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See also references of EP 3372249A4
| REIVINDICACIONES 1.- Un vector adenoasociado (VAA), CARACTERIZADO porque comprende un genoma viral recombinante donde dicho genoma comprende un cásete de expresión que comprende una región reguladora de la transcripción específica de tejido neuronal unido operativamente a un polinucleotido de interés UPRplus codificante para una proteína de fusión. 2 - Un vector adenoasociado, de acuerdo con la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque el serotipo del VAA está seleccionado de un grupo que comprende VAA2, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAA10, VAA11 y AAVs pseudotipados. 3 - Un vector adenoasociado, de acuerdo con la reivindicación 2, CARACTERIZADO porque el serotipo del VAA es VAA 2. 4 - Un vector adenoasociado, de acuerdo con las reivindicaciones 1 , 2 y 3, CARACTERIZADO porque la región reguladora de la transcripción comprende una región de promotor seleccionada del grupo que comprende de CMV, PGK1, CAMKII, T Y† , GAD34, entre otros. 5.- Un vector adenoasociado, de acuerdo con las reivindicación 4, CARACTERIZADO porque la región de promotor seleccionada del grupo es CMV 6.- Un vector adenoasociado, de acuerdo con las reivindicaciones 1 , 2 y 3, CARACTERIZADO porque comprende una región codificante para un sitio de respuesta inmune seleccionada del grupo Ha, Flag, Gfp, His y Myc, entre otras. 7.- Un vector adenoasociado, de acuerdo con las reivindicación 6, CARACTERIZADO porque la región codificante para un sitio de respuesta inmune que es Ha. 8 - Un vector adenoasociado, de acuerdo con las reivindicación 4, CARACTERIZADO porque el tipo de serotipo del vector adenoasociado entrega la especificidad del tipo celular que expresará el trasgen dado el tropismo de cada serotipo. 9 - Un vector adenoasociado, de acuerdo con las reivindicación 8, CARACTERIZADO porque el tipo de serotipo del vector adenoasociado es específico para el tipo celular neurona específico. 10. - Un vector adenoasociado, de acuerdo con las reivindicación 9, CARACTERIZADO porque el tipo de serotipo del vector adenoasociado es del número 2 y/o un vector pseudotipado 2/6. 11. - Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicaciones anteriores, CARACTERIZADO porque el cásete de expresión comprende una región regulatoria post-transcripcional. 12. - Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicación 1 1 , CARACTERIZADO porque la región regulatoria post-transcipcional es el elemento de regulación post-transcipcional del virus de la hepatitis de la marmota americana (WPRE). 13. - Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicación 1 a 12, CARACTERIZADO donde los IRTs del virus adenoasociado son IRTs derivados de VAA2, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAA10, VAA1 1 y AAVs pseudotipados, de preferencia VAA2. 14. - Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicaciones 1 a 13, CARACTERIZADO porque las secuencias objetivo UPRplus a transcribir comprende a XBP1s, ATF6f y una secuencia puente o linker. 15 - Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicación 14, CARACTERIZADO porque la secuencia puente comprende las secuencias LGF, L4H4 y LF. 16 - Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicaciones 14 y 15, CARACTERIZADO porque la secuencia objetivo a transcribir es XBP1s-LGF- ATF6f-HA. 17.- Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicaciones 14 y 15, CARACTERIZADO porque la secuencia objetivo a transcribir es XBP1s-LF- ATF6f-HA. 18. - Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicaciones 14 y 15, CARACTERIZADO porque la secuencia objetivo a transcribir es XBP1s-L4H4- ATF6f-HA. 19. - Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicaciones 14 y 15, CARACTERIZADO porque la secuencia objetivo a transcribir es ATF6f-LGF- XBP1s-HA. 20.- Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicaciones 14 y 15, CARACTERIZADO porque la secuencia objetivo a transcribir es ATF6f-LF- XBP1s-HA. 21. - Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicaciones 14 y 15, CARACTERIZADO porque la secuencia objetivo a transcribir es ATF6f-L4H4- XBPIs-HA. 22. - Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicaciones 1 a 21 , CARACTERIZADO porque el polinucleotido de interés, codifica proteínas de fusión dentro del grupo que comprende a XBP1s-LGF-ATF6f-HA, XBP1s-LF- ATF6f-HA, XBP1s-L4H4-ATF6f-HA, ATF6f-LGF-XBP1 s-HA, A TF6Í-LF-XBP1 s- HA y ATF6f-L4H4-XBP1s-HA, las cuales actúan sistémicamente cerca o con células neuronales. 23.- Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicación 22, CARACTERIZADO porque el polinucleotido de interés, codifica la proteína de fusión XBP1s-LGF-ATF6f-HA. 24. - Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicación 22, CARACTERIZADO porque el polinucleotido de interés, codifica la proteína de fusiónXBPI s-LF-ATF6f-HA. 25. - Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicación 22, CARACTERIZADO porque el polinucleotido de interés, codifica la proteína de fusión XBP1s-L4H4-ATF6f-HA. 26. - Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicación 22, CARACTERIZADO porque el polinucleotido de interés, codifica la proteína de fusión ATF6f-LGF-XBP1s-HA. 27 - Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicación 22, CARACTERIZADO porque el polinucleotido de interés, codifica la proteína de fusión ATF6f-LF-XBP1s-HA. 28. - Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicación 22, CARACTERIZADO porque el polinucleotido de interés, codifica la proteína de fusión ATF6f-L4H4-XBP1s-HA. 29. - Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicación 22, CARACTERIZADO porque el polinucleotido de interés que actúa sistémicamente cerca o con células neuronales, es específico para células involucradas en neurodegeneración. 30 - Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicación 22 y 29, CARACTERIZADO porque el polinucleotido de interés que actúa sistémicamente cerca o con células neuronales, es específico para células involucradas en las enfermedades de Parkinson y Huntington. 31. - Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicación 30, CARACTERIZADO porque el polinucleotido de interés que actúa sistémicamente cerca o con células neuronales, es específico para células involucradas en la enfermedad de Parkinson, de preferencia en las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra, además es específico para células neuronales gabaérgicas llamadas neuronas medio-espinal (MSN) del cuerpo estriado, involucradas en la enfermedad de Huntington. 32. - Una composición farmacéutica, CARACTERIZADA porque comprende un vector adenoasociado descrito en las reivindicaciones anteriores y excipientes farmacéuticamente aceptables. 33. - Una composición farmacéutica, según la reivindicación 32, CARACTERIZADA porque comprende una dosis del virus en un rango entre 109 a 1013 copias de genoma (CG) por mi de composición. 34 - Uso de una composición farmacéutica, según la reivindicación 32, CARACTERIZADO porque es útil en preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa. 35. - Uso de un vector adenoasociado, según la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque es útil en preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, en un mamífero. 36. - Uso de un vector adenoasociado, según la reivindicación 35, CARACTERIZADO porque es útil en preparación de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades de Parkinson y/o Huntington. 37. - Uso de un vector adenoasociado, según la reivindicación 35, CARACTERIZADO porque ese mamífero es un humano. 38. - Uso de un vector adenoasociado, según la reivindicación 35, CARACTERIZADO donde el vector adenoasociado o la composición farmacéutica es administrada sistémicamente o localmente. 39. - Uso de un vector adenoasociado, según la reivindicación 35, CARACTERIZADO donde el vector adenoasociado o la composición farmacéutica requiere la expresión del polinucleótido de interés en el tejido neuronal. 40. - Método de aplicación terapéutico con un vector adenoasociado, según la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque comprende: a: poner en contacto las células neuronales con el virus adenoasociado descrito en las reivindicaciones 1 a 31 ; y b: expresión del virus en las células neuronales. 41. - Método de aplicación terapéutico con un vector adenoasociado, según la reivindicación 40, CARACTERIZADO, porque las vías de administración están supeditadas al paso del virus de la barrera hemato-encefálica y comprenden la vía nasal; por inyección directa intraventricular y/o intratecal, entre otras. 42. - Un polinucleótido CARACTERIZADO, porque comprende un cásete de expresión flanqueado por los ITRs de un virus adenoasociado, donde dicho cásete de expresión comprende un promotor, una región codificante para respuesta inmune y un polinucleótido de interés que codifica una proteína de fusión. 43. - Un polinucleótido, según la reivindicación 42, CARACTERIZADO, porque la región del promotor es seleccionado del grupo que comprende CMV, PGK1, CAMKII, 77- Y1 y GAD34 entre otros. 44. - Un polinucleótido, según la reivindicación 43, CARACTERIZADO porque la región de promotor seleccionada del grupo es CMV. 45.- Un polinucleótido, de acuerdo con las reivindicación 42, CARACTERIZADO porque comprende una región codificante para un sitio de respuesta inmune seleccionada del grupo Ha, Flag, Gfp, His y Myc, entre otras. 46. - Un polinucleótido, de acuerdo con las reivindicación 45, CARACTERIZADO porque comprende la región codificante para un sitio de respuesta inmune es Ha. 47. - Un polinucleótido, de acuerdo con las reivindicación 42, CARACTERIZADO porque el tipo de serotipo del vector adenoasociado entrega la especificidad del tipo celular que expresará el trasgen dado el tropismo de cada serotipo. 48. - Un polinucleótido, de acuerdo con las reivindicación 47, CARACTERIZADO porque el tipo de serotipo del vector adenoasociado es específico para el tipo celular neurona específico. 49. - Un polinucleótido, de acuerdo con las reivindicación 48, CARACTERIZADO porque el tipo de serotipo del vector adenoasociado es del número 2 y/o un vector pseudotipado 2/6. 50. - Un polinucleótido, de acuerdo a la reivindicaciones 42 a 49, CARACTERIZADO porque el cásete de expresión comprende además una región regulatoria post-transcripcional. 51 - Un polinucleótido, de acuerdo a la reivindicación 50, CARACTERIZADO porque la región regulatoria post-transcipcional es el elemento de regulación post-transcipcional del virus de la hepatitis de la marmota americana (WPRE). 52.- Un polinucleótido, de acuerdo a la reivindicaciones 42 a 51 , CARACTERIZADO porque las secuencias objetivo a transcribir comprende a XBP1 s-L GF-A TF6f-HA , XBP 1 s-LF-A TF6f-HA , XBP1 s-L4H4-ATF6f-HA, ATF6Í- LGF-XBP1 s-HA, A TF6f-LF-XBP1 s-HA y ATF6f-L4H4-XBP1s-HA, las cuales actúan sistémicamente cerca o con células neuronales. 53.- Un polinucleótido, de acuerdo a la reivindicación 52, CARACTERIZADO porque las secuencias objetivo a transcribir es XBP1s-LGF-ATF6f-HA. 54. - Un polinucleótido, de acuerdo a la reivindicación 52, CARACTERIZADO porque las secuencias objetivo a transcribir es XBP1 s-LF-ATF6f-HA. 55. - Un polinucleótido, de acuerdo a la reivindicación 52, CARACTERIZADO porque las secuencias objetivo a transcribir es XBP1 s-L4H4-ATF6f-HA. 56. - Un polinucleótido, de acuerdo a la reivindicación 52, CARACTERIZADO porque las secuencias objetivo a transcribir es ATF6f-LGF-XBP1 s-HA. 57. - Un polinucleótido, de acuerdo a la reivindicación 52, CARACTERIZADO porque las secuencias objetivo a transcribir es ATF6f-LF-XBP1s-HA. 58.- Un polinucleótido, de acuerdo a la reivindicación 52, CARACTERIZADO porque las secuencias objetivo a transcribir es ATF6f-L4H4-XBP1 s-HA. 59.- Un polinucleotido, de acuerdo a la reivindicaciones 42 a 58, CARACTERIZADO porque el polinucleotido de interés, codifica proteínas dentro del grupo que comprende XBP1 s-LGF-ATF6f-HA, XBP1 s-LF-ATF6f-HA, XBP1s-L4H4-ATF6f-HA, ATF6f-LGF-XBP1s-HA, ATF6f-LF-XBP1 s-HA y ATF6f- L4H4-XBP1s-HA, las cuales actúan sistémicamente cerca o con células neuronales. 60.- Un polinucleotido, de acuerdo a la reivindicación 59, CARACTERIZADO porque el polinucleotido de interés, codifica la proteína XBP1s-LGF-ATF6f-HA. 61. - Un polinucleotido, de acuerdo a la reivindicación 59, CARACTERIZADO porque el polinucleotido de interés, codifica la proteína XBP1s-LF-ATF6f-HA. 62. - Un polinucleotido, de acuerdo a la reivindicación 59, CARACTERIZADO porque el polinucleotido de interés, codifica la proteína XBP1s-L4H4-ATF6f-HA. 63. - Un polinucleotido, de acuerdo a la reivindicación 59, CARACTERIZADO porque el polinucleotido de interés, codifica la proteína ATF6f-LGF-XBP1s-HA. 64. - Un polinucleotido, de acuerdo a la reivindicación 59, CARACTERIZADO porque el polinucleotido de interés, codifica la proteína ATF6f-LF-XBP1s-HA. 65.- Un polinucleotido, de acuerdo a la reivindicación 59, CARACTERIZADO porque el polinucleótido de interés, codifica la proteína ATF6f-L4H4-XBP1s-HA. 67.- Un polinucleótido, de acuerdo a la reivindicación 42, CARACTERIZADO porque el polinucleótido de interés que actúa sistémicamente cerca o con neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra. 68 - Un polinucleótido, de acuerdo a la reivindicación 67, CARACTERIZADO porque el polinucleótido de interés que actúa sistémicamente cerca o con neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra 69.- Un plásmido, CARACTERIZADO porque comprende las secuencias de un adenoasociado, un cásete de expresión flanqueado por los ITRs del virus adenoasociado, donde dicho cásete de expresión comprende un promotor, una región codificante para respuesta inmune y un polinucleótido de interés, tal como el depositado en el organismo internacional de depósito biológico, Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile, INIA, con el número de depósito RGM 2231. 70.- Un plásmido, CARACTERIZADO porque comprende las secuencias de un virus adenoasociado, un cásete de expresión flanqueado por los ITRs del virus adenoasociado, donde dicho cásete de expresión comprende un promotor, una región codificante para respuesta inmune y un polinucleótido de interés, tal como el depositado en el organismo internacional de depósito biológico, Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile, INIA, con el número de depósito RGM 2232. 71.- Un plásmido, CARACTERIZADO porque comprende las secuencias de un adenoasociado, un cásete de expresión flanqueado por los ITRs del virus adenoasociado, donde dicho cásete de expresión comprende un promotor, una región codificante para respuesta inmune y un polinucleotido de interés, tal como el depositado en el organismo internacional de depósito biológico, Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile, INIA, con el número de depósito RGM 2233. 72 - Un plásmido, CARACTERIZADO porque comprende las secuencias de un adenoasociado, un cásete de expresión flanqueado por los ITRs del virus adenoasociado, donde dicho cásete de expresión comprende un promotor, una región codificante para respuesta inmune y un polinucleotido de interés, tal como el depositado en el organismo internacional de depósito biológico, Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile, INIA, con el número de depósito RGM 2234. 73.- Un plásmido, CARACTERIZADO porque comprende las secuencias de un adenoasociado, un cásete de expresión flanqueado por los ITRs del virus adenoasociado, donde dicho cásete de expresión comprende un promotor, una región codificante para respuesta inmune y un polinucleotido de interés, tal como el depositado en el organismo internacional de depósito biológico, Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile, INIA, con el número de depósito RGM 2235. 74. - Un plásmido, CARACTERIZADO porque comprende las secuencias de un adenoasociado, un cásete de expresión flanqueado por los ITRs del virus adenoasociado, donde dicho cásete de expresión comprende un promotor, una región codificante para respuesta inmune y un polinucleotido de interés, tal como el depositado en el organismo internacional de depósito biológico, Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile, INIA, con el número de depósito RGM 2236. 75. - Un virus adenoasociado, CARACTERIZADO porque comprende el genoma viral descrito en las reivindicaciones 42 a 64. 76. - Un método para obtener un vector viral adenoasociado CARACTERIZADO porque comprende los pasos de: a - proveer una célula que comprende un polinucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 42 a 64, con las proteínas VAA Cap, con las proteínas VAA Rep y las proteínas virales de las cuales depende VAA para su replicación; b.- mantener las células bajo condiciones adecuadas para el ensamblaje del VAA; y c- purificar el vector viral adenoasociado producido por la célula. 77.- Un método, de acuerdo a la reivindicación 76, CARACTERIZADO porque el VAA es dependiente de la replicación derivada desde el adenovirus. 78. - Un método, de acuerdo a las reivindicaciones 69 y 76, CARACTERIZADO porque las proteínas Cap y Rep del virus adenoasociado son derivadas desde un VAA seleccionado de los serotipos VAA2, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAA10, VAA11 y AAVs pseudotipados. . 79. - Un método, de acuerdo a las reivindicación 78, CARACTERIZADO porque las proteínas Cap y Rep del virus adenoasociado es derivado desde el serotipo VAA2. |
TRATAMIENTO GENETICO Y SU USO EN EL TRATAMIENTO ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS, TALES COMO LA ENFERMEDAD DE PARKINSON Y
HUNTINGTON, ENTRE OTRAS
CAMPO TÉCNICO DE LA PRESENTE INVENCIÓN
La presente invención se aplica en el campo de la medicina, específicamente en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, mediante el uso de los virus adeno-asociados (AAV) que sobre-expresan la proteína de fusión entre XBP1s, un conector y ATF6f en neuronas del sistema nervioso central (SNC), recuperando y mejorando problemas neurodegenerativos, de preferencia las enfermedades de Parkinson y Huntington.
ANTECEDENTES Y DESCRIPCIÓN DEL ESTADO DEL ARTE
La investigación científica sobre las enfermedades del SNC ha sido de gran interés en los últimos años, sobre todo las enfermedades relacionadas con alteraciones cognitivas y motoras. El tratamiento de enfermedades relacionadas con problemas de neurodegeneración no tiene hoy enfoques terapéuticos genéticos para disminuir los síntomas.
En la búsqueda para el tratamiento de estas enfermedades motoras y cognitivas, se han identificado los factores de transcripción llamados XBP1 y ATF6 cuya función está involucrada en los mecanismos biológicos y moleculares en los procesos de mejora del plegamiento proteico y su agregación. Principalmente la nueva proteína de fusión pretende activar la transcripción de grupos de genes involucrados en mejorar del plegamiento proteico. Luego mediante una reprogramación de la transcripción de genes específicos que participan en el plegamiento de proteínas, tales como chaperonas, disminuir su agregación. El fenómeno de agregación proteica es una característica común en las enfermedades neurodegenerativas y causa de la muerte neuronal selectiva. Las terapias farmacológicas existentes hoy en día son de carácter paliativo, ya que, están enfocadas a disminuir los síntomas de los pacientes que sufren estas enfermedades y no frenan la muerte selectiva de las neuronas. En general consisten en terapias farmacológicas que regulan los niveles de neurotransmisores que son alterados, debido a la muerte de grupos neuronales fundamentales para la correcta función del cerebro. Un ejemplo de este tipo de terapia es la administración de L-dopa y sus derivados farmacológicos a los pacientes de Parkinson. Este compuesto es capaz de restaurar los niveles de dopamina en los pacientes, pero no frena la muerte selectiva de las neuronas dopaminergicas, que causan esta enfermedad. La presente propuesta se enfoca a frenar la muerte neuronal mediante terapia génica y producir un tratamiento efectivo y definitivo a este tipo de patologías.
Existen otras patologías referentes a males neuro-motores como es el caso de la enfermedad de Huntington, donde sus tratamientos son limitados o inexistentes. Esta enfermedad es una patología neurodegenerativa hereditaria dominante producida por una mutación del gen IT15, codificante de la proteína Huntingtina. La mutación se traduce en la expansión de un segmento poli- glutamina (poliQ) en el extremo N-terminal de la proteína, debido a lo cual se generan agregados proteicos en las neuronas medio-espinal (MSN) de la región del cuerpo estriado. Esto desencadena degeneración neuronal y los síntomas característicos de la enfermedad como la progresiva pérdida del control de movimientos musculares voluntarios (corea), síntomas psiquiátricos y demencia (Atwal, 2007).
En general la propuesta de la utilización de una proteína de fusión sintética no ha sido abordada hasta hoy, existen publicaciones tales como WO2004/1 11 194 y WO2006/028889, las cuales apuntan a la formación de proteínas recombinantes que codifican para XBP1 , elF2a, S51A y ATF (Las formas posteriores a la deleción por splicing), separadas, no como una proteína de fusión, con lo cual no se busca optimizar en un solo constructo la mejora en el control de las enfermedades neurodegenerativas. Por otro lado, individualmente existen documentos que apuntan al decrecimiento endógeno de XBP1 , tal como se presenta en la patente US2013197023, que se correlaciona con el aumento en la capacidad de plegamiento del retículo endoplasmático (RE) requerido para mantener la homeostasis celular. Esta regulación negativa individual de la expresión de XBP1 , se ha visto implicada en la generación de neuroprotección en la enfermedad de Huntington y en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), como se presenta en la solicitud de patente WO2010/008860.
Otra patente relevante con respecto a la medición de estrés de RE, en donde está implicado el factor de transcripción XBP1 es la patente japonesa JP2007129970.
En general, este desarrollo se refiere a la síntesis y viabilidad de un nuevo péptido conformado entre XBP1s, un conector y ATF6f para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas tales como la Enfermedad de Parkinson y Huntington, sin restringirse solo a éstas.
Una de las patentes que se acercan a este enfoque es la solitud de patente Chilena 3590-2014, la cual presenta un método de tratamiento genético para mejorar la memoria con un virus recombinante AAV/XBP1S-HA. Este tratamiento acerca el péptido XBP1s-HA para la mejora de una función cognitiva, no el tratamiento de una enfermedad. Por otro lado, no se habla de una proteína de fusión funcional que involucra, dentro de sus componentes a XBP1s.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
Estudios recientes indican que la alteración crónica de la homeostásis proteica en el RE (Retículo Endoplasmático) es un evento patológico transversal observado en prácticamente todas las enfermedades neurodegenerativas asociadas al mal plegamiento de proteínas como la enfermedad de Alzheimer, Parkinson, Huntington, Esclerosis Lateral Amiotrófica, entre otras. Diferentes condiciones interfieren con el proceso de síntesis y plegamiento de proteínas en el lumen del RE, generando una acumulación anormal de proteínas mal plegadas. Esta condición, denominada estrés de RE, puede ser promovida por la expresión de ciertas proteínas mutantes, como también producto de la alteración en el proceso de síntesis y maduración de proteínas. En respuesta a este fenómeno es activada una cascada de señalización intracelular integrada denominada UPR. La activación de la UPR resulta en diferentes cambios de expresión génica que tienen efectos globales en la homeostasis proteica, disminuyendo, por ejemplo, los niveles de agregación anormal y mal plegamiento de proteínas producto de:
(i) un aumento en la expresión de chaperonas y foldasas;
(ii) una mejora en el control de la calidad de proteínas; y
(iii) la eliminación masiva de proteínas defectuosas.
La UPR tiene como objetivo inicial recuperar el equilibrio proteico, manteniendo la viabilidad celular. Sin embargo, el estrés del RE en forma crónica lleva a la muerte celular por apoptosis, fenómeno observado en diversas patologías neurodegenerativas.
La fase inicial de la UPR está mediada por tres "sensores de estrés" de
RE:
1) PERK (Del inglés double-stranded RNA activated protein kinase [PRK] like endoplasmic reticulum kinase);
2) ATF6 (del inglés activating transcription factor 6); y
3) IRE1 (del inglés inositol requiring kinase 1)
Cada uno de estos sensores transduce información sobre el estado de plegamiento en el lumen del RE hasta el núcleo mediante el control de factores de transcripción específicos, donde destaca XBP1 (del inglés X-Box binding prote¡n-1). XBP1 regula una serie de genes involucrados en el control de calidad de proteínas, plegamiento, entre otros procesos. Estas tres vías adaptativas actúan de forma concertada, manteniendo la homeostasis proteica y la sobrevida celular. A diferencia de las respuestas dependientes de ATF6 y XBP1 , la señalización mediada por el sensor PERK también se ha asociado a efectos pro-apoptóticos. Estas definiciones previas, en conjunto, han colaborado en desarrollar este proyecto para definir el impacto de la UPR en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, además de diseñar nuevos modelos animales para medir estas respuestas.
Existen evidencias previas que han descrito que una ganancia de la función de XBP1 genera el freno del proceso neurodegenerativo en modelos animales de tres enfermedades neurodegenerativas, enfermedad de huntington, enfermedad de Parkinson y Esclerosis lateral amiotrofica. Por otra parte se ha determinado también que la deficiencia del factor de transcripción ATF6 causa una pérdida de la capacidad de resistencia a la muerte neuronal determinada en modelos preclínicos de enfermedad de Parkinson. Estos antecedentes nos indican la importancia de estos factores de transcripción en procesos neurodegenerativos que cursan por la formación de agregados proteicos tóxicos. Por lo tanto, UPRplus® se basa en la fusión de dos componentes activos de la UPR, tales como XBP1 , ATF6 y un conector.
Actualmente el desarrollo UPRplus ha sido generado y presenta actividad transcripcional específica de un grupo (clúster) de genes relacionados con UPR. UPRplus es una proteína de fusión y potencialmente es capaz de participar en el proceso de aliviar la carga de agregados proteicos tóxicos en neuronas. Un primer aspecto de la presente invención se relaciona con un método para tratar enfermedades neurodegenerativas en los procesos cognitivos y motores en mamíferos, de preferencia en humanos, utilizando un virus que induce la sobreexpresión neuronal de UPRplus en el sistema nervioso central. Un segundo aspecto de la presente invención provee un para tratar enfermedades neurodegenerativas en los procesos cognitivos y motores. El método comprende la administración intravenosa y/o intraperitoneal y/o intracraneal y/o intramedular y/o intranasal y/o intraneural y/o cualquier via que introduzca el virus al cerebro pasando la barrera hemato-encefálica de un paciente o sujeto. El virus induce la sobreexpresión neuronal de UPRplus en un rango de dosis de 1 x 10 6 a 1 x 10 30 unidades virales por individuo.
Un tercer aspecto de la presente invención es una forma de composición farmacéutica intravenosa y/ó intraperitoneal y/o intracraneal y/o intramedular y/o intranasal y/o intraneural y/o cualquier forma que conduzca el virus que induce la sobreexpresión neuronal de UPRplus al cerebro, pasando la barrera hemato-encefálica, con rangos de dosis como los presentados previamente y un vehículo farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, las capacidades cognitivas y motoras.
Un cuarto aspecto de la presente invención es el uso de un virus que induce la sobreexpresión neuronal de UPRplus y sus compuestos derivados proteicos porque sirve para preparar un medicamento útil en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, las capacidades cognitivas y motoras.
Un quinto aspecto de la presente invención es un virus del tipo adeno- asociado (AAV) que presenta la secuencia del virus y un inserto con una secuencia nucleotídica descrita en la Tabla I o cualquiera de sus variantes, contenidos en la bacteria Escheríchia coli transformada con el plásmido depositado en el organismo internacional de depósito biológico, Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile, INIA, con el número de depósito RG 2235, donde se sobre-expresa el factor de transcripción neuronal XBP1s-LFG- ATF6f (UPR-Plus 5), de preferencia en el sistema nervioso central o cualquier variante del fragmento, que codifique o sobre-exprese esta alternativa del factor de transcripción neuronal de UPRplus en mamíferos, de preferencia en humanos.
Un sexto aspecto de la presente invención es un virus del tipo adeno- asociado (AAV) que presenta la secuencia del virus y un inserto con una secuencia nucleotídica descrita en las Tabla II o cualquiera de sus variantes, contenidos en la bacteria Escherichia coli transformada con el plásmido depositado en el organismo internacional de depósito biológico, Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile, INIA, con el número de depósito RGM 2234, donde se sobreexpresa el factor de transcripción neuronal XBP1s-LF- ATF6f (UPR-Plus 4), de preferencia en el sistema nervioso central o cualquier variante del fragmento, que codifique o sobre-exprese esta alternativa del factor de transcripción neuronal de UPRplus en mamíferos, de preferencia en humanos.
Un séptimo aspecto de la presente invención es un virus del tipo adeno- asociado (AAV) que presenta la secuencia del virus y un inserto con una secuencia nucleotídica descrita en las Tabla III o cualquiera de sus variantes, contenidos en la bacteria Escherichia coli transformada con el plásmido depositado en el organismo internacional de depósito biológico, Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile, INIA , con el número de depósito RGM 2236, donde se sobreexpresa el factor de transcripción neuronal XBP1s-L4H4- ATF6f (UPR-Plus 6), de preferencia en el sistema nervioso central o cualquier variante del fragmento, que codifique o sobre-exprese esta alternativa del factor de transcripción neuronal de UPRplus en mamíferos, de preferencia en humanos.
Un octavo aspecto de la presente invención es un virus del tipo adeno- asociado (AAV) que presenta la secuencia del virus y un inserto con una secuencia nucleotídica descrita en las Tabla IV o cualquiera de sus variantes, contenidos en la bacteria Escherichia coli transformada con el plásmido depositado en el organismo internacional de depósito biológico, Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile, INIA, con el número de depósito RGM 2232, donde se sobreexpresa el factor de transcripción neuronal ATF6Í-LFG- XBP1s (UPR-Plus 2), de preferencia en el sistema nervioso central o cualquier variante del fragmento, que codifique o sobre-exprese esta alternativa del factor de transcripción neuronal de UPRplus en mamíferos, de preferencia en humanos. Un noveno aspecto de la presente invención es un virus del tipo adeno- asociado (AAV) que presenta la secuencia del virus y un inserto con una secuencia nucleotídica descrita en las Tabla V o cualquiera de sus variantes, contenidos en la bacteria Escherichia coli transformada con el plásmido depositado en el organismo internacional de depósito biológico, Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile, INIA, con el número de depósito RGM 2233, donde se sobreexpresa el factor de transcripción neuronal ATF6f-L4H4- XBP1s (UPR-Plus 3), de preferencia en el sistema nervioso central o cualquier variante del fragmento, que codifique o sobre-exprese esta alternativa del factor de transcripción neuronal de UPRplus en mamíferos, de preferencia en humanos.
Un décimo aspecto de la presente invención es un virus del tipo adeno- asociado (AAV) que presenta la secuencia del virus y un inserto con una secuencia nucleotídica descrita en las Tabla VI o cualquiera de sus variantes, contenidos en la bacteria Escherichia coli transformada con el plásmido depositado en el organismo internacional de depósito biológico, Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile, INIA, con el número de depósito RGM 2231, donde se sobreexpresa el factor de transcripción neuronal ATF6f-LF- XBP1s (UPR-Plus 1), de preferencia en el sistema nervioso central o cualquier variante del fragmento, que codifique o sobre-exprese esta alternativa del factor de transcripción neuronal de UPRplus en mamíferos, de preferencia en humanos.
DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS
El plásmido pAA V_A TF6f-LFG-XBP1s-HA fue depositado con fecha 7 de Octubre de 2015 en el organismo internacional de depósito biológico, Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile, INIA, bajo el número de depósito de RGM 2232.
El plásmido pAAV_ATF6f-LF-XBP1 s-HA fue depositado con fecha 7 de Octubre de 2015 en el organismo internacional de depósito biológico, Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile, INIA, bajo el número de depósito de RGM 2231.
El plásmido pAAV_ATF6f-L4H4-XBP1 s-HA fue depositado con fecha 7 de Octubre de 2015 en el organismo internacional de depósito biológico, Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile, INIA, bajo el número de depósito de RGM 2233.
El plásmido pAA V XBP1 s-LFG-A TF6f-HA fue depositado con fecha 7 de Octubre de 2015 en el organismo internacional de depósito biológico, Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile, INIA, bajo el número de depósito de RGM 2235.
El plásmido pAA V_XBP1 s-LF-A TF6f-HA fue depositado con fecha 7 de Octubre de 2015 en el organismo internacional de depósito biológico, Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile, INIA, bajo el número de depósito de RGM 2234.
El plásmido pAA V_XBP1 S-L4H4-A TF6f-HA fue depositado con fecha 7 de Octubre de 2015 en el organismo internacional de depósito biológico, Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile, INIA, bajo el número de depósito de RGM 2236.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Debe entenderse que la presente invención no está limitada a la metodología particular, compuestos, materiales, técnicas de manufactura, usos y aplicaciones aquí descritas, pues éstas pueden variar. También debe entenderse que la terminología empleada aquí es usada con el solo propósito de describir una representación particular, y no intenta limitar la perspectiva y el potencial del presente invento.
Debe notarse que el uso y método, aquí, en el pliego de reivindicaciones y en todo el texto que el singular no excluye el plural, salvo que en el contexto claramente lo implique. Entonces, por ejemplo, la referencia a un "uso o método", es una referencia a uno o más usos o métodos e incluye equivalentes conocidos por quienes conocen de la materia (el arte). Similarmente, como otro ejemplo, la referencia a "un paso", "una etapa" o a "un modo", es una referencia a uno o más pasos, etapas o modos y que puede incluir sub pasos, etapas o modos, implícitos y/o sob revi n ¡entes.
Todas las conjunciones usadas han de entenderse en su sentido menos restrictivo y más inclusivo posible. Así, por ejemplo, la conjunción "o" debe entenderse en su sentido lógico ortodoxo, y no como un "o excluyente", salvo que el contexto o el texto expresamente lo necesite o indique. Las estructuras, materiales y/o elementos descritos han de entenderse que también se refieren a aquellos equivalentes funcionalmente y así evitar enumeraciones taxativas interminables.
Las expresiones usadas para indicar aproximaciones o conceptualizaciones deben entenderse así, salvo que el contexto mande una interpretación distinta. Todos los nombres y términos técnicos y/o científicos aquí empleados tienen el significado común que le otorga una persona común, calificada en estas materias, salvo indicación expresa, distinta.
Los métodos, técnicas, elementos, compuestos y composiciones son descritos aunque métodos, técnicas, compuestos y composiciones similares y/o equivalentes a los descritos pueden ser usados o preferidos en la práctica y/o pruebas de la presente invención.
Se incorporan todas las patentes y otras publicaciones como referencias, con el propósito de describir y/o informar, por ejemplo, las metodologías descritas en dichas publicaciones, que puedan resultar útiles en relación con el presente invento.
Se incluyen estas publicaciones sólo por su información previa a la fecha de registro de la presente solicitud de patente.
A este respecto nada debe considerarse como una admisión o aceptación, rechazo o exclusión, de que los autores y/o inventores no estén legitimados de serlo, o de estar ante-fechadas dichas publicaciones en virtud de otras anteriores, o por cualquier otra razón.
La presente invención describe vectores basados en los serotipos VAA2, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAA10, VAA11 y AAVs pseudotipados y de virus adeno-asociados capaces de mediar de manera eficiente la transferencia de genes al sistema nervioso central.
La administración sistémica de estos vectores también conduce a un suministro de genes eficiente tanto al cerebro como a la espina dorsal. La presente invención presenta que el vector de AAV2 con regiones proximales del promotor del factor de transcripción UPRplus, permite la generación de una respuesta en un clúster de factores de forma inespecífica de interés en el cerebro y espina dorsal. En particular, la administración local del vector AAV2 que comprende una serie de casetes de expresión en el que los genes heterólogos XBP1s y A TF6f están bajo el control del promotor CMV logrando mejorar en las capacidades motoras y cognitivas en individuos que padecen una enfermedad mediada por neurodegeneración. (Figuras 16/17 y figura 17/17). I. Definición de términos y expresiones generales
Los términos "virus adeno-asociado", "virus AAV", "virión de AAV", "partícula viral AAV", y "partícula de AAV", como se usa en el presente documento son intercambiables, se refieren a una partícula viral compuesta por al menos una proteína de la cápside de AAV (preferiblemente por todas las proteínas de la cápside de un serotipo de AAV en particular) y un polinucleotido del genoma de AAV encapsidado. Si la partícula comprende un polinucleotido heterólogo (es decir, un polinucleotido distinto de un genoma de AAV de tipo nativo como un transgén para ser entregado a célula de mamífero) flanqueado por las repeticiones terminales invertidas del AAV, que se conoce típicamente como un "vector de partículas de AAV" o "vector de AAV". AAV se refiere a virus que pertenecen al género Dependovirus de la familia Parvoviridae. El genoma de AAV es de aproximadamente 4,7 kilobases de longitud y está compuesto por ácido desoxirribonucleico de cadena sencilla (ssDNA) que puede ser censada como positiva o negativa. El genoma comprende repeticiones terminales invertidas (ITR) en ambos extremos de la cadena de ADN, y dos marcos abiertos de lectura (ORFs): REP y CAP (Replicasa y Cápside). El marco REP está formado por cuatro genes superpuestos que codifican para proteínas REP (REP 78, REP 68, REP 52 y REP 40) requeridas para el ciclo de vida del AAV. El marco CAP contiene nucleótidos de solapamiento de 20 secuencias de proteínas de la cápside: VP1 , VP2 y VP3, que interactúan entre sí para formar una cápside de una simetría icosaédrica. El término "virus adeno-asociado IRT" o "AAV ITR", como se usa aquí, se refiere a la terminal invertida que se repite y está presente en ambos extremos de la cadena de ADN del genoma de un virus adeno-asociado. Se requieren de las secuencias ITR para la multiplicación eficiente del genoma de AAV. Otra propiedad de estas secuencias es su capacidad para formar una horquilla. Esta característica contribuye a su autocopia que permite la síntesis primaria independiente de la segunda cadena de ADN. Los IRTs también mostraron ser necesario tanto para la integración del ADN del AAV de tipo nativo en el genoma de la célula hospedera y del rescate de ella, así como para la encapsidación eficaz del ADN del AAV combinado con la generación de su completo ensamblaje.
El término "AAV2", como se usa en la presente invención, se refiere al serotipo 2 del virus adeno-asociado con una secuencia del genoma tal como se define en el número de acceso GenBank AF043303.1 , que se encuentra en la página web: http://www.ncbi.nlm.nih.gOv/nuccore/AF043303.1.
Actualmente se han descrito alrededor de 11 serotipos de AAVs de humanos y alrededor de 100 AAVs de primates que pueden ser utilizados como vectores. Cada serotipo representa ventajas y desventajas con respecto a estabilidad, productividad, inmunogenicidad, biodisponibilidad, tropismo, etc. Sin embargo, muchos laboratorios han desarrollado vectores pseudotipados, es decir, AAVs modificados que contienen proteínas de cubierta de diferentes serotipos, para así obtener las ventajas de distintos serotipos o evitar las desventajas de algunas proteínas de cubierta de algunos serotipos. A modo de ejemplo un virus AAV2/6, en el cual se mezclan características de los dos serotipos virales, utilizado en la presente invención en algunos casos.
El término "vector de AAV", como se usa en la presente invención, se refiere además a un vector que comprende uno o más polinucleótidos de interés (o transgenes) que están flanqueados por secuencias de repetición terminal de AAV (ITR). Tales vectores de AAV pueden ser replicados y empaquetados en partículas víricas infecciosas cuando están presentes en una célula hospedera que ha sido transfectada con un vector que codifica y expresa los genes REP y CAP (es decir las proteínas AAV REP y CAP), y donde la célula hospedera ha sido transfectada con un vector que codifica y expresa una proteína del marco de lectura del adenovirus E4orf6. Cuando un vector de AAV se incorpora en un polinucleótido más grande (por ejemplo en un cromosoma o en otro vector tal como un plásmido utilizado para la clonación o transfección), entonces el vector de AAV se denomina típicamente como un "pro-vector". El pro-vector puede ser "rescatado" por replicación y encapsidación en presencia de las funciones de empaquetamiento del AAV y las funciones auxiliares necesarias proporcionadas por E4orf6. El tipo de serotipo del vector AAV entrega la especificidad del tipo celular donde expresará el trasgen dado el tropismo de cada serotipo.
El término "sitio de unión específico para la región reguladora de transcripción de UPRplus" como se usa en la presente invención, se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que sirven como un promotor (es decir, regula la expresión de una secuencia de ácido nucleico seleccionado, unido operativamente al promotor), y que afecta a la expresión de una secuencia de ácido nucleico seleccionada en células de tejidos específicos, tales como las neuronas. El sitio de unión específico para la región reguladora de la transcripción del tejido neuronal puede ser constitutivo o inducible.
El término "gen CAP' o "gen CAP de AAV", como se usa en la presente invención, se refiere a un gen que codifica para una proteína CAP. El término "proteína CAP", como se usa aquí, se refiere a un polipéptido que tiene actividad de al menos una actividad funcional de la proteína CAP de un AAV nativo (VP1 , VP2, VP3). Ejemplos de actividades funcionales de las proteínas VP1 , VP2 y VP3 incluyen la capacidad para inducir la formación de una cápside, facilitar la acumulación de ADN de hebra sencilla, facilitar el empaquetamiento del ADN de AAV en la cápside (es decir, la encapsidación), unirse a receptores celulares y facilitar la entrada del virión a un hospedero.
El término "cápside", como se usa en la presente invención, se refiere a la estructura en la que se envasa el genoma viral. Un cápside consta de una estructura oligomérica con subunidades estructurales de proteínas CAP. Por ejemplo, el AAV tiene una cápside icosaédrica formada por la interacción de tres proteínas de la cápside: VP1 , VP2 y VP3.
El término "composición de células", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un material tipo compuesto que comprende las células de la invención y al menos otro componente. La composición puede formularse como una sola formulación o se puede presentar como formulaciones separadas de cada uno de los componentes, que se pueden combinar para el uso conjunto como una preparación combinada. La composición puede ser un kit de partes, donde cada uno de los componentes se formula y se empaqueta individualmente.
El término "promotor constitutivo", como se usa en la presente invención, se refiere a un promotor cuya actividad se mantiene a un nivel relativamente constante en todo un organismo, o durante la mayoría de las etapas experimentales, con poca o ninguna consideración a las condiciones ambientales y externas de la célula.
El término "cásete de expresión", como se usa aquí, se refiere a una construcción de ácidos nucleicos, generados por recombinación o sintéticamente, con una serie de elementos específicos de los ácidos nucleicos, que permiten la transcripción de un ácido nucleico en particular, en una célula diana.
El término "genes que proporcionan funciones de ayuda", como se usa aquí, se refiere a genes que codifican polipéptidos, que realizan funciones sobre las que AAV es dependiente para la replicación (es decir, "funciones de ayuda"). Las funciones auxiliares incluyen aquellas funciones necesarias para la replicación de AAV, incluyendo estos fragmentos involucrados en la activación de la transcripción de genes AAV, las etapas específicas del empalme (splicing) de mARN de AAV, la replicación del ADN de AAV, la síntesis de los productos de CAP y el ensamblado de la cápside de AAV. Funciones virales accesorias se pueden derivar de cualquiera de los virus auxiliares conocidos tales como adenovirus, virus herpes, lentivirus y el virus vaccinia. Las funciones auxiliares incluyen, sin limitación, lentivirus WHV.
El término "unido operativamente", como se describe en el presente documento, se refiere a la relación funcional y localización de una secuencia promotora con respecto a un polinucleótido de interés (por ejemplo, un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante la cual afecta la transcripción de esa secuencia). Generalmente, un promotor unido operativamente es contiguo a la secuencia de interés. Sin embargo, un potenciador no tiene que ser contiguo a la secuencia de interés para controlar su expresión.
El término "administrado localmente", como se usa aquí, significa que los polinucleótidos, vectores, polipéptidos, y/o composiciones farmacéuticas de la invención se administran al sujeto en o cerca de un sitio específico.
Los términos "portadores farmacéuticamente aceptables", "diluyentes farmacéuticamente aceptables", "excipiente farmacéuticamente aceptable" o "vehículo farmacéuticamente aceptable", son intercambiables en el presente documento, se refieren a un sólido no tóxico, semisólido, o líquido de relleno, diluyente o material de encapsulación o una formulación auxiliar para cualquier tipo convencional. Un portador farmacéuticamente aceptable es esencialmente no tóxico para los recipientes empleados en las dosificaciones y concentraciones y es compatible con otros ingredientes de la formulación. El número y la naturaleza de los vehículos farmacéuticamente aceptables dependen de la forma de administración deseada. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son conocidos y se pueden preparar por métodos bien conocidos en la técnica El término "promotor", como se usa aquí, se refiere a un ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de uno o más polinucleótidos, situado aguas arriba de la secuencia del polinucleótido(s), y que se identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de unión para DNA dependiente de la ARN Polimerasa, los sitios de iniciación de la transcripción, y cualquier otra secuencia de ADN, incluyendo, pero no limitado a, los sitios de unión de factores de transcripción, represor, y sitios de unión a proteína activadora, y cualesquiera otras secuencias de nucleótidos conocidas en la técnica para actuar directamente o indirectamente para regular la cantidad de transcripción a partir del promotor. Un promotor "específico de tejido" sólo se activa en determinados tipos de células o tejidos diferenciados.
El término "polinucleótido", como se usa aquí, se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea ADN o ARN, que contiene deoxiribonucleótidos o ribonucleótidos respectivamente. El ácido nucleico puede ser doble cadena, de cadena sencilla, o contener partes tanto de secuencia de doble cadena o de cadena sencilla. El término "polinucleótido" incluye, pero no está limitado a, secuencias de ácidos nucleicos con la capacidad para codificar un polipéptido y secuencias de ácidos nucleicos parcial o totalmente complementarios a un polinucleótido endógeno de la célula o el sujeto tratado con la misma de modo que, tras la transcripción del mismo, genera una molécula de ARN (por ejemplo, microARN, shARN, siARN) capaz de hibridarse e inhibir la expresión del polinucleótido endógeno.
El térmico "puente o linker", como se usa aquí, se refiere a una secuencia polinucleotidica continua o discontinua, ya sea de ADN o ARN, que permite separar físicamente las secuencias objeticos con el fin de posicionarlas de manera adecuada para que éstas puedan ser traducidas y transcritas.
El término "cadena" en este documento se refiere a una secuencia de nucleótidos continuos (incluyendo o no incluyendo nucleótidos naturales modificados o no naturales). Las dos o más hebras pueden ser, o cada una forma una parte de, moléculas separadas, o pueden ser covalentemente interconectadas, por ejemplo, mediante un enganche, por ejemplo, un enlazador como polietilenglicol, para formar una molécula. Al menos una de las cadenas puede incluir una región que es suficientemente complementaria a un ARN diana.
Una segunda cadena del agente de dsARN, que comprende una región complementaria a la cadena antisentido, se denomina la "hebra sentido". Sin embargo, un agente siARN también puede formarse a partir de una sola molécula de ARN que es al menos parcialmente auto-complementaria, formando, por ejemplo, una horquilla o estructura de ojal, que incluye una región dúplex. Estos últimos son en lo sucesivo denominadas ARN corto horquilla o shARNs. En tal caso, el término "cadena" se refiere a una de las regiones de la molécula de ARN que es complementaria a otra región de la misma molécula de ARN.
El término "genoma viral recombinante", como se usa aquí, se refiere a un genoma de AAV en el que se inserta al menos un cásete de polinucleótido ajeno a la expresión en el genoma de AAV nativo.
El término "gen rep" o "gen rep de AAV", como se usa aquí, se refiere a un gen que codifica una proteína Rep. El término "proteína Rep", como se usa aquí, se refiere a un polipéptido que tiene al menos una actividad funcional de una proteína nativa rep de AAV (por ejemplo, Rep 40, 52, 68, 78). Una "actividad funcional" de un proteína Rep (por ejemplo, Rep 40, 52, 68, 78) es cualquier actividad asociada a la función fisiológica de la proteína, incluyendo la facilitación de la replicación del ADN a través del reconocimiento, unión y corte del origen de la replicación del ADN de AAV, así como la actividad helicasa de ADN. Las funciones adicionales incluyen modulación de la transcripción de AAV (u otros heterologos) promotores y la integración sitio-específica del ADN de AAV en un cromosoma del huésped.
El término "sujeto", como se usa aquí, se refiere a un individuo, planta, mamífero o animal, tal como un humano, un primate no humano (por ejemplo, chimpancé u otro simio y especies de monos), un animal (por ejemplo, pájaros, peces, ganado, ovejas, cerdos, cabras y caballos), un mamífero (por ejemplo, perros y gatos), o un animal de laboratorio (por ejemplo roedores, tales como ratones, ratas, ratones con genes silenciados (ratones knockout), ratones que sobreexpresan un gen (ratones transgénicos) y conejillos de indias). El término no denota una edad o sexo particular. El término "sujeto" incluye un embrión y un feto.
El término "administrado sistémicamente" y "administración sistémica", como se usa en el presente documento, significa que los polinucleótidos, vectores, polipéptidos, o composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran a un sujeto en una forma no localizada. La administración sistémica de los polinucleótidos, vectores, polipéptidos, o composiciones farmacéuticas de la invención puede alcanzar varios órganos o tejidos de todo el cuerpo del sujeto, o puede llegar a nuevos órganos o tejidos del sujeto específicos. Por ejemplo, la administración intravenosa de una composición farmacéutica de la invención puede dar lugar a la transducción en más de un tejido u órgano en un sujeto.
El término "región regulatoria transcripcional", como se usa aquí, se refiere a un fragmento de ácido nucleico capaz de regular la expresión de uno o más genes. Las regiones reguladoras de los polinucleótidos de la invención incluyen un promotor y opcionalmente un potenciador.
El término "transducción", como se usa aquí, se refiere al proceso mediante el cual una secuencia de nucleótidos foráneos es introducida dentro de la célula en un vector viral. El término "transfección", como se usa en el presente documento, se refiere a la introducción de ADN en las células eucariotas destinatarias. El término "vector", como se usa aquí, se refiere a un constructo capaz de entregar, y opcionalmente expresar, uno o más polinucleótidos de interés en una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores virales, ADN o vectores de expresión de ARN desnudos, plásmido, vectores cósmidos o fagos, vectores de expresión de ARN o ADN asociados con agentes de condensación catiónica, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas, y ciertas células eucariotas, tales como células productoras. Los vectores pueden ser estables y pueden ser auto-replicantes. No hay limitaciones en cuanto al tipo de vector que puede ser utilizado. El vector puede ser un vector de clonación, adecuado para la propagación y para la obtención de polinucleótidos, construcciones génicas o vectores de expresión incorporados a varios organismos heterólogos. Los vectores adecuados incluyen vectores de expresión procariotas, fagos y vectores lanzadera y vectores de expresión eucariotas basados en vectores virales (por ejemplo, adenovirus, virus adeno-asociados así como retrovirus y lentivirus), así como vectores no virales tales como pSilencer 4,1-CMV.
El término "UPRplus", como se usa en el presente documento, se refiere a las secuencias conformadas por XBP1s, ATF6f, un promotor, una secuencia de conexión o puente y un epítope para su identificación.
Los métodos y composiciones de la invención, por ejemplo los métodos y las composiciones del virus AAV con los insertos mencionados previamente, se pueden utilizar con cualquier dosificación y/o formulación descrita en la presente invención, así como con cualquier vía de administración descrita en la presente invención.
Para el término "tratamiento o terapia de las capacidades cognitivas y motoras", nos referimos a las pruebas cognitivas y motoras realizadas en diferentes especies y/o sujetos con una patología como está definida en la presente invención.
El término "cADN" o "ADN complementario", se refiere a una secuencia de ADN totalmente complementaria a un ARN, a partir del cual, se sintetiza por RT-PCR.
La frase "Silenciamiento de un gen diana" se refiere al proceso mediante el cual una célula que contiene y/o expresa un determinado producto del gen diana cuando no esté en contacto con el agente, va a contener y/o expresar, al menos, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o menos de tal producto del gen cuando entra en contacto con el agente, en comparación con una célula similar que no se ha contactado con el agente. Dicho producto del gen diana puede, por ejemplo, ser un mensajero ARN (mARN), una proteína, o un elemento regulador.
Como se usa en este documento, el término "complementario" se utiliza para indicar un grado suficiente de complementariedad tal que una unión estable y específica tiene lugar entre un compuesto y una molécula de ARN diana, la unión específica requiere un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del compuesto oligomérico a secuencias no- objetivo en condiciones en las que se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, o en el caso de ensayos in vitro, bajo condiciones en las que los ensayos se han realizado.
Como se usa en este documento, el término "sitios de restricción" se utiliza para señalar a la secuencia nucleotídica a la cual se une y corta o escinde una enzima de restricción específica para esa secuencia. Ligandos
Las propiedades de un virus, incluyendo sus propiedades farmacológicas, se pueden influenciar y hacer a la medida, por ejemplo, mediante la introducción de ligandos. En adición, las propiedades farmacológicas de un agente viral se pueden mejorar mediante la incorporación de un ligando en una formulación del agente y un virus.
Los ligandos, se pueden unir a una amplia variedad de entidades, por ejemplo ligandos que se unen a un agente viral, o se pueden utilizar como un conjugado o aditivo de formulación, por ejemplo, con el vehículo de una subunidad monomérica conjugada con el ligando. Los ejemplos se describen más adelante en el contexto de una subunidad monomérica conjugada con ligando, pero que es solamente la preferida, y las entidades se pueden acoplar en otros puntos con un virus.
Un ligando altera la distribución, dirección, o tiempo de vida de un agente viral en el que se incorpore. En las modalidades preferidas, un ligando proporciona una mejor afinidad para un objetivo seleccionado, por ejemplo una molécula, célula, o tipo de célula, un compartimiento, por ejemplo un compartimiento celular u órgano, un tejido, o región del cuerpo, por ejemplo, como se compare con una especie en la que esté ausente este ligando.
Los ligandos pueden mejorar las propiedades de transporte, hibridación, y especificidad de la molécula objetivo, para la presente invención, del virus.
Los ligandos en general pueden incluir modificadores terapéuticos, por ejemplo para mejorar la absorción de la molécula en el individuo; compuestos de diagnóstico o grupos reporteros, por ejemplo, para monitorear la distribución; agentes reticulantes; fracciones que confieran resistencia a la reacciones inmunes; y nucleobases naturales o inusuales.
Los ejemplos generales incluyen moléculas lipofílicas, lípidos, lectinas, (por ejemplo, hecigenina, diosgenina), terpenos (por ejemplo, triterpenos, por ejemplo sarsasapogenina, friedelina, ácido litocólico derivado de epifriedelanol), vitaminas, carbohidratos (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, polímeros sintéticos (por ejemplo, oligo-lactato 15-mer) y naturales (por ejemplo, de peso molecular bajo y medio), inulina, ciclodextrina, o ácido hialurónico), proteínas, agentes de enlace de proteínas, moléculas de dirección de integrina, policationes, péptidos, poliaminas, y miméticos de péptidos. Otros ejemplos incluyen los ligandos receptores de células epiteliales o de ácido fólico, tales como transferrina. El ligando puede ser una molécula que se presente naturalmente o recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, por ejemplo un poli- aminoácido sintético. Los ejemplos de los poli-aminoácidos incluyen polilisina (PLL), poli-ácido L-aspártico, poli-ácido L-glutámico, copolímero de estireno- anhídrido de ácido maleico, copolímero de poli-(láctico-co-glicólico), copolímero de diviniléter-anhídrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxi-propil)-metacril- amida (HMPA), polietilenglicol (PEG), polivinil-alcohol vinílico (PVA), poliuretano, poli-(ácido 2-etil-acrílico), polímeros de N-isopropil-acril-amida, o polifosfazina. Los ejemplos de las poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, poliamina pseudo-peptídica, poliamina peptidomimética, poliamina de dendrímero, arginina, amidina, protamina, fracciones catiónicas, por ejemplo lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina, o un péptido alfa-helicoidal.
Los ligandos también pueden incluir grupos de dirección, por ejemplo un agente de dirección a una célula o tejido, por ejemplo una tirotropina, melanotropina, proteína A de tensoactivo, carbohidrato de mucina, un poliaminoácido glicosilado, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, o un péptido de Arg-Gly-Asp (RGD), o un mimético de péptido de RGD. Los ligandos pueden ser proteínas, por ejemplo glicoproteínas, lipoproteínas, por ejemplo lipoproteína de baja densidad (LDL), o albúminas, por ejemplo, albúmina de suero, o péptidos, por ejemplo moléculas que tengan una afinidad específica para un co-ligando, o anticuerpos, por ejemplo un anticuerpo que se enlace con un tipo de célula especificado. Los ligandos también pueden incluir hormonas y receptores de hormonas. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamina, mañosa multivalente, o fucosa multivalente. El ligando puede ser una sustancia, por ejemplo un fármaco, que pueda aumentar la absorción del agente viral dentro de la célula, por ejemplo mediante la alteración del cltoesqueleto de la célula, por ejemplo mediante la alteración de microtúbulos, microfilamentos, y/o filamentos intermedios de la célula.
En un aspecto, el ligando es un lipido, o una molécula basada en lípido. Este lípido o esta molécula basada en lípido, de preferencia, se enlazan con una proteína de suero, por ejemplo suero de albúmina.
En una modalidad alternativa se empacarán los virus.
Para la preparación de las soluciones inyectables de virus se preparan diluyendo la concentración de virus necesaria en PBS (buffer fosfato salino) cuya formulación es la siguiente.
1. - Disolver la dosis viral (diluida previamente en PBS 1x) en 800ml de agua destilada con:
8 g of NaCI
0,2 g of KCI
1 ,44 g of Na 2 HP0 4
0,24 g of KH 2 P0 4
2. Ajusfar el pH to 7,4 con HCI.
3. Ajusfar el volume a 1 L con agua destilada adicional H20.
4. Esterilizar y autoclavar.
Diseño y Selección
Generación de las variantes de la molécula UPRplus.
Uno de los objetivos de la presente patente es la generación de las seis variantes de un ADN recombinante compuesto por las secuencias humana de la forma activa de XBP1 , denominada XBP1s y por la forma activa de ATF6, denominada ATF6f. Las variantes de UPRplus incluye dos variables en el diseño: el orden de las moléculas XBP1 s y ATF6f (XBP1s-ATF6f y ATF6f- XBP1s) y el péptido de unión (o "linker") entre ambas secuencias. Los linkers usados son los siguientes: -Linker Flexible de Glicina ("LFG") de 19 aa;
-Linker Alfa Hélice ("LAH4") de 25 aa; y
-Linker Flexible ("LF") de 50 aa.
Se ha mostrado que estos tres tipos de uniones o puentes otorgan la flexibilidad y distancia adecuada entre las proteínas unidas en sus extremos, para lograr una interacción entre ellas. La generación y evaluación de estos tres linkers entre las moléculas XBP1s y ATF6f, permitió ampliar las posibilidades de generar un factor de transcripción funcional activo, que adopte una geometría tridimensional adecuada para unirse a los elementos génicos específicos.
Además, para una mejor detección de la expresión de estas proteínas quiméricas se incluyó un el péptido hemaglutinina (HA), entre otros, sin limitarse solamente a este epítope, el extremo carboxilo terminal de todas las proteínas.
La estrategia de clonamiento utilizada fue generar las secuencias de ADN de XBP1s, ATF6f y los tres diferentes linkers mediante síntesis de novo incluyendo sitios de restricción para su posterior ligación al vector de expresión pAAV. Este vector de expresión se usa en la generación de las partículas virales previo a la elección de la variante UPRplus con mayor actividad neuroprotectora in vitro.
Mediante síntesis de novo se obtuvieron dos set de secuencias génicas que incluían la secuencia de HA en el extremo 3' y dependiendo el linker de diferentes sitios de restricción que a continuación se señalan: Set 1 XBP1s-linker-ATF6f
SnaBI_XBP1s-LFG-ATF6f_Fsel BspEI_XBPS1 s-LF-ATF6f_Kpnl BspEI_XBPs-L4H4-Atf6f_Kpnl Set 2 ATF6-linker-XBP1s
SnaBI_ATF6-LFG-XBP1s_Fsel
Kpnl_ATF6-L4H4 -XBP1s_Sfil Kpnl_ATF6 -LF-XBP1s_Sfil
Las secuencias de mARN utilizadas para este propósito, están descritas en las tablas VII y VIII, ATF6f y XBP1s respectivamente. Las secuencias de los mARN de los linkers o puentes se describen en la tabla IX. Donde se presenta el linker LGF, L4H4 y LF.
Junto con la generación de estas 6 variantes de UPRplus se produjeron las versiones individuales de XBP1s y ATF6f asociados a AAV (tablas XI y XII, respectivamente) clonadas en el vector de expresión pAAV para poder comparar de forma correcta la actividad de UPRplus respecto a la expresión de estos factores de transcripción individualmente.
La expresión de éstas secuencias usan el mismo promotor de las variantes UPRplus y presentan el péptido HA, a diferencia de los otros estudios realizados previamente con el factor de transcripción XBP1s y ATF6f, que no contenían estos elementos.
Una vez obtenidas todas estas secuencias mediante síntesis de novo se procedió a ligarlas al vector de expresión pAAV a través de los sitios de restricción mencionados anteriormente. Las 8 versiones de ADN recombinante generadas fueron secuenciadas y se corroboró que las secuencias son correctas y concuerdan con lo esperado.
La síntesis de novo de las secuencias mencionadas y la ligación de estas secuencias al vector pAAV fueron realizadas por la empresa GENEWIZ en Estados Unidos. Las secuencias obtenidas en los plásmidos se pueden ver en forma de mapas en las figuras 1/17, 2/17, 3/17, 4/17, 5/17, 6/17.
Para la confirmación de estos plásmidos se realizó un análisis de restricción de las secuencias obtenidas, mediante digestión de ADN plasmidial con la enzima de restricción EcoR1.
Los tamaños de los fragmentos obtenidos en los ensayos de restricción fueron los esperados, tal como se muestra en la Figura 7/17. Analizando los alcances biomédicos de la utilización como terapia, se proporcionó un método efectivo e innovador para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, en los que el uso de esta tecnología genera resultados sorprendentes en su aplicación. Para explorar la participación de UPRplus, se generaron las seis variantes de ADN recombinantes descritos en los párrafos anteriores, que codifican para las secuencias humana de la forma activa de XBP1 , denominada XBP1s y por la forma activa de ATF6, denominada ATF6f unida por diferentes linkers y unidas a un epítope de hemaglutinina (HA), entre otros posibles epítopes.
Con respecto al desarrollo del virus adenoasociado (AAV), éste comprende al genoma recombinante viral que comprende un cásete de expresión que incluye una región regulatoria transcripcional operativamente unida al polinucleótido de interés. El Tipo de serotipo de AAV entrega en parte la selectividad de tejido en el cual se expresará el polinucleótido de interés, sin ser este excluyente.
El virus adenoasociado (AAV) de acuerdo a la presente invención incluye cualquier serotipo conocido de los 42 tipos y son derivados de los parvovirus. En general los diferentes serotipos de AAV son secuencias genómicas con una homología significativa a nivel de aminoácidos y ácidos nucleicos, los cuales proveen idénticas funciones genéticas, proveen vibriones que son esencialmente idénticos en términos funcionales y físicos, y su replicación, ensamblaje utiliza prácticamente los mismos mecanismos.
En particular en la presente invención se utilizó el AAV serotipo 2 (tal como por ejemplo los mencionados en GenBank número de acceso ((AAV2) NC_001401.2, (AAV6) AF028704.1 , NC006260 (AAV7), NC006261 (AAV8), AX753250.1 (AAV9), (AAV10), (AAV11) y AAV pseudotipados, tal como se presenta para AAV2, en la Tabla X.
Para los virus AAV10 y AAV11 no se encuentra una secuencia completa disponible, ya que difieren en las proteínas de la cápside.
El genoma de los AAV de acuerdo a la presente invención, normalmente comprenden un actuador en cis 5 ' y una secuencia de repetición terminal invertida en 3 y un cásete de expresión. Las secuencias ITR o LTR tienen 141 pares de bases de largo. Preferiblemente, la secuencia completa de los LTRs es usada en la molécula y solo se permiten leves modificaciones de las secuencias. En una forma preferente del presente invento, el genoma recombinante del AAV comprende los 5 Λ y 3 ' AAV LTRs. En otra forma preferente del presente invento el 5 ' y 3 ' AAV LTRs deriva desde el AAV serotipo 2. En otra forma más preferente del presente invento el genoma recombinante de los AAV carecen del marco de lectura abierto Rep y Cap.
Por otro lado, los ITRs pueden provenir desde otros serotipos de
AAV. El AAV de la presente invención comprende una cápside desde cualquier serotipo. En particular para la presente invención se prefiere la cápside derivada de los serotipos 2, 6, 7, 8, 9 y 10. Aunque se desea de manera preferente la cápside del AAV del serotipo 2.
En algunas realizaciones, una cap del AAV para uso en el método de la invención puede ser generada por mutagénesis (es decir, inserciones, deleciones o sustituciones) de uno de los AAV caps o de sus ácidos nucleicos codificantes. En algunas realizaciones, la cap de AAV es de al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, o 99% o más similar a uno o más de los mencionados caequillos de AAV.
En algunas realizaciones, el cap de AAV es quimérico, comprende los dominios de dos, tres, cuatro, o más de los mencionados AAV caps. En algunas realizaciones, el cap del AAV es un mosaico de los monómeros VP1, VP2, VP3 y procedentes de dos o tres AAV diferentes o un AAV recombinante (rAAV). En algunas realizaciones, una composición de rAAV comprende más de uno de los mencionados CAPS.
En algunas realizaciones, un CAP AAV para su uso en una composición de rAAV está diseñado para contener una secuencia heteróloga u otra modificación. Por ejemplo, una secuencia de péptido o proteína que confiere focalización selectiva o la evasión inmune puede ser por ingeniería genética en una proteína Cap. Alternativamente, o además, la Cap puede ser modificada químicamente de manera que la superficie de la rAAV presente modificaciones químicas específicas, a modo de ejemplo polietileno glicolado, lo que puede facilitar la evasión inmune. La proteína Cap también puede generarse mutagenizado (por ejemplo, para eliminar su receptor natural de unión, o para enmascarar un epítopo inmunogénico).
En una realización, el vector de AAV contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia diana de al menos una secuencia de SnaBI_XBP1s-LFG-ATF6f_Fsel; o BspEI_XBPS1s-LF-ATF6f_Kpnl; o BspEI_XBPs-L4H4-Atf6f_Kpnl; o SnaBI_ATF6-LFG-XBP1s_Fsel; o Kpnl_ATF6-L4H4 -XBP1s_Sfil o Kpnl_ATF6 -LF-XBP1s_Sfil que se pueden seleccionar dentro de las siguientes tablas: Tabla I (SnaBI_XBP1s-LFG- ATF6f_Fsel) o Tabla II (BspEI_XBPS1s-LF-ATF6f_Kpnl) o Tabla III (BspEI_XBPs-L4H4-Atf6f_Kpnl) o Tabla IV (SnaBI_ATF6-LFG-XBP1s_Fsel) o Tabla V (Kpnl_ATF6-L4H4 -XBP1s_Sfil) o Tabla VI (Kpnl_ATF6 -LF- XBP1s_Sfil), obtenidos desde GenBank
En una realización, el vector de AAV contiene un promotor con la adición de al menos una de las secuencias dianas de SnaBI_XBP1s-LFG-ATF6f_Fsel; o BspEI_XBPS1s-LF-ATF6f_Kpnl; o BspEI_XBPs-L4H4-Atf6f_Kpnl; o SnaBI_ATF6-LFG-XBP1s_Fsel; o Kpnl_ATF6-L4H4 -XBP1s_Sfil o Kpnl_ATF6 -LF-XBP1s_Sfil, quedando como se presenta en las tablas I, II, III, IV, V y VI, respectivamente.
En una realización, el vector de AAV contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia diana que tiene una homología de 85% con una secuencia diana seleccionada de la tablas mencionada anteriormente. En una realización, el vector de AAV contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia diana que tiene una homología de 70% con una secuencia diana seleccionada de las tablas mencionadas anteriormente.
En una realización, el vector de AAV contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia diana que es un equivalente funcional con una secuencia diana seleccionada de las tablas mencionadas.
La región reguladora de la transcripción puede comprender un promotor y, opcionalmente, una región potenciadora. Preferiblemente, el promotor es seleccionado del presente listado: CMV, PGK1, CAMKII, ΤΗΥΛ , GAD34 entre otros. El potenciador no necesita ser específico para el tejido neuronal.
En una realización, el promotor es específico, por ejemplo, el de citomegalovirus, también conocido como CMV. En una realización, el promotor es específico, por ejemplo, el de la proteína fosfoglicerato kinasa 1 , también conocido como PGK1. En una realización, el promotor es específico, por ejemplo, el de la
Calcio calmodulina kinasa 2, también conocido como CAMKII.
En una realización, el promotor es específico, por ejemplo, también conocido como Thy1.
En una realización, el promotor es específico, por ejemplo, la del ácido glutámico descarboxilasa 34, también conocido como GAD34, que normalmente opera en neuronas GABAérgicas. En otra realización, el cásete de expresión que forma parte del AAV de la invención comprende además una región de regulación post-transcripcional. En una realización preferida, la región reguladora post-transcripcional es la marmota Hepatitis Virus región post-transcripcional (WPRE) o variantes funcionales y fragmentos de las mismas y el PPT-CTS o variantes funcionales y fragmentos mismos. En una realización particular, la región regulatoria post- transcripcional es WPRE.
El cásete de expresión que forma parte del AAV de acuerdo con la invención comprende un "polinucleótido de interés". En una realización preferida, el polinucleótido de interés codifica una proteína que actúa sistémicamente. En otra realización, el polinucleótido de interés codifica una proteína que actúa dentro de una neurona. En una realización preferida, la proteína que actúa dentro de dicha neurona es: XBP s-LFG-ATF6f; o XBP1s- LF-ATF6f¡ o XBP1s-L4H4-ATF6f; o ATF6f-LFG-XBP1s; o ATF6-L4H4 -XBP1s o ATF6f-LF-XBP1s, incluyendo cualquiera sus isoenzimas que varían en localizaciones subcelulares.
El límite de tamaño de los envases de los vectores de AAV es limitado al tamaño del genoma de AAV de tipo silvestre, que varía en tamaño según el serotipo de AAV (es decir, entre 4087 a 4767). Por ejemplo, AAV-2 nativo tiene un tamaño de genoma de 5382. En algunas formas de realización, la capacidad de clonación del vector de ARN recombinante pueden ser limitados y una secuencia de codificación deseada pueden implicar la sustitución completa de 4,8 kilobases el genoma del virus. Genes de gran tamaño pueden, por lo tanto, no ser adecuados para uso en un vector de AAV recombinante estándar, en algunos casos. El experto medio apreciará que las opciones están disponibles en la técnica para la superación de una capacidad de codificación limitada. Por ejemplo, el AAV IRTde dos genomas puede hibridar para formar la cabeza a la cola concatámeros, casi duplicando la capacidad del vector. La inserción de los sitios de empalme permite la remoción del IRT después de la transcripción. Otras opciones para la superación de una capacidad de clonación limitada serán evidentes para el experto en la materia.
Como siguiente objetivo, se probó la expresión de estas variantes en una línea celular humana. Para llevar a cabo este objetivo se reemplazaron las células derivadas de neuroblastoma SHSY5Y, por células HEK293, debido al bajo porcentaje de transfección (30%) de las SHSY5Y. Las células HEK293 corresponden a una línea celular de embrionaria de riñon humana, que presenta un alto porcentaje de transfección (80%) por el método de CaP0 4 .
Las células HEK293 fueron transfectadas con las 6 variantes de UPRplus. Como control, se incluyeron las versiones individuales de XBP1s y ATF6f humanas (Tablas XI y XII, respectivamente) que fueron clonadas en el mismo vector de expresión. Además se incluyó la expresión de dos versiones correspondientes a la secuencia de cADN de ratón de XBP1s existentes en el laboratorio.
Las células HEK293 fueron transfectadas mediante el método de CaP0 4 con los respectivos ADN recombinantes y luego de 48 hrs. de expresión se realizó la extracción proteica con buffer RIPA y cuantificación de proteínas totales.
Posteriormente se realizó la detección de las diferentes proteínas mediante Western Blot (WB), utilizando los anticuerpos anti-HA, anti-XBP1 y anti-ATF6.
El análisis de WB demostró que estas proteínas fueron expresadas correctamente, ya que fue posible detectar todas las variantes de UPRplus con el anticuerpo anti-HA como se muestra en la figura 8/17. El epítope de hemaglutinina (HA) está presente en el extremo C terminal de todas las variantes de UPRplus, por lo que se utilizó como primera aproximación. Los pesos moleculares obtenidos fueron aproximadamente de ~100 kDa para las variantes de UPRplus y de ~50 kDa para las proteínas individuales.
El tamaño molecular obtenido para la versión individual de XBP1s clonada en el vector de expresión viral de las variantes UPRplus, no difieren si se compara con las versiones de XBP1s de ratón ya caracterizadas y determinadas en el mismo ensayo (Figura 8/17, carril 8 y 11). Los pesos moleculares obtenidos según la migración electroforética fueron mayores a los pesos moleculares esperados (ver figura 8/17), tanto para las proteínas UPRplus como las proteínas individuales. Por otro lado, se logró la detección de la expresión de XBP1s humano en todas las variantes UPRplus (carriles 1-6, Figura 9/17) como también en la variante individual (carril 8, Figura 9/17) usando el anticuerpo anti-XBP1 143F (Biolegend). Dado que este anticuerpo sólo reconoce la forma humana de XBP1s, no fue posible detectar la expresión de la secuencia de ratón de XBP1s (carriles 9, 11 y 12, Figura 9/17).
Finalmente también se detectó la proteína ATF6f presente en las variantes de UPRplus con un anticuerpo anti-ATF6 (abCam) como se muestra en la figura 10/17. Este anticuerpo reconoce las versiones de ATF6f tanto humana como ratón (Figura 10/17).
Con el fin de determinar la localización subcelular de estas proteínas en células HEK293, se realizaron ensayos de inmunofluorescencia indirecta en células que expresan las proteínas UPRplus y sus versiones individuales. Se utilizaron los mismos anticuerpos descritos anteriormente, usados en el análisis mediante WB. Se detectó la expresión del epítope HA, de la proteína XBP1 y ATF6 (Figuras 11/17, 12/17 y 13/17) en células HE 293 transfectadas de forma transitoria con las diferentes variantes de UPRplus y además en las células transfectadas con las versiones individuales de las proteínas XBP1s y ATF6. A partir de estos resultados determinamos que la localización subcelular de las 6 variantes de UPRplus corresponden a un patrón nuclear que quedó en evidencia al realizar co-marcaje con la sonda Hoechst, la cual tiñe de manera específica los núcleos de las células (Figuras 11/17, 12/17 y 13/17). Para determinar la especificidad del anticuerpo anti-HA se incluyeron células transfectadas transitoriamente con el plásmido mXBP1s/EGFP correspondiente a la secuencia de ratón de XBP1s como control negativo (Figura 11 B/17).
Se determinó además que el anticuerpo anti-XBP1 reconoce específicamente la proteína XBP1 por inmunofluorescencia en todas las variantes de UPRplus. La especificidad del anticuerpo anti-XBP1 fue determinada por la ausencia de la marca en células transfectadas con ATF6 individualmente o en células no transfectadas (Figura 12A/17). Mediante este ensayo fue posible detectar la secuencia de ratón de XBP1s usando el anticuerpo anti-XBP1 (Figura 12B/17).
La expresión de ATF6 también fue corroborada por inmunofluorescencia en células HEK293 transfectadas con las variantes de UPRplus. Se observó la detección de la proteína ATF6 en todas las variantes proteicas de UPRplus, excepto en células que fueron transfectadas con XBP1s individualmente que fue usado como control negativo (Figura 13/17).
Posteriormente a la localización subcelular de la expresión de estas proteínas en células HEK293 transfectadas, se evaluó la activación del elemento promotor a la respuesta a proteínas mal plegadas, "UPR", mediada por el virus pAAV-UPRplus utilizando reporteros acoplados a la actividad Luciferasa.
Para este análisis de la actividad transcripcional de las variantes de pAAV-UPRplus se realizó, utilizando el sistema reportero de la Luciferasa bajo el control del elemento de respuesta de la UPR, llamado "UPRE", el cual responde preferentemente al heterodímero entre ATF6f y XBP1s. Para esto se co-transfectaron células HEK293 con los plásmidos pAAV-UPRplus 1 a 6 en conjunto con el plásmido reportero de Luciferasa-UPRE. Además se transfectó el plásmido que codifica para Renilla, que se usó como control interno del ensayo para determinar el porcentaje de células que expresan todos los plásmidos, ya que, expresa una molécula quimioluminescente de forma constitutiva (Promega, Dual-Luciferase® Repórter Assay System). Luego de 48 hrs. de expresión, se midió la luminiscencia obtenida en un luminómetro. Se compararon los niveles de activación del elemento de respuesta a UPR por las variantes de pAAV-UPRplus con los generados por la transfección del plásmido que codifica para la forma activada de XBP1s, llamado pAAV-XBP1s, y la forma activa de ATF6, llamado pAAV-ATF6f y la co-transfección de ambos plásmidos (pAAV-XBP1s y pAAV-ATF6f). Además se incluyó como control positivo del experimento, la transfección del plásmido pCDNA3-mXBP1s correspondiente a la versión de la secuencia de ratón de XBP1s. También se incluyó la transfección del vector vacío pCDNA3 como actividad basal del sistema de actividad transcripcional de factores de transcripción XBP1/ATF6.
En la figura 14/17 se muestra la actividad transcripcional de las 6 variantes de UPRplus y de los correspondientes controles. Los valores mostrados representan el promedio de tres experimentos independientes. Tal como se muestra en la tabla XIII:
Tabla XIII:
Se determinó como la máxima actividad (100% de actividad transcripcional), los valores de activación alcanzados por las variantes XBP1s y ATF6f co-transfectados, y en base a este valor, se normalizó las actividades de cada una de las variantes en cada experimento.
Los resultados obtenidos muestran una actividad transcripcional de las variantes 1-3 similar a la condición de co-expresión de XBP1s y ATF6f. Estas variantes son capaces de unirse a la región promotora UPRE y lograr activar la expresión del reportero luciferasa. Las variantes 4-6 presentaron niveles de actividad transcripcional de alrededor de un 20% respecto al control de coexpresión ATF6f/XBP1s, por lo cual es probable que no sean capaces de unirse a la región promotora UPRE o que la estructura de adopte esta proteína quimérica altere su unión a la secuencia de ADN.
Además se determinó que las variantes individuales son capaces de activar la región promotora UPRE y que ATF6f presenta una actividad mayor que la proteína XBP1s.
Con estos resultados se comprobó que tres de las variantes mixtas de "ATF6f-XBP1s", las asignadas como 1 , 2 y 3, mantienen la propiedad activadora de la respuesta UPR, indicando que la estrategia planteada en el proyecto es viable y posiblemente son capaces de activar genes blancos relacionados con la actividad transcripcional del heterodímero ATF6f/XBP s.
El siguiente paso a este desarrollo fue la evaluación de la activación de los blancos transcripcionales de la UPR mediada por la expresión de pAAV- UPRplus.
Para realizar este estudio se utilizaron células HEK293 las que fueron transfectadas con los plásmidos codificantes para las seis variantes pAAV- UPRplus y las variantes individuales pAAV-XBP1 s y pAAV-ATF6f. Además, se incluyó la co-transfección de ambas variantes (pAAV-XBP1s y pAAV-ATF6f), condición que fue considerada como la activación máxima alcanzada por el heterodímero en estas pruebas experimentales.
Luego de 24 horas de expresión, se midió la activación transcripcional de genes asociados con la vía de la UPR, a través de la cuantificación de los niveles de mARN de un grupo de genes descritos como blancos transcripcionales modulados por el heterodímero ATF6f-XBP1s, utilizando la técnica de PCR en tiempo real.
Los genes analizados en esta etapa del proyecto, fueron descritos en un reciente trabajo (Shoulders et al., 2013) el cual determinó mediante secuenciación masiva los genes regulados diferencialmente por XBP1s y/o ATF6 en células HEK293. En este estudio se generaron células HEK293 que son capaces de expresar diferencialmente y de forma inducida, los factores de transcripción XBP1s y/o ATF6f mediante la adición de drogas que controlan la expresión de estas proteínas. Este sistema es capaz de expresar XBP1s mediante la adición de doxiciclina, ATF6f por la droga trimetropina (TMP) y ambas proteínas (heterodímero) a través de la incubación con ambas drogas.
Los genes descritos que se expresan diferencialmente por estos factores de transcripción se muestran en la siguiente tabla XIV:
Tabla XIV:
Esta tabla XIV, presenta los genes regulados por XBP1 y/o ATF6 en células HEK293 inducibles.
Basados en esta información, se generaron secuencias de oligonucleótidos para determinar los niveles de expresión de los genes mostrados en la tabla XIV mediante PCR en tiempo real en células HEK tratadas con la droga tunicamicina que induce estrés de retículo endoplásmico (RE). Con este ensayo se logró probar la eficiencia de la amplificación de estos genes y corroborar que dichos genes son activados en respuesta a la condición de estrés de RE.
Como se muestra en el figura 15/17, se determinó que los genes fueron eficientemente amplificados y además sé confirmó que aumentan su expresión en respuesta a la condición de estrés de RE.
Posteriormente se procedió a comparar los niveles de mARN de alguno de los blancos transcripcionales de UPR, obtenidos a partir de células HEK293 transfectadas con cada una de las seis variantes de pAAV-UPRplus, pAAV- XBP1s o pAAV-ATF6f individualmente y co-transfección de ambas variantes (pAAV-XBP1s y pAAV-ATF6f).
Los genes escogidos para ser analizados fueron los asociados a la activación del heterodímero. Los genes elegidos fueron: CRELD2, gen asociado con degradación de proteínas mal plegadas asociado con ER proceso llamado ERAD (del inglés, "Endoplasmic Reticulum Associated protein Degradation"), HYOU1 , relacionado con el proceso de plegamiento de proteínas, EDEM 1 , asociado a ERAD y SULF1 , enzima secretada que participa en la formación de matriz extracelular. Además, se determinó la activación de BIP, asociado al plegamiento de proteínas y HERPUD que participa en el proceso de ERAD. Para los ARN mensajeros asociados a la expresión del heterodímero como Creld2, Edeml , Hyoul y Sulfl se observa que las variantes 1 , 2 y 3 son capaces de activar este grupo de genes en comparado con la variantes 4, 5 y 6 (Figura 16/17). Además para el caso de la expresión del gen SULF1 , la variante de UPRplus3 presenta una activación mayor al obtenido cuando se co-expresan las variantes de XBP1s y ATF6f.
Este resultado nos demuestra que las proteínas quiméricas de UPRplus son capaces de activar genes asociados con la respuesta a proteínas mal plegadas. Además los niveles de activación alcanzados por las variantes 1 , 2 y 3 son similares o mayores a los obtenidos al co-expresar ambas proteínas (Figura 16/17). Respecto la chaperona Bip y el gen HERPUD asociado a ERAD, también se observa que las variantes 1 , 2 y 3 de UPRplus son capaces de activar preferentemente estos genes alcanzando niveles de inducción similares a los obtenidos al co-expresar estos factores de transcripción. Los resultados obtenidos corresponden al promedio de tres experimentos independientes.
Vías de administración
Las vías de administración del virus están supeditadas a que el mismo pueda pasar la barrera hemato-encefálica para infectar las neuronas objetivo.
Para lograr este propósito en la presente invención se han definido principalmente 2 vías de administración.
La primera de estas vías es la nasal, generalmente los medicamentos administrados por vía nasal pueden entrar en la sangre a través de la circulación general, puede penetrar al cerebro directamente, o en algunos casos puede seguir ambas vías. Sin embargo, muchos de los factores que controlan el flujo de fármaco a través de cada una de estas vías no están completamente definidos. En general hay tres rutas por las que un fármaco administrado en la cavidad nasal puede viajar. Estas rutas incluyen la entrada en la circulación sistémica directamente de la mucosa nasal, la entrada en el bulbo olfatorio por el transporte axonal a través de las neuronas, y la entrada directa en el cerebro. La evidencia que apoya el papel de cada una de estas rutas para una variedad de sustratos modelo se resume a continuación para diferentes tipos de virus.
vías de transporte seguida s por varios solutos virales a través de la administración por vía nasal
Soluto Modelo animal | Vía de Administración | Vía seguida
Virus Virus de la hepatitis Ratón Inoculación Nasal Nervio olfatorio
Virus del herpes Simplex Ratón Gotas nasales Directa, Sistemica, Nervio Olfatorio
Virus de la encefalitis Ratón Inoculación Nasal Nervio olfatorio
Neumococos Ratón Gotas nasales Directa
Esta tabla no pretende ser exhaustiva en la naturaleza, sino más bien para resaltar algunos de los solutos de diferentes clases han demostrado seguir una o más vías.
Otras vías de administración a las células en el SNC han incluido:
La inyección directa en espacios fluidos, como el humor vitreo en el ojo;
o en el fluido cerebral de la columna vertebral a través de diferentes rutas, intraventricular o intratecal ( ** ) para su entrega al plexo coroideo, las capas ependimarias/meníngeas, y desde allí en el cerebro adyacente a través de procesos que se extienden dentro de estas capas; y su paso a través de la barrera sangre-cerebro o barreras sangre-tumorales mediante inyección intra- arterial combinada con una interrupción osmótica o farmacológica temporal.
El término ( ** ) Intratecal (intra + teca, "dentro de una vaina") es un adjetivo que se refiere a algo que ocurre o es introducido en un espacio anatómico o espacio potencial dentro de una funda, más comúnmente la membrana aracnoides del cerebro o la médula espinal.
Cálculo de Dosis
Según Ulusoy et al, la titulación del vector requiere un rango entre 10 9 a 10 13 copias de genoma (CG) por mi con una dosis probada entre 10 10 -10 12 gc/ml. Por otra parte, en cualquier tasa de dilución de los vectores a titular tienen que tener un rango bajo-medio de 10 11 gc/ml, lo cual resulta en la desaparición de la toxicidad.
Dosis en humanos: El rango de dosis en humanos se encontraría en el rango de entre 10 9 a 10 30 unidades virales/Kg de peso, sin restringir este rango a la aplicación en grupos etarios diferentes o con volúmenes de distribución modificados por edad o patología.
La máxima concentración o nivel de una sustancia, hallada experimentalmente o por observación, que no causa alteraciones adversas detectables en la morfología, capacidad funcional, crecimiento, desarrollo o duración de la vida de los organismos diana, distinguibles de los observados en organismos normales (control) de la misma especie y cepa, bajo condiciones definidas de exposición.
Método de aplicación Los vectores rAAV2 se inyectaron bilateralmente en el SN usando una jeringa Hamilton de 5μΙ equipada con un capilar de vidrio con un diámetro de la punta de alrededor de 60-80 mieras. Dos microlitros de tampón que contiene las concentraciones apropiadas de partículas virales se inyectó a una velocidad de 0,4 μΙ/minuto. La aguja se retira lentamente 5 minutos después de la finalización de la inyección.
Descripción de Figuras
Figura 1/17
En esta figura se ve un mapa de restricción del plásmidio de pAAV- XBP1s-LFG-ATF6f de 7701 pb y la representación de los elementos génicos presentes en el ADN recombinante generado. Figura 2/17
En esta figura se ve un mapa de restricción del plásmidio de pAAV- XBP1s-LF-ATF6f de 7809 pb y la representación de los elementos génicos presentes en el ADN recombinante generado. Figura 3/17
En esta figura se ve un mapa de restricción del plásmidio de pAAV- XBP1s-L4H4-ATF6f de 7719 pb y la representación de los elementos génicos presentes en el ADN recombinante generado.
Figura 4/17
En esta figura se ve un mapa de restricción del plásmidio de pAAV- ATF6f -LFG-XBP s de 7701 pb y la representación de los elementos génicos presentes en el ADN recombinante generado.
Figura 5/17 En esta figura se ve un mapa de restricción del plásmidio de pAAV-
ATF6f-L4H4-XBP1s de 7719 pb y la representación de los elementos génicos presentes en el ADN recombinante generado.
Figura 6/17
En esta figura se ve un mapa de restricción del plásmidio de pAAV- ATF6f-LF-XBP1s de 7809 pb y la representación de los elementos génicos presentes en el ADN recombinante generado. Figura 7/17
Esta figura presenta una fotografía del ensayo de restricción de las variantes de UPRplus. Se realizó una digestión del ADN plasmidial con la enzima de restricción EcoR1 por dos horas a 37C.
Los fragmentos obtenidos fueron resueltos en un gel de agarosa al 1 %. Se utilizaron dos tipos de estándar de peso molecular (ST). Los tamaños se muestran en los extremos de la fotografía del gel: 1. pAAV_ATF6f-LFG-XBP1 s-HA
2. pAAV_ATF6f-LF-XBP 1 s-HA
3. pAAV_ATF6f-L4H4-XBP1s-HA
4. pAAV_XBP1 s-LFG-ATF6f-HA
5. pAAV_XBP1s-LF-ATF6f-HA
6. pAAV_XBP1s-L4H4-ATF6f-HA
7. pAAV_ATF6f-HA
8. pAAV_XBP1s-HA
Tamaños esperados luego de digestión con Eco R1 1. 3895, 1928, 1531 , 347 tamaño total: 7701
2. 3895, 1928, 1639, 347 tamaño total: 7809
3. 3895, 1928, 1549, 347 tamaño total: 7719
4. 4262, 1928, 818, 693 tamaño total: 7701
5. 4264, 1928, 926, 693 tamaño total: 7809 6. 4264, 1928, 836, 693 tamaño total: 7719
7. 3895, 1928, 693 tamaño total: 6516
8. 4262, 1928, 347 tamaño total: 6537 Figura 8/17
La presente figura muestra la expresión de las variantes de UPRplus en células HEK293 y su detección mediante epítope HA: Las células HEK293 fueron transfectadas en forma transitoria con las variantes de UPRplus. Como control se utilizó plasmidios codificantes para XBP1s-HA, ATF6-HA y XBP1s/GFP. Además se incluyó un extracto de células sin transfectar (NT). Luego de 48 hrs. de expresión se extrajeron las proteínas totales y se detectó el epitope HA usando el anticuerpo anti-HA Covance (dilución 1 :1000). mXBP1- HA fue utilizado como control positivo. Hsp90 fue usado como control de carga.
Los tamaños se muestran en los extremos de la fotografía del gel:
1. pAAV_ATF6f-LFG-XBP1 s-HA peso molecular esperado 83 KDa
2. pAAV_ATF6f-LF-XBP1s-HA peso molecular esperado 87 KDa
3. pAAV_ATF6f-L4H4-XBP1 s-HA peso molecular esperado 82 KDa
4. pAAV XBPI s-LFG-ATF6f-HA peso molecular esperado 83 KDa
5. pAAV_XBP1s-LF-ATF6f-HA peso molecular esperado 87 KDa
6. pAAV_XBP1s-L4H4-ATF6f-HA peso molecular esperado 82 KDa
7. pAAV_ATF6f-HA peso molecular esperado 43 KDa
8. pAAV_XBP1s-HA peso molecular esperado 43 KDa
9. pAAV_mXBP1/GFP peso molecular esperado 40 KDa
10. NT 1 1. pAAV_mXBP1s-HA peso molecular esperado 43 KDa
12. pAAV_mXBP1s-HA peso molecular esperado 43 KDa
Figura 9/17
La presente figura presenta la expresión de las variantes UPRplus en células HEK293 y la detección de XBP1s en las mismas. Las células HEK293 fueron transfectadas en forma transitoria con las variantes de UPRplus, y con los plásmidos codificantes para XBP1s-HA, ATF6-HA, XBP1s, mXBPIs. Como control se utilizó además extractos de células sin transfectar (NT). Luego de 48 hrs. de expresión se extrajeron las proteínas totales y se detectó la proteína XBP1 usando el anticuerpo anti-XBP1 Biolegend 143F (dilución 1 :1000). Hsp90 fue usado como control de carga.
Identificación de los carriles del gel: pAAV_ATF6f-LFG-XBP1 pAAV ATF6f-LF-XBP1
3. pAAV_ATF6f-L4H4-XBP1s-HA
4. pAAV_XBP 1 s-LFG-ATF6f-HA
5. pAAV_XBP1s-LF-ATF6f-HA
6. pAAV_XBP 1 s-L4H4-ATF6f-HA
7. pAAV_ATF6f-HA
8. pAAV_XBP1s-HA
9. pAAV_mXBP1/GFP 10. NT
1 1. pAAV_mXBP1s-HA
12. pAAV_mXBP1s-HA
Figura 10/17 En esta figura se ve la expresión de las variantes UPRplus en células
HEK293 y la detección de ATF6. Las células HEK293 fueron transfectadas en forma transitoria con las variantes de UPRplus, y con los plásmidos codificantes para XBP1s-HA, ATF6-HA, XBP1s, mXBPIs. Como control se utilizó además extractos de células sin transfectar (NT). Luego de 48 hrs. de expresión se extrajeron las proteínas totales y se detectó la proteína ATF6 usando el anticuerpo anti-ATF6 abCam (dilución 1 :250). La expresión de la proteína ATF6 de ratón fue utilizado como control positivo. Hsp90 fue usado como control de carga. Identificación de los carriles del gel:
1. pAAV_ATF6f-LFG-XBP1 s-HA
2. pAAV_ATF6f-LF-XBP s-HA
3. pAAV_ATF6f-L4H4-XBP1s-HA
4. pAAV_XBP 1 s-LFG-ATF6f-HA 5. pAAV_XBP1s-LF-ATF6f-HA
6. pAAV_XBP1s-L4H4-ATF6f-HA
7. p AA V_ATF6f- HA 8. pAAV_XBP1s-HA
9. RV ATF6f
10. NT
Figura 11/17 En esta figura se ven dos grupos de fotografías A y B. Donde se ve la distribución subcelular de las variantes UPRplus en células HEK293.
El grupo identificado como (A), presenta las células HEK293 que fueron transfectadas con las diferentes variantes de UPRplus, fijadas luego de 48 hrs. de expresión y co-teñidas con anticuerpo anti-HA (rojo, panel superior) y Hoechst (azul, panel central) en cada condición. La superposición de imágenes se muestra en el panel inferior de cada condición.
El grupo identificado como (B) presenta las células HEK293 que fueron tranfectadas con mXBP1s/EGFP, fijadas luego de 48 hrs. de expresión y coteñidas con anticuerpo anti-HA (rojo) fluorescencia intrínseca EGFP (verde) y Hoechst (azul).
La Barra inferior de cada foto corresponde a 10 pm.
Figura 12/17
En esta figura se ven dos grupos de fotografías A y B. Donde se presenta la distribución subcelular de las variantes UPRplus en células HEK293.
(A) Las células HEK293 fueron transfectadas con los diferentes variantes de UPRplus, fijadas luego de 48 hrs. de expresión y co-teñidas con anticuerpo anti-XBP1 (rojo, panel superior) y tinción Hoechst (azul, panel central) en cada condición. La superposición de imágenes se muestra en el panel inferior de cada condición.
(B) Las células HEK293 fueron transfectadas con mXBP1s/EGFP, fijadas luego de 48 hrs. de expresión y co-teñidas con anticuerpo anti-XBP1 (rojo), fluorescencia intrínseca EGFP(verde) y tinción Hoechst (azul).
La Barra inferior de cada foto corresponde a 20 pm.
Figura 13/17
En esta figura se analiza la distribución subcelular de las variantes UPRplus en células HEK293.
Las células HEK293 fueron transfectadas con los diferentes variantes de UPRplus, fijadas luego de 48 hrs. de expresión y co-teñidas con anticuerpo anti-ATF6 (rojo, panel superior) y tinción Hoechst (azul, panel central) en cada condición. La superposición de imágenes se muestra en el panel inferior de cada condición.
La Barra inferior de cada foto corresponde a 20 μιη.
Figura 14/17
Esta figura presenta un gráfico de barras representando la actividad transcripcional de las variantes de UPRplus:
Las célulasHEK293 fueron transfectadas en forma transitoria con tres plásmidos distintos:
- los vectores que codifican para las variantes de UPRplus;
- el vector que porta la región promotora UPRE que controla la expresión de luciferasa; y - el plásmido que codifica a renilla, como control interno.
Como controles positivos se utilizaron plásmidos codificantes para ATF6- HA, XBPIs-HA y co-transfección de ATF6-HA/XBP1s-HA. Además como control negativo, se incluyó la transfección del vector pCDNA3 vacío. Luego de 48 hrs.de expresión, se determinó la actividad transcripcional mediante ensayo de luciferasa. Se realizó la medición de luminiscencia que fue normalizada con la actividad de renilla.
El gráfico (panel superior) representa el promedio de tres experimentos independientes y los valores corresponden al promedio y Error Standard Medio (ESM).
En la tabla (panel inferior) se muestra los valores obtenidos en cada experimento para cada condición experimental. Figura 15/17
La presenté figura muestra un análisis de la expresión de genes blancos de UPR en células HEK293 donde: Los niveles de mARN de los blancos transcripcionales asociados a UPR fueron analizados por PCR en tiempo real a partir de cADN obtenido de células HEK293 en condiciones básales y tratadas con 1 pg/ml tunicamicina por 8 hrs.
Todas las muestras fueron normalizadas con los niveles de expresión del gen constitutivamente activo β-actina.
Figura 16/17
Esta figura presenta un análisis de expresión de genes blancos de UPR 16 000070
49 en células HEK293 transfectadas con pAAV-UPRplus donde:
Los niveles de ARNm de los blancos transcripcionales asociados a UPR fueron analizados por PCR en tiempo real a partir de cADN obtenido de células HEK293 transfectadas con los plásmidos codificantes para las seis variantes pAAV-UPRplus y las variantes individuales XBP1s, ATF6f y la cotransfección de ambas variantes (pAAV-XBP1s y pAAV-ATF6f).
Todas las muestras fueron normalizadas con los niveles de expresión del gen constitutivamente activo β-actina.
1. pAAV_ATF6f-LFG-XBP1s-HA,
2. pAAV_ATF6f-LF-XBP1s-HA,
3. pAAV_ATF6f-L4H4-XBP1 s-HA,
4. pAAV XBPI s-LFG-ATF6f-HA, 5. pAAV_XBP1 s-LFATF6f-HA,
6. pAAV_XBP1s-L4H4-ATF6f-HA,
7. pAAV_ATF6f-HA,
8. pAAV_XBP s-HA,
7+8. pAAV_ATF6f-HA + pAAV_XBP1 s-HA, GFP. pAAV-EGFP.
Figura 17/17
Esta figura presenta un análisis de agregación proteica de la proteína T L2016/000070
50
(Ejemplo de aplicación) polyQ79 frente a la expresión de UPRplus donde:
(A) Las células N2A fueron co-transfectadas transitoriamente con los vectores pAAV-UPRplus, pAAV-XBP1s o pAAV-ATF6 y con el vector pEGFP- poly-Q79. Se analizó la expresión proteica mediante Western blot, luego de 24 hrs (panel derecho) y 48 hrs (panel izquierdo) de expresión. HSP90 fue usado como control de carga.
(B) Estas mismas muestras fueron analizadas por ensayo de Filter-trap luego de 24 hrs (panel derecho) y 48 hrs (panel izquierdo) de expresión.
(C) Gráfico que representa la cuantificación de la agregación proteica de polyQ79 mediante Western blot luego de 24 hrs (panel derecho) y 48 hrs (panel izquierdo) de expresión. Se muestra el promedio y error estándar de tres experimentos independientes.
(D) Gráfico que representa la cuantificación de la agregación proteica de polyQ79 mediante Filter-trap luego de 24 hrs (panel derecho) y 48 hrs (panel izquierdo) de expresión. Se muestra el promedio y error estándar de tres experimentos independientes.
EJEMPLO DE APLICACIÓN
Las enfermedades de Parkinson y Huntington se relacionan con la formación de agregados proteicos causantes de la muerte neuronal selectiva, de preferencia en las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra. Para ver estos efectos se realizó un ensayo de Western blot, tal como se ve en la figura 17/17, donde: Se sembraron 3x10 5 células N2A en pocilios de 30 mm. Luego de 24 h se realizó la co-transfección de los vectores pAAV-UPRplus, pAAV-XBP1s o pAAV-ATF6 y con el vector pEGFP-poly-Q79 con método Effectine. Se mezclaron 0,6 pg de cada vector más 3,2 μΙ de Enhancer y 100 μΙ de tampón EC. La mezcla se agitó en vortex durante 15 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se agregaron 8 μΙ de Effectine (Qiagen), se agitó en vortex por 10 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. La solución se mezcló con 500 μΙ de medio DMEM 10% SFB y se agregó a la placa de cultivo por goteo cubriendo la totalidad de la superficie.
Luego de 24 o 48 hrs de expresión las células se despegaron de la placa de cultivo utilizando un cell scraper, se colectaron y se centrifugaron a 2.000 rpm por 5 minutos a 4 °C. El precipitado se resuspendió en tampón PBS con 1% Tritón, suplementado con inhibidor de proteasas (Roche). Las células se lisaron por sonicación 3 veces durante 5 segundos en hielo y finalmente la concentración de proteínas fue determinada en cada muestra utilizando el kit BCA Protein Assay (Pierce, Rockford, IL) (Zhang et al. 2014).
Las muestras de proteína fueron preparadas usando 25 μg de proteína total, mezcladas con buffer de carga 4X (Tris-HCI 0,2 [pH 6.8], SDS 10%, azul de bromofenol 0,05%, y glicerol 20%) y luego calentadas por 5 min a 95 °C, que fueron cargados en geles denaturantes al 8%. El gel de poliacrilamida separador al 8% fue preparado con Tris-HCI 380 mM [pH 8,3], acrilamida-bis- acrilamida 8%, SDS 0,1%, Persulfato de amonio 0,1% y TEMED 0,06%. El gel de poliacrilamida compresor fue preparado con Tris-HCI 60 mM [pH 6,8], acrilamida-bis-acrilamida 4%, SDS 0,1%, persulfato de amonio 0,1% y TEMED 0,06%.
La electroforesis fue llevada a cabo en buffer de corrida (Tris 25 mM, Glicina 250 mM y SDS 0,1%) a un voltaje constante de 100 V. La corrida electroforética fue detenida cuando el frente azul abandonó el gel. A continuación las proteínas fueron transferidas a una membrana de PVDF en buffer de transferencia (Tris 25 mM, glicina 250 mM y metanol 20%) a un voltaje constante de 100 V por 2 horas 30 minutos en hielo. Posteriormente la membrana fue incubada en solución de bloqueo (leche 5% en PBS) por 1 hora a temperatura ambiente y en agitación. Finalmente, las membranas fueron incubadas con alguno de los siguientes anticuerpos, diluidos en leche 5% PBS tween 0,02%; anti-GFP 1 :1000 (Santa Cruz) o anti-HSP90 1 :3000 (Santa Cruz), por 16 h a 4 ° C en agitación. Al día siguiente las membranas fueron lavadas 3 veces por 5 minutos con PBS Tween 0,1% y posteriormente incubadas 1 hora a temperatura ambiente y en agitación con los anticuerpos secundarios correspondientes: anti-rabbit-HRP o anti-mouse-HRP (Invitrogen) diluidos 1 :3000 ( Leche 5% en PBS Tween 0,02%). Transcurrido este periodo, las membranas fueron lavadas con PBS Tween 0,1%, esta vez 3 veces por 5 minutos. Finalmente, el revelado fue realizado utilizando el kit Western Blotting Substrate (Pierce) y el sistema de detección de imágenes Chemidoc (Biorad). Para confirmar los datos anteriormente obtenidos se realizó un ensayo de Filtertrap, donde para realizarlo se usaron 25 [ig de proteína total mezcladas con buffer PBS-SDS 4 X.
Estas muestras fueron cargadas en una placa de 96 well acoplada a una bomba de vacío que contiene filtros de acetato de celulosa. Luego de agregar las muestras se aplicó vacío para retener en el filtro solo especies de alto peso molecular. Posteriormente los filtros fueron incubados en solución de bloqueo (leche 5% en PBS) por 1 hora a temperatura ambiente y en agitación. Luego fueron incubadas con el anticuerpo antí-GFP 1 :1000 (Santa Cruz), diluidos en leche 5% PBS tween 0,02% por 16 h a 4 ° C en agitación. Al día siguiente los filtros fueron lavados 3 veces por 5 minutos con PBS Tween 0,1 % y posteriormente incubadas 1 hora a temperatura ambiente y en agitación con el anticuerpo secundario anti-mouse-HRP (Invitrogen) diluidos 1 :3000 ( Leche 5% en PBS Tween 0,02%).
Transcurrido este periodo, las membranas fueron lavadas con PBS Tween 0,1%, esta vez 3 veces por 5 minutos. Finalmente, el revelado fue realizado utilizando el kit Western Blotting Substrate (Pierce) y el sistema de detección de imágenes Chemidoc (Biorad).
Conclusiones:
La expresión de las proteínas UPRplus, XBP1s y ATF6f durante 24 h se logró disminuir el porcentaje de agregación de la proteína polyQ 79-EGFP en célula N2A. La expresión de las proteínas UPRplus, XBP1s y ATF6f, logró disminuir a un 23,2; 47 y 51 ,4% respectivamente el porcentaje de agregación determinado mediante WB. El efecto anti-agregación también fue determinado usando la técnica de
Filtertrap en cuyo caso la expresión de las proteínas UPRplus, XBP1s y ATF6f, disminuyó a un 15,1 ; 15 y 39,1 % respectivamente, luego de 24 hrs.
Además se evaluó el efecto anti-agregación de la expresión de las proteínas XBP1s, ATF6f y UPRplus, mediante WB luego de 48 hrs. Se observó que la agregación de polyQ79 disminuyó significativamente soló con el tratamiento de UPRplus (47% de disminución).
Por otra parte a través de la técnica de Filtertrap se observó que la expresión de las proteínas XBP1s, ATF6f y UPRplus, disminuyó la agregación proteica de polyQ79-GFP a 48,5; 65,6 y 24% respectivamente, respecto al control, luego de 48 hrs.
Material y métodos
Producción de vectores Adeno-asociado
Las partículas del virus AAV serotipo 2 (AAV2/6) fueron producidos por la transfección de células 293-AAV (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) y se purificaron en un gradiente de iodixanol seguido por cromatografía de afinidad en columna. El número de partículas de AAV que contiene el genoma en la suspensión, así como la infectividad de la suspensión del vector en células HEK293T se determinaron mediante ensayos TaqMan qPCR. Preparación de los plásmidos adenoviral (pAAV) para las 6 variantes:
Para el desarrollo de este objetivo, las secuencias XBP1s, ATF6f humano y los respectivos linkers fueron sintetizados de novo y clonados en el plásmido adenoviral pAAV-CMV-MCS, el cual expresa el transgen bajo el promotor CMV. En todos los constructos generados se incluyó la secuencia del tag HA (Figura 17/17 A), que luego nos permitió identificar las células
transducidas. El plásmido adenoviral vacío pAAV-CMV-MCS fue utilizado como control.
Para confirmar la expresión de los constructos generados transfectamos células HEK con los distintos constructos, luego de 48 horas de transfección realizamos la extracción de proteínas que fueron evaluadas mediante WB utilizando un anticuerpo anti-HA.
Como se observa en la Figura 10/17, detectamos una banda del peso molecular esperado para las variantes de UPRplus (130 KDa) junto con los controles de expresión de pAAV-XBP1s-HA (55 kDa), pAAV-ATF6f-HA (55kDa) y pCDNA-mXBP1s (55 kDa).
PCR en tiempo real
El ARN total fue aislado de células HEK 293 trasfectadas con los difentes plasmidios. Después de la homogeneización en PBS se siguió seguido el protocolo de extracción de ARN Trizol recomendado por el fabricante. El cADN se sintetizó con un kit de cADN de transcripción reversa de alta capacidad (Applied Biosystems). SYBR green y un Sistema (Stratagene) Mx3005P QPCR fueron utilizados para el RT-PCR cuantitativo. La cantidad relativa de mARN se calculó por el método de ciclo umbral comparativo con β- actina como control. Los Primers de las secuencias se obtuvieron a partir del PrimerBank (Tabla XV).
Tabla XV
Erdj4 5'-GGAAGGAGGAGCGCTAGGTC-3' 5'-ATCCTGCACCCTCCGACTAC-3'
HspA5 (BiP) 5'-GCCTGTATTTCTAGACCTGCC-3' 5'-TTCATCTTGCCAGCCAGTTG-3' HerpUD 5 '- A ACGG C ATGTTTTG CATCTG -3 ' 5'-GGGGAAGAAAGGTTCCGAAG-3'
Hyou 1 5'-GCAGACCTGTTGGCACTGAG-3' 5'-TCACGATCACCGGTGTTTTC-3' Pdia4 5'-AGTGGGGAGGATGTCAATGC-3' 5'-TGGCTGGGATTTGATGACTG-3' Sec24D 5'-AGCAGACTGTCCTGGGAAGC-3' 5'-TTTGTTTGGGGCTGGAAAAG-3' SellL 5 '-ATCTCC AA A AG G CAG C AAG C-3 ' 5'-TGGGAGAGCCTTCCTCAGTC-3' Stt3a 5'-TTCAACCTGGGTGACCAGTG-3' 5'-CATGACCTTCGCATCCTCTG-3'
Sulfl 5 '- ATTC A AG G AG G CTGCTC AG G -3 ' 5'-TGTCATGCGTGAAGCAAGTG-3'
Western blot
Está técnica está descrita al detalle en el experimento 1.
Cultivos
Las células Neuro2A y células HEK293T se obtuvieron de la ATCC y se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino o 5%, respectivamente, y antibióticos (10000 U/ml de penicilina, 10 mg/ml de estreptomicina), a 37°C y 5% de C0 2 .
Ensayos Ensayo de Filtertrap: Se aplican 25 ug de proteínas totales en una placa de 96 well acoplada a una bomba de vacío (Microfiltration Apparatus, bio-rad, http://www.bio-rad.com/en-us/applications-technologies/prote in-blotting- equipment-cells-power-supplies#3) que contiene filtros de acetato de celulosa. Luego de agregar las muestras se aplicó vacío para retener en el filtro solo especies de alto peso molecular. Posteriormente los filtros fueron incubados en solución de bloqueo (leche 5% en PBS) por 1 hora a temperatura ambiente y en agitación. Luego fueron incubadas con el anticuerpo anti-GFP 1 :1000 (Santa Cruz), diluidos en leche 5% PBS tween 0,02% por 16 h a 4 ° C en agitación. Al día siguiente los filtros fueron lavados 3 veces por 5 minutos con PBS Tween 0,1% y posteriormente incubadas 1 hora a temperatura ambiente y en agitación con el anticuerpo secundario anti-mouse-HRP (Invitrogen) diluidos 1 :3000 ( Leche 5% en PBS Tween 0,02%).
Método Effectine: Este método consiste en un método de transfección de plasmidios en células eucariontes, el cuál esta descrito y estandarizado por el protocolo del fabricante (Qiagen) (https://www.qiagen.com/es/shop/assay- technologies/transfection-reagents/effectene-transfection-re agent/).
Este protocolo consiste en mezclar 0,6 ig de cada vector más 3,2 μΙ de Enhancer y 100 μΙ de tampón EC. La mezcla se agita en vortex durante 10 segundos y se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego se agregaron 8 μΙ de Effectine, se mezcla en vortex por 10 segundos y se incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos. Esta solución se mezcla con 500 μΙ de medio DMEM 10% SFB y se agrega a la placa de cultivo de 30 mm por goteo cubriendo la totalidad de la superficie.
Estadísticas
Los datos se expresan como media y SEM. En función de los experimentos, los resultados fueron comparados estadísticamente utilizando la prueba T de Student o la prueba de Mann-Whitney, de dos vías ANOVA seguido por Holm-Sidack o Bonferroni como prueba post-hoc o Kruskal-Wallis ANOVA de una vía en rangos seguidos por el Método de Dunn o Bonferroni como prueba post-hoc.