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Title:
PLASMID, METHOD AND KIT OF PRODUCING HEAT- LABILE ENTEROTOXIN B SUBUNIT
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2015/089707
Kind Code:
A1
Abstract:
A plasmid, a method and a kit for producing heat-labile enterotoxin B subunit on the basis of Bacillus subtilis expression system.

Inventors:
LIN JIUNN-HORNG (CN)
WANG JYH-PERNG (CN)
FANG CHIEN-YU (CN)
CHEN ZENG-WENG (CN)
HSIEH MING-WEI (CN)
ZENG HAO-ZHEN (CN)
LAI JIAN-FONG (CN)
HUANG WENG-ZENG (CN)
PENG TZU-TING (CN)
Application Number:
PCT/CN2013/089559
Publication Date:
June 25, 2015
Filing Date:
December 16, 2013
Export Citation:
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Assignee:
AGRICULTURAL TECHNOLOGY RES INST (CN)
International Classes:
C12N15/75; C12N1/21; C12N15/66; C12R1/125
Domestic Patent References:
WO2011025310A22011-03-03
Foreign References:
CN1340625A2002-03-20
Other References:
LIU, YUAN ET AL.: "Cloning and Prokaryotic Expression of the Gene of Porcine Escherichia Coli Heat-labile Enterotoxin (LTB", VETERINARY SCIENCE IN CHINA, vol. 41, no. 2, 31 December 2011 (2011-12-31)
CHEN, YUMEI;: "Expression of a MuIFN-a-7 Gene in Bacillus Subtilis by Using Levansucrase System", BIOTECHNOLOGY BULLETIN, no. 5, 31 December 1990 (1990-12-31)
CUI, WENYU ET AL.: "Prokaryotic Expression, Purification and Mucosal Immunoadjuvantivity of E.coli Heat-labile Enterotoxin B Subunit", CHINESE JOURNAL OF BIOLOGICALS, vol. 24, no. 12, 31 December 2011 (2011-12-31)
WU, CHAO ET AL.: "Expression, Purification of Recombinant LTB Protein of E. Coli and its Mucosal Immunoadjuvanticity", CHINESE JOURNAL OF MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY, vol. 25, no. 4, 30 April 2005 (2005-04-30)
GE, JUNWEI ET AL.: "Expression and Characterization of LTB Subunit of Escherichia Coli in Prokaryocyte", JOURNAL OF NORTHEAST AGRICULTURAL UNIVERSITY, vol. 41, no. 6, 30 June 2010 (2010-06-30)
ZHANG, KE ET AL.: "Advance on the Surface Display of Recombinant Vaccines on Subtilis bacillus Spores", MICROBIOLOGY, vol. 33, no. 5, 31 December 2006 (2006-12-31)
DORSEY, F.C. ET AL.: "Directed Delivery of Heat-labile Enterotoxin by Ente Rotoxigenic Escherichia Coli", CELLULAR MICROBIOLOGY, vol. 8, no. 9, 31 December 2006 (2006-12-31)
WILSON, B.L. ET AL.: "Boosting Systemic and Secreted Antibody Responses in Mice Orally Immunized with Recombinant Bacillus Subtilis Strains Following Parenteral Priming with A DNA Vaccine Encoding the Enterotoxigenic Escherichia Coli (ETEC) CFA/I Fimbriae B Subunit", VACCINE, vol. 26, no. 2008, 2 June 2008 (2008-06-02)
Attorney, Agent or Firm:
BEIJING SANYOU INTELLECTUAL PROPERTY AGENCY LTD. (CN)
北京三友知识产权代理有限公司 (CN)
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Claims:
权利要求书

I . 一种生产大肠杆菌不耐热肠毒素 B亚单位的质粒, 其包含:

转译为大肠杆菌不耐热肠毒素 B亚单位的核苷酸序列; 及

枯草杆菌可辨识的表达元件。

2. 如权利要求 1所述的质粒, 其是使用于枯草杆菌表达系统。

3. 如权利要求 1所述的质粒, 其中前述转译为大肠杆菌不耐热肠毒素 B亚单位的 核苷酸序列如 SEQ ID NO 01中所示。

4. 如权利要求 1 所述的质粒, 其中前述大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位具有如 SEQ ID NO 02中所示的氨基酸序列。

5. 如权利要求 1 所述的质粒, 其中前述枯草杆菌可辨识的表达元件为: P43 表达 元件、 表达元件、 trc表达元件、 lacuv5表达元件、 SP01表达元件、 P59表 达元件、 PS 10表达元件、 r/«F表达元件、 ytkA表达元件、 woF表达元件、 Idh 表达元件、 nap表达元件、 Hpall表达元件、 ΡΦ105表达元件、 PR表达元件、 des表达元件、 x_yM表达元件、 T7表达元件、 groE-gntO表达元件、 glv表达元 件、 ara 表达元件、 《>¾4表达元件、 表达元件、 表达元件、 ναηΗ ¾¾ 元件、 gsiB ¾¾ Π 表达元件、 c tM表达元件、 gcv-riboswitch region表 达元件、 acoA 表达元件、 tac-lacO表达元件、 T5-lacO表达元件、 spac表达元 件、 sacS表达元件、 r/«J-/acO表达元件、 wg6-/acO表达元件、 或其组合。

6. 如权利要求 5所述的质粒, 其中前述 r/«/-/acO表达元件具有如 SEQ ID NO 03 所示的核苷酸序列。

7. 如权利要求 5所述的质粒, 其中前述 veg6-lacO表达元件具有如 SEQ ID NO 04 所示的核苷酸序列。

8. 如权利要求 1 所述的质粒, 其进一步包含转译为分泌性蛋白质的信号肽的核苷 酸序列。

9. 如权利要求 8 所述的质粒, 其中前述信号肽为果聚糖转移酶 (levansucrase) 的 信号肽。

10. 如权利要求 9 所述的质粒, 其中前述果聚糖转移酶 (levansucrase) 的信号肽的 核苷酸序列如 SEQ ID NO 05所示。

I I . 一种生产大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位的方法, 其包含于枯草杆菌表达系统 中表达如权利要求 1所述的质粒。

12. 如权利要求 11 所述的方法, 其中前述质粒中转译为大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位的核苷酸序列如 SEQ ID NO 01中所示。

13. 如权利要求 1 1所述的方法, 其中前述质粒进一步包含转译为分泌性蛋白的信号 肽的核苷酸序列。

14. 如权利要求 13所述的方法, 其包含以下步骤:

(A) 使转化 (transform) 有前述质粒的枯草杆菌培养于培养液中;

(B)诱发前述质粒中前述转译为大肠杆菌不耐热肠毒素 B亚单位的核苷酸序列的 表达;

(C)收集前述培养液并纯化取得大肠杆菌不耐热肠毒素 B亚单位。

15. 如权利要求 14所述的方法, 其中前述培养液为 LB培养液、 SR培养液、 或其 组合。

16. 如权利要求 14所述的方法, 其中前述枯草杆菌表达有乳糖抑制子 (Lacl) , 且 前述质粒中的枯草杆菌可辨识的表达元件为 rpsJ-lacO表达元件或 veg6-lacO表 达元件; 前述步骤 (B)是加入异乳糖、 异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷、 或其类似物以 诱发前述表达元件。

17. 如权利要求 14 所述的方法, 其中待前述步骤 (A)的枯草杆菌培养至 OD6(K)读值 为 0.3至 0.5时, 才进行前述步骤 (B;)。

18. 如权利要求 14所述的方法, 其中前述纯化是使前述培养液通过固定化半乳糖树 脂管柱。

19. 如权利要求 14 所述的方法, 其生产前述大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位的产 量为 100mg/L至 200mg/L, 其是以前述培养液的总体积为基础。

20. 如权利要求 14所述的方法, 其中前述培养的时间为 24至 72小时。

21. 如权利要求 14所述的方法, 其中前述培养液含有 0.1 ^%至 0.8wt%的葡萄糖。 22. 一种生产大肠杆菌不耐热肠毒素 B亚单位的套组, 其包含:

枯草杆菌, 其转化有如权利要求 1所述的质粒。

23. 如权利要求 22 所述的套组, 其中前述质粒中的枯草杆菌可辨识的表达元件为 rpsJ-lacO表达元件或 veg6-iacO表达元件, 且前述枯草杆菌表达有乳糖抑制子 (Lacl) 。

24. 如权利要求 23所述的套组, 其进一步包含诱发前述质粒表达的试剂。

25. 如权利要求 24 所述的套组, 其中前述试剂为异乳糖、 异丙基 -β-D-硫代半乳糖 苷、 或其类似物。

Description:
生产不耐热肠毒素 B亚单位的质粒、 方法及其套组 技术领域

本发明关于一种不耐热肠毒素 B 亚单位的生产方法, 尤指一种利用枯草杆菌来 生产不耐热肠毒素 B亚单位的方法。 背景技术

大肠杆菌不耐热肠毒素 (heat labile enterotoxin; LT ) 是由肠毒素产生性大肠杆 菌所产生的外毒素, 其是由一个 A亚单位 (LT-A) 及五个 B亚单位 (LT-B ) 所组 成。 LT-A 主要扮演毒素的角色, 其具有二磷酸腺核苷核糖转移酶 (ADP- ribosyltransferase ) 活性, 在进入宿主的细肠细胞之后, 会活化腺苷酸环化酶 ( adenylate cyclase) , 使细胞中的环 AMP ( cAMP ) 增加, 进而活化蛋白质激酶 A ( protein kinase A) , 促使细胞中的 Na + 、 K + 及水分向肠腔内转移, 导致腹泻、 脱 水和电解质紊乱。 LT-B 的功能则是与肠细胞膜上的 GM1 神经节苷酯 (GM1 ganglioside) 受体 (receptor) 结合, 协助 A亚单位进入细胞内。

研究显示, LT、 LT-A及 LT-B 皆有调节免应反应的效果, 可作为黏膜佐剂 ( mucosal adjuvant) ; 其中 LT-B 由于不具毒性, 更为适合作为刺激免疫反应的佐 剂使用。 LT-B的佐剂活性虽为已知, 但如何大量生产重组 LT-B 以因应疫苗产业所 需仍极为关键。 领域中已知利用大肠杆菌 Escherichia coli ) 、 桥石短芽孢杆菌 (.Brevibacillus choshinensis) 、 面包酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae ) 及嗜甲酉享酵 母菌 Pichia pastor is) 生产重组 LT-B 并作为佐剂之用。 然而, 现行已知的每一种 表达系统均有其缺点, 比如说: (1 ) 大肠杆菌的优点为基因操作方便, 但生产的 LT-B主要存在于包涵体中, 导致 LT-B的生产成本增加 (Ma W α/., 2010 ) 。 此外, 大肠杆菌具有内毒素, 若未来要应用重组 LT-B于人类或宠物疫苗, 纯化 LT-B需进 —步将内毒素去除, 方能提升使用安全性。 (2 ) 桥石短芽孢杆菌具有将蛋白质分泌 至胞外的能力, 但需于 30°C培养 8天后, 才能达到最高产量 (约 350 mg/L) , 生产 周期较长 (Kozuka et al, 2000 ) 。 (3 ) 面包酵母菌为一般认可为安全 (generally recognized as safe; GRAS ) 的菌株且具有将蛋白质分泌至胞外的能力, 但产量过低 (约 3 mg/L) (Lim et α/., 2009 ) 。 (4 ) 嗜甲醇酵母菌具有将蛋白质分泌至胞外的 能力, 产量也相当优异 (Ma et a/., 2010 ) , 但此表达系统需使用甲醇做为诱导物, 而存在工业管理及使用安全疑虑的多项缺点。

综上所述, 目前领域中用以生产大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位的方法皆有改 善的空间, 有鉴于大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位于作为疫苗佐剂的良好功效, 领 域中急需一种操作方式简单、 产量佳且具安全性的生产方法。 发明内容

爰是, 本发明的一目的为提供一种生产大肠杆菌不耐 热肠毒素 B 亚单位的质粒 及其套组, 其具有安全性高的优点, 特别合适于人类或动物的疫苗使用。

本发明的又一目的为提供一种生产大肠杆菌不 耐热肠毒素 B 亚单位的方法, 其 采用生产步骤更为简单的表达系统, ^得以降低生产成本。

为达到上述目的, 本发明提供一种生产大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位的质 粒, 其包含: 转译为大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位的核苷酸序列; 及枯草杆菌可 辨识的表达元件。

本发明另提供一种生产大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位的方法, 其包含于枯草 杆菌表达系统中表达前述质粒。

本发明又提供一种生产大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位的套组, 其包含: 枯草 杆菌, 其转化 (transformation) 有前述质粒。

较佳地, 前述质粒是使用于枯草杆菌表达系统。

较佳地, 前述转译为大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位的核苷酸序列如 SEQ ID

NO 01中所示。

较佳地, 前述大肠杆菌不耐热肠毒素 B亚单位具有如 SEQ ID NO 02中所示的 氨基酸序列。

较佳地, 前述枯草杆菌可辨识的表达元件为 P43 表达元件、 表达元件、 trc 表达元件、 /aci v5表达元件、 SP01表达元件、 P59表达元件、 PS 10表达元件、 rpsF 表达元件、 _ytM表达元件、 表达元件、 /dh表达元件、 ap表达元件、 Hpall表 达元件、 ΡΦ105表达元件、 PR表达元件、 表达元件、 x_yM表达元件、 T7表达元 件、 groE-gntO ¾¾ Π g/v表达元件、 ar<¾4表达元件、 ra'&4表达元件、 spaS ¾¾ 元件、 pst表达元件、 vanH表达元件、 gsiB表达元件、 amy表达元件、 citM表达元 件、 gcv-riboswitch region表达元件、 acoA 表达元件、 tac-lacO表达元件、 T5-lacO 表达元件、 spac表达元件、 sacB表达元件、 rpsJ-lacO表达元件、 veg6-lacO表达元 件、 或其组合。

较佳地, 前述 r J-/acO表达元件具有如 SEQ ID NO 03所示的核苷酸序列。 较 佳地, 前述 veg6-lacO表达元件具有如 SEQ ID NO 04所示的核苷酸序列。

较佳地, 前述质粒进一步包含转译为分泌性蛋白的信号 肽的核苷酸序列。 较佳 地, 前述信号肽为果聚糖转移酶 (levansucrase ) 的信号肽。 较佳地, 前述果聚糖转 移酶 (levansucrase) 的信号肽的核苷酸序列如 SEQ ID NO 05所示。

较佳地, 前述方法包含以下步骤: (A) 使转化 (transform ) 有前述质粒的枯草 杆菌培养于培养液中; (B) 诱发前述质粒中前述转译为大肠杆菌不耐热肠 毒素 B 亚 单位的核苷酸序列的表达; (C) 收集前述培养液并纯化取得大肠杆菌不耐热肠 毒素 B亚单位。

较佳地, 前述培养液为 LB培养液、 SR培养液、 或其组合。

较佳地, 前述枯草杆菌表达有乳糖抑制子 (Lacl ) , 且前述质粒中的枯草杆菌 可辨识的表达元件为 rpsJ-lacO表达元件或 ve g 6-kicO表达元件。

较佳地, 前述步骤 (B)是加入异乳糖、 异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷、 或其类似物以 诱发前述表达元件; 其中前述类似物是指与前述异乳糖、 及 /或前述异丙基 -β-D-硫代 半乳糖具有相似结构, 而得以与前述乳糖抑制子结合的物质。

较佳地, 前述方法是待前述步骤 (A)的枯草杆菌培养至 OD 6(K) 读值为 0.3 至 0.5 时, 才进行前述步骤 (B;)。

较佳地, 前述纯化是使前述培养液通过固定化半乳糖树 脂管柱。

较佳地, 前述方法生产前述大肠杆菌不耐热肠毒素 B亚单位的产量为 100mg/L 至 200mg/L, 其是以前述培养液的总体积为基础。

较佳地, 前述培养的时间为 24至 72小时。

较佳地, 前述培养液含有 0.1 ^%至0.8^%的葡萄糖。

较佳地, 前述套组进一步包含诱发前述质粒表达的试剂 。 较佳地, 前述试剂为 异乳糖、 异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷、 或其类似物; 其中前述类似物是指与前述异乳 糖、 及 /或前述异丙基 -β-D-硫代半乳糖具有相似结构, 而得以与前述乳糖抑制子结合 的物质。 综上所述, 本发明关于用于生产大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位的质粒、 含其 的套组, 及使用该质粒以生产大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位的方法。 本发明成功 建立用于产制重组不耐热肠毒素 B 亚单位的枯草杆菌表达系统, 且本发明的方法具 有产率佳及操作简单的优点, 较现行领域中使用的方法更具优势。 附图说明

图 1显示出本发明所制得的质粒 pMV60SP-OLTBT。

图 2为比较含有 pBLl及 pMCST的枯草杆菌 (第 1栏) 、 含有 pBLl及本发明 的 pMROSP-LTBT 的枯草杆菌 (第 2栏) 、 及含有 pBLl 及本发明的 pMV60SP- LTBT 的枯草杆菌 (第 3 栏) 于 LT-B 的产量。 M 为 Markl2 TM Protein Standard (Invitrogen, USA)。

图 3显示培养于不同培养液、 及不同培养时间时, LT-B的产量变化; 其中分别 使用含有 pBLl及 pMV60SP-OLTBT的枯草杆菌以及含有 pBLl及 pMV60SP-LTBT 的枯草杆菌进行实验。 M为 Markl2 TM Protein Standard (Invitrogen, USA)。

图 4显示培养于不同浓度的葡萄糖时, LT-B的产量变化。 图中实验是将枯草杆 菌 (Bacillus subtilis WB pBLl, pMV60SP-OLTBT ) 分别培养于含有不同浓度的 葡萄糖的 SR培养基, 再经诱导培养 72小时后的检测结果; 其中第 1栏为培养于含 有 0.1wt%葡萄糖的 SR培养基; 第 2栏为培养于含有 0.2wt%葡萄糖的 SR培养基; 第 3栏为培养于含有 0.4wt%葡萄糖的 SR培养基; 第 4栏为培养于含有 0.6wt%葡萄 糖的 SR培养基。 M为 Markl2 TM Protein Standard (Invitrogen, USA)。

图 5显示本发明实施例二中纯化 LT-B的效率。 M为 Markl2 TM Protein Standard (Invitrogen, USA)。

图 6显示本发明所制得的 LT-B辅助抗原的免疫原性的评估结果。

图中符号说明:

1―—表达元件

2 - -一信号肽

3- ---多种限制酶切位

4- --一转录终止子

5 -—蹄选标志 6-----复制起始点

7…一密码子最佳化的 LT-B基因 具体实施方式

原核生物表达系统是一种遗传工程技术, 领域中已知道多种适合作为表达系统 使用的菌种。 然而, 每一种已知表达系统于生产特定种类的蛋白质 的效率并非可当 然预期, 如同领域中已知多种用于生产大肠杆菌不耐热 肠毒素 B 亚单位的表达系 统, 其中每一种表达系统皆各有其优缺点, 甚至有些表达系统只能提供非常低的产 率。 由此可知, 即便领域中已熟悉原核生物表达系统的操作, 当实际运用于表达特 定蛋白质时, 不仅需要相当程度的试验及调整, 其生产的效率也全然无法预期。

本发明的贡献在于成功建立用于产制重组不耐 热肠毒素 B 亚单位的枯草杆菌表 达系统。 枯草杆菌 Bacil s subtilis) 为革兰氏阳性、 兼性厌氧的芽孢杆菌。 如同面 包酵母菌, 枯草杆菌也是一种 GRAS 等级的安全菌株, 但有别于面包酵母菌低产 量, 本发明所建立的枯草杆菌表达系统可产出约 100 mg/L至 200 mg/L的大肠杆菌 不耐热肠毒素 B 亚单位。 可见本发明同时具备了安全性与产量佳的优点 。 在本发明 的一个实施态样中, 本发明成功以分泌蛋白质的形式产出大肠杆菌 不耐热肠毒素 B 亚单位, 有利于自表达系统中纯化产出的蛋白质, 减少生产步骤及成本。

通常而言, 一用于表达系统的质粒除了欲表达的目标基因 之外, 尚会包含 (1 ) 表达元件 (expression cassette) 、 ( 2 ) 信号肽 ( signal peptide) DNA、 ( 3 ) 限制酶 切位、 (4 ) 转录终止子 ( transcription terminator ) 、 (5 ) 筛选标志 ( selection marker) 及 /或 (6 ) 复制起始点。 前述表达元件带有转录及转译讯号, 为基因表达所 必需; 前述信号肽为蛋白质由胞内转位 (translocation) 至胞外所需的分泌信号; 前 述限制酶切位可增进 DNA选殖的便利性; 前述转录终止子: 位于基因的下游, 可 终止转录作用。 研究显示, 转录终止子具有提升 mRNA稳定性的作用, 亦能防止转 录穿越 (transcription readthroug ) 并避免质粒不稳定的现象; 前述筛选标志是用于 转化株的筛选, 通常选用抗药性基因; 前述复制起始点是用于使质粒于宿主细胞中 进行复制作用。

在一个面向中, 本发明提供一种生产大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位的质粒, 其包含: 一转译为大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位的核苷酸序列; 及一枯草杆菌可 辨识的表达元件。 在一可行实施态样中, 可基于枯草杆菌适用的密码子偏好

( Codon Usage) , 自领域中习知的大肠杆菌不耐热肠毒素 B亚单位氨基酸序列 (例 如, 但不限于 SEQ ID NO 02中所示序列) 反向估算出前述转译为大肠杆菌不耐热 肠毒素 B 亚单位的核苷酸序列。 在一可行实施态样中, 前述转译为大肠杆菌不耐热 肠毒素 B亚单位的核苷酸序列如 SEQ ID NO 01中所示。

在一较佳实施态样中, 前述枯草杆菌可辨识的表达元件为一种持续型 表达元 件, 可使基因持续进行表达, 或一种诱导性表达元件, 以有助于控制表达系统的启 动与终止。 可被使用的持续型表达元件包括, 但不限于: P43表达元件、 表达元 件、 trc表达元件、 lacuv5表达元件、 SP01表达元件、 P59表达元件、 PS 10表达元 件、 rpsF表达元件、 ytkA 表达元件、 woF表达元件、 Idh 表达元件、 nap 表达元 件、 Hpall 表达元件、 或其组合。 可被使用的诱导型表达元件包括, 但不限于: ΡΦ105 表达元件、 PR表达元件、 des表达元件、 x_yM 表达元件、 T7 表达元件、 groE-gntO表达元件、 glv表达元件、 araA 表达元件、 nisA 表达元件、 spaS表达元 件、 pst表达元件、 vanH表达元件、 gsiB 表达元件、 amy表达元件、 citM表达元 件、 gcv-riboswitch region表达元件、 acoA 表达元件、 tac-lacO表达元件、 T5-lacO 表达元件、 spac表达元件、 sacB表达元件、 rpsJ-lacO表达元件、 veg6-lacO表达元 件、 或其组合。

在一较佳实施态样中, 前述枯草杆菌可辨识的表达元件为 rpsJ-lacO表达元件或 veg6-lacO表达元件。 当使用 rpsJ-lacO表达元件或 veg6-lacO表达元件作为表达元件 时, 可搭配使用表达有乳糖抑制子 (Lacl ) 的枯草杆菌菌株。 藉此, 可藉由添加异 乳糖、 异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷、 或其类似物来诱发前述表达元件, 而得以操控表 达系统的运作。 较佳地, 前述 r J-/acO具有如 SEQ ID NO 03所示的核苷酸序列。 较佳地, 前述 veg6-lacO具有如 SEQ ID NO 04所示的核苷酸序列。

在异乳糖或异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷于诱发 rpsJ-lacO或 veg6-lacO表达元件的 反应机制中, 异乳糖或异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷会与前述乳糖抑制子结合而 限制其 活性, 进而促使 rpsJ-lacO或 ve g 6-la C 0表达元件的活化。 据此, 本发明所述 "异乳 糖、 异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷、 或其类似物" 中的 "类似物"一词, 是指一物质, 其具有类似于前述异乳糖或前述异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷与前述乳糖抑制子结合的 结合区域的结构, 而得以仿效出前述异乳糖或前述异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷与前述 乳糖抑制子结合状态, 进而产生限制前述乳糖抑制子的活性的效果。

在一较佳实施态样中, 前述质粒进一步包含一转译为分泌性蛋白质的 信号肽的 核苷酸序列。 此段信号肽可由枯草杆菌所辨识, 而主动将所产出的大肠杆菌不耐热 肠毒素 B 亚单位分泌 (secrete) 至细胞外。 这一特点有助于直接自培养液中收集产 出的大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位, 而得以简化生产歩骤及节省生产成本。 较佳 地, 前述信号肽为果聚糖转移酶 (levansucrase ) 的信号肽。 较佳地, 前述果聚糖转 移酶 (levansucrase) 的信号肽的核苷酸序列如 SEQ ID NO 05所示。

在另一个面向中, 本发明提供一种生产大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位的方 法, 其包含于一枯草杆菌表达系统中表达前述质粒 。 较佳地, 前述方法包含以下步 骤: (A) 使一转化 (transform) 有前述质粒的枯草杆菌培养于一培养液中; (B) 诱发 前述质粒中前述转译为大肠杆菌不耐热肠毒素 B亚单位的核苷酸序列的表达; 及 (C) 收集前述培养液并纯化取得大肠杆菌不耐热肠 毒素 B亚单位。

在一可行实施态样中, 可藉由领域中习知的转化步骤, 将本发明的质粒转化进 入一枯草杆菌中。 较佳地, 前述质粒可进一步包含有用于筛选转化步骤是 否成功的 筛选标志, 例如, 抗药性基因, 或是采用领域中常用的蓝白筛选方法 (Blue and White Screening ) 的概念。 前述培养液可选用, 但不限于: LB 培养液、 SR 培养 液、 或其组合。 前述 LB培养液或前述 SR培养液皆采用领域中所已知的配方, 惟, 所属领域技术人员当可视其需求调整培养液的 配方, 而仍应属于本发明的范畴。 本 发明的实验中显示, 含有 0.1%至 0.8wt%的葡萄糖的 SR培养液是较佳的培养环境; 更佳地, 是含有 0.1 wt%的葡萄糖的 SR培养液。 较佳地, 前述培养的时间为 24小 时至 72小时。

在一较佳实施态样中, 前述枯草杆菌表达有乳糖抑制子 (Lad ) , 且前述质粒 中的枯草杆菌可辨识的表达元件为 rpsJ-lacO 表达元件或 veg6-lacO 表达元件。 藉 此, 可藉由于加入异乳糖、 异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷、 或其类似物以诱发前述表达 元件 (步骤 (B) ) 。

在一较佳实施态样中, 待前述步骤 (A)的枯草杆菌培养至 OD 6QQ 读值为 0.3至 0.5 时, 才进行前述步骤 (B)以诱发前述表达元件。 此操作程序可循序渐进地使枯草杆菌 适应培养条件后, 才进行大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位的产出, 有助于稳定整体 表达系统的运作。 在一可行实施态样中, 于收集取得培养液之后, 可进一步进行一离心步骤, 以 将前述培养液中的杂质沉淀。 此一步骤有助于提升后续纯化步骤的效率。 在一较佳 实施态样中, 前述纯化可利用大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位与半乳糖结合的特 性, 使前述培养液通过一固定化半乳糖树脂管柱, 而选择性地将产出的大肠杆菌不 耐热肠毒素 B 亚单位捕捉于树脂管柱中。 尔后, 再导入冲涤液将树脂管柱中吸附的 大肠杆菌不耐热肠毒素 B亚单位溶离出来。

在又一个面向中, 本发明提供一种生产大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位的套 组, 其包含: 一枯草杆菌, 其转化 (transformation) 有前述质粒。 较佳地, 前述套 组进一步包含一诱发前述质粒表达的试剂。 前述试剂为异乳糖、 异丙基 -β-D-硫代半 乳糖苷、 或其类似物; 其中前述类似物如前述段落中所定义。

以下实施例谨记载本发明研发所进行的试验, 以进一步释明本发明的特征与优 点。 惟需理解的是, 所列实施例仅是示范性地例示所请发明, 不应用于限制本发明 的申请专利范围。 实施例一: 菌种及其培养

本发明的研究过程是采用大肠杆菌 coli) TA-196ELT做为 LT-B基因 的来源。 以大肠杆菌 JM109 做为基因选殖用的宿主细胞。 以枯草杆菌 (^^7/^ subtiiisy 職 (pBLiM乍为蛋白质表达用的宿主细胞。

前述大肠杆菌是培养于 LB (Luria-Bertani) 培养基 (Difco, USA) 。 前述枯草 杆菌是培养于 LB培养基或 SR培养基 (2% yeast extract, 2.5% Bacto trptose, 0.3% K 2 HP0 4 , pH 7.5 ) 。 实施例二: 本发明的质粒的建构

1、 p300MCST的建构

为了后续实验中选殖步骤的便利性, 本实验将质粒 pHY300PLK ( Takara,

Japan) 的多重选殖部位 ( multiple cloning site ) 置换成人工合成的多重选殖部位。

首先, 禾 1 J用重叠延伸聚合酶链式反应 (overlapping-extension polymerase chain reaction, OEPCR ) 进行多重选殖部位的合成; 其中所设计的限制酶切位包括 EcoRl Bg l , Spel , Ndel , Nrul、 BamHl、 Xmal , Pstl , Sail , Xhol , Xbal 及 HindlU。 设计的引物包括 MCST1、 MCST2、 MCSF 及 MCSR (请参表一) ; 其中 MCST1及 MCST2作为模板引物, MCSF及 MCSR则做为扩增引物。 表一:

于 PCR反应时, 模板引物间会黏合, 以使聚合酶以 3'至 5'的引物为模板, 由 5'至 3'的引物进行延伸, 而产生全长 DNA。 接着, 扩增引物以全长 DNA作为模 板, 大量扩增 DNA片段。 在 50 μL的 PCR反应混合物中包含 1倍 GDP-HiFi PCR 缓冲液 B, 200 μΜ的 dATP、 dTTP、 dGTP与 dCTP, 1 μΜ引物及 1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。 PCR反应条件为 98°C反应 2分钟 (1 个步骤) ; 94°C反应 30秒、 55 °C反应 30秒、 68°C反应 30秒 (35 个循环) ; 68°C反应 5 分钟 (1 个步骤) 。 PCR反应结束后, 利用琼脂糖凝胶电泳确认 PCR产物中是否含有预估大小的 DNA 片段。 接着, 利用 PCR-M™ Clean Up system kit ( GeneMark, Taiwan) 进行 PCR产 物的回收。 然后, 将 PCR产物以 EcoM及 Hindm剪切后, 利用 T4 DNA ligase将 DNA 片段接入以相同限制酶剪切的质粒 pHY300PLK 中。 将黏合产物转化 (transform) 入大肠杆菌 ECOS 9-5 中。 以菌落聚合酶链式反应筛选转化株。 利用 DNA电泳确认转化株中的重组质粒带有外插 DNA后, 再抽取转化株中的质粒。 经 进行 DNA定序确认正确无误的质粒则命名为 p300MCS。

以 Sail及 Xbal剪切质粒 pQE30 ( Qiagen, USA) 后, 回收分子量较小的 DNA 片段。 此片段中含有 Lambda t0 terminator及 trnB Tl terminator 0 利用 T4 DNA ligase 将此 DNA片段接入以相同限制酶处理的 p300MCS中。 将黏合产物电转化入大肠杆 菌 ECOS 9-5 中。 随机挑选转化株抽取其质粒, 进行限制酶剪切。 将分子量大小正 确无误的质粒命名为 p300MCST。 2. 表达载体的建构

本发明的目标在于以枯草杆菌建立表达外源基 因的表达系统, 并据以生产大肠 杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位。 欲利用枯草杆菌表达外源基因, 外源基因的上游必需 带有枯草杆菌可辨识的表达元件, 包括转录及转译讯号, 方能达到基因表达的目 的。

本实施例分别采用 rpsJ-lacO 表达元件及 veg6-lacO 表达元件来进行质粒的建 构。 前述 rpsJ-lacO表达元件是衍生自枯草杆菌 r J基因, 在 r J基因的 -10区域下 游导入源自于大肠杆菌乳糖操纵子 ( ac operon) 的 /acO序列; 前述 wg6-/acO表达 元件衍生自枯草杆菌 基因, 在 基因的 -10 区域由 TACAAT 改为共识序列 ( consensus sequence) T AT AAT; -16区域导入 TG motif; -10区域下游导入 /acO序 列; -10及 -35区域间的距离由 17 bp更改为 16 bp; SD序列由 AGTGAGGTG更改 为 AAAGGAGG。 据此, 前揭两种表达元件的序列分别如 SEQ ID NO 03及 SEQ ID NO 04中所示。

将前述表达元件以 EcoM及 剪切后, 利用 T4 DNA连接酶将 DNA片段接 入以相同限制酶剪切的 p300MCST 中。 将黏合产物转化进入大肠杆菌 ECOS 9-5 中。 以菌落聚合酶连锁反应筛选转化株。 利用 DNA 电泳确认转化株中的重组质粒 带有外插 DNA后, 抽取转化株中的质粒并进行 DNA定序。 将 DNA序列正确无误 的质粒分别命名为 p300MROT及 p300MV6OT。 3. 分泌表达载体的建构

以枯草杆菌染色体作为模板, 利用 SacBSPF ( 5'-GTTATACATATGAACATCA AAAAGTTTGCAAAAC A-3 '; SEQ ID NO 10) /SacBSPR ( 5 ' -T AGAT AGTCGACGC

NO 11 ) 引物组合进行 levansucrase信号肽 (SacBSP) 的 DNA片段的扩增。

在 50 μL的 PCR反应混合物中包含 1倍 GDP-HiFi PCR缓冲液 B, 200 μΜ的 dATP、 dTTP、 dGTP 与 dCTP, 1 μΜ扩增引物, 200 ng 枯草杆菌染色体及 1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。 PCR反应条件为 98°C反应 5分钟 (1个步骤) ; 94°C反应 30秒、 55 °C反应 30秒、 68°C反应 45秒 (35个循环) ; 68°C反应 5分钟 (1个步 骤) 。 PCR反应结束后, 利用琼脂糖凝胶电泳确认有无预估大小的 DNA片段。 然 后, 利用 PCR-M™ Clean Up system kit ( GeneMark, Taiwan) 进行 PCR产物的回 收。 将 PCR产物以 及 Sail剪切后, 利用 T4 DNA连接酶将 DNA片段接入以 相同限制酶剪切的 p300MROT 或 p300MV6OT 中。 将黏合产物转化入大肠杆菌 ECOS 9-5中。 以菌落聚合酶链式反应筛选转化株。 利用 DNA电泳确认转化株中的 重组质粒带有外插 DNA后, 抽取转化株中的质粒并进行 DNA定序。 经 DNA序列 确认无误的质粒则分别命名为 pMROSPT或 pMV60SPT。

4. LT-B分泌表达表达质粒的建构

以 TA-196ELT 作 为 模 板 , 禾 IJ 用 LTBF ( 5'-GTTATAGGATCCGCT CCCC AGACT ATT AC AGAACT ATGTTC-3 ' ; SEQ ID NO 12 ) /LTBR ( 5'- T AGAT AGTCGACCT AG TTTTTC AT ACTGATTGCCGC A-3 '; SEQ ID NO 13 ) 引物 组合进行 LT-B基因的扩增。

在 50 μL的 PCR反应混合物中包含 1倍 GDP-HiFi PCR缓冲液 B, 200 μΜ的 dATP、 dTTP、 dGTP与 dCTP, 1 μΜ扩增引物, 200 ng TA-196ELT及 1 U GDP- HiFi DNA聚合酶。 PCR反应的条件为 98°C反应 5分钟 (1个步骤) ; 94°C反应 30 秒、 55 反应 30 秒、 68°C反应 30 秒 (35 个循环) ; 68°C反应 5 分钟 (1 个步 骤) 。 PCR反应结束后, 利用琼脂糖凝胶电泳确认有无预估大小的 DNA片段。 然 后利用 PCR-M™ Clean Up system kit ( GeneMark, Taiwan) 进行 PCR产物的回收。 将 PCR产物以 Bamm及 Sail剪切后, 利用 T4 DNA连接酶将 DNA片段接入以相同 限制酶剪切的 pMROSPT或 pMV60SPT中。 将黏合产物转化入大肠杆菌 ECOS 9-5 中。 以菌落聚合酶链式反应筛选转化株。 利用 DNA 电泳确认转化株中的重组质粒 带有外插 DNA后, 再抽取转化株中的质粒进行 DNA定序。 将经 DNA序列止确无 误的质粒分别命名为 pMROSP-LTBT或 pMV60SP-LTBT。

5. LT-B分泌表达表达质粒的修饰

依据枯草杆菌的偏好密码子 (preferred codons) 将 LT-B 的氨基酸序列 (如,

SEQ ID NO 02中所示序列) 反向推倒为核苷酸序列 (如, SEQ ID NO 01中所示序 列) 。 依据前述核苷酸序列设计引物: OLTB-Tl、 OLTB-T2. OLTB-T3、 OLTB- T4、 OLTB-T5、 OLTB-T6、 OLTBF及 OLTBR, 其序列如下表二中所示。 名称 序列 (5'至3') SEQ ID NO

OLTB-T1 GCCCCTCAAACAATCACGGAATTATGCTCAG 14

AATACAGAAACACGCAAATCTACACAATC

OLTB-T2 CTCTTTTACCTGCCATAGATTCTGTGTAGGAT 15

AAGATTTTGTCGTTGATTGTGTAGATTTGCGT GTTTCTGTAT

OLTB-T3 CACAGAATCTATGGCAGGTAAAAGAGAAATG 16

GTTATCATCACATTTAAATCCGGCGAAACGTT TCAAGTT

OLTB-T4 GTCTTTCATTCTTTCGATCGCTTTTTTCTGGCT 17

ATCAATATGTTGTGATCCCGGCACTTCAACTT GAAACGTTTCGCCG

OLTB-T5 AAAGCGATCGAAAGAATGAAAGACACACTGC 18

GCATTACGTATCTTACAGAAACGAAAATCGA TAAACTGTGCGTCTGGAACAAC

OLTB-T6 ATTTTTCATTGAGATAGCAGCGATAGAGTTAG 19

GTGTTTTGTTGTTCCAGACGCACAGTTTATC

OLTBF CAATATGGATCCGCCCCTCAAACAATCACGG 20

A

OLTBR GATATAGTCGACTTAATTTTTCATTGAGATAG 21

CAGCGATAGAG

OLTB-T1-OLTB-T6作为模板引物, OLTBF及 OLTBR则作为扩增引物。 利用 OEPCR大量扩增密码子最佳化的 LT-B基因。 在 50 μL的 PCR反应混合物中包含 1 倍 GDP-HiFi PCR缓冲液 B, 200 μΜ的 dATP、 dTTP、 dGTP与 dCTP, 1 μΜ的各 引物及 1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。 PCR反应的条件为 98°C反应 2分钟 (1个步 骤) ; 94°C反应 30秒、 55 °C反应 30秒、 68°C反应 30秒 (35个循环) ; 68°C反应 5 分钟 (1 个步骤) 。 PCR 反应结束后, 利用琼脂糖凝胶电泳确认有无预估大小的 DNA片段。 然后利用 PCR-M™ Clean Up system kit ( GeneMark, Taiwan) 进行 PCR 产物的回收。 将 PCR产物以 BamHl及 Sail剪切后, 利用 T4 DNA连接酶将 DNA片 段接入以相同限制酶剪切的 pMV60SPT中。 将黏合产物转化入大肠杆菌 ECOS 9-5 中。 以菌落聚合酶链式反应筛选转化株。 利用 DNA 电泳确认转化株中的重组质粒 带有外插 DNA后, 再抽取转化株中的质粒进行 DNA定序。 将经 DNA序列正确无 误的质粒命名为 pMV60SP-OLTBT (以同样操作原理对 pMROSP 进行处理, 但此 实验数据不再赘述于此) 。

请参图 1, 其显示出本发明所制得的质粒 pMV60SP-OLTBT。 由图中可知, pMV60SP-OLTBT含有表达元件 lCwg6-/acO;)、 信号肽 2(SacBSP;)、 多种限制酶切位 3、 转录终止子 4、 筛选标志 5(Ap f : 抗胺苄青霉素基因; Tc f : 抗四环霉素基因)、 复 制起始点 6(大肠杆菌质粒 pACYC177的复制起始点 ori-177, 可使质粒于大肠杆菌中 复制; 粪链球菌 Enterococcus faecalis ) DS-5 质粒 pAMal 的复制起始点 ori- pAMal , 可使质粒于枯草杆菌中复制)、 及密码子最佳化的 LT-B基因 7。

6. 枯草杆菌的转化

本实验进行枯草杆菌的转化程序, 以将本发明的质粒转化进入枯草杆菌中。 首 先将 α«7/^ WB800 (含质粒 pBLl, 即, /ac/基因表达质粒) 接种于含红霉 素 (erythromycin, 5 的 LB培养基中, 于 37°C、 150 rpm的条件下进行振荡 培养。 经隔夜培养后, 菌液以 1 : 10的比例接种至含 1% 苏氨酸 (threonine) 的基本 培养液 (minimal medium) 中振荡培养 (37°C , 200 rpm) 至 OD 6 QQ约为 1.0左右, 离 心 (5610 xg, 15分钟, 4°C ) 收集菌体。 以冰冷的灭菌去离子水清洗菌体两次后, 将 菌体悬浮于冰冷的灭菌 SHMPYT 缓冲液中 (0.25 M sucrose, 1 mM Hepes, 1 mM MgCl 2 , 20% (v/v) polyethylene glycol 6000 (PEG6000), 0.125% tryptone) 并进行分装 ( 100 μ!7管) , 此即为后续转化实验所需的电胜任细胞 (电穿孔法胜任细胞) 。 进 行 DNA转化试验时, 自 -70°C冰箱中取出电胜任细胞, 进行解冻。 取电胜任细胞 ΙΟΟμί加入 1 质粒, 并置入预先冰冷的电极管中, 冰浴 5 分钟后, 于电场强度 8.75 kV/cm、 电阻 500 Ω、 电容 25 的条件下进行电转化。 将转化后的菌体加入 1 mL SB ( 3.5 % 胰蛋白胨, 2 % 酵母抽提物, 0.5 % NaCl, pH 7.0 ) 培养液中, 于 37°C 下以 150 rpm 震荡 3 小时。 接着, 取适量菌液涂布于含红霉素 (erythromycin, 5 g/mL) 及四环霉素 (12.5 g/mL) 的固态培养基上, 于 30°C下培养 24小时, 观察 结果。 7. 重组蛋白质的表达及侦测

将枯草杆菌转化株接种于含红霉素 (erythromycin, 5 g/mL) 及四环霉素 (12.5 g/mL) 的 LB 培养基中, 于 30°C、 180 rpm 的条件下进行振荡培养。 经隔夜培养 后, 转移适量菌液至含红霉素 (erythromycin, 5 g/mL) 及四环霉素 (12.5 g/mL) 的新鲜 LB 培养基或 SR培养基或含有不同葡萄糖浓度的 SR 培养基中, 将起始 OD 6 QQ调整为 0.1, 继续于 30°C下进行震荡培养 (180 rpm) 。 当菌体生长至 OD 6 Q 0 约 0.5 时, 添力口 1 mM 异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷 ( isopropyl-β- D-thiogalactoside; IPTG) 进行蛋白质的诱导表达。 于不同培养时间下, 取出适量菌液经离心 (ΙΟ,ΟΟΟχ g, 10分钟) 后, 收集上清液部分并以 Tricine-SDS PAGE进行蛋白质电泳。 Tricine- SDS-PAGE依 Schagger及 von Jagow (1987)所述的方法加以修饰。 首先先制备聚丙 烯酰胺胶体, 其分为三层胶, 分别为 stacking gel ( 4% T, 3% C ) 、 spacer gel ( 10% T, 3% C ) R separation gel ( 16.5% T, 3% C ) 。 将电泳胶片放入电泳槽设备 ( ATTO, Japan) 中, 并倒入正极缓冲液 ( 0.2 M Tris, pH 8.9 ) 及负极缓冲液 ( 0.1 M Tris, 0.1 M tricine, 0.1% SDS, pH 8.25 ) 。 样品装载至样品槽后, 在 80 V电压下进行电泳 60 分钟, 再以 145 V 的电压进行电泳 80 分钟。 拆下胶体后, 以固定液 (50% 甲醇, 10%乙酸) 进行蛋白质固定, 经过 30分钟后, 倒除固定液并加入 BLUE BANDIT™ PROTEIN STAIN ( Amresco, USA) 进行蛋白质染色。

实验结果请参图 2, 其中第 1栏为转化有 pBLl及 pMCST的枯草杆菌 (不会表 达 LT-B , 阴性对照组) , 第 2栏为转化有 pBLl及本发明的 pMROSP-LTBT的枯草 杆菌, 第 3栏为转化有 pBLl及本发明的 pMV60SP-LTBT的枯草杆菌。 从实验结果 来看, 本发明的 pMV60SP-LTBT具有较高的产量。

图 3显示培养于不同培养液 (LB培养液或 SR培养液) 、 及不同培养时间 (24 小时或 48 小时) 时, LT-B 的产量变化。 图中数据显示培养于 SR培养液中可具有 较高的产率, 而基本上来说, 培养时间越长, 产率越高。 此外, 比较含有 pBLl 及 pMV60SP-OLTBT 的枯草杆菌以及含有 pBLl 及 pMV60SP-LTBT的枯草杆菌两组 数据可知, 本发明针对枯草杆菌所进行的最佳密码子的调 整亦显著的提升 LT-B 的 图 4显示培养于不同浓度的葡萄糖时, LT-B的产量变化。 图中第 1栏为培养于 含有 0.1^%葡萄糖的 SR培养基, 再经诱导培养 72小时的结果; 第 2栏为培养于含 有 0.2^%葡萄糖的 SR培养基, 再经诱导培养 72小时的结果; 第 3栏为培养于含有 0.4^%葡萄糖的 SR培养基, 再经诱导培养 72 小时的结果; 第 4栏为培养于含有 0.6wt%葡萄糖的 SR培养基, 再经诱导培养 72小时的结果。 实验结果显示, 培养于 含有 0.1^%葡萄糖的 SR培养基可具有最高的产量, 约为 116 mg/L。 8. 重组 LT-B的纯化

利用 LT-B 能与半乳糖结合的特性, 采用固定化半乳糖树脂 (Pierce, USA) 进 行蛋白质纯化。 本实验所进行的蛋白质纯化是依据厂商提供的 操作手册加以修饰。 将枯草杆菌培养液离心 (ΙΟ,ΟΟΟχ g, 30 分钟) 后, 收集上清液部分。 将上清液导入 含有 1 mL固定化半乳糖树脂的管柱中, 使 LT-B结合至树脂上。 然后, 加入 30 mL 的 HEPES缓冲液洗涤该树脂, 以洗除非特异性结合的蛋白质或其它杂质。 检测流出 液的 OD 28Q 读值, 当 OD,读值达平稳时, 代表已将非特异性结合的蛋白质洗出。 最后加入 10 mL溶离缓冲液 ( 0.1 M HEPES, 0.15 M NaCl, 0.1 M D-galactose, pH 7.2) 冲提树脂上所吸附的 LT-B, 此步骤的原理是利用高浓度的 D-galactose和 LT-B 与重组蛋白质产生吸附的竞争, 致使 LT-B 自树脂上被冲提下来。 利用蛋白质电泳 观察重组 LT-B 的纯化情形。 根据图 5 中所示结果, LT-B 的纯化纯度达到 95%以 上。 实施例三: 本发明表达系统所制得的 LT-B的佐剂特性探讨

本实验使用增强型绿荧光蛋白质 (GFP+) 作为模式抗原 (model antigen) , 结 合本发明所制得的 LT-B 作为佐剂。 实验所使用小白鼠为五周龄的 BALB/c 雌小鼠 (购买自国家动物实验中心) 。 将小鼠词养在具备空调设备的标准动物房中, 并供 应小鼠饲料及干净饮水。 饲养 7天后, 开始进行免疫试验。

将小白鼠分为 A、 B及 C三组, 每组 3只老鼠。 其中 A组的每只小鼠以腹腔注 射免疫 0.5 mL GFP+溶液 (含 50 GFP+、 10 mM Na 2 HP0 4 及 1.5 mM NaH 2 P0 4 , pH 7.5 ) 。 B组的每只小鼠以腹腔注射免疫 0.5 mL GFP+及重组 LT-B混合溶液 (含 50 g GFP+、 50 g LT-B、 10 mM Na 2 HPO 4 1.5 mM NaH 2 P0 4 , pH 7.5 ) 。 C组的每 只小鼠以腹腔注射免疫 0.5 mL GFP+及重组 LT-B混合溶液 (含 50 g GFP+、 100 μ β LT-B、 10 mM Na 2 HP0 4 1.5 mM NaH 2 P0 4 , pH 7.5 ) 。 每隔两周免疫抗原一次, 共 免疫两次。 免疫后的第 7、 14 及 21 天, 收集血清, 以酵素连结免疫吸附法测定抗 GFP+的 IgG免疫球蛋白, 以评估本发明制得的 LT-B的佐剂效果。 实验结果如图 6 中所示, 随着 LT-B添加量的增加, 抗 GFP+的 IgG免疫球蛋白的效价 (titer)也就越 高, 显示本发明产出的 LT-B确实有效提升免疫原性。

所属领域技术人员当可了解, 在不违背本发明精神下, 依据本案实施态样所能 进行的各种变化。 因此, 显见所列的实施态样并非用以限制本发明, 而是企图在所 附申请专利范围的定义下, 涵盖于本发明的精神与范畴中所做的修改。