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| WO2004087739A1 | 2004-10-14 |
| CN1754889A | 2006-04-05 | |||
| CN1654478A | 2005-08-17 |
北京戈程知识产权代理有限公司 (CN)
| 权利要求书 1、 一种结构如式 所示的干扰素偶联物， P-NH-CH2-X-S-Y-Q (I) 其中， P是干扰素； X是 -(CH2)k-或- CH2(OCH2CH2)k-， k选自 1〜10 的整数； Q是甲氧基聚乙二醇； Y选自 Y1〜Y12: Υ2 Y3 Y4 Y5 其中 m、 n各自独立地选自 2〜10之间的整数。 2、 根据权利要求 1所述的干扰素偶联物， 其特征在于， 所述偶 联物选自式 （Π：)〜 (XIII)所示化合物： CH: ( Π) (ΠΙ) (IV) (XIII) 其中， P是干扰素， X是 -(CH2)k-或- CH2(OCH2CH2)k -， k选自 1〜 10， m、 n各自独立地选自 2〜10之间的整数， 1¾选自 100〜2000之 间的整数。 3、 根据权利要求 1或 2所述的干扰素偶联物， 其特征在于， 所 述干扰素选自所有类型的干扰素及其亚类中的任意一种，或者不同类 型和 /或亚类干扰素组成的复合干扰素。 4、 根据权利要求 3所述的干扰素偶联物， 其特征在于， 所述干 扰素是重组人干扰素 0 β、 γ或 ω， 优选重组人干扰素 α， 更优选重 组人干扰素 a2b。 5、 根据权利要求 4所述的干扰素偶联物， 其特征在于， m=2， n=2 o 6、 根据权利要求 5 所述的干扰素偶联物， 其特征在于， X 是 -(CH2)k-, k为 1〜4之间的整数， 优选 k=2。 7、 根据权利要求 6所述的干扰素偶联物， 其特征在于， mi选自 450-600之间的整数。 8、 根据权利要求 7所述的干扰素偶联物， 其特征在于， 每个甲 氧基聚乙二醇基团的平均分子量为 5,000-40,000 道尔顿， 优选为 20,000道尔顿。 9、 一种制备权利要求 1-8任意一项所述干扰素偶联物的方法， 其包括以下步骤： 1) 干扰素和含有已保护巯基的醛类物质反应， 形成通过 -NH-CH2-键连接的活化干扰素蛋白； 2) 所述活化的干扰素蛋白脱保护， 与活性甲氧基聚乙二醇衍生 物偶联。 10、根据权利要求 9所述的方法， 其特征在于所述醛类物质是式 (X IV) 的小分子醛化合 (XIV) 其中 k的数目选自 2〜10之间的整数， 优选 2( 11、根据权利要求 9或 10所述的方法， 其特征在于所述活性甲: 聚乙二醇衍生物是 （XVI) 的活化甲氧基聚乙二醇， (XVI) AG选自： CH- -NH—— CH2 m O 〇 •CH. -NH CH2 -NH ~ fCH -NH- m 〇 〇 〇 •CH -NH—— CH2 -NH—— CH?一 CH?- m 〇 其中 m、 n的数目选自 2〜10之间的整数， 优选 2( 12、 根据权利要求 9所述的方法， 包括以下步骤: (1) 制备结构通式为 物， (X IV) 其中 k的数目选自 2〜10之间的整数， 优选 2; (2) 将结构通式为 （X R 的小分子醛化合物与干扰素在缓冲 里反应， 并加入还原剂得到结构通式为 （X V) 的活化干扰素， 其中 P是指干扰素， 优选重组人干扰素 (x2b; (3)在含有活化干扰素的缓冲液里加入脱保护剂脱去结构通式为 (X V) 的活化干扰素的乙酰基保护基， 随后加入结构通式为 （X VI) 的活化甲氧基聚乙二醇进行聚乙二醇化反应，得到聚乙二醇干扰素偶 联物， (xvi) AG选自 0 、 , H2 0 H H2 H2 -N— C — C - O ■CH -NH—— CH2 -NH—— CH?一 CH?- m O 其中 m、 n的数目选自 2〜10之间的整数， 优选 2; (4) 纯化聚乙二醇干扰素偶联物。 13、 一种药物组合物， 其包含： 1) 如权利要求 1-8 任意一项所述的治疗有效量的聚乙二醇化干 扰素偶联物； 2) 药学可接受的药物载体。 14、权利要求 1-8所述的聚乙二醇化干扰素偶联物，权利要求 10 所述的药物组合物，在制备抗病毒、抗肿瘤、免疫调节药物中的用途; 优选在制备治疗慢性乙型肝炎、 丙型肝炎和戊型肝炎、 带状疱疹、 扁 平和尖锐湿疣、 乳头瘤病毒感染、 流行性出血热、 小儿呼吸道合胞病 毒肺炎、 毛细胞性白血病、 慢性粒细胞白血病、 黑色素瘤、 淋巴瘤、 多发性骨髓瘤、 肾细胞癌、 卵巢癌、 直肠癌、 肝癌、 肺癌的药物中的 用途。 |
技术领域
本发明涉及一种聚乙二醇干扰素偶联物，该偶 联物通过一种新颖 的生物蛋白分子的聚乙二醇修饰技术合成，具 有抗病毒感染、抗肿瘤、 免疫调节等生物学活性， 本发明的应用领域涉及生物化学、药物化学 以及人类疾病的治疗。 背景技术
干扰素 （Interferon:) 是一组具有多种功能的活性蛋白质， 是一类 重要的家族性细胞因子， 具有广谱的抗病毒、 抗细胞增殖、 和免疫调 节作用。 哺乳动物的干扰素可以分为 α、 β、 γ、 ω等几种类型， 其中 α干扰素又可分十余种亚型， 经大量临床研究证明 α型干扰素是一种 重要的抗病毒和抗肿瘤治疗药物。目前我国在 临床使用最广泛的主要 是重组人干扰素 alb、 a2b和 a2a。 另外， 美国 Amgen公司根据 13 种 α型干扰素的基因序列同源性，设计出的一种 新的蛋白质工程药 物干复津 （INFERGEN® , IFN-Con-1) 于 1997年经 FDA批准上市用 于治疗丙型肝炎， 其病毒活性是 a2b干扰素的 5〜10倍。
但是，一般来说，许多有生物技术 (如基因重组:)表达所得的产品， 包括干扰素，都是通过非肠道给药途径而进入 生物体内发挥其药效作 用。此类由非肠道给药的生物大分子药物产品 通常存在下面的一些问 题： （1) 生物大分子药物往往具有致敏性反应， 生物体内产生的抗体 会对生物体造成严重的伤害并影响治疗的进行 ； （2) 生物大分子药物 本身因受到抗体的影响或因蛋白分解酶而引起 的代谢作用，致使其生 物半衰期大为缩短； （3) 生物大分子的稳定性差， 保存困难。 所以， 无论是干扰素 alb、 a2b和 a2a还是干复津， 作为蛋白质药物， 由于 稳定性差， 血桨清除率高， 体内半衰期短， 易产生抗原抗体反应等， 在临床治疗中受到很大的限制， 这些缺点造成的结果是： 需频繁注射 干扰素才能达到有效的血桨治疗浓度； 而且， 每次注射后均会导致血 液浓度的较大波动， 形成药物浓度的峰值与谷值。这样就可能增加 了 治疗费用以及给药不便和不良反应的风险。 因此， 人们试图采用各种 药物传递技术 （Drug Delivery Technology), 来提高蛋白质药物的疗 效。 而目前在药物传递技术中研究最为广泛的是聚 乙二醇修饰技术 (PEGNOLOGY)。
1980年， Davis等人在美国专利 4,179,337中公开了利用单一分 子不同聚合度的聚乙二醇对蛋白药物进行的化 学修饰，在保持药物的 生物活性同时， 药物的抗原性降低， Verones等人在 Applied Biochem and Biotech 11, 142(1985)上公开发表了用氯甲酸苯酯活化的聚乙 二醇 修饰核糖核酸酶和超氧化物歧化酶， 增加了蛋白的生物半衰期。上述 现有技术文献报导已表明聚乙二醇修饰技术的 确可以解决非肠道给 药生物大分子药物存在的一些问题。
目前，市场上已经有两种聚乙二醇化干扰素产 品，分别是 Schering Plough公司的 PEG-IFNa2b (PEG-INTRON) 与 Hoffman-la Roche 公 司的 PEG-IFNa2a (PEGASYS)， 提高了干扰素在体内的半衰期， 达到 每周注射一次， 使得干扰素的生物利用度得到了一定程度的提 升。这 两个产品已占有国外干扰素市场 60%, 获得了巨大的经济效益。 发明内容
本发明的目的在于提供一种生物学活性更好、 生物利用度更高的 的聚乙二醇修饰的干扰素偶联物， 其结构如式 （I )所示：
P-NH-CH 2 -X-S-Y-Q
( I )
其中， P是干扰素， 包括所有类型的干扰素， 以及这些类型所有 的亚类， 以及不同类型和 /或亚类干扰素组成的复合干扰素； P可以是 任何来源的， 包括天然来源、组织培养或由基因重组技术得 到的干扰 素； P优选天然的或人工重组的干扰素蛋白， 更优选重组人干扰素， 更优选重组人干扰素 α、 β、 γ或 ω， 最优选 a2b; P既可通过本领域 公开的技术制得， 也可在市场上购得；
X是 -(CH 2 ) k -或- CH 2 (OCH 2 CH 2 ) k -， k选自 2〜10的整数，优选 1〜 4， 进一步优选为 2;
Q为甲氧基聚乙二醇，其平均分子量优选 5,000〜40,000道尔顿， 更优选 20,000道尔顿；
Y5 〇 工
一种结构通式为 （Π ) 的偶联
其中 P是指干扰素， X是 -(CH 2 ) k -或 -CH 2 (OCH 2 CH 2 ) k -， k的数目 1〜10， m、 n 的数目选自 2〜10， 选自 100〜2000之间的整 其中 X优选为 -(CH 2 ) k -， k的数目可进一步优选自 1〜4， 最优选 的是 2。
对上述优选实施方案进一步优选，本发明还提 供了最优选的一个 实施方案， 对应的结构式为：
m i 选自 450〜600的整数， 其中 P是指干扰素， 可进一步优选重 组人干扰素， 再优选重组人干扰素 α， 最优选重组人干扰素 (x2b。
本发明还 一种结构通式为 （III) 的偶联物：
其中 P是指重组人干扰素， X是 -(CH 2 ) k -或- CH 2 (OCH 2 CH 2 ) k -， k 的数目选自 1〜10， m的数目选自 2〜10， 1¾选自 100〜2000之间的 对结构式 （ΠΙ) 进一步优选， 所对应的最优选实施方案需要同时 满足以下条件： P是指重组人干扰素 a; X是 -(C¾) k -， 其中 k是 2; m的数目选自 2; mi选自 450〜600的整数。
本发明还提供一种结构通式为 （IV) 的偶联物： 其中 P是指重组人干扰素， X是 -(CH 2 ) k -或- CH 2 (OCH 2 CH 2 ) k -， k 的数目选自 1〜10， m的数目选自 2〜10， 1¾选自 100〜2000之间的 整数。
对结构式 （IV) 进一步优选， 所对应的最优选实施方案需要同时 满足以下条件： P是指重组人干扰素 a; X是 -(C¾) k -， 其中 k是 2; m的数目选自 2; in选自 450〜600的整数。
本发明还提供一种结构通式为 （V) 的偶联物： 其中 P是指重组人干扰素， X是 -(CH 2 ) k -或- CH 2 (OCH 2 CH 2 ) k -， k 的数目选自 1〜10， 1¾选自 100〜2000之间的整数。
对结构通式为 （V) 的偶联物进一步优选， 所对应的最优选实施 方案需要同时满足以下条件： P是指重组人干扰素 a; X是 -(CH 2 ：) k -， 其中 k是 2; 1¾选自 450〜600的整数。
本 一种结构通式为 （VI) 的偶联物：
其中 P是指重组人干扰素， X是 -(CH 2 ) k -或- CH 2 (OCH 2 CH 2 ) k -， k 的数目选自 1〜10， m的数目选自 2〜10， mi选自 100〜2000之间的 整数。
对结构式 （VI) 进一步优选， 所对应的最优选实施方案需要同时 满足以下条件： P是指重组人干扰素 a; X是 -(CH 2 ：) k -， 其中 k是 2; m的数目选自 2， mi选自 450〜600的整数。
本发明还提供一种结构通式为 （VII) 的偶联物： H
P-NH— C—— X—— S-SH-CHp -C-NH-f-CH OCH 2 CH 2 ~ OCH;
m m
(VII)
其中 P是指重组人干扰素， X是 -(CH 2 ) k -或- CH 2 (OCH 2 CH 2 ) k -， k 的数目选自 1〜10， m、 n的数目各自独立地选自 2〜10的整数， 1¾ 选自 100〜2000之间的整数。
对结构通式为 （VII) 的偶联物进一步优选， 所对应的最优选实施 方案需要同时满足以下条件： P是指重组人干扰素 a; X是 -(CH 2 ) k -， 其中 k是 2; m、 n的数目选自 2 ON; 选自 450〜600的整数。
本发明还提供一种结构通式为 (覆)的偶联物：
其中 P是指重组人干扰素， X是 -(CH 2 ) k -或- CH 2 (OCH 2 CH 2 ) k -， k 的数目选自 1〜10， m的数目选自 2〜10， 1¾选自 100〜2000之间的 对结构式 （覆）进一步优选， 所对应的最优选实施方案需要同时 满足以下条件： P是指重组人干扰素 a; X是 -(C¾) k -， 其中 k是 2; m的数目选自 2; mi选自 450〜600的整数。
本发明还提供一种结构通式为 IX) 的偶联物：
P— NH— CH 2 — X— S— CH 2 CH 2 -— - S . CH 2
(IX)
其中 P是指重组人干扰素， X是 -(CH 2 ) k -或- CH 2 (OCH 2 CH 2 ) k -， k 的数目选自 1〜10， m， n的数目选自 2〜10， 选自 100〜2000之 间的整数。 满足以下条件： P是指重组人干扰素^ X是 -(C¾ ， 其中 k是 2; m， n的数目选自 2; 选自 450〜600的整数。
本发明还提供一种结构通式为 （X) 的偶联物：
其中 P是指重组人干扰素， X是 -(CH 2 ) k -或- CH 2 (OCH 2 CH 2 ) k -， k 的数目选自 1〜10， m的数目选自 2〜10， 1¾选自 100〜2000之间 对结构通式为 （X) 的偶联物进一步优选， 所对应的最优选实施 方案需要同时满足以下条件： P是指重组人干扰素 a; X是 -(CH 2 ) k -， 其中 k是 2; m的数目选自 2， 1¾选自 450〜600的整数。
本发明还提供一种结构通式为 （XI) 的偶联物： 其中 P是指重组人干扰素， X是 -(CH 2 ) k -或- CH 2 (OCH 2 CH 2 ) k -， k 的数目选自 1〜10， m的数目选自 2〜10， mi选自 100〜2000之间的 对结构式 （XI) 进一步优选， 所对应的最优选实施方案需要同时 满足以下条件： P是指重组人干扰素 a; X是 -(CH 2 ) k -， 其中 k是 2; m的数目选自 2， mi选自 450〜600的整数。
本发明还提供一种结构通式为 （ΧΠ) 的偶联物：
-NH- -CH, ■ CHy -NH- CH2 -NH' CH' -NH- CH 2 CH 2 十 0CH 3
(ΧΠ)
其中 Ρ是指重组人干扰素， X是 -(CH 2 ) k -或- CH 2 (OCH 2 CH 2 ) k . 的数目选自 1〜10， m、 n的数目各自独立地选自 2〜10的整数， 选自 100〜2000之间的整数。 对结构通式为 （ΧΠ) 的偶联物进一步优选， 所对应的最优选实施 方案需要同时满足以下条件： Ρ是指重组人干扰素 a; X是 -(CH 2 ) k -， 其中 k是 2; m、 n的数目选自 2; 选自 450〜600的整数。
发明还提供一种结构通式为 （XIII) 的偶联物：
-ΝΗ- -CH 2 一 S- -CH 7 -NH- CH2 - NH—— CH 2 CH 2 — fOCH 2 CH 2 i— OCH;
(XIII)
其中 P是指重组人干扰素 X是 -(CH 2 ) k -或- CH 2 (OCH 2 CH 2 ) k -， k 的数目选自 1〜10， m、 n的数目 自独立地选自 2〜10的整数， 1¾ 选自 100〜2000之间的整数。
对结构通式为 （XIII) 的偶联物进一步优选， 所对应的最优选实 施方案需要同时满足以下条件： P是指重组人干扰素 α; X是 -(CH 2 ：) k -， 其中 k是 2; m、 n的数目选自 2; 选自 450〜600的整数。
本发明的又一目的在于提供一种制备所述干扰 素偶联物的方法， 该方法主要包括两个阶段：首先是干扰素和含 有已保护巯基的醛类物 质反应， 形成通过 -NH-CH 2 -键连接的活化干扰素蛋白； 然后， 所述活 化的干扰素脱保护， 与活性甲氧基聚乙二醇衍生物偶联， 通过分离而 得到。 具体而言， 其步骤包括：
(1) 制备结构通式为 （ 物：
(X IV)
其中 k的数目选自 2〜10， 优选 2;
(2) 将结构通式为 （X R 的小分子醛化合物与干扰素在缓冲液 里反应， 并加入还原剂得到结构通式为 （X V) 的活化干扰素； 其中 P是指干扰素， 优选重组人干扰素 (x2b， 缓冲液的 pH选自 4.0 7.0, 优选 4.5， 还原剂可以是硼氰化钠、 氰基硼氰化钠， 优选氰基 ί 氰化钠；
(3) 利用本领域公知的技术在含有活化干扰素的缓 冲液里加入脱 保护剂脱去结构通式为 （X V) 的活化干扰素的乙酰基保护基， 随后 加入结构通式为 （XVI) 的活化甲氧基聚乙二醇进行聚乙二醇化反 应，
(XVI)
缓冲体系的 pH选自 5.0〜7.0， 优选 pH6.2; AG选自：
O
■CH -NH- CH2 -NH- CHp -NH-
O O
O
" CH, -NH- CH2 -NH—— CH ? 一 CH;
m
O
其中 m、 n的数目选自 2〜10， 优选 2;
(4) 聚乙二醇干扰素偶联物的纯化方法采用本领域 技术人员公知 的技术， 如离子交换层析、 凝胶层析。
本发明制备所述干扰素偶联物的方法中， 结构通式为 （X IV) 的 小分子醛化合物可按文献公开的已知方法制备 ， 如 US4338435。
本发明的又一目的在于提供一种含有该被修饰 的干扰素偶联物 的药物组合物， 其包含： （1) 本发明所提供的治疗量的聚乙二醇化干 扰素偶联物； 药学可接受的药物载体。 本发明提供的干扰素偶联 物可以通过本领域公知的方法用药学可接受载 体或赋形剂制成适合 注射的药物组合物， 欲使用的药物组合物可制成制剂， 并按与合适的 医疗惯例一致的方式给药。本发明的化合物可 以在含有 132 mM氯化 钠的 10 mM磷酸钠 /钾缓冲液 pH7中配制。 任选地， 药物组合物可 以含有防腐剂。 药物组合物可以含有不同量的干扰素， 例如 10-1000 微克 /毫升， 例如 50微克或 400微克。 进一步，本发明的目的在于提供所述干扰素偶 联物以及含有它们 的药物组合物在制备抗病毒感染、 抗肿瘤、 免疫调节药物中的用途。 上述疾病具体包括： 慢性乙型肝炎、 丙型肝炎和戊型肝炎等； 病毒性 疾病如带状疱疹、 扁平和尖锐湿疣、 乳头瘤病毒感染、 流行性出血热 和小儿呼吸道合胞病毒肺炎等； 恶性肿瘤如毛细胞性白血病、慢性粒 细胞白血病、黑色素瘤、淋巴瘤、 多发性骨髓瘤、 肾细胞癌、卵巢癌、 直肠癌、 肝癌、 肺癌等。
干扰素或本发明提供的聚乙二醇干扰素偶联物 的生物活性可由 宿主细胞致病效应测试法的颜色反应而确定。 宿主细胞致病效应
(CytoPathic Effect,or CPE)测试法系由 Foti 提出（Methods in Enzymology,119,533,198)。 本法利用人类宿主细胞经干扰素处理后产 生抵抗病毒感染的活性而能防止细胞病变死亡 的原理设计而成的一 种简易快捷的颜色吸收反应测试方法。简单而 言， 宿主细胞在经干扰 素处理后可抵抗病毒入侵因而可防止宿主细胞 死亡。干扰素的抗病毒 生物活性即可经由存活细胞所吸收的染料而直 接定量测量。由此而来 的采用细胞病变抑制法通过 WISH-VSV系统测定干扰素的体外抗病 毒活性， 是本技术领域公知的方法， 具体参照 2005版 《中华人民共 和国药典》 三部附录 X C"干扰素的生物活性测定"。
通过对本发明提供的聚乙二醇干扰素偶联物的 测试数据表明：本 发明提供的聚乙二醇干扰素偶联物可以达到修 饰干扰素 a2b 分子表 面氨基酸的目的且保留较多的干扰素 a2b 的生物活性并提供良好的 药代特性。
在本发明所提供的化合物中，干扰素与连接体 以 -NH-CH 2 -键形式 连接， 由此增强了 PEG修饰反应的专一性。 附图说明
图 1 是食蟹猴单次皮下给药相同剂量 HH-IFN-003 与 PEG-IFNa-2b (Peglntron, 先灵葆雅） 后的血清抗原浓度 -时间变化比较图。
图 2是食蟹猴单次皮下给药 10 g.kg-l HH-IFN-003及 Peglntron后血 清抗病毒活性-时间变化的比较图。 具体实施方式
实施例 h 乙酰基巯基丙醛的制备 将 11.2 g (0.2mmol) 丙烯醛与干燥的 100 ml THF加入到反应瓶 中，冷却至 0°C，然后缓慢滴加 1.52 g (0.02 mol)硫代乙酸 /20 ml THF 的混合溶液。滴加完毕保温反应 2小时后。 35°C减压浓缩除去过量的 丙烯醛。 然后快速上柱 （洗脱液纯正己垸→正己垸 /乙酸乙酯 =50/1)， 合并收集产物点， 减压浓缩至干得油状液体 0.6 g。
实施例 2: 活化干扰素的制备
取 600 mg干扰素 a2b (来自上海恒瑞医药有限公司:)，蛋白浓度为 1.0 mg/ml, 共 600 ml， 体系为 0.1 M乙酸缓冲液， pH 4.5; 取 39.6 mg 乙酰基巯基丙醛溶于 400 ul乙腈后加入以上蛋白溶液；再称取 756 mg 氰基硼氢化钠加入上述反应液， 并慢速搅拌反应， 冰浴控制反应温度 在 10°C， 反应 4小时； 然后将反应液转入透析袋 （截留分子量 3500), 对 0.1 M磷酸钠盐缓冲液， 含 2 mM EDTA， pH 6.25进行透析， 以除 掉过量的小分子醛， 然后再加入羟胺脱去乙酰基， 得活化干扰素。
说明： 以下实施例 （3~8) 为将实施例 2得到的活化干扰素用活 性聚乙二醇修饰， 并得到聚乙二醇干扰素的过程。 目标物的代号及结 构示意图见下表， 其中 IFN是活化干扰素 a2b:
实施例 3: HH-IFN-001的制备
通过实施例 2得到的 100 mg活化干扰素 a2b (1.0 mg/ml, 0.1 M磷 酸钠盐缓冲液， 含 2mMEDTA， pH 6.25), 加入 0.25 g mPEG-马来酰 胺 （5kD， 来自 SU BIO), 搅拌反应 60分钟； 再加入 N-甲基马来酰 亚胺至浓度为 5mM，室温反应 30分钟， 以反应掉蛋白上剩余的巯基； 然后将反应液透析至 20 mM乙酸缓冲液体系。
反应液使用离子交换层析 （SP Sepharose H.P) 纯化， 得到聚乙二 醇化干扰素 （HH-IFN-001), 约 17.5mg， 经 MALDI-TOF-MS检测分子 量为 24.6KD。
实施例 4: HH-IFN-002的制备
向实施例 2得到的含有游离巯基的 100 mg活化干扰素 a2b (1.0 mg/ml, 0.1M磷酸钠盐缓冲液， 含 2mMEDTA， pH 6.25), 加入 0.5 g mPEG-马来酰胺（10kD， 来自 SUNBIO), 搅拌反应 60分钟； 再加入 N-甲基马来酰亚胺至浓度为 5 mM， 室温反应 30分钟， 以反应掉蛋白 上剩余的巯基； 然后将反应液透析至 20 mM乙酸缓冲液体系。
反应液使用离子交换层析 （SP Sepharose H.P) 纯化， 得到聚乙二 醇化干扰素 （HH-IFN-002),约 15.3mg，经 MALDI-TOF-MS检测分子 量为 29.9KD。
实施例 5: HH-IFN-003的制备
向实施例 2得到的含有游离巯基的 100 mg活化干扰素 a2b (1.0 mg/ml, 0.1M磷酸钠盐缓冲液， 含 2 mMEDTA， pH6.25), 加入 1.0 g mPEG-马来酰胺（20kD， 来自 SU BIO), 搅拌反应 60 分钟； 再加入 N-甲基马来酰亚胺至浓度为 5 mM， 室温反应 30分钟， 以反应掉蛋白 上剩余的巯基； 然后将反应液透析至 20 mM乙酸缓冲液体系。
反应液使用离子交换层析 （SP Sepharose H.P) 纯化， 得到聚乙二 醇化干扰素 （HH-IFN-003),约 16.0 mg，经 MALDI-TOF-MS检测分子 量为 40.3KD。
实施例 6: HH-IFN-004的制备
向实施例 2得到的含有游离巯基的 100 mg活化干扰素 a2b (1.0 mg/ml, 0.1 M磷酸钠盐缓冲液， 含 2 mM EDTA， pH6.25), 加入 2.0 g mPEG-马来酰胺 （40kD， 来自 SU BIO), 拌反应 60分钟， 再加入 N- 甲基马来酰亚胺至浓度为 5 mM， 室温反应 30分钟， 以反应掉蛋白上 剩余的巯基； 然后将反应液透析至 20 mM乙酸缓冲液体系。
反应液使用离子交换层析 （SP Sepharose H.P) 纯化， 得到聚乙二 醇化干扰素 （HH-IFN-004),约 14.5 mg，经 MALDI-TOF-MS检测分子 量为 60.1KD。
实施例 7: HH-IFN-005的制备
向实施例 2得到的含有游离巯基的 100 mg活化干扰素 a2b (1.0 mg/ml, 0.1M磷酸钠盐缓冲液， 含 2mM EDTA， pH 6.25), 加入 l.Og mPEG-邻吡啶基-二硫化物 （20KD, 来自 SU BIO), 搅拌反应 60分 钟， 再加入 N-甲基马来酰亚胺至浓度为 5 mM， 室温反应 30分钟， 以反应掉蛋白上剩余的巯基； 然后将反应液透析至 20 mM乙酸缓冲 液体系。
反应液使用离子交换层析 （SP Sepharose H.P) 纯化， 得到聚乙二 醇化干扰素 （HH-IFN-005),约 16.0 mg，经 MALDI-TOF-MS检测分子 量为 41.0KD。
实施例 8: HH-IFN-006的制备
向实施例 2得到的含有游离巯基的 100 mg活化干扰素 a2b (1.0 mg/ml, 0.1 M磷酸钠盐缓冲液， 含 2 mM EDTA， pH 6.25), 加入 l.Og 碘乙酰胺 -mPEG (20KD, 来自 NOF CORPORATION), 搅拌反应 60分 钟， 再加入 N-甲基马来酰亚胺至浓度为 5 mM， 室温反应 30分钟， 以 反应掉蛋白上剩余的巯基； 然后将反应液透析至 20 mM乙酸缓冲液体 系。
反应液使用离子交换层析 （SP Sepharose H.P) 纯化， 得到聚乙二 醇化干扰素 （HH-IFN-006),约 16.5 mg，经 MALDI-TOF-MS检测分子 量为 39.8KD。
实施例 9: 干扰素 a2b及 6种聚乙二醇干扰素偶联物的体外抗病 毒活性测试
采用细胞病变抑制法通过 WISH-VSV系统测定干扰素体外抗病毒 活性。
本实施例测定了 7种干扰素 （或衍生物） 的体外抗病毒活性，具体 包括： IFNa2b (上海恒瑞医药股份有限公司提供：)、 HH-IFN-001 (本发 明实施例 3制备)、 HH-IFN-002 (本发明实施例 4制备)、 HH-IFN-003 (本 发明实施例 5制备)、 HH-IFN-004 (；本发明实施例 6制备)、 HH-IFN-005 (；本发明实施例 7制备：)、 HH-IFN-006 (；本发明实施例 8制备：)。 体外抗 病毒活性测定结果见表 1 :
表 1 体外抗病毒活性测定结果
表 1中数据显示， 本发明所提供的聚乙二醇干扰素 a2b偶联物与 修饰前的干扰素 a2b相比， 仍保留有约 7-15%的抗病毒活性。
实施例 10: 食蟹猴单次皮下给药受试品 HH-IFN-003 和参比品 Peglntron后的血清抗原浓度和药代动力学比较实 验
用 Hu-IFN-a ELISA药盒可以测定血清中受试品 HH-IFN-003和 参比品 Peglntron的浓度。 Hu-IFN-a Immunoassay是一种放大的双夹 心抗体免疫分析法， 试验操作步骤遵照药盒说明书， 96 孔板预先用 IFN- α的单抗包被，分别加入受试品 HH-IFN-003和参比品 Peglntron, 孵育一定时间， 洗板， 加抗体稀释液， 封板， 室温孵育， 再洗板， 另 加入携有 HRP (辣根过氧化物酶） 耦合物， 封板， 室温孵育， 彻底 洗板， 最后加入显色底物室温避光孵育直到出现颜色 ； 加入终止液终 止反应， 用酶标仪测定 450 nm波长处的光吸收值。 光吸收值的对数 值与样品中 HH-IFN-003和 Peglntron的浓度对数值呈正相关，对浓度 对数和光吸收值对数进行双对数线性回归， 绘制标准曲线， 计算未知 样品浓度。
实验结果：与单次皮下给药先灵葆雅公司参比 品组 Peglntron, 10 μ^- Ι相比， HH-IFN-003受试品组各时间点血清抗原浓度在数 上 均大于 Peglntron组 （见图 1 )， AUC(0-96h)， 和 AUC(O-inf)均高于 Peglntron 组， 药代动力学参数见表 2。 表面单次皮下给药后， HH-IFN-003的体内暴露量要高于 PegIntron。
表 2 食蟹猴单次皮下注射受试品 HH-IFN-003与 Peglntron药代动力 学参数比较 受试品 HH-IFN-003 Peglntron 参 数 单位
lO g-kg- 1 10 g-kg- 1
AUC( 0- 96h) ng-h-mL" 1 1167.0 + 146.5 782.9 + 304.2
AUC(O-inf) ng-h-mL" 1 1187.3 ± 146.1 803.2 + 304.4 实施例 11 : 食蟹猴单次皮下给药 10 g'kg— 1 HH-IFN-003 及 Peglntron后血清抗病毒活性比较实验
PEG-IFNa-2b与 IFNa-2b活性测定方法采用细胞病变抑制试法 ( CPE法）， 以 WISH细胞作为病毒的宿主细胞 （易感细胞）， 细胞受 到病毒感染攻击后会产生细胞病变效应 （CPE ) , 细胞发生病变， 死 亡， 并从培养皿底部脱落。 在抗病毒活性药物的干预下， 未发生病变 的细胞附着在培养皿上， 利用结晶紫染料， 可使活细胞染色， 再用脱 色液将染料脱出， 通过测定其 OD值来反映细胞附着在培养皿上的存 活状态。 将处于对数生长期的 WISH细胞消化， 用含 10%FBS的 MEM培养 液调整细胞浓度， 接种于 96孔培养板中， 37°C， 5 %C02, 孵育 24小 时。 以 PBS清洗后， 分别加入以 2 %FBS的 MEM培养液稀释调配的含 有受试品 HH-IFN-003或参比品 Peglntron的血清样本，每个浓度设三复 孔， 并设无药物对照孔， 继续培养 24小时。 加入以 2%FBS的 MEM培 养液稀释调配的 100倍 TCID50 (50%细胞感染量） 的病毒， 并设无病 毒感染正常细胞孔和病毒感染对照组， 继续培养 24小时， 中性红染色 后甲醛固定， 洗涤后用脱色液溶解， 在 540nm处得到吸光度 (OD)值。 根据不同稀释度的待测样品抵抗病毒感染发生 的细胞病变 (CPE)的保 护能力， 计算出干扰素抵抗病毒感染抑制率 （％)， 并得到半数有效 保护浓度 （EC50)。
实验结果： 食蟹猴单次皮下给药 lO kg- 1 HH-IFN-003后各时间 点血清抗病毒活性的绝对值高于同剂量的 PegIntron。 见表 3、 图 2。 这 个结果表明， 由于 HH-IFN-003血药浓度要高于同剂量的 Peglntron, 因 此其体内的抗病毒药效也优于 PegIntron。
表 3 食蟹猴皮下给药单剂量 Peglntron 以及 HH-IFN-003后血清抗病 毒活性-时间变化的比较
抗病毒活性 （IU.mL- 1 )
时
间 10 g.kg- 1 10 g.kg- 1
点 HH-IFN-003 Peglntron
0 ND ND
4 184.7± 89.7 164.7±36.9
12 223.0± 132.4 210.7±30.9
24 180.7± 113.4 122.7± 17.9
48 24.0± 12.0 19.7±7.4
96 5.0± 1.0 3.3 ±3.2