PARK HEE KYUNG (KR)
KIM KYUNG TAK (KR)
KR20140000439A | 2014-01-03 | |||
KR20140046688A | 2014-04-21 | |||
KR20140088796A | 2014-07-11 | |||
CN102453761A | 2012-05-16 | |||
CN104263848A | 2015-01-07 |
청구범위 [청구항 1] 서열번호 1내지서열번호 11로이루어진군으로부터선택된어느하나의 서열을포함하는유전성난청검출용 PNA프로브. [청구항 2] 제 1항에 있어서, 상기 PNA프로브는 GJB2, SLC26A4, 12S rRNA, CDH23및 TMPRSS3로 이루어진군에서선택된어느하나의유전자와흔성화 (hybridization)하는 것을특징으로하는유전성난청검출용 PNA프로브. [청구항 3] 제 1항에 있어서, 상기 PNA프로브는 GJB2유전자의 V37I, 235delC, 299-300delAT, R143W, SLC26A4유전자의 T410M, L676Q, H723R, IVS7-2A>G, 12S rRNA 유전자의 1555A>G, CDH23유전자의 P240L및 TMPRSS3유전자의 A306T로이루어진군에서선택된어느하나의유전자변이체와 흔성화하는것을특징으로하는유전성난청검출용 PNA프로브. [청구항 4] 제 1항에 있어서, 상기 PNA프로브는리포터또는소광자가결합되어 있는것을특징으로 하는유전성난청검출용 PNA프로브. [청구항 5] 서열번호 12내지서열번호 31로이루어진군에서선택되는유전성난청 검출용프라이머쌍에 있어서, 정방향프라이머로서열번호 12,역방향프라이머로서열번호 13의 염기서열; 정방향프라이머로서열번호 14,역방향프라이머로서열번호 15의 염기서열; 정방향프라이머로서열번호 16,역방향프라이머로서열번호 17의 염기서열; 정방향프라이머로서열번호 18,역방향프라이머로서열번호 19의 염기서열; 정방향프라이머로서열번호 20,역방향프라이머로서열번호 21의 염기서열; 정방향프라이머로서열번호 22,역방향프라이머로서열번호 23의 염기서열; 정방향프라이머로서열번호 24,역방향프라이머로서열번호 25의 염기서열; 정방향프라이머로서열번호 26,역방향프라이머로서열번호 27의 염기서열; 정방향프라이머로서열번호 28,역방향프라이머로서열번호 29의 염기서열;또는 정방향프라이머로서열번호 30,역방향프라이머로서열번호 31의 염기서열;인프라이머쌍 (primer pair). [청구항 6] 제 1항내지제 4항으로이루어진군으로부터선택되는어느한항의 PNA 프로브및제 5항의프라이머쌍을포함하는유전성난청검출용조성물. [청구항 7] a)검체시료로부터 gDNA를추출하는단계; b) GJB2, SLC26A4, 12S rRNA및 TMPRSS3로이루어진군에서선택되는 유전자또는그변이체를증폭시킬수있는정방향및역방향프라이머 쌍을이용하여상기유전자또는그변이체를증폭시키고,상기유전자 또는그변이체와흔성화할수있는 PNA프로브와흔성화시키는단계;및 c)상기 b)단계에서혼성화된반웅물의융해곡선을분석하여상기유전자 또는그변이체를검출하는단계; 를포함하는유전성난청검출방법 . [청구항 8] 제 7항에 있어서, 상기유전자의변이체는 GJB2유전자의 V37I, 235delC, 299-300delAT, R143W, SLC26A4유전자의 T410M, L676Q, H723R, IVS7-2A>G, 12S rRNA유전자의 1555A>G, CDH23유전자의 P240L및 TMPRSS3유전자의 A306T로이루어진군에서선택되는것을특징으로하는검출방법. [청구항 9] 제 7항에 있어서, 상기 PNA프로브는서열번호 1내지서열번호 11로이루어진군으로부터 선택된어느하나의서열인것을특징으로하는검출방법. [청구항 10] 제 7항에 있어서, 상기프라이머쌍은 정방향프라이머로서열번호 12,역방향프라이머로서열번호 13의 염기서열; 정방향프라이머로서열번호 14,역방향프라이머로서열번호 15의 염기서열; 정방향프라이머로서열번호 16,역방향프라이머로서열번호 17의 염기서열; 정방향프라이머로서열번호 18,역방향프라이머로서열번호 19의 염기서열; 정방향프라이머로서열번호 20,역방향프라이머로서열번호 21의 염기서열; 정방향프라이머로서열번호 22,역방향프라이머로서열번호 23의 염기서열; 정방향프라이머로서열번호 24,역방향프라이머로서열번호 25의 염기서열; 정방향프라이머로서열번호 26,역방향프라이머로서열번호 27의 염기서열; 정방향프라이머로서열번호 28,역방향프라이머로서열번호 29의 염기서열;또는 정방향프라이머로서열번호 30,역방향프라이머로서열번호 31의 염기서열; 인것을특징으로하는검출방법. [청구항 11] 제 7항에 있어서, 상기검체시료는인간의객담,혈액,타액또는소변으로부터유래된 DNA시료인것을특징으로하는검출방법. [청구항 12] 제 7항에 있어서, 상기융해곡선분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석)방법으로수행하는것을특징으로하는검출방법. [청구항 13] 제 7항에 있어서, 상기증폭은실시간중합효소연쇄반응 (real-time PCR)방법으로수행하는 것을특징으로하는검출방법. |
발명의명칭:유전성난청검출용 P N A프로브및이를이용한 유전성난청검출방법
기술분야
[1] 본발명은유전성난청검출용 PNA(Peptide Nucleic Acid)프로브및이를
이용한유전성난청검출방법에관한것이다.
배경기술
[2] 난청은현재발견되는신생아의선천성질환중발 병률이높은질환의하나로
1,000명의신생아당 0.9명부터 5.9명까지보고되고있으며,신생아난청은높은 비중을차자하고있음에도불구하고,출생시발 되지못하고 2세이후에 이르러서야발견,진단되는경향이 있다.
[3] 출생후첫 3년이언어발달에가장중요한시기이므로, 2세이전에난청이 발견되어치료되지않는다면이후언어재활의어 려움과더불어평생 장애인으로남는후유증이발생한다.따라서이 예방을위해유전성난청과 같이영아또는소아들의청각장애를조기에발견 하고적절한재활치료를해 주기위한신생아난청선별검출의필요성이대두 되었다.
[4] 한편,신생아난청선별검사는자동청성뇌간반 검사 (AABR)또는
자동이음향방사검사 (AOAE)등의기기를통해서시행되고있지만,이러 한 기기를통한물리적검사는선천성난청진단시에 만유용하며,비증후군성 유전성난청진단은불가능한단점이 있다.따라서비증후군성유전성난청 진단을위해서신생아의유전자검출이필수적이 라고할수있다.
[5] 현재까지유전자돌연변이검출방법은중합효소 연쇄반웅 (polymerase chain reaction, PCR)결과물의직접적인염기서열분석법 (Direct sequencing), 제한효소절편길이다양성분석법 (PCR-RFLP),라인프로브분석법 (Line Probe assay),제한효소절편질량다양성분석법 (PCR-RFMP)및 multiplex PCR방법과 DNA칩을이용한검출방법이 있다.
[6] 유전성난청진단방법으로는 DNA칩 (chip)이나 PCR을통한 DNA
서열분석 (sequencing)위주로진행되어왔으나, DNA칩기술은새로운변이가 발견되면칩자체를새롭게제작해야하는제약이 있다.따라서대한민국 공개특허공보 2012-0067384호에개시된것과같은유전성난청을저 렴하고 정확하게진단하는기술이필요하다.
[7] 최근프로브를이용한검출방법은감도 (sensitivity)와특이성 (specificity)이높아 각광받고있다.하지만,복잡한디자인방식의 로브검출은값이비싸고 사용상의불편함이 있다.따라서보다간편한디자인올통해신속하 정확성이 높은검출이가능한기술의 개발이절실히요구되는상황이다.
발명의상세한설명 기술적과제
[8] 상기와같은문제점의해결을위하여본발명에서 는유전성난청검출을위한
PNA프로브와프라이머쌍 (primer pair)을설계하여제공하고자하였다.
[9] 또한,상기 PNA프로브와프라이머쌍을이용하여증폭되고, 성화된검체 시료로부터난청과관련된유전자의 변이를검출하는방법을제공하고자 하였다.
과제해결수단
[10] 본발명은서열번호 1내지서열번호 11로이루어진군으로부터선택된어느 하나의서열을포함하는유전성난청검출용 PNA프로브에관한것이다.
[11] 또한본발명은서열번호 12내지서열번호 31로이루어진군에서선택되는 유전성난청검출용프라이머쌍에 있어서,
[12] 정방향프라이머로서열번호 12,역방향프라이머로서열번호 13의염기서열;
[13] 정방향프라이머로서열번호 14,역방향프라이머로서열번호 15의염기서열;
[14] 정방향프라이머로서열번호 16,역방향프라이머로서열번호 17의 염기서열;
[15] 정방향프라이머로서열번호 18,역방향프라이머로서열번호 19의 염기서열;
[16] 정방향프라이머로서열번호 20,역방향프라이머로서열번호 21의염기서열;
[17] 정방향프라이머로서열번호 22,역방향프라이머로서열번호 23의염기서열;
[18] 정방향프라이머로서열번호 24,역방향프라이머로서열번호 25의염기서열;
[19] 정방향프라이머로서열번호 26,역방향프라이머로서열번호 27의 염기서열;
[20] 정방향프라이머로서열번호 28,역방향프라이머로서열번호 29의염기서열; 또는
[21] 정방향프라이머로서열번호 30,역방향프라이머로서열번호 31의
염기서열;인프라이머쌍 (primer pair)에관한것이다.
[22] 또한본발명은상기 PNA프로브및프라이머쌍을포함하는유전성난청
검출용조성물에관한것이다.
[23] 또한본발명은 a)검체시료로부터 gDNA를추출하는단계; b) GJB2, SLC26A4, 12S rRNA, CDH23및 TMPRSS3로이루어진군에서선택되는유전자또는 변이체를증폭시킬수있는정방향및역방향프라 이머쌍을이용하여상기 유전자또는그변이체를증폭시키고,상기유전 또는그변이체와혼성화할 수있는 PNA프로브와혼성화시키는단계 ;및 c)상기 b)단계에서흔성화된 반웅물의융해곡선을분석하여상기유전자또는 그변이체를검출하는단계;를 포함하는유전성난청검출방법에관한것이다.
발명의효과
[24] 본발명에따른유전성난청검출용 PNA프로브및이를이용한유전성난청 검출방법을통해난청과관련된유전자또는그변 이체를신속간단하게판별할 수있으며,유전성난청의주요한원인이되는 GJB2, SLC26A4, 12S rRNA, CDH23및 TMPRSS3유전자의돌연변이 11개를이용하여유전성난청을조기에 진단하고비증후군성난청및위험도를진단하는 데활용될수있을것으로 기대된다.
도면의간단한설명
[25] 도 1은유전성난청검출을위한증폭과 PNA FMCA를위한 PCR조건이다.
[26] 도 2는난청관련유전자의야생형 (wild-type)및돌연변이개체의
융해곡선이다.
발명의실시를위한최선의형태
[27] 본발명의용어 "프로브"란,유전자또는 mRNA와특이적결합을이를수있는 짧게는수염기내지길게는수백염기에해당하는 RNA또는 DNA둥의 핵산 단편을의미하는데,올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)프로브,단쇄
DNA(single stranded DNA)프로브,이중쇄 DNA(double stranded DNA)프로브, RNA프로브등의형태로제작될수있고,보다용이 하게검출하기위하여 라벨링될수있으나,특별히이에제한되지는않 는다.
[28] 본발명의 "흔성화' '는상보적인단일가닥핵산들이 이중 -가닥핵산을형성하는 것을의미한다.흔성화는 2개의 핵산가닥간의상보성이완전할경우 (perfect match)일어나거나또는일부부정합 (mismatch)염기가존재하여도일어날수 있다.흔성화에필요한상보성의정도는흔성화 건에따라달라질수있으며, 특히온도에의하여조절될수있다.
[29] 본발명의 '핵산 '은검출하고자하는핵산서열을의미하며,흔 화,어닐링또는 증폭조건하에서프라이머또는프로브와어닐링 또는혼성화된다.
[30] 본발명은서열번호 1내지서열번호 11로이루어진군으로부터선택된어느 하나의서열을포함하는유전성난청검출용 PNA프로브에관한것이다.
[31] PNA(Peptide Nucleic Acid)는 LNA(Locked nucleic acid), MNA(Mopholino nucleic acid)처럼유전자인식물질의하나로,인공적으로 합성하며기본골격이 폴리아미드 (polyamide)로구성되어 있다. PNA는친화도 (affinity)와선택성 (selectivity)이매우우수하며 ,핵산분해효소에대한안정성이높아현존하는 제한효소 (restriction enzyme)로분해되지않는다.또한열 /화학적으로물성및 안정성이높아보관이용이하고쉽게분해되지않 는장점이 있다.또한
DNA-DNA결합력보다 PNA-DNA결합력이매우우수하여 1개의 핵산 불일치 (nucleotide mismatch)에도 1( 15°C가량융해온도 (Tm)차이가난다. 이러한결합력의차이를이용하여 SNP(single nucleotide polymorphism)및 InDel(insertion/deletion)핵산변화를검출할수있게 다.
[32] PNA프로브의핵산과이에상보적으로결합하는 DNA의차이에따라서도 Tm값의 변화를나타내어이를이용한웅용기술의개발이 용이하다. PNA 프로브는 TaqMan프로브의수화 (hydrolysis)반웅과는다른흔성화 (hybridization) 반응을이용하여분석하며,비슷한역할을하는 프로브로는분자표지
프로브 (molecular beacon probe),스콜피온프로브 (scorpion probe)가있다. [33] 흔성화반웅의분석방법으로는형광융해곡선분 석 (Fluorescence Melting Curve Analysis, FMCA)를이용하며,형광융해곡선분석은 PCR반웅종료후생성된 산물과투입한프로브간의결합력차이를융해온 도로구분하여분석한다.다른 SNP검출프로브와는다르게프로브디자인이매우 간편하여 SNP를포함하는 11-18 mer의염기서열을이용하여제작한다.따라서원 는융해온도를갖는 프로브를설계하기위해서는 PNA프로브의길이에따라 Tm값을조절할수 있으며,같은길이의 PNA프로브라도 probe에변화를주어 Tm값을조절할수 있다. PNA는 DNA보다결합력이우수하여기본적인 Tm값이높기때문에 DNA보다짧은길이로 design이가능하여가깝게이웃한 SNP라도 detection이 가능하다.기존의 HRM method는 Tm값의차이가약 0.5 o C로매우작아추가적인 분석프로그램이나세밀한온도변화가요구되고 2개이상의 SNP가나타날경우 분석이어렵게되는반면, PNA프로브는 probe sequence이외의 SNP에대해서는 영향을받지않아분석이가능하다.
[34] 본발명에서상기 PNA프로브는제한되지는않으나 GJB2, SLC26A4, 12S
rRNA, CDH23및 TMPRSS3로이루어진군에서선택된어느하나의유 자와 흔성화 (hybridization)할수있다.
[35] 본발명에서상기 PNA프로브는제한되지는않으나상기 GJB2유전자의 V37I, 235delC, 299-300delAT, R143W, SLC26A4유전자의 T410M, L676Q, H723R, IVS7-2A>G, 12S rRNA유전자의 1555A>G, CDH23유전자의 P240L및
TMPRSS3유전자의 A306T로이루어진군에서선택된어느하나의유전 변이체와흔성화할수있다.
[36] 또한본발명에서상기 PNA프로브는제한되지는않으나리포터또는
소광자가결합되어있을수있다.본발명의리포 및소광자가포함된 PNA 프로브는표적핵산과흔성화된후형광신호가발 생하며,온도가올라감에따라 프로브의적정융해온도에서표적핵산과빠르게 융해되어형광신호가 소광되며,이러한온도변화에따른상기형광신 로부터얻어진고해상도의 융해곡선분석을통하여표적핵산의유무를검출 할수있다.
[37] 본발명에있어서, "PNA프로브 (probe)"는표적핵산이존재하는경우
표적핵산에우선적으로결합하여예상된융해온 도 (Tm)값을보이며, 표적핵산이없는경우내부컨트를에결합하여예 상보다낮은융해온도 (Tm) 값을보이는것올특징으로할수있으며,내부컨 트롤과표적핵산융해곡선 차이를이용하여위양성및위음성시그널을구분 할수있다. PNA프로브는 TaqMan probe의 hydrolysis method와는다른 hybridization method를이용하여 분석하며 ,비슷한역할을하는 probe로는 molecular beacon probe, scorpion probe가 있다.
[38] 본발명의프로브는양말단에리포터와리포터형 광을소광할수있는
소광자의형광물질이결합할수있으며,인터컬 레이팅 (intercalating)형광물질을 포함할수있다.상기리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), HEX, Texas red, JOE, TAMRA, CY5, CY3, Alexa680로구성되는군에서선택되는하나이상일 있으며,상기소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 또는 Dabysyl을사용하는것이바람직하지만이에한정 는것은아니다.상기 인터컬레이팅형광물질은아크리딘호모다이머 (Acridine homodimer)및이의 유도체,아크리딘오렌지 (Acridine Orange)및이의유도체,
7-아미노액티노마이신 D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD)및이의유도체, 액티노마이신 D(Actinomycin D)및이의유도체,에이씨엠에이 (ACMA,
9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine)및이의유도체,디 이피아이 (DAPI)및 이의유도체,디하이드로에티듐 (Dihydroethidium)및이의유도체,에티듐 브로마이드 (Ethidium bromide)및이의유도체,에티듐호모다이머 -l(EthD-l)및 이의유도체,에티듬호모다이머 -2(EthD-2)및이의유도체 ,에티듐
모노아자이드 (Ethidium monoazide)및이의유도체,핵시디움
아이오다이드 (Hexidium iodide)및이의유도체,비스벤지마이드 (bisbenzimide, Hoechst 33258)및이의유도체,호에크스트 33342(Hoechst 33342)및이의 유도체,호에크스트 34580(Hoechst 34580)및이의유도체,
하이드로옥시스티바미딘 (hydroxystilbamidine)및이의유도체,엘디에스
751(LDS 751)및이의유도체,프로피디움아이오다이드 (Propidium Iodide, PI)와 이의유도체및사이다이스 (Cy-dyes)유도체로이루어진군에서선택될수있다 .
[39] 또한본발명은서열번호 12내지서열번호 31로이루어진군에서선택되는 유전성난청검출용프라이머쌍에 있어서,
[40]
[41] *정방향프라이머로서열번호 12,역방향프라이머로서열번호 13의 염기서열;
[42] 정방향프라이머로서열번호 14,역방향프라이머로서열번호 15의염기서열;
[43] 정방향프라이머로서열번호 16,역방향프라이머로서열번호 17의염기서열;
[44] 정방향프라이머로서열번호 18,역방향프라이머로서열번호 19의염기서열;
[45] 정방향프라이머로서열번호 20,역방향프라이머로서열번호 21의염기서열;
[46] 정방향프라이머로서열번호 22,역방향프라이머로서열번호 23의 염기서열;
[47] 정방향프라이머로서열번호 24,역방향프라이머로서열번호 25의 염기서열;
[48] 정방향프라이머로서열번호 26,역방향프라이머로서열번호 27의염기서열;
[49] 정방향프라이머로서열번호 28,역방향프라이머로서열번호 29의염기서열; 또는
[50] 정방향프라이머로서열번호 30,역방향프라이머로서열번호 31의
염기서열;인프라이머쌍 (primer pair)에관한것이다.
[51] 또한본발명은상기 PNA프로브및상기프라이머쌍을포함하는유전성 난청 검출용조성물에관한것이다.
[52] 본발명의조성물은제한되지는않으나하나이상 의상기프라이머쌍,상기
PNA프로브및 FMCA버퍼를포함할수있다.예를들어,서열번호 1의 PNA 프로브와서열번호 12/13의프라이머쌍은난청관련유전자인 GJB2의 V37I 변이체,서열번호 2내지 3의 PNA프로브와서열번호 14/15의프라이머쌍은 GJB2또는그변이체 (235delC, 299delAT),서열번호 4의 PNA프로브와 16/17의 프라이머쌍은 CDH23또는그변이체 (P240L),서열번호 5의 PNA프로브와 서열번호 18/19의프라이머쌍은 SLC26A4또는그변이체 (T410M),서열번호 6의 PNA프로브와서열번호 20/21의프라이머쌍은 SLC26A4또는그
변이체 (L676Q),서열번호 7의 PNA프로브와서열번호 22/23의프라이머쌍은 SLC26A4또는그변이체 (H723R),서열번호 8의 PNA프로브와서열번호 24/25의 프라이머쌍은 SLC26A4또는그변이체 (IVS7-2A>G),서열번호 9의 PNA 프로브와서열번호 26/27의프라이머쌍은 12S rRNA또는그변이체 (1555A>G), 서열번호 10의 PNA프로브와서열번호 30/31의프라이머쌍은 TMPRSS3또는 그변이체 (A306T)및서열번호 11의 PNA프로브와서열번호 28/29의프라이머 쌍은 GJB2또는그변이체 (R143W)의검출용 PCR조성물이될수있다.
[53] 또한본발명은 a)검체시료로부터 gDNA를추출하는단계; b) GJB2, SLC26A4, 12S rRNA, CDH23및 TMPRSS3로이루어진군에서선택되는유전자또는 변이체를증폭시킬수있는정방향및역방향프라 이머쌍을이용하여상기 유전자또는그변이체를증폭시키고,상기유전 또는그변이체와흔성화할 수있는 PNA프로브와흔성화시키는단계 ;및 c)상기 b)단계에서흔성화된 반응물의융해곡선올분석하여상기유전자또는 그변이체를검출하는단계;를 포함하는유전성난청검출방법에관한것이다.
[54] 본발명의유전성난청검출에서사용될수있는시 료는 DNA또는 RNA이며, 상기분자는이증가닥또는단일가닥형체일수있 다.초기물질로서핵산이 이중가닥인경우,두가닥을단일가닥으로,또 는부분적인단일 -가닥형태로 만드는것이바람직하다.가닥들을분리하는것 로알려진방법들은,열, 알카리,포름아미드,우레아및글리콕살처리, 소적방법 (예,헬리카아제작용) 및결합단백질을포함하나,이에한정되는것은 아니다.예를들어,가닥분리는 80내지 105 o C의은도로열처리하여달성될수있다.
[55] 본발명의검출방법은타겟 DNA또는 RNA가존재하는경우타겟에
우선적으로결합하여 예상된융해온도 (Tm)값을보이며,타겟이없는경우즉, 돌연변이의경우,융해온도 (Tm)값의차이가발생하는것을특징으로하며, 를 이용하여유전성난청을검출할수있다.
[56] 본발명에서상기유전자의변이체는제한되지는 않으나상기 GJB2유전자의 V37I, 235delC, 299-300delAT, R143W, SLC26A4유전자의 T410M, L676Q, H723R, IVS7-2A>G, 12S rRNA유전자의 1555A>G, CDH23유전자의 P240L및
TMPRSS3유전자의 A306T로이루어진군에서선택될수있다.
[57] 유전적인원인에의한난청의경우다른증상과의 동반여부에따라증후군성 난청과비증후군성난청으로구분할수있으며, 증후군성난청의경우 상염색체열성유전의양상이 약 80%를차지하고있으며,약 15~20%는상염색체 우성유전이,나머지 2%미만이 X염색체와미토콘드리아에존재하는유전자에 의한것이다.비증후군성난청으로나타나는유 성난청의경우복잡한유전적 이형성올보이고있는데지금까지인간의 염색체에서 120군데이상이관련이 있는것으로보고가되었고,이증 41개의유전자가원인유전자로밝혀졌다.이 가운데 GJB2, GJB6및 SCL26A4유전자들이많은집단에유전성난청의주 원인인자로보고되고있다.또한,미토콘드리 12S rRNA유전자의돌연변이가 전체환자중 0.9%의빈도를나타내었다.
[58] 본발명에서상기 PNA프로브는제한되지는않으나서열번호 1내지서열번호 11로이루어진군으로부터선택된어느하나의서 일수있다.
[59] 본발명에서상기프라이머쌍은제한되지는않으 나
[6이 정방향프라이머로서열번호 12,역방향프라이머로서열번호 13의 염기서열;
[61] 정방향프라이머로서열번호 14,역방향프라이머로서열번호 15의염기서열;
[62] 정방향프라이머로서열번호 16,역방향프라이머로서열번호 17의 염기서열;
[63] 정방향프라이머로서열번호 18,역방향프라이머로서열번호 19의염기서열;
[64] 정방향프라이머로서열번호 20,역방향프라이머로서열번호 21의염기서열;
[65] 정방향프라이머로서열번호 22,역방향프라이머로서열번호 23의 염기서열;
[66] 정방향프라이머로서열번호 24,역방향프라이머로서열번호 25의 염기서열;
[67] 정방향프라이머로서열번호 26,역방향프라이머로서열번호 27의 염기서열;
[68] 정방향프라이머로서열번호 28,역방향프라이머로서열번호 29의염기서열; 또는
[69] 정방향프라이머로서열번호 30,역방향프라이머로서열번호 31의 염기서열; 일수있다.
[70] 본발명에서상기검체시료는제한되지는않으나 인간의객담,혈액,타액또는 소변으로부터유래된 DNA시료일수있다.
[71] 본발명에서 '검체시료'는다양한시료를포함하며 ,바람직하게는,본발명의 방법을이용하여생물시료 (bio-sample)를분석한다.식물,동물,인간,균류, 박테리아및바이러스기원의생물시료가분석될 수있다.포유류또는인간 기원의시료를분석하는경우,상기시료는특정 조직또는기관으로부터유래될 수있다ᅳ조직의대표적인예로는,결합,피부 근육또는신경조직이포함된다. 기관의대표적인예로는,눈,뇌,폐,간,비 ,골수,흉선,심장,림프,혈액,뼈, 연골,췌장,신장,담낭,위,소장,고환,난소, 궁,직장,신경계,선및내부 혈관이포함된다.분석되는생물시료는생물학 근원으로부터나온어떠한 세포,조직,유체액 (fluid),또는본발명에의하여잘분석될수있는어 한다른 매질 (medium)도포함하며,이는인간,동물,인간또 동물의소비를위하여 제조된음식으로부터얻은시료가포함된다.또 ,분석되는생물시료는체액 시료를포함하며,이는혈액,혈청,혈장,림프, 유,소변,분변,안구유액,타액, 정액,뇌추출물 (예컨대,뇌분쇄물),척수액,층수,비장및편 도선조직추출물이 포함되나,이에한정되는것은아니다.
[72] 본발명에서상기융해곡선제한되지는않으나분 석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis;형광융해곡선분석 )방법으로수행할수있다.
[73] 본발명의융해곡선분석은타겟 DNA또는 RNA와프로브로형성되는이중쇄 핵산의융해온도를해석하는방법이다.이러한 법은예컨대, Tm해석,또는 상기이중쇄의융해곡선의해석에의해행해지기 때문에,융해곡선분석이라고 불리고있다.검출목적의변이를포함하는검출 상서열에상보적인프로브를 이용하여,검출시료의표적단일쇄 DNA와상기프로브와의하이브리드 (이중쇄 DNA)를형성시킨다.계속해서,이하이브리드형성 체에가열처리를실시하고, 은도상승에따른하이브리드의해리 (융해)를흡광도등의시그널의변동에의해 검출한다.그리고,이검출결과에기초하여 Tm값을결정함으로써,
점돌연변이의유무를판단하는방법이다. Tm값은하이브리드형성체의 상동성이높을수록높고,상동성이낮을수록낮 아진다.이때문에,점돌연변이를 포함하는검출대상서열과그것에상보적인프로 브와의하이브리드형성체에 대해서미리 Tm값 (평가기준값)을구해두고,검출시료의표적단일 쇄 DNA와 상기프로브와의 Tm값 (측정값)을측정하여,측정값이평가기준값과 일한 정도이면,매치,즉표적 DNA에돌연변이가존재한다고판단할수있고, 측정값이평가기준값보다낮으면,미스매치,즉 겟 DNA에변이가존재하지 않는다고판단할수있다.
[74] 본발명의형광융해곡선분석은형광물질을사용 하여융해곡선을분석하는 방법으로,보다구체적으로,형광물질을포함 하는프로브를이용하여 융해곡선을분석할수있다.형광물질은리포터 소광자일수있으며, 인터컬레이팅형광물질일수있다.
[75] 본발명에서상기증폭은제한되지는않으나실시 간
중합효소연쇄반웅 (real-time PCR)방법으로수행할수있다.
[76] 본발명의실시간 PCR방법은,형광물질이 PCR과정에서 이중가닥 (double strand) DNA사슬에결합 (intercalating)되도록하고 PCR산물의증폭과함께, 온도를높여주어 DNA이중가닥을풀어줌으로써 DNA이중가닥사이에 존재하는형광물질의양이줄어들게되는융해곡 선의패턴,특히 DNA가 융해 (변성)되는은도 (Tm)를분석하여정상대조군과돌연변이사이에 염기서열의변이유무를분석할수있다.
[77] 이하,실시예를통하여본발명을보다상세히설 한다.그러나이들실시예는 본발명에 대한이해를돕기위한것일뿐,어떤의미로든본 발명의범위가이들 예로만한정되는것은아니다.
[78] 심시예 1:게높 DNA (genomic DNA)
[79] DNA는 HeLa Genomic DNA(New England BioLabs,영국)에서구입하였으며, 인위적 DNA변이는 Bioneer사 (한국)에서합성하여사용하였다.합성된난청 관련유전자변이는표 1과같다ᅳ [80] [표 1]
[81]
[82] 심시예 2: PNA프로브고
[83] 본발명에서 GJB2, SLC26A4, 12S rRNA, CDH23및 TMPRSS3유전자내특정 위치의돌연변이유무검출용표적프로브는표 2의서열번호 1내지 11과같다.
[84] 본발명에서사용한모든 PNA프로브 (FAM, HEX, Texas Red, Cy5-labeled,
Dabcyl)는파나진 (Panagene,한국)에서 HPLC정제방법을통해합성하였으며, 합성된모든프로브의순도는질량분석법을이용 하여확인하였으며, 표적핵산과의더효과적인결합을위해프로브의 불필요한이차구조는 피하였다.
[85] [표 2]
[86]
[87] 심시예 3:프라이머고?
[88] 5개의유전자의 11개돌연변이를검출하기위해 5개의프라이머세트를 구성하였으며,해당염기서열과융해온도 (Tm)그리고 PCR산물크기를표 3에 나타내었다.
[89]
HL12S-F GGTCGAAGGTGGATTTAGC 21 60.99 202 26
AG
HL12S-R GCTACACTCTGGTTCGTCC 21 60.31 27
AA
GJB2_R143W-1 GGTGGACCTACACAAGCA 21 63.54 90 28 F GCA
GJB2_R143W-1 TGGAGAAGCCGTCGTACAT 21 64 29 R GA
TMPRe8-F ATTTCAGCTTGTACCTCCC 23 62.82 189 30
CAAG
TMPRe8-R ACCCAGATGTACCATTGAA 23 62.15 31
CGTG
[91] 심시예 4:난청 ^자염기변이에따론읍해곡서분석
[92] 상기에서합성한이중가닥 DNA및 PNA프로브를이용한융해곡선분석을 위한 PCR은 CFX96™ Real-Time시스템 (BIO-RAD, USA)을이용하여 수행하였다ᅳ PCR의조건은도 1과같다.총볼륨이 20 μί이되도록 IX qPCR PreMix (시선바이오머티리얼스,한국), 0.05 μΜ forward primer및 ().5 μΜ reverse primer에 0·5μΜ PNA프로브, 7 ίΆ human gDNA(15ng/ ^)또는인공합성된 target DNA(Bioneer,한국)를첨가한다음실시간 PCR을실시하였다. 4개의 PNA 프로브는하나의튜브또는웰 (well)에각 PCR프라이머와함께첨가되었으며 멀티플렉스 (multiplex)로진행하였다.멀티플렉스조합은표 4와같이프라이머 세트와프로브를첨가하여수행하였다.
[93] [표 4]
[95] 실시간 PCR(real-time PCR)은 95°C에서 10분간변성시킨다음, 95°C에서 30초, 58°C에서 45초및 74°C에서 45초동안차례로반웅시켰다.상기과정을 40회 반복하였고,실시간으로형광 (fluorescence)을측정하였다.
[96] 이후, 95°C에서 5분간변성단계를거친다음 75°C에서 1분, 55°C에서 1분및 45°C에서 30초간흔성화반웅시키고, 20°C에서 85 0 C까지 1 0 C씩상승시키며 형광올측정하는융해곡선분석을수행하였다. 단계사이마다 5초간정지 상태를유지하였다 (도 1).
[97] Human gDNA를주형으로하여 PCR수행후,융해곡선분석을수행한결과, 완전한흔성화를보이는야생형 (wild type)과불일치 (mismatch)하는
돌연변이형 (mutant type)의융해온도차이가발생하는것을확인하였 (도 2).
[98] 도 2의 11개융해곡선증에 Setl은좌측으로부터 GJB2:V37I, GJB2:299delAT, CDH23:P240L, GJB2:235delC이고, Set2는좌측으로부터 SLC26A4:T410M, SLC26A4.L676Q, SLC26A4.H723R, SLC26A4:IVS7-2A>G이고, Set3는
좌측으로부터 12S rRNA: 1555A>G, GJB2:R143W, TMPRSS3:A306T의순이다. 또한ᄋ표시는돌연변이형, X표시는야생형을의미한다ᅳ
[99] PNA형광융해곡선분석 (FMCA)을통해얻어진융해온도는표 5에표시하였다. 표 5의각다중분석 (멀티플렉스, multiplex)용세트 A, B및 C에서사용되는 형광물질과프로브의조합과그에따른돌연변이 형및야행형의융해온도는 아래와같다. [100] [표 5]
[101]
[102] 상기 11가지돌연변이를각각의 염기서열분석을통해확인하기위해서는 최소 9가지 이상의중합효소연쇄반웅 (PCR)산물을제조하여염기서열을 분석해야한다.그러나,본발명에서구성한상 표 5의다중분석구성을통해 3 개의반웅튜브또는 96웰-플레이트 (well-plate) 3개의웰만으로도돌연변이에 대한정확도높은분석이가능하여증폭시약의소 모량을줄일수있으며, 96 웰-플레이트기준으로한번에분석하는검체의 도 8개검체에서 32개검체로 4배증가되는활용성이높다.또한,본발명은염기 서열분석에비해 DNA검체 사용량 (요구량)이 1/3수준으로감소하게되는데 DNA검체는혈액으로부터 분리하게되므로채혈량의감소효과가있다.따 서,상기로부터본발명의 방법은기존의방법에비하여현저히향상된효과 가있음을알수있었다.
[103] 상기결과로부터,유전성난청변이의융해온도 융해곡선분석을이용하여 유전성난청을효율적으로검출할수있었다.결 적으로본발명의 PNA프로브 및프라이머쌍을이용하여유전성난청을편리하 고신속하게높은정확성으로 확인할수있음을발견하여본발명을완성하였다 .
[104] 이상으로,본발명내용의특정한부분을상세히 기술하였는바,당업계의
통상의지식을가진자에게있어서,이러한구체 기술은단지바람직한 실시양태일뿐이며,이에의해본발명의범위가 제한되는것이아닌점은 명백할것이다ᅳ따라서본발명의실질적인범위 는첨부된청구항들과그것들의 등가물에의하여정의된다고할것이다. 서열목록 Free Text
서열목록은별도의파일로첨부하였다.