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Title:
POLYMER-BOUND IODINE AS A QUENCHER FOR FLUORESCENCE MEASUREMENTS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2015/024576
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to a method for the quenching, by means of a halogen, of extracellular fluorescence in the detection, examination, and/or sorting of prokaryotic and eukaryotic cells by means of esterase substrates that fluoresce after ester cleavage, wherein at least one esterase substrate is used in combination with at least one halogen as such or in the form of a halogenide or as oligo halogenide ions, or as mixtures of two more of said species, bonded to a long-chain polymer, as a quencher, corresponding use of halogen/halogenide/oligo halogenide bonded to long-chain polymers, and measuring devices that are equipped with reservoirs for the halogen/halogenide/oligo halogenide and the long-chain polymer, separately or as a mixture.

Inventors:
BRUGGER SIMON (DE)
VASILEUSKAYA-SCHULZ ZINAIDA (DE)
MUHL MIKE (DE)
RIEGER ROBERT (DE)
STRNAD MARTIN (DE)
BRUNNENKAN BRITTA (DE)
SCHWÄR MARKUS (DE)
Application Number:
PCT/EP2013/002504
Publication Date:
February 26, 2015
Filing Date:
August 20, 2013
Export Citation:
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Assignee:
TESTO AG (DE)
International Classes:
C12Q1/04; G01N33/542
Domestic Patent References:
WO1992002632A11992-02-20
Foreign References:
DE69915468T22005-01-20
US6214563B12001-04-10
Other References:
MAKO KAMIYA ET AL: "An Enzymatically Activated Fluorescence Probe for Targeted Tumor Imaging", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 129, no. 13, 1 April 2007 (2007-04-01), pages 3918 - 3929, XP055106842, ISSN: 0002-7863, DOI: 10.1021/ja067710a
LI H ET AL: "A live-cell high-throughput screening assay for identification of fatty acid uptake inhibitors", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, ACADEMIC PRESS INC, NEW YORK, vol. 336, no. 1, 1 January 2005 (2005-01-01), pages 11 - 19, XP004665748, ISSN: 0003-2697, DOI: 10.1016/J.AB.2004.09.025
"CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay Kit", 20 July 2009 (2009-07-20), XP055073845, Retrieved from the Internet [retrieved on 20130801]
Attorney, Agent or Firm:
BÖRJES-PESTALOZZA, Heinrich et al. (DE)
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Claims:
Ansprüche

1. Verfahren zum Quenchen extrazellulärer Fluoreszenz bei der Detektion, Untersuchung und/oder Sortierung von prokaryotischen und eukaryot ischen Zellen mit nach Esterspaltung fluoreszierenden Esterase-Substraten mittels einem Halogen, umfassend, dass mindestens ein Esterase- Substrat in Kombination mit mindestens einem Halogen als solchem oder in Form eines Halogenids oder als Oligohalogenidionen, oder als Mischungen von zwei oder mehr der genannten Species, in an ein langkettiges Polymer gebundener Form als Quencher eingesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den eingesetzten Halogenen in der an das langkettige Polymer gebundenen Form um Brom oder Iod, Bromid- oder Iodidsalze, oder Tri- oder Pentabromid oder Tri- oder Pentaiodid, oder Gemische von zwei oder mehr davon handelt. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem eingesetzten langkettigen Polymeren um ein in wässrigen Lösungen lösbares oder dispergierbares oder quellbares, Halogen als solches, in Form von Halogenid und/oder als Ol igohalogenid bindendes Polymer handelt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei es sich bei dem eingesetzten langkettigen Polymer um ein Polyamid oder Polyimid, wie Nylon-6; ein Mannichbasen—Typ- Polyaminpolymer ; ein Polysaccharid, wie Stärke, Polydextrose , Glykogen oder Amylopektin; ein Polyethylenglykol ; ein Aminoglycan, wie Hyaluronat; ein monosubst ituiertes Polyacetylen mit Methyl, Ethyl, Propyl , Pentyl , t-Butyl oder Phenyl als Subst ituenten ; ein Anionenaustauscherharz , z.B. Aminoethyl - ,

Diethylaminoethyl - (DEAE-) , quarternäre Aminoethyl- (QAE-) und quarternäre Ammoniumgruppen, gekoppelt an Cellulose,- Agarose (Agar), Dextran (Dextrane) oder Polystyrol; einen Polyvinylalkohol (PVA) , insbesondere syndiotaktisch angereichert (S-PVA) ; oder um ein gesättigte oder ganz oder teilweise ungesättigte Heterocyclen mit 3 bis 10 Ringatomen, wovon ein bis drei unabhängig voneinander aus N oder NH, O und S ausgewählt sind und die vorzugsweise ein oder zwei Oxo- Reste tragen, beinhaltendes Polymer, wie vor allem Polyvinylpyrrolidon (PVP) , auch ganz oder teilweise quervernetzt, handelt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich bei dem eingesetzten Polymer um Polyvinylalkohol oder

Polyvinylpyrrolidon handelt. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Die bevorzugten mittleren Molmassen des langkettigen Polymeren im Bereich von 1000 Dalton bis 10 Millionen Dalton liegen, beispielsweise im Bereich von 2.500 bis 2.500.000 Dalton. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei als Esterase-Substrat Xanthene der folgenden Formeln:

Fluoresceinacetat , Fluoresceinlaurat , Fluoresceindiacetat (FDA) , Fluoresceindilaurat , halogeniertes

Fluoresceinmonoacetat , halogeniertes Fluoresceindiacetat, z.B. 2 7 ' -Dichlorf luoresceindiacetat oder Diacetyl-2 , 7- dichlorofluoreseein, Carboxyfluoresceinmonoacetat ,

Carboxyfluoresceindiacetat , wie 5, 6- oder 5,6- Carboxyfluoresceindiacetat (CFDA) , 5 (6)-CFDA -N- hydroxysuccinimidester , 5 -Maleimid- FDA, carboxyl iertes halogeniertes Fluorescein, Sulfof luoresceinmonoacetat , 5- oder 5 , 6 -sulfo-FDA Sulfof luoresceindiacetat ,

Azidofluoreszeinmonoacetat , Azidofluoresceindiacetat ,

Fluoreszein-Dipropionat , Fluoresceindibutyrat , Fluoresceindilaurat, 5 (6) -2 ' , 7 ' dichloro-CFDA, 5 ( 6 ) - sul fo- FDA, Di-beta-D- galactosid Fluorescein, 3-o-methylf luorescein Phosphat, pentaacetoxy Ester des 2 ', 7 ' -Bis- (Carboxyethyl ) -5 (6)- Carboxyfluorescein (BCECF / AM) , pentaacetoxy Ester des 2 ' , 7 ' -Bis (carboxyethyl) -5 ( 6 ) -Fluorescein (BCECF / AM) oder Chlormethylf luorescein diacetat, ;

Alanin-7-Amino-4-methylcumarin, Glycin- 7 -Amino-4 - methylcoumarin, Prolylvaline-7-Amino-4-methylcoumarin oder Glycyl -L-Prolin-7 -Amino-4 -methylcoumarin, 3- (2-Benzoxazolyl) umbilliferylacetat , 4-Methylumbelliferyl - butyrat oder -acetat, , 4-beta-D methylumbelliferyl Galactosid, 4 -Methylumbelliferyl -alpha-D-mannopyranosid, 4- Methylumbell iferyl nonanoate, 4-Methylumbelliferylphosphat oder Methyl - 1-umbelliferylglucoromide , ;

Eosindiacetat oder Carboxyeosindiacetat ,

Diacetoxy-2 , 3 -Dicyanbenzol acetat (ABD) oder Hydroethidin Resoruf inacetat ;

Alkohoholate , wie Methanolate, Ethanolate oder Butanolate der folgenden BOPIDY-Verbindungen :

BODIPY 6G

oder 8 -Octanoylpyrene- 1 , 3 , 6-trisulfonsäure- trialkalimetall (z. B . natrium) salz ; oder dergleichen, oder Mischungen von zwei oder mehr davon, eingesetzt werden. 8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das Halogen und das langkettige Polymer gemischt und anschließend mit einer zu prüfenden Probe gemischt werden.

9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das Halogen und das langkettige Polymer zugleich mit einer zu prüfenden Probe vermischt werden.

10. Verwendung von an ein langkettiges Polymer gebundenem Halogen, Halogenid und/oder Ol igohalogenid als Quencher bei der Untersuchung von prokaryot ischen und eukaryot ischen Zellen mit nach Esterspaltung fluoreszierenden Esterase- Substraten, wobei das langkettige Polymer, das Esterase- Substrat und die Halogene insbesondere wie in einem der vorstehenden Ansprüche definiert sind.

11. Messvorrichtung für intrazelluläre Fluoreszenz, beinhaltend ein oder mehrere Reservoirs für Lösungen des oder der Halogene und des oder der langkettigen Polymeren, oder einer Mischung hiervon, wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 genannt .

Zusammenfassung

Description:
Polymergebundenes lod als Quencher für Fluoreszenzmessungen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Quenchen extrazellulärer Fluoreszenz bei der Detektion und Untersuchung oder Sortierung von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen mit (zumindest) nach Esterspaltung fluoreszierenden Esterase-Substraten mittels Halogenen, sowie die Verwendung von Halogenen als Quencher bei der Untersuchung von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen mit nach Esterspaltung fluoreszierenden Esterase-Substraten, sowie damit verwandte Erfindungsgegenstände, wie für die Anwendung des Verfahrens ausgestattete Messvorrichtungen für intrazelluläre Fluoreszenz.

Esterase-Substrate , wie beispielsweise Carboxyf luores- ceindiacetat , Fluoresceindiacetat und Modifikationen hiervon, werden häufig in Bioassays, wie z.B. im Rahmen von ELISA, zytometrischen Untersuchungen und mikroskopischen

Untersuchungen, unter anderem für die Detektion von prokaryotischen und/oder eukaryotischen Zellen eingesetzt. Die Substrate werden von intrazellulären Esterasen in fluoreszierende Produkte wie Fluorescein, Carboxyf luorescein oder dergleichen, umgesetzt und liefern somit Informationen über das Vorhandensein und/oder den physiologischen Zustand der Zellen.

Ein Nachteil von esterasebasierten Assays zeigt sich in einem oft beträchtlichen Fluoreszenz -Hintergrund durch unspezifische, extrazelluläre Umsetzung von Esterase- Substraten oder den Ausfluss von fluoreszierenden Produkten aus den Zellen. Um daraus resultierende Störungen der Messung zu verringern, wurden in Bioassays Waschschritte und/oder Schritte zum Quenchen (Fluoreszenzlöschen, -unterdrücken) eingebaut zur Minimierung der unspezifischen Fluoreszenz. Die Waschschritte sind umständlich, zeitaufwändig und nicht mit jedem Assay kompatibel. In chemischen Assays wird häufig Iod in Form von Natrium- oder Kaliumiodid oder anderen Salzen in hoher Konzentration als Kontaktquencher verwendet, der aber - abhängig u.a. vom Puffer und Zelltyp - in die Zellen eindringen und somit zu intrazellulärem Quenching führen kann .

Es bestand somit die Aufgabe, neue Methoden und Ansätze zur Unterdrückung von unerwünschter extrazellulärer Fluoreszenz bei der Verwendung von fluoreszierende Farbstoffe freisetzenden Esterase-Substraten bereitzustellen, welche die genannten Nachteile eindämmen oder beseitigen.

Es wurde nun gefunden, dass diese Aufgabe durch die Verwendung langkettiger Polymere gelöst werden kann, welche Halogene, wie Iodid, zu binden vermögen, beispielsweise durch Van-der-Waals- , Wasserstoffbrücken- oder ionische oder kovalente Interaktionen oder zwei oder mehr davon, und so das Eindringen von Halogen (z.B. als Halogenid und somit die Fluoreszenzquenchung im Zellinneren, vermindern oder sogar vollständig verhindern.

Die Erfindung betrifft daher in einer ersten Ausführungsform ein Verfahren zum Quenchen extrazellulärer Fluoreszenz bei der Detektion, Untersuchung und/oder Sortierung von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen mit nach Esterspaltung fluoreszierenden Esterase-Substraten mittels einem Halogen, umfassend, dass mindestens ein Esterase- Substrat in Kombination mit mindestens einem Halogen als solchem oder in Form eines Halogenids oder als Oligohalogenidionen, oder als Mischungen von zwei oder mehr der genannten Species, in an ein langkettiges Polymer gebundener Form als Quencher eingesetzt wird. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung von an langkettige Polymeren gebundenem Halogen, Halogenid und/oder Ol igohalogenid als Quencher bei der Untersuchung von prokaryot ischen und eukaryotischen Zellen mit nach Esterspaltung fluoreszierenden Esterase-Substraten.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung betrifft diese für Anwendung des Verfahrens ausgestattete bzw. eingerichtete Messvorrichtungen für intrazelluläre

Fluoreszenz. Beispielsweise beinhalten diese ein oder mehrere Reservoirs für Lösungen des oder der Halogene und des oder der langkettigen Polymeren, oder einer Mischung hiervon.

Weitere Erfindungsgegenstände gehen aus der nachfolgenden Beschreibung sowie den Ansprüchen hervor, wobei Letztere hier durch Bezugnahme aufgenommen werden. Auch die in der Zusammenfassung beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung werden hier durch Bezugnahme inkorporiert .

Die nachfolgenden Definitionen dienen der Konkretisierung bevorzugter Formen verwendeter allgemeiner Begriffe, wobei in den Ausführungsformen der Erfindung ein, zwei, mehrere oder alle verwendeten allgemeinen Begriffe durch konkretere Begriffe ersetzt werden könne, was zu vorteilhaften Ausführungsformen der Erfindung führt.

Als langkettige Polymere kommen in erster Linie in wässrigen Lösungen lösbare oder dispergierbare oder quellbare, Halogen (als solches, in Form von Halogenid oder als Ol igohalogenid) bindende Polymere in Frage, z.B. Polyamide oder Polyimide, wie Nylon-β; Mannichbasen—Typ- Polyaminpolymere ; Polysaccha- ride, wie Stärke, Polydextrose , Glykogen oder Amylopek in ; Polyethylenglykol ; Aminoglycane , wie Hyaluronate; monosub- stituierte Polyacetylene mit Methyl, Ethyl , Propyl , Pentyl , t-Butyl oder Phenyl als Substituenten; oder insbesondere Anionenaustauscherharze , z.B. Aminoethyl-, Diethylaminoethyl - (DEAE-) , quarternäre Aminoethyl- (QAE-) und quarternäre Ammoniumgruppen, gekoppelt an Cellulose, Agarose (Agar) , Dextran (Dextrane) oder Polystyrol; Polyvinylalkohol (PVA) , insbesondere syndiotaktisch angereichert (S-PVA) ; oder vor allem gesättigte (bevorzugt) oder ganz oder teilweise ungesättigte Heterocyclen mit 3 bis 10 Ringatomen, wovon ein bis drei unabhängig voneinander aus N oder NH, O und S ausgewählt sind und die vorzugsweise ein oder zwei Oxo-Reste tragen, beinhaltende Polymere, wie vor allem Polyvinylpyrrol idon (PVP) (auch als Polyvidon, Povidon bezeichnet) (auch ganz oder teilweise quervernetzt) , in Frage. Die Polymeren sind dabei insbesondere in dem verwendeten Lösungsmittel mindestens für die Anregungs- und die Emissionswellenlänge der Fluoreszenz transparent .

Die bevorzugten Molekulargewichte (mittlere Molmassen) der Polymeren können dabei im Bereich von 1000 Dalton bis 10 Millionen Dalton liegen, beispielsweise in den unten für PVP angegebenen Bereichen.

Besonders bevorzugt ist PVP, welches handelsüblich mit Molekulargewichten (mittleren Molmassen) von 2.500 bis 2.500.000 Dalton erhältlich ist. Es wurde beobachtet, dass beispielsweise mit Molekulargewichten von 10.000 bis 40.000 Dalton gute Resultate erzielt werden, ohne dass dies eine Einschränkung hinsichtlich des zuvor erwähnten

Molekulargewichgtsbereichs bedeutet, wobei zu erwarten ist, dass mit höheren Molekulargewichten tendenziell bessere Ergebnisse möglich sind.

„Gebunden" oder „bindend" bedeutet eine im Wesentlichen reversible Bindung, sei es durch Van-der- aalskräfte , durch Wasserstoffbrücken, durch ionische Bindungen und/oder ferner durch kovalente Bindungen, wobei insbesondere ein oder mehr der drei ersten genannten Bindungsarten verwirklicht sind bzw. werden. Die Halogene werden dabei als Anionen, als Moleküle oder als Ol igohalogenide (worunter hier negativ geladene Ionen mit drei oder mehr Halogenatomen pro Molekül des Typs (Hal) n " (Hai = Halogen, N = ungerade ganze Zahl 3, 5 oder höher) zu verstehen sind, wie Tri- oder Pentahalogenide , z.B. Br 3 " oder Br 5 " ' I 3 " oder I 5 ~ , gebunden.

Bei den Halogenen oder insbesondere Halogeniden (Halogen- anionen, z.B. als Salze) oder oligomeren Halogeniden handelt es sich um die entsprechenden Species der Elemente der siebten Hauptgruppe des Periodensystems der Elemente, insbesondere von Fluor, Chlor oder vor allem Brom oder in erster Linie Iod.

Sofern vor- und nachstehend von „Halogenen" oder „Iod" oder „Brom" oder „Fluor" oder „Chlor" die Rede ist, beinhaltet dies stets ein oder mehrere der drei Formen (Halogen als Molekül, Halogenid oder Oligohalogenid) , wenn es nicht ausdrücklich anders erwähnt oder aus dem Kontext ersichtlich anders zu verstehen ist.

Halogenide werden dabei vorzugsweise in Form ihrer Salze eingesetzt, beispielsweise als Erdalkalimetallsalze, wie Magnesiumchlorid, Magnesiumbromid oder Magnesiumiodid oder die entsprechenden Calciumsalze , oder insbesondere als Ammonium- salze, wie Ammoniumchlorid, - bromid oder -iodid, oder als Alkalimetallsalze, wie Natriumchlorid, Natriumbromid, Kaliumchlorid, Kaliumbromid, oder insbesondere Natriumiodid oder Kai iumiodid . Die Halogene und das langkettige Polymer können bei den er- f indungsgemäßen Verfahren oder Verwendungen getrennt voneinander oder bereits in miteinander verbundener Form der Testprobe (Probe) zugesetzt werden. Wo der Plural verwendet wird, schließt dies stets auch den Singular mit ein. Wo „ein" verwendet wird, schließt dies auch „ein oder mehrere" ein.

Als Esterase - Substrate kommen acylierte oder mit Alkoholen veresterte Formen von Fluoreszenzfarbstoffen in Betracht, wie entsprechende Xanthen-, Fluorescein- , Coumarin-, Bor-dipyrro- methen- („BODIPY"-), Eosin-, Dicyanobenzol , Ethidin oder Resoruf inderivate . Als Beispiele für derartige Verbindungen seien genannt:

Xanthene der folgenden Formeln, insbesondere Verbindung 9 ;

1 F C0 2 H. Y = 0 4 R -= C0 2 H, X « H 7 R =. CO J H X * H

2 R S0 3 H. Y » O 5 R = C0 2 H, X = Br 8 R■ C0 2 H, X -= Br

3 R = C0 2 H. Y = +N(CH 3 ) 2 Θ R = S0 3 H. X = H 9 R = S0 3 H. X = H

Fluoresceinace at , Fluoresceinlaura , Fluoresceindiacetat (FDA) , Fluoresceindilaurat , halogeniertes

Fluoresceinmonoaceta , halogeniertes Fluoresceindiacetat , z.B. 2 1 , 7 ( -Dichlorfluoresceindiacetat oder Diacetyl - 2 , 7 - dichlorofluorescein, Carboxyf luoresceinmonoacetat , Carboxyfluoresceindiacetat , wie 5 , 6 - oder 5,6-

Carboxyfluoresceindiacetat ' CFDA) , -CFDA -N- hydroxysuccinimidester , 5-Maleimid-FDA, carboxyl iertes halogeniertes Fluorescein, Sulfofluoresceinmonoacetat , 5- oder 5 , 6 -sulfo-FDA Sulfof luoresceindiacetat ,

Azidofluoreszeinmonoaceta , Azidof luoresceindiacetat , Fluoreszein-Dipropionat , Fluoresceindibutyrat , Fluoresceindi - laurat, 5 ( 6 ) - 2 ' , 7 ' dichloro-CFDA, 5 ( 6 ) - sul fo- FDA, Di-beta-D- galactosid Fluorescein, 3 -o-methylfluorescein Phosphat, pentaacetoxy Ester des 2 ', 7 ' -Bis- (Carboxyethyl ) -5 (6)- Carboxyfluorescein (BCECF / AM) , pentaacetoxy Ester des 2 ' , 7' -Bis (carboxyethyl) -5 ( 6 ) -Fluorescein (BCECF / AM) oder Chlormethyl f luorescein diacetat, ;

Alanin- 7 -Amino-4 -methylcumarin, Glycin- 7 -Amino-4 - methylcoumarin, Prolylvaline-7-Amino-4-methylcoumarin oder Glycyl-L- Prolin- 7 -Amino-4 -methylcoumarin,

3- (2 -Benzoxazolyl ) umbilliferylacetat , 4-Methylumbelliferyl- butyrat oder -acetat, , 4-beta-D methylumbelliferyl Galactosid, 4 -Methylumbell i feryl -alpha-D-mannopyranosid, 4- Methylumbelliferyl nonanoate, 4 -Methylumbelliferylphosphat oder Methyl - 1 -umbel 1 i ferylglucoromide , ;

Eosindiacetat oder Carboxyeosindiacetat , Diacetoxy-2 , 3 -Dicyanbenzol acetat (ABD ) oder Hydroethidin

Resoruf inacetat ;

Alkohoholate , wie Methanolate, Ethanolate oder Butanolate der folgenden BOPIDY-Verbindungen :

^I CO^H BODIPY 630/650 BODIPY 650/665

oder 8-Octanoylpyrene-l , 3 , 6 - trisul fonsäure- trialkalimetall (z.B. natrium) salz ; oder dergleichen, oder Mischungen von zwei oder mehr davon.

Fluoresceinderivate , insbesondere die spezifisch genannten, sind dabei besonders bevorzugt.

Als Lösungsmittel (Medium) für die erfindungsgemäßen Assays sind vor allem wässrige Lösungen, wie dem Fachmann bekannte Kultur- bzw. Zellkulturmedien, Pufferlösungen und Salzlösungen vorzusehen. Nicht erschöpfend genannte Beispiele sind Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (z.B. von Gibco) , F-12 Nutrient Mixture (z.B. von F12), oder Phosphatgepufferte Physiologische Kochsalzlösung (PBS), Saline-Natriumcitrat-Puf fer (SSC für Saline Sodium Citrate Buffer), Tris (hydroxymethyl) aminomethan (TRIS), TTRIS-HC1, 2- (4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl) ethansulfonsäure (HEPES) , Citratpuffer, Acetatpuf fer , Cocodylat-, Dimethylglutarat - , Imidazol- , Bis- ( 2 -hydroxyethyl ) amino- tris (hydroxymethyl ) methan- (Bis-Tris-), N- ( 2 -Acetamido) - 2 - aminoethansulfonsäure- (ACES-), N- ( 2 -Acetamido) - iminodiessigsäure- (ADA-), Piperazin- 1 , 4 -ethansul fonsäure (PIPES) , Saline Sodium Phosphate EDTA- (SSPA

Kochsalzlösung/Natriumphosphat -EDTA) -Puffer, jeweils eingestellt mit geeigneten anorganischen Säuren, wie HCl oder Schwefelsäure, oder organischen Säuren, wie Essigsäure oder dergleichen .

Die Messung bzw. Bestimmung der Fluoreszenz zu untersuchender Proben erfolgt unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren, beispielsweise mittels Photometrie,

Durchf lusszytometrie oder Mikroskopie, z.B. mithilfe von Photomultipliern oder Photodioden oder durch digitale verwendbare Lichtsensoren, wie z.B. Diodenarrays , beispielsweise mittels CCD-Chips oder der CMOS -Technik , oder mittels Mikroskopen. Die Messung kann im inneren von Messgeräten oder mittels Sensoren, die Messsignale an Auswerteeinheiten weitergeben, oder dergleichen mehr erfolgen. Die Anregung der Fluoreszenz kann beispielsweise mittels geeigneter Lichtquellen, z.B. unter Verwendung von elektromagnetischer Strahlung geeigneter (d.h. insbesondere zu Fluoreszenzanregung geeigneten, vorzugsweise nicht die Messung der Fluoreszenz beeinträchtigenden) Wellenlängen, etwa mittels Monochromator, mit Lichtquellen beispielsweise ausgewählt aus Xenon- oder Wol framhalogen- Lampen , LEDs oder Laser (beispielsweise auch im Pulsbetrieb) mit für den jeweiligen Farbstoff geeigneten Anregungswellenlängen erfolgen. Als Untersuchungsmaterial kommen beispielsweise Proben für Hygiene- und Qualitätskontrolle, wie Abstriche von Oberflächen, deren Keimbedeckung ermittelt werden soll, oder Waschflüssigkeit nach Oberflächenbehandlung oder nach Durchdringung von Materialien oder flüssigkeitsdurchlässigen (z.B. porösen) Gegenständen, Proben von Flüssigkeiten, wie Getränken oder Wasserproben aus Leitungen, Gefäßen (wie Aquarien) oder Gewässern oder Proben für medizinisch- diagnostische Untersuchungen beispielweise

Körperflüssigkeiten wie Blut, Blutplasma, Blutserum, Urin, Speichel, Tränenflüssigkeit, Schweiß, Säfte aus dem Verdauungstrakt, Nasenschleim oder Sperma, oder Zellkulturen, oder Nahrungsmittel, oder dergleichen in Frage .0

Diese können nach dem Fachmann an sich bekannten Verfahren aufbereitet werden, beispielsweise durch Filtrieren, Zentrifugieren, Chromatograf ie (z.B. Gelchromatographie), Einengen (z.B. unter Unterdruck oder über wasseraufnehmenden Stoffen, wie Natriumsulfat oder Calciumchlorid) , Verdünnen (beispielsweise mit geeigneten wässrigen Lösungen wie den oben genannten Pufferlösungen), oder dergleichen.

Zu den bestimmbaren Zellen gehören sowohl prokaryot ische Zellen, wie Bakterien (ferner auch antibiotikaresistente Bakterien, wie resistente Staphylokokkus aureus, Pseodomonas species, Escherichia coli oder Mycobacterium tuberculosis, oder Archaeen) ; als auch eukaryot ische Zellen, wie Algen, Hefen, andere einzellige Pilze, Protozoen, Zellen aus Zellkulturen, Zellen aus Geweben (insbesondere nach Vereinzelung), oder dergleichen.

Die Messung ermöglicht, über die Zahl (z.B. Konzentration), den Stoffwechselzustand (z.B. schwache Fluoreszenz bei geschädigten Zellen) und die Identität der Zellen (z.B. unterschiedliche Esteraseaktivitäten für unterschiedliche Esterasesubstrate, unterschiedliche Größe der Zellen oder dergleichen) Informationen zu gewinnen - im letzteren Falle kann so auch eine Sortierung von Zellen mit unterschiedlichem Fluoreszenzverhalten (beispielsweise Aufnahme oder Spaltung unterschiedlicher Esterase-Substrate mit unterschiedlichen Wellenlängen der Fluoreszenz oder Trennung nicht fluoreszierender von fluoreszierenden Zellen) erreicht werden, beispielsweise mittels Fluss -Sortieren unter Durchf lusszytometrie , z.B. mittels FACS .

Das/Die nachfolgende (n) Beispiel (e) dienen/dient der Illustration der Erfindung, ohne ihren Umfang einzuschränken. Abbildungen:

Fig. 1 zeigt das Quenchen des farbstoffverursachten Hintergrundes .

In (a) und (b) ist der vom CFDA verursachte Hintergrund zu erkennen, (a)als Plot der beiden Streulichkanäle FSC-H und SSC-H gegeneinander und (b)als Darstellung des Fluoreszenz- Kanals FL1-H gegen das Seitwärtsstreulicht SSC-H.

(c) und (d) zeigen die Reduktion des vom CFDA verursachten Hintergrundes nach Zugabe von PVP- I , (c) im FSC-H/SSC-H Diagramm und (d) im SSC-H/FL1-H Plot.

Fig. 2 zeigt das Fluoreszenzspektrum von Carboxyfluorescein und von Carboxyfluorescein mit PVP-I.

Emmisionspektrum von Carboxyf luorescein (CF) , Polyvinylpyrrol idone - Iodine complex (PVP-I) und Kombination von Carboxyf luorescein und Polyvinylpyrrol idone- Iodine in Färbepuffer .

Fig. 3 zeigt das Quenchen des farbstoffverursachten Hintergrundes in einer Suspension gefärbter E. coli. Punktediagramm FSC-H/SSC-H (a) und Histogramm FL1-H (c) zeigen den farbstoffverursachten Hintergrund (Population unterhalb 10 4 FSC-H resp. 2*10 3 FL1-H) , sowie eine Population angefärbter Escherichia coli (Region Rl) . Im Punktediagramm FSC-H/SSC-H (b) und Histogramm FL1-H (d) ist die Population angefärbter E. coli nach der Zugabe von PVP-I zu sehen, der Hintergrund ist verschwunden

Fig. 4 zeigt die Färbeintensität von Bakterien nach dem Quenchen mit PVP-I oder KI.

Histogramme (FL1-H) zeigen Färbeintensität von Escherichia coli (a) und Enterococcus mundtii (b) nach dem Quenchen mit IM KI (kleine Peaks)oder 0,003% PVP-I (große Peaks) . Beide Stämme weisen vergleichbare Färbeintensität (FL1-H) nach der Zugabe von beiden Quenchersubstanzen auf. Um diesen Effekt zu veranschaulichen, wurden für KI und PVP-I Bakterien in unterschiedlicher Zellzahl (Counts) verwendet, was an der Höhe der Histogramme, die der Eventszahl (gezählte Ereignisse) entspricht, zu sehen ist.

Fig. 5 zeigt die Counts von Escherichia coli und Enterococcus mundtii nach dem Quenchen mit PVP-I und KI.

Die Diagramme stellen die Zellzahl der gefärbten E. coli (a) und Ent . mundtii nach dem Quenchen mit PVP-I und KI sofort nach Zugabe (0h), nach einer Stunde Inkubation und nach zwei Stunden Inkubation dar.

Beispiele : Die getesteten Stämme von Escherichia coli DSM 498 und Enterococcus mundtii DSM 4838 wurden von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) (Braunschweig, Deutschland) erhalten. Beide Stämme wurden als Testorganismen mit unterschiedlicher Zellwandstruktur ausgewählt. Es ist allgemein bekannt, dass sich Gram-positive Mikroorganismen und Gram-negative Bakterien im Aufbau ihrer Zellwände unterscheiden. Gram-positive Bakterien, wie Enterococcus mundtii, besitzen eine einzelne Membran mit einer dicken äußeren Schicht aus Peptidoglycan. Die Zellwand von Gram-negativen Bakterien, wie E. coli, besteht aus einer Doppelmembran, die Peptidoglycane sind weniger häufig und dispergiert. Aufgrund der unterschiedlichen

Zellwandorganisation weisen Gram-positive und Gram-negative Bakterien teilweise eine unterschiedliche Permeabilität für zahlreiche Substanzen, einschließlich Farbstoffen und Quenchern, und somit unterschiedliche Färbe- und Quenchingverhalten auf.

Die Bakterienstämme wurden nach Herstellerangaben aufbereitet und als Plattenkultur (Ausstrichplatte) für ca. 1-2 Wochen bei 4 °C gelagert. Für die Versuche wurden die verwendeten Testorganismen über Nacht in CASO-Bouillon (Komplexmedium zur Anzüchtung von anspruchsvollen Bakterien, Hefen und Schimmelpilzen - das Medium entspricht in seiner Zusammensetzung den Empfehlungen der aktuellen Europäischen Pharmacopoeia (EP) und der United States Pharmacopoeia (USP) ; Heipha Diagnostica, Eppelheim, Deutschland) auf einem Schüttler (HeizThermomixer MHR 23, Ditabis, Pforzheim) bei 200 min "1 und 30 °C inkubiert. Nach der Bebrütungszeit wurde ein Teil der Bakteriensuspension mit 0,85 % NaCl-Lösung (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe) so verdünnt, dass ein Wert von 0,5 McF im Densitometer (DEN- 1B , Biosan, Lettland) angezeigt wurde. Dies entspricht circa 1,5*10 8 Zellen/ml. Anschließend wurde die Bakteriensuspension weiter in isotonischer Salzlösung oder Färbepuffer verdünnt, um die gewünschte Zellkonzentration zu erreichen.

In den vorgenommenen Experimenten wurde der Farbstoff Carboxyfluorescein-Diacetat , kurz CFDA ( Sigma-Aldrich , 21879) , eingesetzt um die Testorganismen für deren Detektion im Zytometer anzufärben. Es handelt sich dabei um einen membrangängigen Farbstoff mit dem lebende Mikroorganismen angefärbt und nachgewiesen werden. CFDA wird von intrazellulären Esterasen durch die Abspaltung zweier Acetatgruppen in das fluoreszierende Carboxyf luorescein überführt. Dieses ist weniger membrangängig und fluoresziert besonders stark im Fluoreszenzkanal FL-1 des Zytometers . Das CFDA wurde als Stammlösung in einer Konzentration von 1 mg/ml in wasserfreiem Dimethylsul foxid (Abk. DMSO, Sigma-Aldrich, 276855-100ML) zu Portionen von jeweils 50 μΐ eingefroren und bei -21 °C gelagert. Zu Beginn der Messungen wurde ein Aliquot entnommen, aufgetaut und jeweils 100-fach verdünnt der Bakterienlösung zugefügt. Nach einer Färbezeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur in Färbepuffer wurden die Bakterien im Accuri Zytometer analysiert.

Für die Quenching Versuche wurde entweder wässrige 1 M Kai iumiodid-Lösung (Roth, 8491.1), oder wässrige PVP-I-Lösung (Sigma-Aldrich, PVP1-100G) in einer Endkonzentration von 0,003 % für die durchf lusszytometrische Analyse oder von 0,025 % für die Fluoreszenzspektroskopie verwendet. PVP-I ist ein wasserlöslicher Komplex von Iod und Polyvinylpyrrol idon (PVP, Povidon) , der normalerweise als Desinfektionsmittel bzw. Antiseptikum verwendet wird. Im PVP-I Komplex fungiert Wasserstofftriiodid (H + I 3 ~ ) als Ionenpaar innerhalb des Povidons. Beide Quenchersubstanzen wurden nach 15 min Färbereaktion der Bakterienkultur oder der

FarbstoffSuspension zugesetzt.

Die Fluoreszenzspektren wurden mit dem Thermo Scientific Varioskan Flash Multifunktions -Spektralreader aufgenommen. Die Anregung von CFDA erfolgte bei 480 nm, das Fluoreszenzspektrum wurde im 495-600 nm Bereich in 5 nm Schritten aufgenommen.

Die in den folgenden Beispielen dargestellten Ergebnisse wurden mit einem BD Accuri™ C6 Flow Cytometer erstellt, das mit rotem (640 nm) und blauem Laser (488 nm) , zwei Streulichtdetektoren und vier Fluoreszenzdetektoren mit Filtern (FL1 533/30 nm, FL2 585/40 nm, FL3 > 670 nm, FL4 675/25 nm) ausgestattet ist. Die Detektion von CFDA- markierten Bakterien erfolgte im FL1 Kanal bei der Anregung mit blauem Laser. Am Gerät wurde ein Threshold von 1000 FL1-H und 500 SSC-H, sowie eine Flussrate von 35 μΐ/min eingestellt. Die mit dem Accuri C6-Zytometer aufgenommenen Messdaten wurden mithilfe der zum Gerät gehörenden Software CFlow Plus Analysis ausgewertet. Die Durchflusszytometrie ist eine allgemein bekannte und häufig verwendete Methode zur Analyse von Zellen jeglicher Art, wobei mehrere Parameter wie Zellgröße, Zellzahl, DNA, RNA, Proteingehalt gleichzeitig vermessen werden können. Bei den vorgelegten Beispielen wurden die Fluoreszenz, sowie die Streulichtparameter der Bakterien und der Farbstoffhintergrund analysiert.

Figur 1 zeigt ein typisches Ergebnis einer zytometrischen Messung des Esterase-Substrates CFDA in Färbepuffer. Jeder Punkt stellt ein einzelnes (unerwünschtes) Zählereignis dar. Die Zugabe von 0,003 % PVP-I Komplex führt zu einer deutlichen Reduktion dieses Hintergrunds, sichtbar im Streulicht ( SSC-H/FSC-H) und FL1-H Kanal (SSC-H/FL1 -H) .

Figur 2 zeigt die Fluoreszenzspektren von 50 g/ml Carboxyfluorescein (1), 0,025 % PVP-I (3) und der Mischung beider Substanzen (2) in Färbepuffer, aufgenommen mit dem Varioskan° Flash bei einer Anregungswellenlänge von 480 nm. Das Spektrum der Mischung belegt die Wirksamkeit des PVP-I als Quencher für Carboxyf luorescein .

Durch die Zugabe von 0,003 % PVP-I zu einer Suspension fluoreszenz -gefärbter E. coli kann der durch den Farbstoff verursachte Hintergrund deutlich reduziert werden, wie aus Figur 3 ersichtlich. Nach der Zugabe von I M KI oder 0,003 % PVP-I ( Polyvinylpyrrolidon- Iod) zu gefärbten Escherichia coli oder Enterococcus mundtii weisen beide Bakterienstämme eine vergleichbare Färbeintensität auf, wie Figur 4 veranschaulicht. Verwendet man jedoch 1 KI anstelle von 0,003 % PVP-I als Quencher, sinkt die Zellzahl nach dessen Zugabe zur angefärbten Probe innerhalb von zwei Stunden deutlich ab. Die Zellzahl nach der Zugabe von PVP-I verändert sich hingegen nicht. Das ist plausibel erklärbar, wenn man annimmt, dass PVP-I überwiegend extrazellulär quench . Die großen Polymermoleküle von PVP dringen nicht in die Zelle ein und binden Iod außerhalb der Zellen, wodurch überwiegend extrazelluläres Quenching von unerwünschter Fluoreszenz, z.B. von unspezifisch hydrat isiertem fluorogenem Substrat oder Farbstoff, der aus den Zellen rausfließt, stattfindet. KI hingegen dringt wesentlich schneller in die Zellen ein und unterdrückt dort ebenfalls (unerwünscht) die Fluoreszenz des gebildeten Farbstoffes, wodurch deren Fluoreszenzintensität unter die Detektionsschwelle gedrückt wird. In der Folge können nur noch die stärker gefärbten Bakterien detektiert werden .

Dies veranschaulichen die Diagramme der Figur 5 für Escherichia coli und für Enterococcus mundtii. Anstatt des PVP- Iod Komplex kann ein PVP Polymer (unterschiedliche Molekulargewichte) mit unterschiedlichen Konzentrationen von Halogenen als Quencher verwendet werden. Dies ermöglicht eine flexible Optimierung des Bioassays, abhängig vom Zelltyp, der verwendeten Methode usw.

Ergänzende Angaben können den Texten für die Figuren oben entnommen werden.

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