par un stress environnemental tel que défini ci-dessus. De préférence, les promoteurs inductibles selon l'invention regroupent les promoteurs inductibles par un stress hydrique ou par un agent fongique, viral ou bactérien. Les promoteurs inductibles par un stress hydrique sont bien connus de l'homme du métier. A titre d'exemple on peut ainsi citer les promoteurs décrits par Kasuga et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:287-291. Les promoteurs inductibles par un agent fongique, viral ou bactérien, sont notamment sensibles à des molécules dérivées de ces organismes et sont également bien connus de l'homme du métier. Des exemples de promoteurs spécifiques d'un tissu incluent le promoteur du virus de la Chlorelle régulant l'expression du gène de l'adénine méthyltransférase, le promoteur du virus de la mosaïque du manioc qui s'expriment principalement dans les tissus verts, les éléments régulateurs du promoteur du gène2A11 de la tomate, qui permettent une expression spécifique dans les fruits, ou les promoteurs racinaires décrits dans les demandes WO 02/46439 et WO 03/040322. On peut également citer le promoteur High Molecular Weight Glutenin (HMGW) de blé (Blechl et Anderson (1996) Nat Biotechnol. 14:875- 879) ou encore le promoteur PEPC du gène de la phosphoénolpyruvate carboxylase de sorgho (Crétin et al. (1991) Gène 99:87-94), qui permettent respectivement une expression dans les graines et les feuilles.

L'expression « promoteur constitutif de plante » signifie que ce promoteur entraîne l'expression inconditionnelle des gènes qui sont placés sous son contrôle dans une cellule de plante. En particulier, les promoteurs constitutifs ne sont pas spécifiques d'un tissu et induisent l'expression des acides nucléiques placés sous leur contrôle indépendamment des conditions auxquelles la cellule qui les abrite est soumise. Dans les plantes Arabidopsis thaliana de type sauvage, le gène CYP98A9 n'est pas placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif de plante ; en particulier CYP98A9 s'exprime essentiellement dans le bourgeon (voir l'Exemple 1).

De nombreux promoteurs constitutifs de plantes sont connus de l'homme du métier. A titre d'exemple on peut citer le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) (Kay et al. (1987) Science 236 : 4805), ses dérivés, le promoteur du virus de la mosaïque des nervures de manioc (CsVMV) (WO 97/48819), le

promoteur de l'ubiquitine ou le promoteur « Actine-lntron-actine », du riz (McEIroy et al. (1991) Mol. Gen. Genêt. 231 : 150 ; GenBank S44221).

Les séquences terminatrices sont également bien connues de l'homme du métier. Les séquences terminatrices entraînent l'arrêt de la transcription de séquences nucléotidiques qui se trouvent en amont et favorisent la synthèse d'ARNm messagers plus stables, notamment par adjonction d'une queue polyA. A titre d'exemple on peut citer le terminateur 3' Nos, terminateur de la nopaline synthase qui correspond à la région en 3' non codante du gène de la nopaline synthase provenant du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens souche à nopaline.

Avantageusement, le vecteur d'expression selon l'invention est adapté à la transformation de cellules, notamment bactériennes ou de plantes. Les procédés de transformation de cellules sont bien connus de l'homme du métier. Pour les bactéries, on peut par exemple citer le procédé décrit par McCormac et al. (1998) Mol. Biotechnol. 9 : 155-159.

Avantageusement, le vecteur d'expression selon l'invention peut comprendre, un ou plusieurs gènes de sélection, tel qu'un gène de résistance à un herbicide (par exemple le glufosinate (Basta®), le glyphosate (Roundup®), l'asulam, ou le bromoxynil), comme le gène barde Streptomyces hygroscopicus (GenBank X17220) qui code une phosphinotricine acétyltransférase et confère la résistance au glufosinate (phosphinotricine) ; et/ou à un antibiotique (par exemple l'hygromycine (Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987-995), la kanamycine, la bléomycine ou la streptomycine). Il peut également comprendre une origine de réplication bactérienne et/ou de plante. Le vecteur d'expression selon l'invention peut notamment être sous forme plasmidique.

Procédé de production de plantes modifiées

Dans un mode de réalisation de l'invention, le procédé de production de plantes modifiées, ou de parties de plantes modifiées, présentant une résistance accrue à des stress environnementaux par rapport aux plantes, ou parties de plantes, non modifiées correspondantes, consistant à augmenter l'expression d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus dans les plantes modifiées, ou parties de plantes modifiées par rapport aux plantes, ou parties de plantes, non modifiées correspondantes, comprend

a) une étape de transformation d'une plante ou d'une partie de plante, telle qu'une cellule, par un acide nucléique tel que défini ci-dessus, une cassette d'expression telle que définie ci-dessus, ou un vecteur tel que défini ci-dessus, et b) une étape de régénération de plantes modifiées, ou de parties de plantes modifiées, à partir des plantes, ou parties de plantes, obtenues à l'étape a).

Les procédés de transformation de cellules de plante sont bien connus de l'homme du métier, on peut par exemple citer le procédé décrit Clough et Bent (1998) Plant J. 16: 735-743. A titre d'autres exemples non limitatifs de méthodes utilisables dans le cas des plantes mentionnées ci-dessus, il est également possible de citer les protocoles décrits par Guis et al. (Scientia Horticulturae 84 : 91-99, 2000) pour le melon, par Hamza et Chupeau (J. Exp. Bot 44 : 1837-1845, 1993) pour la tomate, par Shoemaker et al. (Plant CeII Rep. 3 : 178-181 , 1986), ou Trolinder et Goodin (Plant CeII Rep. 6 : 231-234, 1987) pour le cotonnier, par Van der Mark et al. (J. Genêt Breeding 44 : 263-268, 1990) ou par Marchant et al. (Ann. Bot. 81 : 109- 114, 1998) pour les rosiers. Dans le cas des plantes monocotylédones, on peut citer par exemple les protocoles décrits par Hiei et al. (The Plant Journal 6 : 271-282, 1994) ou Ishida et al. (Nature biotechnology 14 : 745-750, 1996) pour le maïs, ou par Rasco-Gaunt et al. (J. Exp. Bot. 52 : 865-874, 2001) pour le blé.

Les procédés de régénération de plante à partir de cellules transformées sont bien connus de l'homme du métier. L'Exemple 2 fournit une illustration d'un tel procédé.

Description des figures

Figure 1

La Figure 1 représente l'expression relative du gène CYP98A9 (axe des ordonnées) dans les tissus de racine, de tige, de feuille, de bourgeon, de fleur et de silique chez Arabidopsis thaliana.

Figure 2

La Figure 2 représente l'expression relative du gène CYP98A9 (axe des ordonnées)

dans des tissus de plants d'A thaliana sauvages (WT1 , WT2, WT3) et de plants d'A thaliana transgéniques comprenant un vecteur d'expression exprimant CYP98A9 (A à I).

Figure 3

La Figure 3 représente l'expression relative du gène CYP98A9 (axe des ordonnées) dans des tissus de plants d'A thaliana sauvages (WT1 , WT2) 0 h (1 ^ere colonne en partant de la gauche), 24 h (2 ^ème colonne en partant de la gauche), 48 h (3 ^eme colonne en partant de la gauche) et 72 h (4 ^eme colonne en partant de la gauche) après une infection par Pseudomonas syringae avrRpmi.

Figure 4

La Figure 4 représente le phénotype de feuilles représentatives issues de plantes d'A thaliana sauvages (à gauche) et surexprimant CYP98A9 (à droite) 72 heures après l'infection par P. syringae avrRpmi.

Figure 5

La Figure 5 représente le nombre de colonies bactériennes à la surface de feuilles infectées par P. syringae avrRpmi (axe des ordonnées, log cfu (unités formant colonies) / surface du disque de feuille prélevé (cm ² )) immédiatement après infection (colonnes blanches, TO) ou 3 jours après l'infection (colonne hachurée, T3) pour deux plants d'A thaliana sauvages (WT1 , WT2) ou surexprimant CYP98A9 (A, E).

Figure 6A et figure 6B

Les Figures 6A-6B représentent l'expression relative du gène CYP98A9 (axe des ordonnées) dans des tissus de plants d'A thaliana sauvages (WT1 , WT2) 0 h (1 ^ere colonne en partant de la gauche), 24 h (2 ^eme colonne en partant de la gauche), 48 h (3 ^eme colonne en partant de la gauche), 72 h (4 ^ème colonne en partant de la gauche) et 96 h (5 ^eme colonne en partant de la gauche) après une infection par Xanthomonas campestris 147 (XCC 147) (Figure 6A) et Xanthomonas campestris 568 (XCC 168) (Figure 6B).

Figure 7A, Figure 7B, Figure 7C et Figure 7D

Les Figures 7A-7B représentent le phénotype de feuilles représentatives issues de

plantes d'A thaliana sauvages (à gauche) et surexprimant CYP98A9 (à droite) 72 heures après l'infection par X. campestris 147 (XCC147) (Figure 7A) et X. campestris 568 (XCC168) (Figure 7B).

Les Figures 7C et 7D représentent le nombre de colonies bactériennes à la surface de feuilles infectées par X. campestris 147 (XCC147) (Figure 7C) et X. campestris 568 (XCC168) (Figure 7D) (axe des ordonnées, log cfu (unités formant colonies) / surface du disque de feuille prélevé (cm ² )) immédiatement après infection (colonnes blanches, TO) ou 3 jours après l'infection (colonne hachurée, T3) pour deux plants d'A thaliana sauvages (WT1 , WT2) ou surexprimant CYP98A9 (A, E).

Figure 8

La Figure 8 représente l'expression relative du gène CYP98A9 (axe des ordonnées) dans des tissus de plants d'A thaliana sauvages (WT1 , WT2) 0 h (1 ^ere colonne en partant de la gauche), 24 h (2 ^ème colonne en partant de la gauche), 48 h (3 ^ème colonne en partant de la gauche) et 72 h (4 ^eme colonne en partant de la gauche) après une infection par Botrytis cinerea.

Figure 9

La Figure 9 représente le phénotype de feuilles représentatives issues de plantes d'A thaliana sauvages (à gauche) et surexprimant CYP98A9 (à droite) 72 heures après l'infection par B. cinerea.

Figure 10

La Figure 10 représente le diamètre (axe des ordonnées, en mm) de la zone d'infection de feuilles de plantes d'A thaliana sauvages (WT1 , WT2) et surexprimant CYP98A9 (A, E) infectées par B. cinerea.

Figure 11

La Figure 11 représente l'expression relative du gène CYP98A9 (axe des ordonnées) dans des tissus de plants d'A thaliana sauvages (WT1 , WT2) 0 h (1 ^ère colonne en partant de la gauche), 24 h (2 ^ème colonne en partant de la gauche), 48 h (3 ^ème colonne en partant de la gauche), 72 h (4 ^eme colonne en partant de la gauche) et 96 h (5 ^eme colonne en partant de la gauche) après mise en contact avec une solution de Rosé Bengale.

Figure 12

La Figure 12 représente le phénotype de feuilles représentatives issues de plantes sauvages (à gauche) et exprimant un ARNi dirigé contre CYP98A9 (à droite) 72 heures après mise en contact avec une solution de Rosé Bengale.

Figure 13A, Figure 13B, Figure 13C et Figure 13D

Les Figures 13A-13D représentent la quantité de camalexine présente dans des disques foliaires (axes des ordonnées, en μg /surface de disque (cm ² )) de plantes d'A thaliana sauvages (WT1 , WT2) et surexprimant CYP98A9 (A, E) infectées par P. syήngae avrRpmi (Figure 13A), B. cinerea (Figure 13B), ou Alternaria brassicicola (Figure 13C) ou soumises à un stress oxydatif par traitement au Rosé Bengale (Figure 13D).

Figure 14

La Figure 14 représente l'expression relative du gène CYP98A9 (axe des ordonnées) dans des tissus de plants d'A thaliana sauvages (WT1 , WT2) 0 h (1 ^ere colonne en partant de la gauche), 48 h (2 ^ème colonne en partant de la gauche), 72 h (3 ^ème colonne en partant de la gauche) et 96 h (4 ^eme colonne en partant de la gauche) après une exposition des plantes au froid.

Figure 15

La Figure 15 représente l'expression relative du gène CYP98A9 (axe des ordonnées) dans des tissus de plants d'A thaliana sauvages (WT1 , WT2) 0 h (1 ^ère colonne en partant de la gauche), 48 h (2 ^ème colonne en partant de la gauche), et 72 h (3 ^ème colonne en partant de la gauche) après exposition des plantes à un stress hydrique.

Exemples

Exemple 1

Détermination de la localisation de l'expression du gène CYP98A9 chez

Arabidopsis thaliana

La localisation de l'expression du gène CYP98A9 dans différents organes d'A.

thaliana CoI-O (Nottingham Stock Centre) est obtenue par PCR quantitative à partir du produit de rétrotranscription des ARN totaux extraits des feuilles, des tiges, des racines, des bourgeons, des fleurs et des siliques.

Les ARN sont préparés comme suit. Environ 2,5 μg d'ARN de chaque échantillon sont tout d'abord rétro-transcrits en ADNc. L'ARN est mélangé avec 0,5 μg d'amorces oligo(dT), les dNTPs (0,83 mM final), le tout complété à 12 μl avec de l'eau (traitée au DEPC) stérile. Le mélange est incubé à 65°C pendant 5 min, afin de détruire les structures secondaires et de permettre l'hybridation des amorces, puis maintenu dans la glace. On rajoute ensuite, le tampon « first strand buffer » (Invitrogen) du DTT (10 mM final), puis on complète à 19 μl avec de l'eau stérile, avant d'ajouter 1 μl de transcriptase reverse Superscriptll (Invitrogen) 200 u/μl. La réaction est incubée 50 min à 42°C, puis 15 min à 70 ⁰ C pour inactiver l'enzyme. L'ADNc ainsi obtenu est utilisé pour la PCR quantitative réalisée sur un appareil Applied Biosystems GeneAmp 5700 Séquence Détection System. Des couples d'amorces spécifiques des gènes étudiés sont conçus à partir des séquences codantes décrites dans les banques de données, et selon les critères suivants : une taille d'environ 20-30nt, un Tm d'environ 6O ⁰ C et un amplicon d'environ 50-200 nt. Les amorces utilisées sont sélectionnées par le logiciel Primer Express (Applied Biosystems). Pour chaque réaction de PCR quantitative, 5 μl d'une dilution 1/5 de l'ADNc sont mélangés avec 0,3 μM (final) d'amorces, et 13 μl de SYBR Green mix (Sigma). Le volume est complété à 25 μl par de l'eau, et le mélange est maintenu dans la glace. La PCR est initiée en démarrage à chaud (« hot start »), afin d'éviter les amplifications aspécifiques comme les dimères d'amorces, et par une étape à 95°C de 10 minutes permettant la dénaturation, suivie de 40 cycles de 15 secondes à 95°C, 1 minute à 60 ⁰ C. Une première étape de standardisation des échantillons par PCR quantitative sur un gène d'expression constitutive est nécessaire pour ajuster la quantité d'ADNc entre les différents échantillons. Le gène de référence utilisé est celui de l'actine II. Les ADNcs ajustés peuvent ensuite être utilisés en PCR quantitative pour déterminer l'expression des gènes d'intérêt. La quantification pour chaque échantillon est répétée trois fois. Les amorces utilisées ont les séquences suivantes : A9q1 (sens) CACCGTTTGGCTTAAACGTCTT (SEQ ID NO : 3) A9q2 (antisens) CCGAGCCATGTGCTTCAT (SEQ ID NO : 4)

Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 1. Il apparaît que le gène CYP98A9 n'est exprimé de manière significative que dans les bourgeons.

Exemple 2

Préparation de plantes surexprimant le gène CYP98A9

L ¹ ADNc de CYP98A9 (SEQ ID NO : 1) est amplifié à l'aide de I ¹ ADN polymérase HIFI (Boehringer) à partir des amorces suivantes : Attb7 (sens) :

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGATTTATTACTCATATCCTTAAC CACTATCATAATCGCCGCC (SEQ ID NO : 5), et Attbδ (antisens) :

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAAAGGTATAACTCTTGTGGCAGC CTGGACGAAGCTAGAGCCTGC (SEQ ID NO : 6).

L'ADNc de CYP98A9 est ensuite introduit dans un vecteur d'entrée GATEWAY pDNOR201 (Invitrogen). Après sélection d'un clone dépourvu d'erreur d'amplification par séquençage, l'ADNc est transféré dans le vecteur de surexpression GATEWAY pB7WG2 (Karimi et al. (2002) Plant Sci. 7 : 193-195) en aval du promoteur constitutif CaMV 35S pour donner le vecteur d'expression GATEWAY pB7WG2 CYP98A9 (SEQ ID NO : 7) qui contient un gène de résistance à l'herbicide Basta® (AgroEvo) et un gène de résistance à la spectinomycine.

Le vecteur obtenu a ensuite été utilisé pour transformer A. thaliana CoI-O via Agrobacterium tumefaciens et par la technique dite du « floral dip ». Brièvement, une culture d'une nuit à 28°C est réalisée dans du milieu YEB (Van Larebeke et al. (1977) Nature 265 : 561-563) contenant l'antibiotique approprié à partir d'une préculture d'agrobactéries transformées à l'aide du vecteur GATEWAY pB7WG2 CYP98A9 (SEQ ID NO : 7) (Clough & Bent (1998) Plant J. 16: 735-743). Après centrifugation de cette culture, le culot est repris délicatement dans une solution de saccharose 5% de façon à obtenir une DOβfJO d'environ 0,8. Avant le traitement, 0,025% de Silwet L-77 (surfactant) est ajouté à la suspension d'agrobactéries. Les inflorescences des plantes à transformer (TO) sont ensuite immergées pendant 1 min dans la solution contenant les agrobactéries et les plantes sont ensuite placées sous mini-serres pendant 2 jours afin de maintenir une forte humidité. Lorsque les plantes

arrivent à maturité, l'arrosage est arrêté pour qu'elles se dessèchent progressivement jusqu'à la récolte des graines (Clough & Bent (1998) Plant J. 16: 735-743). Les graines sont alors récoltées et semées dans des barquettes (25x50 cm), à une densité de 1500 plantes par barquette. Les plantes obtenues (T1) sont aspergées avec 250 mg/L de Basta (AgroEvo) 5 jours, 2 semaines, 3 semaines après germination. Les plantes transgéniques résistantes à l'herbicide sont transférées dans des pots individuels. Pour une sélection in vitro, les graines des plantes T1 sont récoltées et semées sur le milieu MS supplémenté avec 0,8% de Pastagar, 1% de saccharose, 10 μg/ml de phosphinotricine, et 500 μg/ml de carbénicilline.

L'expression du gène CYP98A9 dans les plants transgéniques sélectionnés a été mesurée par PCR quantitative comme dans l'Exemple 1. Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 2. Ils montrent que la surexpression conduit à une augmentation relative des quantités de transcrits détectés chez les transformants qui varie entre 3 et 7 fois l'expression détectée chez le sauvage. L'expression la plus élevée est détectée dans les lignées A et E qui ont été utilisées par la suite.

Exemple 3

Résistance des plantes surexprimant le gène CYP98A9 aux infections bactériennes

Des feuilles d'A. thaliana CoI-O sauvages ou surexprimant le gène CYP98A9 (voir Exemple 2) âgées de 6 semaines ont été infiltrées dans l'espace intercellulaire (de chaque coté de nervure centrale) par une solution de Pseudomonas syringae avrRpmi ou Pseudomonas syringae vira 10? cfu (unités formant colonie)/ml. Les ARN totaux ont été extraits à partir des feuilles infectées Oh, 24h, 48h, 72h et 96h après l'infiltration puis rétrotranscrits (voir Exemple 1). L'expression relative de CYP98A9 a ensuite été quantifiée par PCR quantitative (voir Exemple 1). Les résultats obtenus pour deux plantes sauvages distinctes infectées par P. syringae avrRpmisont présentés dans la Figure 3. La valeur représente la moyenne de trois expériences répliquées (8 plants/replicats ; 3 feuilles/plantes). On observe que l'expression de CYP98A9 augmente en réponse à l'infection. Des résultats similaires ont été obtenus avec P. syringae vir.

La Figure 4 présente le phénotype de feuilles représentatives issues de plantes sauvages et surexprimant CYP98A9 72 heures après l'infection par P. syringae avrRpmi. Les plantes surexprimant CYP98A9 sont visiblement protégées de l'infection par rapport aux plantes sauvages. Des résultats similaires ont été obtenus avec P. syringae vir.

En outre, un comptage bactérien a été effectué sur les feuilles infectées, immédiatement (TO) et 3 jours (T3) après l'inoculation. Les résultats sont présentés dans la Figure 5. La valeur représente la moyenne de trois expériences répliquées (8 plants/replicats ; 3 feuilles/plantes) ± l'erreur standard sur la moyenne de trois réplicats. On compte significativement moins de colonies bactériennes pour les plantes surexprimant CYP98A9 que pour les plantes sauvages.

Des expériences similaires d'infection ont été réalisées avec des solutions à 10 ^* 7 cfu/ml de Xanthomonas campestris 147 (XCC147) et Xanthomonas campestris 568 (XCC 168).

Les résultats présentés dans les Figures 6A et 6B indiquent que l'expression de CYP98A9 augmente en réponse à l'infection. Par ailleurs, on observe également dans les Figures 7A-7D que les plantes surexprimant CYP98A9 sont visiblement protégées de l'infection par rapport aux plantes sauvages.

Exemple 4

Résistance des plantes surexprimant le gène CYP98A9 aux infections fongiques

Une goutte de 5 μl de spores de Botrytis cinerea ou d'Alternaria brassicicola à 5

1fj6 spores/ml a été déposée sur des feuilles d'A. thaliana CoI-O sauvages ou surexprimant CYP98A9 (voir Exemple 2) âgées de 6 semaines. Les ARN totaux ont été extraits à partir des feuilles infectées Oh, 24h, 48h, 72h et 96h après l'infiltration et rétrotranscrits (voir Exemple 1). L'expression relative de CYP98A9 a ensuite été quantifiée par PCR quantitative (voir Exemple 1). Les résultats obtenus pour deux plantes sauvages distinctes infectées par β. cinerea sont présentés dans la Figure 8. La valeur représente la moyenne de trois expériences répliquées (8 plants/réplicats ; 3 feuilles/plantes) ± l'erreur standard sur

la moyenne des trois réplicats. Des résultats similaires ont été obtenus avec A brassicicola.

La Figure 9 présente le phénotype de feuilles représentatives issues de plantes sauvages et surexprimant CYP98A9 72 heures après la mise en présence des feuilles et de B. cinerea. Les plantes surexprimant CYP98A9 sont visiblement protégées de l'infection par rapport aux plantes sauvages. En outre, le diamètre de l'infection est significativement inférieur pour les plantes surexprimant CYP98A9 par rapport aux plantes sauvages (Figure 10).

Exemple 5

Résistance au stress oxydatif liée au gène CYP98A9

Des feuilles d'A. thaliana CoI-O sauvages ou exprimant un ARNi CYP98A9 âgées de

6 semaines ont été traitées au Rosé Bengale (2OmM), un colorant oxydant, par dépôt de 5 μl de la solution de Rosé Bengale.

Les plantes exprimant l'ARNi CYP98A9 ont été préparées comme suit. Un fragment de séquence spécifique de 105 paires de bases de l'ADNc de CYP98A9 (SEQ ID

NO : 8) amplifié à l'aide de l'ADN polymérase HIFI (Boehringer), a été introduit dans un vecteur d'entrée GATEWAY pDNOR201 (Invitrogen) à partir des amorces AttbiO et AttbH .

Attb11 (sens) :

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTTCGTCATGGTTCACTAGC (SEQ

ID NO : 9)

AttbiO (antisens)

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGG TGATCTCTTCCTCCATATA (SEQ ID

NO : 10)

Après sélection d'un clone dépourvu d'erreur d'amplification par séquençage, le fragment a été transféré en orientation inversée répétée dans le vecteur d'ARN interférence GATEWAY pB7WIWG2(ll) (Karimi et al., 2002) pour donner le vecteur d'ARN interférence GATEWAY pB7WIWG2(ll) CYP98A9 (SEQ ID NO :11). Ce vecteur a été introduit dans A. thaliana CoI-O et les transformants ont été sélectionnés comme décrit précédemment.

Les ARN totaux ont été extraits à partir des feuilles infectées Oh, 24h, 48h, 72h et

96h après le traitement puis rétrotranscrits (voir Exemple 1). L'expression relative de

CYP98A9 a ensuite été quantifiée par PCR quantitative. Les résultats obtenus pour deux plantes sauvages distinctes sont présentés dans la Figure 11. La valeur représente la moyenne des trois expériences répliquées (8 plants/replicats ; 3 feuilles/plantes). On observe que le Rosé Bengale induit une augmentation de l'expression de CYP98A9.

La Figure 12 présente le phénotype de feuilles représentatives issues de plantes sauvages et exprimant l'ARNi CYP98A9 72 heures après la mise en présence des feuilles et du Rosé Bengale. Les plantes sauvages résistent visiblement mieux au stress oxydant induit par le Rosé Bengale que les plantes n'exprimant pas le gène CYP98A9 (Le. les plantes exprimant l'ARNi CYP98A9).

Exemple 6

Induction de la synthèse de camalexine

Des plantes sauvages ou surexprimant CYP98A9 ont été infectées par P. syringae avrRpmi, B. cinerea ou A. brassicicola (voir Exemples 3 et 4) ou soumises à un stress oxydatif par traitement au Rosé Bengale (voir Exemple 5). Un dosage de la camalexine, un dérivé indolique impliqué dans la défense contre les pathogènes, a été réalisé par fluorimétrie 48h après l'infection. Brièvement, les disques foliaires sont prélevés sur les plantes infectées (3 réplicats, 6 plantes/réplicat, 6 disques/plante) et chauffés à 80-90 ⁰ C pendant 20 min dans 1 ml de méthanol 80%. Le solvant est évaporé et le résidu repris dans le chloroforme (v/v), puis le chloroforme est évaporé à son tour. Le résidu est repris dans 60 μl de chloroforme et puis les échantillons sont déposés sur un gel de silice (DC Platten Kieselgel 60 F254, Merck) La migration des échantillons s'effectue dans un solvant hexane : acétate d'éthyle (1 : 9) pendant 1h30 à 2h. La bande correspondant à la camalexine (bleue) est visualisée sous UV à 366 nm (rf entre 0,78-0,81). La bande bleue est grattée et éluée dans 3 ml de méthanol 100%. Le mélange est bien vortexé et filtré. La fluorescence de la camalexine est mesurée par la fluorimétrie et sa concentration déterminée par rapport à une courbe de standard obtenue avec la camalexine de référence.

Les résultats obtenus sont présentés dans les Figures 13A-13D. La valeur représente la moyenne des trois expériences répliquées (8 plants/replicats ; 3

feuilles/plantes) ± l'erreur standard sur la moyenne de trois réplicats. En réponse au divers stress auxquels elles ont été soumises, les plantes surexprimant CYP98A9 présentent une production significativement plus élevée de camalexine que les plantes sauvages.

Exemple 7

Induction de la synthèse de CYP98A9 par le froid

Des plantes A thaliana CoI-O sauvages ont été soumises à un traitement par le froid (plantes de 6 semaines placées en chambre de croissance à 4°C).

Les ARN totaux ont été extraits à partir des feuilles Oh, 48h, 72h et 96h après l'installation des plantes en chambre de croissance à 4 ⁰ C. L'expression relative de CYP98A9 a ensuite été quantifiée par PCR quantitative. Les résultats obtenus pour deux plantes sauvages distinctes sont présentés dans la Figure 14. La valeur représente la moyenne des trois expériences répliquées (8 plantes/ réplicat ; 3 feuilles/ plante). On observe que le traitement par le froid provoque une augmentation de l'expression de CYP98A9.

Par ailleurs, des plants d'A. thaliana CoI-O sauvages ou surexprimant le gène CYP98A9 (voir Exemple 2) sont soumis au stress thermique ci-dessus. On observe que les plants surexprimant le gène CYP98A9 résistent mieux au stress que les plants sauvages.

Exemple 8

Induction de la synthèse de CYP98A9 par le stress hydrique

Des plantes A. thaliana CoI-O sauvages ont été soumises à un stress hydrique (arrêt de l'arrosage).

Les ARN totaux ont été extraits à partir des feuilles Oh, 48h et 72h après l'arrêt de l'arrosage. L'expression relative de CYP98A9 a ensuite été quantifiée par PCR quantitative. Les résultats obtenus pour deux plantes sauvages distinctes sont présentés dans la Figure 15. La valeur représente la moyenne des trois expériences

répliquées (8 plantes/ réplicat ; 3 feuilles/ plante). On observe que le stress hydrique provoque une augmentation de l'expression de CYP98A9.

Par ailleurs, des plants d'A. thaliana CoI-O sauvages ou surexprimant le gène CYP98A9 (voir Exemple 2) sont soumis au stress hydrique ci-dessus. On observe que les plants surexprimant le gène CYP98A9 résistent mieux au stress que les plants sauvages.