Beschreibung

Die Erfindung betrifft einen Blutersatz auf der Basis von bioverträglichen Polymeren und Hämoglobin.

Sauerstofftransportierende Präparate mit und ohne Plasma¬ expanderwirkung sind bereits als Blutersatz bekannt. Läßt man die Fluorkarbone wegen ihres vollsynthetischen

Charakters außer ac.ht, so gibt es noch eine Reihe halb¬ synthetischer und natürlicher Produkte.

Das von der Herstellung einfachste Präparat ist die stroma- freie Hämoglobinlösung. Da diese weder Membranstrukturen noch Antigendeter inaten enthält, entfallen sowohl die Probleme der Typisierung als auch der Sensibilisiarung. Der wesentliche Nachteil der stro afreien Hämoglobin¬ lösung liegt in der zu kurzen intravasalen Halbwertzeit, die für ein Blut- bzw. Plasmaersatzmittel sechs bis zwölf Stunden betragen sollte. Di-e mittlere zirkuiatorische Halbwertzeit liegt für Chargen 6 %iger stromafreier Hämo¬ globinlösungen bei 100 bis 140 Minuten. 240 Minuten nach Austausch von 2 ml/kg Vollblut sind nur noch ca. 20 % stromafreier Hämoglobinlösung im Blutkreislauf nachweis¬ bar. Ein weiterer Nachteil der stromafreien Hämoglobin¬ lösung ist die in vitro deutlich nach links verschobene Sauerstoff-Bindungskurve gegenüber der Sauerstoff¬ dissoziationskurve des Normalblutes. Das bedeutet, daß die Sauerstoff-Affinität des Hämoglobins wesentlich er¬ höht ist und dadurch der Sauerstoff im Gewebe zu schwer wieder abgegeben wird. Als Blutersatzmittel kann die stromafreie Hämoglobinlösung nur akzeptiert werden, wenn es gelingt, einerseits die intravasale Verweildauer zu erhöhen und andererseits die Abgabe des Sauerstoffs von

dem sauerstoffbeladenen Hämoglobintetramer zu erleichtern.

Methoden zur Lösung des Problems der zu kurzen intraver- salen Verweildauer der stromafreien Hämoglobinlösungen sind bekannt. Man kann z. B. das Hämoglobintetramer ein¬ fach oder mehrfach über kovalente chemische Bindungen ent¬ weder an einen polymeren löslichen Träger binden oder über kürzere Kopplungsstücke mit weiteren Hämoglobintetrameren zu größeren Einheiten polymerisieren. Durch dieses Vorgehen erhält man Einheiten, die meist mehrere Hamoglobintetramere enthalten und so groß sind, daß sie nicht mehr ohne voran¬ gegangenen chemisch-physiologischen Abbau durch die Niere ausgeschieden werden können. Abgesehen von den unterschied¬ lichen Resten, die zur kovalenten Bindung nötig sind oder als polymere Träger fungieren, wird das Hämoglobintetramer immer an mindestens einer reaktiven Stelle durch die kova¬ lente Bindung verändert. Da die zugänglichen reaktiven Gruppen im Hämoglobin jedoch auch für deren typische bio¬ logische Eigenschaften wie Sauerstoff- und Kohlendioxid- transport verantwortlich sind, erfolgt mit einer kova¬ lenten Bindung zu diesen Gruppen zwangsweise auch eine andere biologische Funktion des Hämoglobins. Es könnten zwar Präparate hergestellt werden, deren intravasale Halbwertzeit den ausreichenden Wert von zwölf Stunden besitzen, jedoch erfolgt meist gleichzeitig eine Erhöhung der Sauerstoffaffinität. Auf der anderen Seite kann man eine stromafreie Hämoglobinlösung durch Kopplung von Pyridoxalphosphat an die endständigen Aminogruppen mit einer auf Dauer erniedrigten Sauerstoffäffinität her- stellen. Zur Verbesserung der intravasalen Halbwert¬ zeit gibt es Produkte, bei denen durch Bindungseinheiten mehrere Hämoglobinmoleküle chemisch kovalent miteinander verbunden werden. Durch diesen Vorgang der kovalenten Verknüpfungen sind diese Produkte vom Prinzip her mit den polymergebundenen Produkten vergleichbar.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Hämoglobin-

präparat mit erhöhter intravasaler Verweildauer und er¬ niedrigter Sauerstoffäffinität zu entwickeln.

Diese Aufgabe ist erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das Hämoglobin mit einem wasserlöslichen Polymeren über Phos¬ phat-, Sulfat-, und/oder Sulfonat-Gruppen absorptiv ge¬ bunden ist. Unteransprüche 2 bis 4 betreffen vorteilhafte Ausbildungen des erfindungsgemäßen Blutersatzes.

Das erfindungsgemäße Mittel wird dadurch hergestellt, daß ein wasserlösliches Polymer durch Einführung von freien OH-, NH-, SH- und/oder COOH-Gruppen aktiviert und an¬ schließend mit einer Verbindung, die die Fähigkeit be¬ sitzt Hämoglobin absorptiv zu binden, und Phosphat-, Sulfat- und/oder Sulfonat-Gruppen enthält, umgesetzt wird und daß das entstehende Produkt anschließend mit Hämoglobin zusammengebracht wird. Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den Unteransprüchen 6 bis 10 beschrieben.

Erfindungsgemäß werden Affinoren, die eine hohe Affinität zu Hämoglobin aufweisen und gleichzeitig die Sauerstoff¬ dissoziationskurven nach rechts verschieben, kovalent an verschiedene Polymere, die als .Trägerverbindung fun¬ gieren, gebunden. Dadurch wird erreicht, daß das Polymer- molekül über die Affinorkomponente fest an Hämoglobin adsorbiert wird und somit die Ausscheidung des Hämo¬ globins über die Niere durch das höhere Molekulargewicht erschwert wird. Gleichzeitig wird die Sauerstoffäffinität des adsorptiv gebundenen Hämoglobins gegenüber dem stroma- freien Hämoglobin erniedrigt.

Erfindungsgemäß kann als Polymer jedes bekannte Plasma¬ ersatzmittel verwendet werden. Vorzugsweise werden jedoch Polysacharide, insbesondere Dextran, eingesetzt.

Als Affinoren sind insbesondere Phosphorsäure bzw. Derivate 8-Hydroxy-1 ,3,6-pyren-trisulfonat, Pyridoxalphosphat,

N-(2 , 4-Diphosphobenzyl ) -1 -amino-5-naphthalinsulfonsäure, 2 ,3-Disphosphoglycerat, Adenosintriphoshat, Inositoltetra- phosphat, Inositolpentaphosphat, Inositolhexasulfat und vorzugsweise Inositolhexaphosphat geeignet. Einerseits bewirkt Inositolhexaphosphat in der Reihe 2,3-Diphosphoglycerat/ Adenosin riphosphat/Inositoltetraphosphat/Inositolpenta- phosphat/Inositolhexasulfat/Inositolhexaphosphat, die größte Abnahme der Sauerstoffäffinität des Hämoglobins. Andererseits besitzt der Komplex Hämoglobin/Inositolhexaphosphat in der Reihe: 2 ,3-Diphosphoglycerat/Inositolpentaphosphat/

Inositolhexasulfat/Inositolhexaphosphat die kleinste Disso¬ ziationskonstante. Abgesehen von diesen Eignungsfaktoren kommt Inositolhexaphosphat im menschlichen Organismus natür¬ lich vor. Prinzipiell gibt es Verbindungen, die eine noch größere Affinität zum Hämoglobin und eine noch kleinere

Dissoziationskonstante des entsprechenden Komplexes besitzen als Inositolhexaphosphat. Das sind vor allem analog aufgebaute Substanzen, die mehr als sechs Phosphorsäura-oder Sulfat¬ reste besitzen.

Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Blutersatzes wird das wasserlösliche Polymer aktiviert. Am Beispiel von Dextran läßt sich dies synthetisch am einfachsten und mit den besten ümsetzungsgraden durch katalytische Reaktion mit Epichlorhydrin durchführen. Als Katalysator wird z.B. Zinktetrafluoroborat verwendet. Auf diese Weise entsteht zunächst die nicht reaktive Verbindung (I), die während der Herstellung nicht schon zu Vernetzungen führt. Im alkalischen Medium wandelt sich diese Verbindung (I) in die sehr reaktive Epoxidvariante (II) um:

OH Dex-0-CH ₂ -CH-CH ₂ Cl (I)

0

/ \

Dex-0-CH ₂ -CH-CH ₂ (II)

Die Kopplung des Hämoglobin-Affinors, Inositolhexa- phosphats (IHP), an lösliches Dextran kann dann z.B. ent¬ sprechend folgender Reaktion erfolgen:

OH NaOH I Dex-0-CH ₂ -CH-CH ₂ Cl ~ Dex-0-CH ₂ -C AH-CH ₂

(I) (II)

(II)+IHP-'

(III)

wobei R einen Inositolring mit restlichen fünf Phosphor¬ säuregruppen darstellt.

Ebenso läßt sich ein erfindungsgemäßes Produkt ausgehend von 3-Amino-2-hydroxypropyl-dextran (IV) herstellen, das durch Reaktion des 3-Chlor-2-hydroxypropyi-dextran (I) oder der Epoxyd ariante (II) im wäßrigen Medium mit Ammoniak erhalten werden kann. In diesem Fall muß die unreaktive Aminogruppe des 3-Amino-2-hydroxypropyl-dextrans (IV) akti¬ viert werden, z.B. durch Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder Epichlorhydrin.

OH DCC + IHP Dex-0-CH ₂ -CH-CH ₂ -NH ₂ > tert. Bu tanol/H ₂ 0

( IV )

O H 0

I it

Dex-0-CH ₂ -CH-CH ₂ -NH-P-0-R ( V )

OH

wobei R die obige Bedeutung besitzt.

Um eine Erhöhung der Zahl der Phosphatgruppen des Af finors zu erreichen , können mehrere aktivierte Inositolhexaphos- phat-Gruppierungen oder einfach Phosphorsäuregruppen über

Polyamine , z . B . Triethyl entetramin- oder Po lyethylenimin- Gruppierungen auf dem modifizierten Dextran örtlich ange¬ reichert werden.

Hierzu wird epoxydaktiviertes Dextran z. B . mit Triethylentet¬ ramin umgesetzt. Dieses besitzt zwei endständige , primäre Amino- gruppen , wovon eine bei der Reaktion mit 2 , 3-Epoxypropyl- dextran umgesetzt wird. Das entstandene Produkt enthält 3 sekundäre und eine primäre Aminogruppe. Diese Aminogruppen dienen als Reaktionszentren bei der Umsetzung mit den durch

Epichlorhydrin aktivierten Phosphatgruppen , den mit Epichlorhydrin aktivierten Inositolhexaphosphat sowie den ebenfalls mit Epichlorhydrin behandelten Alkalihydrσgen- phosphat.

0 / \

Dex-0-CH ₂ -CH-CH ₂ + Triethyl entetramin

( II )

OH f

Dex-0-CH ₂ -CH-CH ₂ -NH- . . . ( Restl . Triethylentetramingruppe)

( VI )

Die Erfindung wird anhand nachfolgender Beispiele nähe: erläutert :

Beisoiel 1

Aktivierung von Dextran mit Zinketrafluoroborat/Epi-

chlorhvdrin

In einem 10O-ml-Dreihalskolben mit Rückflußkühler und Tropftrichter werden 5 g Dextran (M=81600) unter Er- wärmen im Ölbad in einer Mischung von 5 ml Wasser und 7,5 ml 25 iger Zinktetrafluoroborat-Lösung aufgelöst. Hat die Temperatur 80 C erreicht, tropft man unter starkem Rühren langsam insgesamt 25 ml Epichlorhydrin zu. Die Mischung wird drei Stunden bei 80 C und an- schließend bei Raumtemperatur ca. 10 Stunden gerührt.

Das Polymer wird durch tropfenweises Eingießen in 1 1 Aceton gefällt, abfiltriert, mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Zur weiteren Reinigung wird das Produkt wiederholt in wenig Wasser aufgelöst und ab¬ wechselnd durch Eintropfen in Aceton oder Methanol ge¬ fällt. Man erhält 4 g 3-Chlor-2-hydroxypropyl-dextran als weißes Pulver, das in Wasser löslich ist. Durchschnittlicher Chlorgehalt: ca. 3 %.

Umsetzung von 3-Chlor-2-hydroxypropyl-dextran mit Triethylentetramin

10 g 3-Chlor-2-hydroxypropyl-dextran (M=4oooo) werden in 1 1 Wasser (pH 9) aufgelöst. Nachdem einige Zeit gerührt wurde, gibt man 10 ml Triethylentetramin zu und rührt bei Raumtemperatur über Nacht weiter. Anschließend wird, wie üblich, ultrafiltriert und das Konzentrat durch Einrühren im Aceton gefällt. Elementaranalyse Stickstoff: 4,92 %

Chlor: 0,44 %

Herstellunα von aktiviertem Inositolhexaohoschat

54 g Natriumphytat pH 7 werden in 100 ml Wasser gelöst, mit 10 ml Epichlorhydrin versetzt und bei 30 C 36 Stunden magnetisch gerührt. Anschließend wird die Lösung am

Rotationsverdampfer bis zur Trockene eingeengt. Man erhält ein feines, weißes Pulver. Elementaranalyse Chlor: 10,6 % Phosphor: 15,1 %

Umsetzung von triethylentetraminmodifiziertem Dextran mit aktiviertem Inositolhexaohosphat

Mit Triethylentetramin modifiziertes 3-Chloro-2-hydrσxy- propyl-dextran wird in Wasser gelöst, mit einer wäßrigen Lösung des aktivierten Phosphats versetzt und gerührt. Anschließend wird die Reaktionslösung in einer Ultra¬ filtrationszelle über ein PM-1 O-Membran konzentriert. Durch Eingießen in Methanol wird das Umsetzungsprodukt ausgefällt. Nach dem Absetzen des Niederschlags saugt man ab, wäscht mit Methanol und trocknet. Durchschnittlicher Phosphorgehalt: ca. 6 %

Beisoiel 2

Herstellunσ von 3-Amino-2-hvdroxvoroovl-dextran

4 g 3-Chlor-2-hydroxypropyl-dextran werden wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt und in einem 200 ml-Ξrlenmeyer- kolben in einem Gemisch aus 60 ml Wasser und 20 ml 25%iger wäßriger Ammoniaklösung aufgelöst und bei Raumtemperatur 20 Stunden magnetisch gerührt. Anschließend gibt man die Lösung tropfenweise in 1 1 Methanol. Der gebildete Nieder¬ schlag wird abfiltriert, mit Aceton gewaschen und im Vakuumexsikkator getrocknet. Zur Reinigung wird das Produkt ebenfalls wiederholt in wenig Wasser aufgelöst und durch Eintropfen in 1 1 Methanol gefällt. Man erhält 3,5 g weißes Pulver. Durchschnittlicher Stickstoffgehalt: ca. 1 % .

Umsetzung von 3-Amino-2-hydroxyprooyl-de tr n mit NatriurrtDhvtat

18 g Natriumphytat werden nach und nach unter Rühren und gleichzeitiger Kühlung mit Eiswasser in 200 ml Wasser eingetragen. Nach beendeter Zugabe wird so lange gerührt, bis die Lösung klar ist. Dann stellt man mit Salzsäure auf pH 7 und fügt 2 g 3-Amino-2-hydroxypropyl-dextran und 300 ml Hexamethylphosphorsäuretriamid unter Rühren hinzu.

10 g Dicyclohexylcarbodiimid werden in einer Mischung von 40 ml Hexamethylphosphorsäuretriamid und 20 ml

Wasser aufgelöst (eventuell unter Erwärmen) und dann zu der obigen Lösung getropft. Nach beendeter Zugabe wird die Lösung bei Raumtemperatur für 48 h gerührt. Das Hexamethylphosphorsäuretriamid wird im Vakuum ent- fernt und die wäßrigen Lösungen ultrafiltriert. Die Kon¬ zentrate werden gefriergetrocknet. Durchschnittlicher Phosphorgehalt: ca. 8 %.

Beisoiel.3

Umsetzunσ von Phosohatouffer oH 7 mit Eoichlorhvdrin

142 g (1 mol) Dinatriumhydrogenphosphat und 136 g (1 mol) Kaliumhydrogenphosphat werden in 2 1 Wasser aufgelöst und die Lösung mit verdünnter Natronlauge auf pH 7 eingestellt. Dann gibt man 111 g (1,2 mol) Epichlorhydrin zu und rührt 72 Stunden bei Raumtemperatur. Danach wird am Rotationsver¬ dampfer das Volumen der Lösung auf einen Liter eingeengt Für die Analyse werden 50 ml dieser Lösung zur Trockne ein- gedampft.

Elementaranalyse Chlor: 8,2 % Phosphor: 14,4 %

Die Umsetzung des aktivierten Phosphats mit triethylen- tetramin-modifiziertem Dextran erfolgt nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren. Durchschnittlicher Phosphorgehalr: ca. 5 %

Beispiel _4

U setzunσ von PhosDhorsäure mit Eoichlorhvdrin

10 g Epichlorhydrin werden unter Rühren und Eiskühlung innerhalb von 45 Minuten zu 20 g 84 %iger Phosphorsäure getropft. Nach erfolgter Zugabe wird für weitere 30 Minuten gerührt. Man verdünnt anschließend mit Wasser auf 350 ml und versetzt die Lösung dann unter Rühren nach und nach mit insgesamt 75 g Bariumhydroxid bis zur alkalischen Reaktion.

Die weitere Umsetzung mit aktiviertem Dextran erfolgt nach dem in Beispiel 1 oder 3 beschriebenen Verfahren. Durchschnittlicher Phosphorgehalt: ca. 5 %

Beisoiel 5

Die Inos itolhexaphosphat/Dextran-Kopplungsprodukte werden mittels Gelchromatographie auf die erfolgte Kopplung sowie ihre Eignung zur Adsorption an Hämcglo- bi untersucht. Verschiedene Mischungen der Kopplungs-

Produkte mit Hämoglobin werden gelchromatographisch nach ihrem Mo lekulargewicht aufgetrennt . Im Gegensatz zum reinen Hämoglobin , bei dem immer nur ein einzelner scharfer Peak auftritt , zeigen die Chromatogra me der Mischungen von Hämoglobin mit den Kopplungsprodukten in allen Fällen zwei je nach den Chromatographiebedin¬ gungen ( Ge le , Laufmittel usw. ) mehr oder weniger vonei¬ nander getrennte Peaks . Dies zeigt , daß neben dem reinen Hämoglobin die Fraktion eines höhermolekularen , hämoglo- binhaltigen Produktes enthalten ist , die sich gelchroma¬ tographisch abtrennen läßt .

D ie Kopplungs produkte bewirken die zu erwartende Rechtsver¬ schiebung der Sauerstof fdissoziationskurve des Hämoglobins .

aktivierter Phosphorsäure oder mit aktiviertem 8-Hydroxy-1 , 3 , 6-pyren-trisulf onat , Pyridoxalphosphat , N- ( 2 , 4-Diphosphobenzyl ) -1 -amino-5-naphthalensulfonsäure , 2 , 3-Diphosphoglycerat , Adenosintriphosphat , Inositolte- traphosphat , Inositolpentaphosphat und/oder Inositol- hexasulfat, vorzugsweise Inositolhexaphosphat umgesetzt wird.

1 0. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9 , dadurch gekennzeichnet , daß als Polymer ein Plasmaersatz¬ mittel , vorzugsweise Dextran verwendet wird.