Es ist bekannt, daß neoplastische Transformationen von Zellen und Geweben kein für den Menschen spezifisches Phänomen darstellen. Die Entstehung von Tumoren, sowohl benignen als auch malignen, ist in verschiedenen tierischen Spezies und in Pflanzen beschrieben. Es ist heute gesichert, daß der Ursprung neoplastischer Entartungen auf der DNA-Ebene zu suchen ist.

Erst vor einigen Jahren konnte jedoch die Rolle von spezi- fischen Genen bei der Krebsentstehung auf molekularer Ebene gezeigt werden.

Die Analyse der in Wirbeltieren bekannten Tumore zeigt, daß neoplastische Entartungen entweder aus der Aktivierung der dominanten zellulären Oncogene oder aus der Inaktivierung der recessiven Tumorsuppressorgene resultieren. Im aktiven Zustand üben die Tumorsuppressorgene zahlreiche Funktionen wie Zelldifferenzierung, Zellkommunikation, Zelladhäsion, Wachstumshemmung, Regulation der Transkription, Apoptose und Hemmung der DNA-Synthese aus. Verlieren die Tumorsuppres- sorgene jedoch infolge von spezifischen Mutationen ihre Aktivität, treten neoplastische Transformationen auf. Diese Vorgänge sind zunächst bei der Fruchtfliege Drosophila melanogaster beobachtet (1) und wissenschaftlich untersucht

worden (2). Dabei wurde erkannt, daß recessive Mutationen des Drosophila melanogaster Tumorsuppressorgens lethal (2) tumorous imaginal discs (1 (2) tid) zu neoplastischen Entartungen der Imaginalscheiben, die die Anlagen der adulten Organe sind, führen. Durch die Mutation des Tumorsuppressorgens 1 (2) tid geht in den Imaginalscheiben von Drosophila die Fähigkeit zur Zelldifferenzierung verloren, ohne daß die Fähigkeit zur Zellteilung beeinträchtigt wird.

Weitere Untersuchungen haben gezeigt, daß das von dem Tumorsuppressorgen 1 (2) tid kodierte Genprodukt, das Tid56 Protein, eine signifikante Homologie zu den in der Evolution streng konservierten DnaJ Chaperonen zeigt, die aus einer Vielzahl von Organismen und auch beim Menschen bekannt sind.

Zu den an den Entfaltungs-und Rückfaltungsvorgängen von Proteinen beteiligten Chaperonen gehören auch die sogenannten Hitzeschock-Proteine (Hsp). Trotz des hohen Konservierungs- grades der DnaJ homologen Proteine von Bakterien bis zum Menschen mußte es nach den bisherigen wissenschaftlichen Erkenntnissen als unwahrscheinlich erscheinen, daß die Aufklärung der Wirkungen des Drosophila-Proteins Tid56 als Tumorsuppressor einen Hinweis auf ähnliche Funktionen der humanen DnaJ nomologen Proteine (HDJ-1 und HSJ-1) als molekulare Chaperone geben könnte, da zur Funktion dieser humanen Proteine bisher keine Daten vorliegen.

Die Frage, ob die beim Studium der Tumorbildung und Tumorsup- pression bei Drosophila melanogaster gewonnen Erkenntnisse auch auf den Menschen übertragen werden können, läßt sich nur dann benatworten, wenn ein dem Tumorsuppressor Tid56 der Drosophila entsprechender Tumorsuppressor beim Menschen gefunden wird. Es stellte sich deshalb die Aufgabe, ein hierfür geeignetes diagnostisches Mittel zu entwickeln.

Es wurde nun gefunden, daß ein polyklonaler Antikörper erfindungsgemäß zur Verfügung gestellt werden kann, der durch Immunisierung, beispielsweise einer Maus oder eines Kanin- chens, mit einem Polypeptid gemäß dem Sequenzprotokoll (SEQ ID Nr. 1) Glu-Ala-Tyr-Glu-Val-Leu-Ser-Asp-Lys-His-Lys-Arg-Glu-Ile-Tyr- Asp oder mit einem Protein, das diese Aminosäuresequenz in identischer oder abgewandelter, jedoch immunologisch gleich- wertiger Form aufweist, erhältlich ist.

Das vorstehend genannte Peptid SEQ ID Nr. 1 repräsentiert die DnaJ-Domäne des HSJ-la Proteins und entspricht dem am höchsten konservierten Teil der J-Domäne aller bisher bekannten DnaJ- ähnlichen Proteine. Der damit nach üblichen Verfahren hergestellte polyklonale Antikörper hTid erkennt nun überra- schenderweise ebenso wie ein weiterer polyklonaler Antikörper, der gegen das Drosophila melanogaster Protein Tid56 gerichtet ist, beim"Western"-Blotting das 50kDa Protein, das das menschliche Homologe zu dem Drosophila melanogaster Protein Tid56 ist.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein ELISA-Nachweis- verfahren für das tumorassoziierte Antigen hTid, bei dem man (1) eine Probe der zu untersuchenden Flüssigkeit an einen festen Träger bindet, (2) das auf dem Träger gebundene Antigen mit einem polyklonalen Antikörper behandelt, der durch Immunisierung mit einem Polypeptid gemäß dem Sequenzprotokoll (SEQ ID Nr. 1) oder mit einem Protein, das die Aminosäuresequenz in identischer

oder abgewandelter, jedoch immunologisch gleich- wertiger Form aufweist, wodurch der polyklonale Antikörper an das nachzuweisende Antigen gebunden wird, (3) dann einen Antikörper zugibt, der an den primären Antikörper spezifisch bindet und mit einem Enzym verknüpft ist, das die Umwandlung eines farblosen Substrats in ein farbiges Produkt katalysiert und (4) das farblose Substrat zugibt und die entstehende Färbung mißt.

Mit diesem Verfahren kann in einfacher und eindeutiger Weise das humane hTid-Protein nachgewiesen werden, das bei bestimm- ten Krebserkrankungen, nämlich dem Adenocarcinom des Dickdarms und des Endrometriums als auch bei Brust-, Lungen-und Cervixcarcinomen exprimiert wird. Dagegen wurde dieses Protein bei anderen Erkrankungen, wie einem humanen Sarkom, einem Lymphom oder einem Melanom nicht nachgewiesen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert : Beispiel 1 : Herstellung des anti-hTid Antikörpers und anderer erfindungsgemäßer Antikörper Ein polyklonales Kaninchenantiserum gegen das Peptid der SEQ ID Nr. 1 des Sequenzprotokolls gekoppelt an Hämocyanin über einen N-terminal zugefügten Cysteinrest wurde nach der Festphasenmethode von Merrifield in der Modifikation wie sie von Houghten et al. beschrieben ist, hergestellt (3), in an sich bekannter Weise gereinigt, in 0,9% NaCl gelöst und mit einem gleichen Volumen des unvollständigen Freundschen Adjuvans emulgiert, um eine Endkonzentration von 1 mg/ml zu

ergeben. 1 ml der frisch hergestellten Mischung wurde zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. Die Injektionen wurden im Abstand von 3 x 3 Wochen durchgeführt und 1 Woche nach der letzten Injektion Blut entnommen. Nach Entfernung der ganzen Zellen durch Zentrifugieren wurde das Antiserum gesammelt und bei-20° C aufbewart. Die Empfindlichkeit des polyklonalen Serums wurde mit dem Enzym gekoppelten Immunnachweis (ELISA) durchgeführt (s Beispiel 2). Die Antikörper wurden durch Affinitätschromatographie auf CNBr-aktivierten Sepharose 4B Säulen (Biotech, Freiburg) gereinigt. Der polyklonale Kaninchen anti-Tid Antikörper gegen das Drosophila melano- gaster 1 (2) tid Protein wurde nach dem Verfahren hergestellt, das von Kurzik-Dumke et al. beschrieben ist (4).

Beispiel 2 : ELISA Test Mikrotiterplatten wurden mit einer Proteinprobe beschichtet, die auf das Vorliegen des tumorassoziierten Antigens hTid geprüft werden sollte. In jede Vertiefung der Mikrotiterplatte wurde die Probe zusammen mit einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) bei einem pH 7,5 und 4°C gegeben und über Nacht stehen gelassen. Nach dem Auswaschen mit phosphatgepuf- ferter Salzlösung wurde die Mikrotiterplatte 1 Stunde bei Zimmertemperatur mit einer 3%-igen BSA-Lösung (= Bovine Serum Albumin) in PBS versetzt. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Verdünnungen in gepufferter Lösung (PBS mit 0, BSA) in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben. Nach zweistündiger Inkubation bei Raumtemperatur und Waschen mit PBS wurde der sekundäre Antikörper [Kaninchen-anti-IgG gekoppelt mit alkalischer Phosphatase (AP) (Sigma)] verdünnt im Verhältnis 1 : 5.000 in Pufferlösung in jede Vertiefung gegeben. Nach dem Auswaschen des nicht gebundenen Antikörpers wurde die alkalische Phosphatase mit einer Mischung von 0, des Nitroblau-Tetrazoliumsalzes (NTB) (Serva, Heidelberg) und 0, Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat-toluidiniumsalzes (X-

Phosphat) (Serva) in AP-Puffer (100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris, pH 9,2) gegeben. Die Absorption jeder Probe wurde bei einer Wellenlänge von 405 nm automatisch aufgezeichnet.

Beispiel 3 : Proteinanalyse durch Western-Blotting Rohe Proteinextrakte aus menschlicher Leber, dem Dickdarm und der Lunge wurden durch Gewebehomogenisierung in einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) hergestellt und durch Zentrifugierung in zwei Fraktionen aufgetrennt, wobei die obere Schicht frei von Zellkernen war und die untere Schicht Zellkerne und Zelltrümmer enthielt. Alle Maßnahmen wurden bei 4°C durchgeführt. Die Fraktionen wurden dann mit dem Protease Inhibitor Cocktail von Boehringer versetzt und entweder sofort für die Analyse eingesetzt oder bei-70°C vor der weiteren Verwendung aufbewahrt. In allen Geweben und Zellfraktionen wurde der Proteingehalt spektrophotometrisch nach der Methode von Bradford (5) bestimmt.

Der Nachweis des hTid-Proteins in den wie oben hergestellten Protein-Extrakten wurde dann unter denaturierenden Bedingungen mit Hilfe der SDS-PAGE Elektrophorese nach üblichen Bedingun- gen durchgeführt. Nach Übertragung auf eine Polyvinylfluorid (PVDF) Membran (Immobilen-P, Millipore-Corporation, Milford, U. S. A.) wurde mit dem primären polyklonalen anti-hTid Antikörper (s. Beispiel 1) inkubiert und der Immunnachweis mit Hilfe eines sekundären Antikörpers, wie oben beschrieben, durchgeführt.

Beispiel 4 : Immunhistochemische Untersuchungen von mensch- lichem Gewebe und lichtmikroskopische Aus- wertung Operativ entferntes menschliches Gewebe wurde in Formalin (4%) fixiert und in Paraffin eingelagert, wie es in histophatologi-

schen Laboratorien üblich ist. Zur Immunmarkierung wurden Gewebeabschnitte von 3 Hm Durchmesser benutzt und der polyklonale Kaninchen Antikörper anti-hTid und der Anti-Tid Antikörper gegen das Protein Tid56 von Drosophila melanogaster eingesetzt. Die Antikörper Nachweisreaktion wurden grundsätz- lich mit dem Avidin-Biotin/Meerrettich-Peroxidase Komplex (ABC/HRP) (Vectastain Elite PK-6102, Camon-Labor Service GmbH, Wiesbaden) nach dem vom Hersteller beschriebenen Verfahren durchgeführt.

Literaturzusammenstellung (1) Kurzik-Dumke, U. 1995. Genetische und molekulare Analyse des Drosophila melanogaster Tumorsuppressorgens let- hal (2) tumorous imaginal discs (1 (2) tid). BIOSCOPE 4/95, Seite 26 bis 32.

(2) Kurzik-Dumke, U., Gundacker, D., Rentrop, M., and Gateff, E. 1995. Tumor Suppression in Drosophila Is Causally Related to the Function of the let- hal (2) tumorous imaginal discs Gene, a dnaJ Homolog.

Developmental Genetics 16 : 64-76 (1995).

(3) Houghten, R., Chang, W., Li, C. Human beta endorphin.

Synthesis and characterization of analogs iodinated and tritiated at tyrosine residues 1 and 27. Int. J. Pept.

Protein Res. 16,311-315,1980.

(4) Kurzik-Dumke, U., Debes, A., Kaymer, M. Mitochondrial localization and temporal expression of the Drosophila melanogaster DnaJ homologous tumor suppressor Tid 56, in preparation.

(5) Bradford, M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utili- zing the principle of protein-dye binding. Aual. Bio- chem. 72,248-254,1976.

Sequenzprotokoll

Allgemeine Angaben Anmelder : Dr. Ursula Kurzik-Dumke Institut für Genetik Johannes Gutenberg-Universität Mainz 55122 Mainz Bundesrepublik Deutschland Tel. : 06131/39 58 44 Fax : 06131/39 58 45 Bezeichnung der Erfindung : Polyklonaler Antikörper zum Nachweis des tumorassoziierten Antigens hTid Anzahl der Sequenzen : 1 Zustellanschrift : Patentanwälte Dr. Rainer A. Keil Ludwig R. Schaafhausen Nanno M. Lenz Dr. K.-H. Meyer-Dulheuer Eysseneckstraße 31 60322 Frankfurt am Main Computerlesbare Fassung : Datenträger : Diskette Computer : IBM PC compatible Operating System : PC-DOS/MS-DOS Software : Word Perfect 6.0

Angaben zur SEQ. ID-No. 1 : Länge : 16 Aminosäuren Art : Polypeptid Herkunft : Chemische Synthese ; inneres Fragment aus der DnaJ-Domäne des humanen HSJ- la Proteins Sequenzbeschreibung : SEQ ID No. 1 : Glu-Ala-Tyr-Glu-Val-Leu-Ser-Asp-Lys-His-Lys-Arg-Glu-Ile-Tyr- Asp