GUO YANMING (CN)
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| CN103288673A | 2013-09-11 | |||
| US5110797A | 1992-05-05 | |||
| CN102389102A | 2012-03-28 | |||
| CN102311482A | 2012-01-11 |
广州嘉权专利商标事务所有限公司 (CN)
| 权 利 要 求 书 1. 一种铂配体， 其化学式如式 I所示: 式 （ I ) 式中， m=2-5， Z为 C2~4的饱和碳链， X和 Y独立为 NH2、 NR'2、 SR'， COOH基团， 分 别连接在 Z的不同碳上， ！ '为 — 4烷基。 2. 根据权利要求 1所述的铂配体， 其特征在于： X和 Y独立为 NH2， SR'。 3. 根据权利要求 2所述的铂配体， 其特征在于： X和 Y独立为 NH2。 4. 一种末端修饰的靶向多肽， 其通式如式 II所示： 式 （II ) 式中， m=2-5， Z为 C2~4的饱和碳链， X和 Y独立为 NH2、 NR'2、 SR'、 COOH基团， 分 别连接在 Z的不同碳上， R为靶向识别序列， ！ '为 — 4烷基。 5 根据权利要求 4所述的末端修饰的靶向多肽， 其特征在于： R为靶向识别多肽序列。 一种靶向试剂， 由上述末端修饰的靶向多肽与功能化合物配合而成。 根据权利要求 6所述的靶向试剂， 其特征在于： 功能化合物选自抗肿瘤药物、 检测试剂。 根据权利要求 6所述的靶向试剂， 其特征在于： 抗肿瘤药物选自铂类抗肿瘤药物、 活性 抗肿瘤多肽， 其中， 配合得到的靶向含铂抗肿瘤药物的通式如式 III所示： 〇、 P \ // 一 NH— (CH2)m— C\ X -—- Z NH R P R R2 式 （III) 式中， m=2-5， Z为 C2~4的饱和碳链， X和 Y独立为 NH2、 NR'2、 SR'， COOH基团， 分 别连接在 Z的不同碳上， ！ '为 — 4烷基， R为靶向识别序列； Ri、 R2分别为独立的基团， 或 、 R2共价连接成环。 9. 根据权利要求 8所述的靶向试剂， 其特征在于： 抗肿瘤药物选自顺铂、 卡铂、 奥沙利铂。 10.根据权利要求 8所述的靶向试剂， 其特征在于： 、 R2独立为 C1或 H20。 |
技术领域
本发明主要涉及一种偶联物， 特别涉及一种靶向偶联体。
背景技术
肿瘤， 特别是恶性肿瘤， 直接影响人类的健康和生命， 给社会和患者带来巨大的经济负 担。 我国恶性肿瘤发病率总体呈上升趋势， 发病率以年均 3%〜5%的速度递增。 我国癌谱呈 现新的特征， 既有发达国家又保留发展中国家的双重特征， 即出现恶性肿瘤发病的双重负担 局面， 2009年我国恶性肿瘤发病率居前 5位的是肺癌、 胃癌、 结直肠癌、 肝癌、 乳腺癌 [1 — 3] 。 肺癌 1988〜2005年发病率以每年 1.63%的速度增加， 2000〜2005年间肺癌的新发病例增加了 12万 [4] ， 并且其发病率及死亡率均呈逐年上升的趋势。 肺癌的预后与临床分期密切相关， I-IV 期患者总的 5年生存率仅约 15%。 导致肺癌致死率高的主要原因是检测晚， 多数病人是在肺 癌晚期甚至是发生了远处转移后才检测出来 [5] 。
为了减少肿瘤给人们带来的危害， 需要尽可能早， 并尽可能准确的诊断 [6] 。 近年来虽然 肿瘤的早期诊断如血清标志物诊断 [7] 、 蛋白质组 [8] 、 正电子断层扫描技术 [9 ' 1()] 等新型诊断技术 取得了一定的进步， 但这些诊断技术受限于特异性和假阳性率的影 响， 临床上对于肺癌诊断 的金标准仍然是以病理诊断为主， 肿瘤标志物的分子诊断和分子影像诊断等新技 术仅作为肺 癌诊断的辅助手段。 但是现有的多肽， 及其与其他化合物， 特别是无机化合物的结合力差， 无法形成较为稳定的偶联物。 同样以顺铂为例， 其与氨基的结合力较弱， 且一般难以保证其 顺式铂结构， 这也是其难以制备成为靶向药物的一个重要原 因。
现有的肿瘤临床治疗中， 仍然以手术治疗、 化疗和放疗为主。 目前肿瘤药物治疗中， 主 要依赖于细胞毒类药物， 如顺铂、 卡铂、 奥沙利铂等人工合成的具有顺式铂的化合物， 长春 碱、 紫杉醇等天然或半合成化合物。 但是细胞毒类药物在杀灭癌细胞的同时， 也存在严重的 副作用。 这个副作用包括但不限于骨髓抑制、 胃肠道反应、神经系统毒性等严重的不良不应 ， 这限制了这类药物的临床应用。
顺铂最早由美国生理学家 Rosenberg B等发现， 是中心以二价铂同两个氯原子和两个氨 分子结合的重金属络合物， 类似于双功能烷化剂， 对乏氧细胞作用， 进入人体后扩散通过带 电的细胞膜， 先将所含之氯解离， 然后在 DNA分子中鸟嘌呤的 6位和 7位之间形成交叉连 接、 或与腺嘌呤和胞嘧啶形成 DNA单链内两点的交叉联结， 也可能形成双链间的交叉联结， 从而破坏 DNA的结构和功能。对 RNA和蛋白质合成的抑制作用较弱。属周期非特 异性药物。 顺铂自发现以来， 已成为治疗肺癌最有效的药物之一。 它具有抗瘤谱广、 作用强、 与多种抗 肿瘤药有协同作用、 且无交叉耐药等特点。 其他铂类化合物如卡铂、 奥沙利铂等虽然在不良 反应上有一定降低， 但抑瘤效果与顺铂相比仍有较大差距， 因此顺铂仍为当前联合化疗中最 常用的药物之一。
近年来， 以一些与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号转 导通路的关键酶作为药物筛选靶 点， 发现选择性作用于特定靶位的高效、 低毒、 特异性强的新型抗癌药， 即分子靶向药和抗 体靶向药， 已成为当今抗肿瘤药研发的重要方向。 而用于诊断肿瘤的多肽、 肿瘤靶向性的载 体多肽、 抑制肿瘤细胞生长的多肽、 抑制肺癌生长的相关多肽激素或生长因子等具 有肿瘤靶 向性多肽的发现为靶向性药物的治疗奠定了基 础， 这些多肽或受体可作为靶向载体， 在肿瘤 靶向治疗中起到举足轻重的作用， 其可增加药物的溶解性、 改变抗肿瘤药物在体内各组织器 官的分布 [11] ， 同时还可以将化疗药物靶向浓集于肿瘤组织， 起到提高肿瘤的治疗作用和降低 化疗药物毒副作用的目的， 从而实现肿瘤的靶向治疗。 该类药物可有望实现肿瘤组织的高亲 和力和高特异性， 同时有望显著降低化疗药物的毒副作用。
但是现有的多肽， 及其与其他化合物， 特别是无机化合物的结合力差， 无法形成较为稳 定的偶联物。 同样以顺铂为例， 其与氨基的结合力较弱， 且一般难以保证其顺式铂结构， 这 也是其难以制备成为靶向药物的一个重要原因 。
参考文献
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[2] 赵平， 陈万青 .2009中国肿瘤登记年报 [M].北京军事医学科学出版社， 2010.
[3] 赵平， 陈万青 .2010中国肿瘤登记年报 [M].北京军事医学科学出版社， 2011.
[4] 陈万青， 张思维， 邹小农.中国肺癌发病死亡的估计和流行趋势 究 [J].中国肺癌杂志， 2010， 13(5):488-493.
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本发明的一个目的在于提供一种铂配体。
本发明的另一个目的在于提供一种靶向性铂配 体。
本发明的再一个目的在于提供一种靶向试剂。
本发明所采取的技术方案是：
一种铂配体， 其化学式如式 I所示：
式 （ I )
式中， m=2-5， Z为 C2〜4的饱和碳链， X和 Y独立为 NH 2 、 NR' 2 、 SR'， C00H基团， 分别连接在 Z的不同碳上， R'为 C1-4烷基。 进一步的， X和 Y独立为 NH 2 ， SR'， 特别的， X和 Y独立为 NH 2 。
一种末端修饰的靶向多肽， 其通式如式 II所示：
式 （Π )
式中， m=2-5， Z为 C2〜4的饱和碳链， X和 Y独立为 NH 2 、 NR' 2 、 SR'、 C00H基团， 分别连接在 Z的不同碳上， R为靶向识别序列， R'为 C1-4烷基。 特别的， R为靶向识别多肽 序列。 进一步的， X和 Y独立为 NH 2 ， SR'， 特别的， X和 Y独立为 NH 2 。
一种靶向试剂， 由上述末端修饰的靶向多肽与功能化合物配合 而成。 功能化合物选自抗 肿瘤药物、 检测试剂。 特别的， 抗肿瘤药物选自铂类抗肿瘤药物、 活性抗肿瘤多肽， 其中， 配合得到的靶向含铂抗肿瘤药物的通式如式 III所示:
式 （III)
式中， m=2-5， Z为 C2〜4的饱和碳链， X和 Y独立为 NH 2 、 NR' 2 、 SR'， COOH基团， 分别连接在 Z的不同碳上， R'为 C1-4烷基， R为靶向识别序列， 进一步的， X和 Y独立为 NH 2 ， SR'， 特别的， X和 Y独立为 NH 2; R 2 分别为独立的基团， 或 、 R 2 共价连接成 环。 更进一步的， 抗肿瘤药物选自顺铂、 卡铂、 奥沙利铂； Ri、 R 2 独立为 C1或 H 2 0。
本发明的有益效果是：
本发明的铂配体， 可以很好偶联多种试剂， 并可以在其上连接靶向序列， 可以作为多种 试剂的配体。 配体本身结构简单， 合成成本较低， 易于批量生产。
本发明的靶向配体， 具有很好的靶向性， 与铂试剂配位后， 在体内易于局部集中， 起到 更好的效果。
本发明的靶向试剂， 靶向性好， 可以很好地应用于肿瘤的靶向治疗、 诊断。
附图说明
图 1是本发明一化合物中间体的核磁共振图；
图 2、 3是本发明不同化合物中间体的质谱图；
图 4是本发明另一化合物中间体的核磁共振图；
图 5〜10是本发明不同化合物中间体的质谱图。
具体实 式
下面结合实施例， 进一步说明本发明。
以下实施例中所使用的縮写如下：
Orn: 鸟氨酸；
5-AVA: 5-氨基戊酸；
TFA: 三氟乙酸；
HOBt: 1-羟基苯并三唑；
DIC: Ν, Ν-二异丙基碳二亚胺；
DMF: 二甲基甲酰胺； Ala: 3-氨基丙酸；
Met: 蛋氨酸；
Dab: 2,4-二氨基丁酸；
Dap: 2,3-二氨基丙酸；
EA: 乙酸乙酯；
RGD: Arg-Gly-Asp;
RGQ: Arg-Gly-Gln;
RGN: Arg-Gly-Asn;
THF: 四氢呋喃；
DCC: 二环己基碳二亚胺
HOSu: N-羟基琥珀酰亚胺。
实施例 1 化合物 7 (Cl 2 Pt- Orn-5-AVA- RGD) 的合成
1) 化合物 2的合成：
冰浴条件下， 化合物 1溶解在水中， 4N NaOH溶液缓慢滴加。 滴加完毕后移走冰浴， 与 Boc 2 0溶解在 THF溶液混合， 继续反应 2h; 监测反应完全后， 用酸调节 pH=2-3; EA萃取两 次； 合并有机相旋干， 得到白色固体；
2) 化合物 3的合成
冰浴条件下， 化合物 2和 HOSu溶解在 EA中， DCC/EA混合溶液缓慢滴加。 滴加完毕 后移走冰浴， 继续反应 2h; 监测反应完全后过滤； 滤液旋蒸白色固体； 加入甲苯， 60°C水浴 搅拌至固体完全溶解； 旋蒸至有固体析出， 冷却放置过夜。 过滤并用少量甲苯和乙醚洗涤， 干燥箱干燥 2h， 得到白色固体。 3)化合物 4的合成
冰浴条件下， 化合物 3溶解在 DMF中， 缓慢滴加到 5-AVA-OH的 DMF溶液中。 滴加 完毕后， 撤去冰浴， 反应过夜。 确认反应完成后， 加入过量的水中， 过滤得到化合物 4。
化合物 4的核磁数据为: 1H NMR (400Hz,CDCl 3 ) δ: 4.75(m， 1H)， 3.19-3.20 (m， 1H)， 2.86 ( s， 4H) ,1.85-2.00 (m， 2H)， 1.68(m， 2H)， 1.47 ( s， 18H)， 1.22-1.23(m, 2H)， 其 核磁共振图如图 1所示。
4)化合物 5的合成
冰浴条件下， 化合物 4加入 TFA中， 反应 lh。 监测反应完毕后， 旋蒸并与甲苯共沸 2 次 ， 得到油状产物。
5)化合物 6的合成
化合物 5溶解在水中， 用 Na 2 C0 3 调 pH至 8〜9， 加入 K 2 PtC 溶液， 反应进行期间连续 监测 pH值， 保持 PH=8〜9， 反应过夜； 抽滤并干燥， 得黄色固体。
质谱分析 （relative intensity): 496 Anal. (C 10 H 21 Cl 2 N 3 O 3 Pt 497.15),其质谱图如图 2所示。
6)化合物 7的合成
a) 取已连接 RGD 多肽的树脂加入固相反应瓶中， DMF溶胀后， 依次加入化合物 6， HOBt, DIC, 反应过夜。 检测反应完全后， 抽干， DMF洗 3次， 二氯甲烷洗 3次， 甲醇收縮树脂；
b) 树脂加入裂解液 （TFA:TIS: H 2 0=95:2.5:2.5), 搅拌 2h， 过滤并用 TFA洗涤树脂 2 次。 反应液旋蒸至到约 50ml反应液后， 倒入已冰浴过的异丙醚 500ml中， 有白色沉 淀析出， 稍静置片刻后， 离心并干燥。 得到白色产物；
c) 用液相制备纯化， 收集纯度大于 95%的产品化合物 7。
实施例 2 化合物 11 (Cl 2 Pt-Orn-p-Ala-RGD) 的合成
1)化合物 8的合成
冰浴条件下， 化合物 3溶解在 DMF中， 缓慢的滴加到 β-丙氨酸的 DMF溶液中。 滴加完 毕后， 撤去冰浴， 反应过夜。 确认反应完成后， 加入过量的水中， 过滤得到化合物 8。
质谱分析 （relative intensity): 403 Anal. (C 18 H 33 N 3 0 7 404.07)， 其质谱图如图 3所示。
2)化合物 9的合成
冰浴条件下， 化合物 8加入 TFA中， 反应 lh。 监测反应完毕后， 旋蒸并与甲苯共沸 2 次 ， 得到油状产物。
3)化合物 10的合成
化合物 9溶解在水中， 用 Na 2 C0 3 调节 pH至 8〜9， 加入 K 2 PtC 溶液， 反应进行期间连 续监测 pH值， 保持 pH 8〜9， 反应过夜； 抽滤并干燥， 得黄色固体。
4)化合物 11的合成
a) 取已连接 RGD多肽的树脂加入固相反应瓶中， DMF溶胀后， 加入化合物 10， HOBt, DIC, 反应过夜。 检测反应完全后， 抽干， DMF洗 3次， 二氯甲烷洗 3次， 甲醇收縮 树脂；
b) 树脂加入裂解液 （TFA:TIS: 水 =95:2.5:2.5)， 搅拌 2h， 过滤并用 TFA洗涤树脂 2次。
反应液旋蒸浓縮至约 50ml反应液后， 倒入已冰浴过的异丙醚 500ml中， 有白色沉淀析 出， 稍静置片刻后， 离心并干燥。 得到白色产物；
c) 用液相色谱纯化， 收集纯度大于 95%的产品 C12Pt-Orn-P-Ala-RGD。
实施例 3 化合物 18 (PtCl 2 -Dab -5-AVA - RGD) 的合成
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1)化合物 14的合成
a) 冰浴条件下， 化合物 13和 HOSu溶解在 EA中， DCC/EA混合溶液缓慢滴加。 滴 加完毕后移走冰浴， 继续反应 2h ; 监测反应完全后过滤， 滤液旋蒸白色固体； b) 加入甲苯， 60°C水浴搅拌至固体完全溶解； 旋蒸至有固体析出， 冷却放置过夜。 过 滤并用少量甲苯和乙醚洗涤， 干燥箱干燥 2h， 得到白色固体。
取得到的白色固体进行核磁共振分析，其核磁 共振图如图 4所示，具体数据为： 1H NMR (400Hz,CDCl 3 ) δ: 5.48 ( s， 1H) ,5.23 ( s， 1H) ，4.80 (d， 1H)， 3.54 ( s， 1H)， 3.10 ( s， 1H)， 2.86 ( s， 4H)， 2.18 (m， 1H) ,2.05-2.08 (m， 1H) ,1.47 ( s， 9H) ,1.45 ( s， 9H)， 1.22-1.23 (m， 2H)。
2)化合物 15的合成
冰浴条件下， 化合物 14溶解在 DMF中， 缓慢滴加到 5-氨基戊酸的 DMF溶液中。 滴加 完毕后， 撤去冰浴， 反应过夜。 确认反应完成后， 加入过量的水中， 过滤得到化合物 15。 质 谱分析 （relative intensity): 417 Anal. (C 19 H 35 N 3 0 7 418.25)， 其质谱图如图 5所示。
3)化合物 16的合成
冰浴条件下， 化合物 15加入 TFA中， 反应 lh。 监测反应完毕后， 旋蒸并与甲苯共沸 2 次 ， 得到油状产物。
质谱分析 （relative intensity): 217 Anal. (C 9 H 19 N 3 0 3 218.27) ， 其质谱图如图 6所示。
4)化合物 17的合成
化合物 16溶解在水中， 用 Na 2 C0 3 调节 pH至 8〜9， 加入 K 2 PtC 溶液， 反应进行期间 连续监测 pH值， 保持 pH 8〜9， 反应过夜； 抽滤并干燥， 得黄色固体。
质谱分析 （relative intensity): 482 Anal. (C 9 H 19 C 12 N 3 0 3 Pt 484.18) ，其质谱图如图 7所示。
5)化合物 18的合成
a) 取已连接 RGD 多肽的树脂加入固相反应瓶中， DMF 溶胀后， 依次加入 Cl 2 Pt -Dab-5-AVA-OH, HOBt, DIC， 反应过夜。 检测反应完全后， 抽干， DMF洗 3次， 二氯甲烷洗 3次， 甲醇收縮树脂；
b) 树脂加入裂解液 （TFA:TIS: 水 =95:2.5:2.5)， 搅拌 2h， 过滤并用 TFA洗涤树脂 2次； 反应液旋蒸浓縮至约 50ml反应液后， 倒入已冰浴过的异丙醚 500ml中， 有白色沉淀 析出， 稍静置片刻后， 离心并干燥。 得到白色产物；
c) 用液相制备纯化， 收集纯度大于 95%的产品化合物 18。
质谱分析 （relative intensity): 810 Anal. (C 21 H 39 C 12 N 9 0 8 Pt 810.44) ， 其质谱图如图 8 所示。 实施例 4 化合物 25 (PtCl 2 -Dap-5-AVA-RGQ) 的合成
1) 化合物 20的合成
冰浴条件下， 化合物 1溶解在水中， 4N NaOH溶液缓慢滴加。 滴加完毕后移走冰 浴，与 Boc 2 0溶解在二氧六环溶液混合，继续反应 2h;监测反应完全后，用酸调节 pH=2-3; EA萃取两次； 合并有机相旋干， 得到白色固体；
2) 化合物 21的合成
冰浴条件下， 化合物 20和 HOSu溶解在 EA中， DCC/EA混合溶液缓慢滴加。 滴加完 毕后移走冰浴， 继续反应 2h; 监测反应完全后过滤， 滤液旋蒸白色固体； 加入甲苯， 60°C 水浴搅拌至固体完全溶解； 旋蒸至有固体析出， 冷却放置过夜。 过滤并用少量甲苯和乙 醚洗涤， 干燥箱干燥 2h， 得到白色固体。
取得到的白色固体进行核磁共振分析， 其核磁共振图如图 3所示， 具体数据为： iH NMR (400Hz,CDC13) δ: 5.42 ( s， 1H) ,4.76 ( s， 1H) ,3.81-3.82 (m, 1H)， 3.59-3.63 (m， 2H)， 2.88 (m， 4H)， 1.47(s, 18H)。 质谱分析 (relative intensity): 401 Anal. (C 17 H 27 N 3 0 8 +Na 425.22) ， 其质谱图如图 9所示。 3)化合物 22的合成
冰浴条件下， 化合物 21溶解在 DMF中， 缓慢滴加到 5-AVA-OH的 DMF溶液中。 滴加 完毕后， 撤去冰浴， 反应过夜。 确认反应完成后， 加入过量的水中， 过滤得到 Boc- Dap(Boc)-5-AVA-OH。
4)化合物 23的合成
冰浴条件下， 化合物 22加入 TFA中， 反应 lh。 监测反应完毕后， 旋蒸并与甲苯共 沸 2次 ， 得到油状产物。
质谱分析 （relative intensity): 203 Anal. (C 8 H 17 N 3 0 3 204.10) ， 其质谱图如图 10所示。
5)化合物 24的合成
化合物 23溶解在水中， 用 Na 2 C0 3 调节 pH至 8〜9， 加入 K 2 PtC 溶液， 反应进行期间 连续监测 pH值， 保持 pH8〜9， 反应过夜； 抽滤并干燥， 得黄色固体。
6)化合物 25的合成
a) 取已连接 RGQ多肽的树脂加入固相反应瓶中， DMF溶胀后， 依次加入化合物 24， HOBt, DIC, 反应过夜。 检测反应完全后， 抽干， DMF洗 3次， 二氯甲烷洗 3次， 甲醇收縮树脂；
b) 树脂加入裂解液 （TFA:TIS: 水 =95:2.5:2.5)， 搅拌 2h， 过滤并用 TFA洗涤树脂 2次。
反应液旋蒸至到约 50ml反应液后， 倒入已冰浴过的异丙醚 500ml中， 有白色沉淀析 出， 稍静置片刻后， 离心并干燥。 得到白色产物；
c) 用液相色谱纯化， 收集纯度大于 95%的产品化合物 25。
实施例 5化合物 31 (PtCl 2 -Met-5-AVA- RGN) 的合成
31
1)化合物 27的合成
冰浴条件下， Boc- Met-OH和 HOSu溶解在 EA中， DCC/EA混合溶液缓慢滴加。 滴加 完毕后移走冰浴， 继续反应 2h; 监测反应完全后过滤， 滤液旋蒸白色固体； 加入甲苯， 60 °C水浴搅拌至固体完全溶解； 旋蒸至有固体析出， 冷却放置过夜。 过滤并用少量甲苯 和乙醚洗涤， 干燥箱干燥 2h， 得到白色固体。
2)化合物 28的合成
冰浴条件下， 化合物 27溶解在 DMF中， 缓慢滴加到 5-AVA-OH的 DMF溶液中。滴加 完毕后， 撤去冰浴， 反应过夜。 确认反应完成后， 加入过量的水中， 过滤得到化合物 28。
3)化合物 29 的合成
取化合物 28加入 TFA中， 反应 lh。 监测反应完毕后， 离心收集固体， 以异丙醚洗 涤， 得产物。
4)化合物 30的合成
TFA.H-Met-5-AVA -OH溶解在水中， 用 Na 2 C0 3 调节 pH至 8〜9， 加入 K 2 PtC 溶液， 反 应进行期间连续监测 pH值， 保持 pH 8〜9， 反应过夜； 抽滤并干燥， 得黄色固体。
5)化合物 31的合成
a) 取已连接 RGN多肽的树脂加入固相反应瓶中， DMF溶胀后，依次加入 Cl 2 Pt - Met -5-AVA -OH, HOBt, DIC， 反应过夜， 检测反应完全后， 抽干， DMF洗 3次， 二氯甲烷洗 3次， 甲醇收縮树脂；
b) 树脂加入裂解液 （TFA:TIS: 水 =95:2.5:2.5)， 搅拌 2h， 过滤并用 TFA洗涤树脂 2 次。 反应液旋蒸浓縮至约 50ml反应液后， 倒入已冰浴过的异丙醚 500ml中， 有 白色沉淀析出， 稍静置片刻后， 离心并干燥得到白色产物；
c) 用液相色谱纯化， 收集纯度大于 95%的产品 Cl 2 Pt - Met -5-AVA -RGN。
上述实际例仅为示例性说明， 并不可被认为是对本发明的局限。 如上述的靶向识别序 列，除了上述的 RGD、 RGN，还可以是其他为本领域技术人员所熟知的 三肽，如 RGE、 RGQ 、 HGD、 HGE、 HGN、 HGQ KGD、 KGE、 KGN、 KGQ DGR、 DGK、 NGR等， 也可以是 其他已经报导的具有肿瘤靶向性的多肽。
动物实验：
多肽-顺铂偶联化合物 (PtCl 2 -Orn-5-AVA -RGD)对荷瘤裸鼠的抑瘤作用
细胞系： 人肺鳞癌细胞系 NCI-H1299
实验动物： 健康 Balb-c裸鼠， 雄雌各半， 接种 3-4周后取瘤体直径约 0.3-0.5cm的裸鼠用 于实验。
药品： 多肽-顺铂偶联配合物 RGD-5-AVA-Om-PtCl 2 (批号： zp-2-pl9)、 注射用顺铂 （山 东齐鲁， 批号 203008CF)。
药品的配制： 多肽-顺铂偶联配合物以注射用生理盐水溶解 混匀， 在超净工作台内以 0.22μηι滤头过滤除菌。 取注射用顺铂于超净工作台内以注射用生理盐 水溶解， 混匀备用。
分组： 实验设置阴性对照组、 阳性对照组和 RGD-顺铂配合物实验组 （高、 中、 低剂量 组， 按 6:3:1设置）。 每组包括已造模成功的裸鼠 6只。
剂量： RGD-顺铂配合物的给药量为： 高剂量组 90μΜ.1¾- 中剂量组 30μΜ.1¾- 低剂量 组 10μΜ.1¾- 顺铂组 10μΜ.1¾- ^ 通过尾静脉注射给药， 根据体重确定给药量， 一天 1次、 连给 5天。
实验方法： 健康 Balb-c裸鼠， 雄雌各半， 3 周龄左右， 体重 18-22g。 人肺鳞癌细胞株 NCI-H1299大量培养，用含有 0.01%EDTA的 0.25%胰酶消化， lOOOrpm离心 1.5min，去上清， 加入无血清的 DMEM 培养液重悬沉淀， 细胞计数调整细胞密度， 于裸鼠前右腋下皮下接种 2χ10 6 个细胞 /只，三到四周左右观察，成瘤率达 95%左右，接种 3-4周后取瘤体直径约 0.3-0.5cm 的裸鼠用于实验。
多肽-顺铂偶联配合物以注射用生理盐水溶解 混匀， 在超净工作台内以 0.22μηι滤头过 滤除菌。 取注射用顺铂于超净工作台内以注射用生理盐 水溶解， 混匀备用。 给药前称重， 按
模剂量剂量低剂量顺铂组组高型中 15 体重确定给药量。 以尾静脉注射方式给药， 一天一次， 连续给药 5天， 给药结束后继续观察 9天， 于第 15天将动物处死， 取脏器和肿瘤。
检测指标： 每 2日裸鼠称重并测量瘤体直径， 动态观察药物对受试裸鼠的抗肿瘤效应。 于第 15天将动物处死， 剥取瘤体、 肝脏和肾脏并称重， 计算脏器系数。 以瘤重为指标计算肿 瘤抑制率： 肿瘤抑制率 = ( 1- 给药组平均瘤重 /对照组平均瘤重） χΐοο%。
结果见表 1、 表 2、 表 3、 表 4。 表 1 ζρ-2-ρ19对裸小鼠脏器重量、 脏器系数的影响 （ ± s， n = 6 ) ~~体重 肿瘤 肝脏 肾脏 脾脏
组 /g 重量 /g L 重量 /g L 重量 /g L 重量 /g L ~
18.7
0.522 0.0279 1.2633 0.0679 0.327 0.0175 0.0883 0.00473 士 0.97
±0.180 ±0.0108 ±0.0840 士 0.00710 ±0.0528 士 0.00300 士 0.00750 ±0.00361 4
20.5 0.418 0.0204 1.62 0.0664 0.342 0.0166 0.0917 0.0045 ±2.81 ±0.182 士 0.00970 ±0.870 ±0.0310 ±0.0717 ±0.0015 ±0.0279 ±0.0009
19.3 0.932 0.0484 1.2367 0.0642 0.3050 0.0158 0.100 0.00520 ±1.04 ±0.438 士 0.0224 ±0.116 士 0.00481 士 0.0356 ±0.00110 士 0.0358 ±0.00181
0.00300
14.1 0.398 0.0282 1.04 0.0724 0.262 0.0191 0.0417
±0.00176 ±2.72 ±0.192 ±0.0182 ±0.318 ±0.0142 士 0.0445 士 0.00438 士 0.0264 *
0.00491
21.9 0.758 0.0346 1.42 0.0648 0.387 0.0176 0.107
±0.00055 ±3.17 ±0.429 ±0.0272 ±0.283 ±0.00809 士 0.0841 ±0.00175 ±0.0137
2
*— P<0.05 , 与空白组比较。
表 2 zp-2-pl9对裸小鼠体重的影响 （x± s， n = 6 ) 给药前 2d 4d 6d 8d 10d 12d 14d
1¾齐11量 19.2士 1.2 18.4士 1.2 18.2士 1.2 16.5士0.8 16.5士 0.7 17.2士 0.9 18.0士 1.0 18.3士0.9 中剂量 18.4士 1.4 17.5士 1.2 17.8士 1.2 17.9士 2.3 18.7士 2.5 19.6士 3.0 20.3士3.1 20.2士 2.8 低剂量 19.2士 0.8 18.4士 0.9 18.7士 0.8 18.4士 1.0 19.2士 1.0 19.5士 1.0 19.8士1.1 19.8士1.0 顺铂组 18.8士1.6 17.3士1.7 16.9士1.8 15.0士 1.9 13.7士1.8 13.5士2.5 14.0士 2.1 14.4士 1.9 模型组 21.1士0.8 22.4士 0.5 23.4士 1.1 22.4士 2.7 22.3士 2.4 22.4士 2.2 22.4士 2.8 22.7士 2.7 表 3、 zp-2-pl9对裸小鼠肿瘤体积的影响 （^± s， n = 6 ) 给药前 2d 4d 6d 8d lOd 12d 14d 71.3士 101.21士 138.8士 182.8士 9 277.7士 367.2士 453.7士 579.0士 507.7士
1¾齐11量
38.9 58.8 103.2 9.2 172.3 157.3 180.3 127.5 128.6
63.6士 109.7士 129.4士 195.3士 251.3士 327.1士 446.8士 484.2士 420.7士 中剂量
30.2 50.7 74.1 135.9 135.4 160.0 172.3 179.3 162.3
88.7士 252.5士 313.8士 465.7士 590.8士 680.0士 752.5士 810.6士 851.9士 低剂量
28.1 112.0 186.4 251.2 286.4 354.5 405.3 429.9 412.1
78.5士 268.0士 307.4 352.6 341.7 390.2 414.5 417.6 339.1士 顺铂组
20.1 165.3 士 169.5 ±178.1 ±173.0 士 221.9 士 204.4 ±189.3 177.7
62.3士 141.1 181.4 226.4 322.6 427.2 585.7 769.9 807.65士 模型组
19.5 ±40.0 ±97.8 士 221.6 ±273.4 ±344.3 ±387.0 ±487.3 495.5
(单位： 立方毫米）
表 4、 zp-2-pl9的抑瘤率 ( x± s, 组别 抑瘤率 （瘤重） （％)
高齐 U量 41.21%
中剂量 31.91%
低剂量 12.86%
顺铂组 52.95%
结果表明： 在表 1中， 对各剂量组裸小鼠脏器重量、 脏器系数进行统计学分析， 顺铂组 动物的肝脏、 肾脏显著肿大， 脾脏萎縮， 从脏器系数的相关数据， 显示顺铂对肝脏、 肾脏、 脾脏都具有明显的毒性， 而 zp-2-pl9各剂量组均无出现明显的肝脏、 肾脏、 脾脏毒副作用。 在表 2中， 从实验 14天的体重变化趋势， 与模型组对比， 顺铂组动物在给药第二天开始即出 现明显的下降趋势， 虽然给药结束后有一定程度回升， 但仍明显小于 zp-2 pl9实验组及模型 组， 而 zp-2-pl9各剂量组均无出现明显的体重改变。 在表 3中， 从实验前后肿瘤体积的变化 情况， 与模型组相比， zp-2-pl9 各剂量组和顺铂组均显示出较好的抑瘤效果， 从瘤体体积变 化趋势可见 zp-2的抑瘤作用具有一定的量效关系。在表 4中， 可见 zp-2-pl9与顺铂组均具有 较好的抑瘤效果， 且 zp-2-pl9的抑瘤作用与给药剂量有关。 多肽-顺铂偶联化合物 (zp-2-pl9)对昆明小鼠的急性毒性作用
实验动物： 健康昆明小鼠， 雄雌各半， 4周龄左右， 体重 18-22g， 购自广东省医学实验 动物中心。
药品的配制： zp-2-pl9以注射用生理盐水溶解， 混匀， 在超净工作台内以 0.22μηι滤头过 滤除菌。 取注射用顺铂于超净工作台内以注射用生理盐 水溶解， 混匀备用。
分组： 预先采用少量动物逐步摸索出上下限量， 即使全部动物死亡的最小剂量（Dm)和 一个动物也不死亡的最大剂量 （Dn)。 根据预实验结果确定实验组数和剂量， 将动物分为 7 个剂量组。
方法： 采用随机方法进行分组， 按体重自低到高排序编号， 依随机数字表法分组。
数量： 满足统计学要求， 通常每个剂量组至少包括 10只动物。
剂量： 在预试的基础上进行正式试验。 Zp-2剂量分别设为 152.82mg.kg- 230 mg.kg 1 , 305.64 mg.kg" 1 382.05 mg.kg" 1 420.26 mg.kg" 1 458.46 mg.kg" 1 611.28 mg.kg— 1 七组。 顺铂剂 量设为 5.00 mg.kg" 1 8.75 mg.kg" 1 13.10 mg.kg" 1 17.50 mg.kg" 1 26.25 mg.kg" 1 35.00 mg.kg" 1 52.50 mg.kg— 1 七组。
给药方法： 给药前禁食 6-12小时， 给药后再禁食 3-4小时。
给药途径： 尾静脉注射。
检测指标： 观察动物体重、 饮食、 外观、 行为、 分泌物、 排泄物及中毒症状等变化， 记 录动物的死亡情况、 中毒症状及中毒反应的起始时间、 严重程度、 持续时间等并分别在给药 前 （D0)、 给药后第 3天 （D3)、 第 5天 （D5 ) 称量动物体重。 结果见表 5、 表 6。
表 5 zp-2-p!9对 KM小鼠的急性毒性
(mg-kg 1 ) 动物数 （只） 死亡数 （只） 死亡百分率 （％)
152.82 10 0 0.00
230.00 10 0 0.00
305.64 10 1 10.00
382.05 10 3 30.00
420.26 10 4 40.00
458.46 10 7 70.00
611.28 10 10 100.00
半数致死量 LD 5Q =419.08mg.kg- 1 (相当于摩尔质量的 521.05μΜ.1¾- LD 50 (Feiller校正) 95%的可信限 =382.66-462.49mg.kg— 表 6 顺铂对 KM小鼠的急性毒性
齐 LI量 (mg.kg -1 ) 动物数 （只） 死亡数 （只） 死亡百分率 （％)
5.00 10 0 0.00
8.75 10 1 10.00 13.10 10 3 30.00
17.50 10 7 70.00
26.25 10 9 90.00
35.00 10 10 100.00
52.50 10 10 100.00 半数致死量 LD5 l5.029mg.kg- 1 (相当于摩尔浓度的 50.08μΜ.1¾- ^
LD 50 (Feiller校正) 95%的可信限 =12.208-18.051mg.kg—
表 7 zp-2及顺铂对 KM小鼠的半数致死量
组别 回归方程 LD 50 ( μΜ-kg-
Zp-2 y(Probit)= -25.887+11.779Log(D) 521.05
顺铂 y(Probit)= :-2.102+6.0344Log(D) 50.08
结果表明： 在表 5中， zp-2-pl9对 KM小鼠的急性毒性结果表明， zp-2 pl9的安全范围 较大， LD 5Q 达到 419.08mg.kg- 表 6中， 顺铂对 KM小鼠的急性毒性结果表明， 顺铂的安全 范围较小， LD 5 o为 15.029mg.kg- 表 7中， zp-2 pl9及顺铂对 KM小鼠的半数致死量结果表 明， 由于 zp-2 pl9可选择性与整合素受体特异性结合， 对正常脏器组织的影响较小， 因此毒 性显著降低， 安全范围大。 而顺铂作为传统的细胞毒类抗肿瘤药物， 对肿瘤细胞的选择性低， 在损伤肿瘤细胞的同时， 对正常的组织细胞也有一定程度的损伤， 毒性明显， 安全范围较小。