Plasmafiltration

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Aufbereitung von Blutplasma vor der Bestimmung eines oder mehrerer Blutparameter, wie z.B. Gerinnungsparameter und Thrombinparameter, die Erfindung bezieht sich auch auf eine Vorrichtung, mit der das Verfahren durchgeführt werden kann.

Die nicht gattungsgemäße EP 1 733 748 Al beschreibt ein Verfahren, bei dem Blutplasma von Lipiden befreit wird. Das lipidfreie Blutplasma wird dann dem Blut wieder zugeführt. Eine Bestimmung von Blutparametern ist nicht vorgesehen.

Die ebenfalls nicht gattungsgemäße EP 0 578 086 A1 offenbart ein Verfahren, bei dem ein angelegter Unterdrück lediglich dazu dient, das Blutplasma als ganzes anzusaugen bzw. zu transportieren. Eine Filterung ist dabei nicht vorgesehen.

Zur Durchführung verschiedener Analysen wird zunächst aus dem Blut eines Patienten Plasma gewonnen. Dies erfolgt in den meisten Fällen durch Zentrifugation. Das dabei erhaltene Plasma bildet im Stand der Technik die Grundlage für verschiedene Labortests. Der Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass im Blut vorhandene Mikropartikeln durch die Zentrifugation nicht selektiert werden, sondern im Plasma verbleiben. Es hat sich nun herausgestellt, dass diese Mikropartikeln die Messwerte bei der Bestimmung von diversen Blutparametern verfälschen.

Es besteht somit der Bedarf an einer Lösung dieses Problems, eine zuverlässige und reproduzierbare Bestimmung von Blutwerten zu erlangen, die von den Mikropartikeln nicht verfälscht sind.

Dieses Ziel wird mit einem Verfahren der eingangs genannten Art dadurch erreicht, dass das aus dem Blut erhaltene Plasma filtriert wird, bevor es auf einen bestimmten Parameter hin analysiert wird.

Dieses Ziel wird durch eine Vorrichtung der eingangs genannten Art dadurch erreicht, dass ein Filter vorgesehen ist, durch den das Plasma in einen Auffangbehälter gelangt, und einer

Vakuumpumpe, die ausgelegt ist, auf der einen Seite des Filters einen Unterdruck zu erzeugen.

Bevorzugte Ausfuhrungsformen beinhalten, dass das Filter für Mikropartikel im wesentlichen undurchlässig ist, ddas Filter eine Durchlassgrenze zwischen 0,05 und 1,5 μm (Mikrometer), vorzugsweise zwischen 0,1 bis 1,2 μm (Mikrometer) aufweist, dass der Unterdruck -50 mbar bis -1000 mbar, vorzugsweise -300 mbar bis -600 mbar beträgt, dass das Beaufschlagen des Filters mit Unterdruck zwischen 30 Sekunden und 30 Minuten dauert.

Die Vorrichtung zur Aufbereitung von Blutplasma für die Bestimmung eines oder mehrerer Blutparameter, insbesondere Gerinnungsparameter, ist dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung einen Filter, einen hinter dem Filter angeordneten Auffangbehälter und eine Vakuumpumpe aufweist, wobei die Vakuumpumpe mit dem Raum hinter dem Filter verbunden ist.

Bevorzugte Ausführungsformen beinhalten, dass das Filter eine Durchlassgrenze zwischen 0,05 und 1,5 μm (Mikrometer), vorzugsweise zwischen 0,1 bis 1,2 μm (Mikrometer) aufweist, dass der Auffangbehälter eine Mikrotitierplatte ist, dass der Auffangbehälter Eppendorf Tubes sind, dass der Filter, der Auffangbehälter und die Vakuumpumpe in einer gemeinsamen Einheit integriert sind, dass unterhalb des Filters ein Kühlelement, vorzugsweise ein Peltierelement, zur Kühlung des Filtervorganges vorgesehen ist.

Die Erfindung wird anhand der Zeichnung näher erläutert. Dabei zeigt die Fig. 1 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, die Fig. 2 eine erfindungsgemäße Vorrichtung im Detail.

Die Gewinnung von Plasma aus antikoaguliertem (Citrat 0,01 ImM) Vollblut erfolgt üblicherweise durch Zentrifugation nach DIN 58905 (15 min, bei mindestens 2500g). Das hierbei erhaltene Plasma wird als thrombozytenarmes Plasma (PPP) beschrieben und zur Durchführung von verschiedenen Labortests, insbesondere von Gerinnungsanalysen verwendet. In diesem PPP sind jedoch unterschiedliche Mengen an Mikropartikeln (membranöse Vesikel aus Zellen, 0.1 bis lμm groß, in einer Anzahl von -4.000 bis

~60.000/μl) enthalten, die verschiedene Gerinnungsteste beeinflussen, insbesondere die Thrombingenerierung. Es ist somit wünschenswert, für solche Laboranalysen mikropartikelfreies Plasma zu verwenden.

Mikropartikel können aus dem Plasma zwar durch Ultrazentrifugation des Plasmas (100.000 x g für 60 min ¹ ) entfernt werden. Diese Prozedur ist jedoch zeitaufwendig und auch dadurch beeinträchtigt, dass nicht sichergestellt werden kann, dass beim Aufnehmen des mikropartikelfreien Plasmas unterschiedliche Mengen an Mikropartikel mit aufgenommen werden. Weiters sind Mikropartikel beschrieben, welche dieselbe Dichte wie Plasma haben und daher durch Zentrifugation nicht getrennt werden können ² .

Für die Trennung von Plasma und Mikropartikeln allenfalls einsetzbare Filtrationseinheiten über welche eine größere Anzahl von Proben über Filterplatten in dazupassende Auffangplatten filtriert werden können sind zwar beschrieben, doch werden hierzu diese Filtrationseinheiten an die in Labors üblichen Membranvakuumpumpen angeschlossen. Für die dazu nötigen Schlauchleitungen, Sicherheitsflaschen, die Pumpe selbst und Absperrhähnen wird relativ viel Platz gebraucht. Die für die Filtration verwendeten Parameter sind nicht standardisiert und bleiben dem Anwender überlassen.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist es eine einfache Apparatur zu gestalten, die die rasche und standardisierte Trennung von Plasma und Mikropartikel gestattet.

In dem der Erfindung zugrunde liegenden Vorrichtung (Fig. 1) wird eine Filtrationseinheit bestehend aus einem Membranfilter, welches luftdicht auf einem Auffanggefäß aufliegt, so mit einer Vakuumpumpe verbunden, dass in dem Auffanggefäß ein Unterdruck entsteht, mit dessen Hilfe das Plasma durch den Membranfilter gesaugt wird und das Filtrat in dem Auffanggefäß erhalten wird. Die Dauer der Filtration wird durch eine mit der Vakuumpumpe verbundene Steuereinheit festgelegt und der Filtrationsdruck durch ein die Einstellung eines Ventils. Zur Kontrolle des Filtrationsdruckes ist in dem System ein Druckmesser eingebaut. Dadurch entsteht eine kompakte Bauweise, welche nur wenig Platz benötigt und durch die Festlegung von Zeit und Druck eine Standardisierung der Filtration ermöglicht. Die Vakuumpumpe ist unempfindlich gegenüber Flüssigkeiten und kann gegebenenfalls zusammen mit dem Schlauchsystem bei Bedarf mit einer

Waschlösung gereinigt werden. Der Filteraufsatz und die Auffangplatte für die Proben können bei Bedarf über ein Pelltierelement im Boden des Filteraufsatzes gekühlt werden.

Die Filtrationseinheit besteht aus einem Gehäuse mit seitlichen Abdeckungen, auf dem handelsübliche Filteraufsätze, z.B. von der Firma PaIl, montiert werden können. Zur Stromversorgung der Pumpe und der übrigen Bauteile dient ein Netzgerät.

Das Gehäuse enthält folgende Bauelemente: Einen Schalter zum Starten des Filtrationsvorganges und eine Buchse zur Stromversorgung, eine Vakuumpumpe, die den Unterdruck für die Filtration erzeugt, Vakuumschläuche vom Filteraufsatz zur Pumpe und von der Pumpe zur Auslassöffhung, ein elektronisches Bauelement zur Steuerung der Vakuumpumpe. In einer bevorzugten Ausführung ist ein Pelltierelement zur Kühlung des Filteraufsatzes vorgesehen, das mit einem elektronischen Bauelement zu seiner Steuerung dient. Weiters kann ein Axiallüfter zur Kühlung des Kühlkörpers in die Gehäusewand eingebaut sein, sowie ein elektronisches Bauelement zur Steuerung des Axiallüfters.

Ablaufbeschreibung einer Filtration:

Der Filteraufsatz wird mit Auffangplatte und Filterplatte bestückt. Die Proben werden in die Filterplatte pipettiert, der Startknopf wird gedrückt und die Filtration startet automatisch. Nach Ende der Filtration wird der Druckausgleichsknopf betätigt, der Filterplattenhalter kann abgehoben und die Auffangplatte mit den Proben entnommen werden.

Sollte es zu einer Verschmutzung des Filteraufsatzes, der Schläuche oder der Pumpe kommen, kann die Verschmutzung bei laufender Pumpe mit einer Waschlösung aus dem Filteraufsatz zur Auslassöffnung abgesaugt werden.

Die Fig. 1 zeigt in schematischer Weise eine erfindungsgemäße Plasmafiltriervorrichtung, deren Elemente in einer gemeinsamen Einheit integriert sind. Im oberen Teil des Gehäuses 9 befinden sich die Filtrationseinheit bestehend aus einem Oberteil 25 und einem Unterteil 26. Ein Peltierelement 15 unter der Filtrationseinheit sorgt in Zusammenwirken mit einem Kühlelement 23, z.B. leitfahiges Metall, für eine entsprechende Temperatur des Plasmas.

Mit einem Startknopf 27 an der Außenseite des Gehäuses 9 kann das Filtrieren einfach gestartet werden. Der untere Teil der erfindungsgemäßen Vorrichtung enthält die Vakuumpumpe 11 und einen Ventilator 13 zur Kühlung des Kühlelementes 23 und aller anderer elektrisch angetriebener Bauteile. Dafür ist auch ein entsprechendes Leitblech 24 vorgesehen.

Die Fig. 2 zeigt etwas detaillierter, in einem gemeinsamen Gehäuse integriert eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Filterung von Blutplasma mit einem Filter, einem unterhalb des Filters angeordneten Auffangbehälters, einem Distanzblock und einer öffnung, über die der Bereich unterhalb des Filters mit Vakuum beaufschlagt werden kann.

Im unteren Teil der Einheit ist eine Vakuumpumpe untergebracht, die mit einer Steuerung verbunden ist. Lm oberen Bereich des unteren Teils der Einheit befindet sich ein Kühlelement, vorzugsweise ein Peltierelement, das mit Kühlrippen thermisch verbunden ist und zur Einstellung einer bestimmten Temperatur für das zu filternde Plasma mit der Steuerung verbunden ist. Ein Lufteinlass auf der linken Seite mit einem Ventilator sorgt dafür, dass die vom Peltierelement erzeugte Wärme weggeblasen werden kann. über ein Interface, beispielsweise eine Tastatur können die Parameter für das Verfahren eingestellt werden.

Die Fig. 2 zeigt in einem gemeinsamen Gehäuse, z.B. einem Alugehäuse 9, integriert eine erfindungsgemäße Vorrichtung 1 zur Filterung von Blutplasma im Detail. Obenauf ist eine Multiwell-Filterplatte 2 vorgesehen, die mit einer umlaufenden Dichtung 18 am Gehäuse 9 angebracht ist. An der Unterseite der Multiwell-Filterplatte 2 befindet sich das Filter 3. Unterhalb des Filters ist ein Auffangbehälter 4 angeordnet, gefolgt von einem Distanzblock 8 und einer öffnung, über die der Bereich unterhalb des Filters mit Vakuum beaufschlagt werden kann. Dazu wird ein mit einem Absperrhahn 6 versehener Vakuumschlauch 7 verwendet, der die Ansaugöffnung 11 a der Vakuumpumpe 1 1 mit dem Raum unter dem Filter verbindet. Der Auslass I Ib der Vakuumpumpe 11 ist mit dem Luftauslass 19 der Vorrichtung 1 verbunden. Zwischen Ober- und Unterteil des Filteraufsatzes ist eine Dichtung 5 vorgesehen.

Eine Steuerung 10 umfasst einen Temperaturschalter 10a für einen Axiallüfter, einen Temperaturschalter 10b für ein Peltierelement und einen Langzeit-Timer 10c. Eine Stromversorgung 20, z.B. mit 12V Gleichspannung, versorgt die Steuerung 10 und den Axiallüfter 13 mit Strom. Der Axiallüfter saugt über einen Lufteinlass 12 Luft an und versorgt so die Vorrichtung mit Kühlluft 21. Ein Interface 14 zur Steuerung der Vorrichtung 1 ist an der Außenseite des Gehäuses 9 vorgesehen.

Unterhalb des Filteraufsatzes ist ein Peltierelement 15 vorgesehen, das an seiner Unterseite Kühlrippen 22 aufweist, die von der Kühlluft 21 gekühlt werden. Ein Temperatursensor 16 ist mit den Kühlrippen thermisch verbunden. Ein weiterer Temperatursensor 17 misst die Temperatur im Bereich oberhalb des Peltierelements. Das Peltierelement und die Temperatursensoren 16, 17 sind mit der Steuerung 10 verbunden, wodurch die übertragung von Ansteuerimpulsen und die Stromversorgung gewährleistet werden.

Im unteren Teil der Einheit ist eine Vakuumpumpe untergebracht, die mit einer Steuerung verbunden ist. Im oberen Bereich des unteren Teils der Einheit befindet sich ein Kühlelement, vorzugsweise ein Peltierelement, das mit Kühlrippen thermisch verbunden ist und zur Einstellung einer bestimmten Temperatur für das zu filternde Plasma mit der Steuerung verbunden ist. Ein Lufteinlass auf der linken Seite mit einem Ventilator sorgt dafür, dass die vom Peltierelement erzeugte Wärme weggeblasen werden kann. über ein Interface, beispielsweise eine Tastatur können die Parameter für das Verfahren eingestellt werden.

Bezugszeichen der Fig. 1 und 2:

Vorrichtung 1,

Multiwell-Filterplatte 2,

Filter 3,

Auffangbehälter 4, Dichtung zwischen Ober- und Unterteil 5,

Absperrhahn 6,

Vakuumschlauch 7,

Distanzblock 8,

Gehäuse, z.B. Alugehäuse 9,

Steuerung 10,

Temperaturschalter für einen Axiallüfter 10a,

Temperaturschalter für ein Peltierelement 10b, Langzeit-Timer 1 Oc,

Vakuumpumpe 11 ,

Lufteinlass 12,

Lüfter 13,

Interface 14 Kühlelement, z.B. Peltierelement 15,

Temperatursensor 16,

Temperatursensor 17,

Dichtung für Filterplatte 18,

Luftauslass 19, Stromversorgung 20,

Kühlluft 21,

Kühlrippen für das Peltierelement 22,

Kühlelement 23,

Leitblech 24, Oberteil der Filtrationseinheit 25,

Unterteil der Filtrationseinheit 26,

Luftauslass für Kühlluft 27.

Beispiele: Wenn verschiedene normale Plasmen unter Zuhilfenahme des beschriebenen Gerätes von Mikropartikel getrennt werden, können typischerweise folgende Ergebnisse erhalten werden:

Einsatz von Mikropartikel freiem Plasma für Gerinnungsanalysen:

Die folgende Tabelle zeigt verschiedene Parameter, wobei unter PPP die Ergebnisse aufgelistet sind, die sich auf das thrombozytenarme Plasma nach der Zentrifigation beziehen, und unter MPFP (micro particle filtered plasma) jene, die am gefilterten Plasma vorgenommen wurden:

Aus diesen Daten ergibt sich, dass die Messung der Parameter, insbesondere einzelne Gerinnungsparamter wie aPTT, Thrombingenerierung (TGA) und Lupus-Teste durch das Vorhandensein von Mikropartikel stark beeinflusst werden. Die Abweichungen zeigen, dass durch die Erfindung zuverlässigere Ergebnisse erreicht werden können, die nicht mehr vom Gehalt des Blutes bzw. Plasmas an Mikropartikeln abhängen.

Mikropartikelfreies Plasma hergestellt mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung eignet sich ganz allgemein zum Einsatz in der Labordiagnostik, insbesondere in der Gerinnungsdiagnostik und zum Einsatz für die Bestimmung der Thrombingenerierung.

Referenzliste:

(1) Jy W, Horstman LL, Jimenez JJ et al. Measuring circulating cell-derived microparticles. J Thromb Haemost. 2004;2:1842-1843.

(2) Horstman LL, Jy W, Jimenez JJ, Bidot C, Ahn YS. New horizons in the analysis of circulating cell-derived microparticles. Keio J Med. 2004;53 :210-230.

Der Inhalt beider oben genannten Veröffentlichungen wird durch Bezugnahme vollständig in die vorliegende Beschreibung aufgenommen.