La presente invención se encuentra dentro del campo de la medicina y la biología molecular, y se refiere al uso de los genes gef y apoptina como terapia génica antitumoral, y concretamente para el tratamiento del cáncer de colon.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El cáncer colorrectal es el tercer cáncer más común en hombres y el segundo en mujeres. La incidencia anual de cáncer de colon se estima en un millón, y aproximadamente 500.000 personas mueren cada año como consecuencia de un cáncer de colon en todo el mundo (Ferlay et al., 2010. Int J Cáncer 127:2893-917). Los recientes avances en la quimioterapia y la radioterapia han aumentado la supervivencia media de los pacientes.

La terapia génica, se presenta como una de las estrategias más prometedoras para el desarrollo de un tipo de terapia antitumoral que persigue la destrucción de las células neoplásicas, el cese o disminución de su capacidad de proliferación o la corrección del defecto celular que induce la alteración de la célula normal (Ortiz et al., 2012. Drug Discovery, 7(3), 297-312).

Se ha descrito que la utilización de "genes suicidas" (genes que inducen a la muerte celular) en terapia génica dirigida hacia tumores, induce a la muerte celular de las células tumorales (Vassaux et al., 2004. Expert Opin Biol T 7er4(4):519-30).

De entre estos genes suicidas, se ha descrito el efecto antitumoral del gen gef, con el fin de establecer una terapia combinada junto con agentes citotóxicos que potencien la acción de estos últimos (Ortiz et al., 2012. Biomedicine and Pharmacotherapy 66(7), 563-567). Se ha demostrado la utilidad de la transfección del gen gef en células humanas derivadas de cáncer de mama (MCF-7), mediante un vector de expresión simple con un promotor no específico inducido con dexametasona, lo que ha permitido demostrar la aparición de modificaciones ultraestructurales características de apoptosis (Boulaiz et al., 2003. Br J Cáncer. 7;89(1): 192-8.). Así mismo, nuestros resultados demuestran que en líneas celulares humanas derivadas de melanoma (MS-36), el gen gef es capaz de inducir modificaciones en el ciclo celular, que conducen a una disminución significativa de la capacidad de proliferación (Boulaiz et al., 2003. Cáncer Sci.; 94(6): 564-8.; Boulaiz et ai, 2008. Br J Dermatol. 159(2):370-8.). De la misma forma, se ha descrito el papel del gen apoptina en la inducción de la muerte celular y su posible uso en la terapia génica antitumoral (Zhou eí al., 2012. Medical Oncology 29(4), 2985-2991). La apoptina, una proteína de 121 aminoácidos codificada por un virus aviar, no se asemeja a ninguna otra proteína animal o viral secuenciada (Noteborn et al., 1991. J Virol 1991 ; 65:3131-3139). La apoptina induce apoptosis en los timocitos de pollos jóvenes, así como en las células transformadas del pollo bajo condiciones de cultivo tisular (Danen-van Oorschot eí al., 2003. J Biol Chem.; 278:27729-27736; Leliveld eí al., 2003a. Nucleic Acids Res 2003a; 31 :4805-4813, Leliveld eí al., 2003b. J Biol Chem; 278: 9042-9051.; Natesan eí al., 2006. J Gen Virol 2006; 87:2933-2940.). Como las células transformadas del pollo, las líneas tumorales humanas y de roedores son sensibles a la apoptina (Noteborn, 1999a. Biogenic Amines 1999; 15:73-91. Noteborn, 1999b. Apoptosis 1999; 4:317-319.). De hecho, la inyección conjunta de células de carcinoma hepático y del gen de la apoptina en los tumores inducidos en ratones produjo una disminución de la masa tumoral debido fundamentalmente a apoptosis (Shen eí al., 2003. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci 2003; 23: 105-107). La importante y trascendente singularidad de la apoptina es su propiedad de inducir apoptosis únicamente en células neoplásicas y no en células normales por lo que la convierte en un potencial agente anti-tumoral (Pietersen eí al., 1999; Gene Tfter 1999; 6:882-892. Maddika et al, 2006. Cáncer Biol Ther200Q; 5: 10-19). Sin embargo, el cáncer colorrectal avanzado o recurrente sigue siendo incurable por los tratamientos convencionales (Berrino et al., 2007. Lancet Oncol 8:773-883). Por lo tanto, es necesario explorar mejores opciones para el tratamiento del cáncer avanzado de colon. Se ha propuesto potenciar los efectos de los fármacos actuales y combinarlos con los posibles beneficios terapéuticos que podría aportar la terapia génica (Doloff et al., 2010. BMC Cáncer 2010; 10:487; Oh et al., 2010. Int J Mol Med 2010; 25(3):369-76; Kojima et al., 2010. J Surg Res 2009; 157(1): e63-70). La introducción de genes suicidas en células tumorales provocan un cierto grado de muerte celular de dichas células. Sin embargo, sería necesario encontrar una terapia génica en la que se introdujeran una combinación adecuada de genes para incrementar el efecto de la terapia, ya que el distinto mecanismo de acción de los mismos no conduce en general a resultados mejores que las terapias aisladas. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han desarrollado unos plásmidos retrovirales que incorporan el gen gef y el gen apoptina, proporcionando una composición farmacéutica y una preparación combinada que puede emplearse en la terapia antitumoral, y especialmente frente al cáncer de colon.

Así pues, un primer aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido de ARN o ADN aislado, de ahora en adelante polinucleótido de la invención, capaz de traducirse a una secuencia aminoacídica que comprende un péptido que presenta una identidad de al menos un 95% con la secuencia aminoacídica de la proteína GEF (SEQ ID NO: 1) y de al menos un 95% con la secuencia aminoacídica de la proteína APOPTINA (SEQ ID NO: 2). Más preferiblemente se refiere a un polinucleótido de ARN o ADN aislado capaz de traducirse a una secuencia aminoacídica que comprende un péptido que presenta una identidad de al menos un 99% con la secuencia aminoacídica de la proteína GEF (SEQ ID NO: 1) y de al menos un 99% con la secuencia aminoacídica de la proteína APOPTINA (SEQ ID NO: 2).

Otro aspecto de la invención se refiere a una construcción genética de ADN o ARN, de ahora en adelante construcción genética de la invención, que comprende al menos uno de los siguientes tipos de secuencias:

a) Secuencia de nucleótidos, que comprende, al menos, un polinucleótido de la invención, para su transcripción in vitro o in vivo.

b) secuencia de nucleótidos, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende un polinucleótido de la invención, operativamente enlazado con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende:

I) un polinucleótido de la invención, y/o

II) al menos dos componentes, un componente A, de ahora en adelante componente A de la invención, que se seleccionan de entre:

a) Un polinucleótido de ARN o ADN aislado capaz de traducirse a una secuencia aminoacídica que comprende un péptido que presenta una identidad de al menos un 95% con la secuencia aminoacídica que codifica para la proteína GEF (SEQ ID NO: 1),

b) Un polinucleótido de ARN o ADN aislado capaz de traducirse a una secuencia aminoacídica que comprende un péptido que presenta una identidad de al menos un 99% con la secuencia aminoacídica que codifica para la proteína GEF (SEQ ID NO: 1).

c) Una construcción genética de ADN o ARN, que comprende, al menos uno de los siguientes tipos de secuencias:

i) Secuencia de nucleótidos, que comprende, al menos, un polinucleótido según (a) o (b), para su transcripción in vitro o in vivo,

ii) Secuencia de nucleótidos, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende un polinucleótido según (a) o (b), operativamente enlazado con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar.

d) La secuencia aminoacídica de la proteína GEF (SEQ ID NO: 1)

Y un componente B, de ahora en adelante componente B de la invención, que se selecciona de entre:

e) Un polinucleótido de ARN o ADN aislado capaz de traducirse a una secuencia aminoacídica que comprende un péptido que presenta una identidad de al menos un 95% con la secuencia aminoacídica de la proteína APOPTINA (SEQ ID NO: 2), f) Un polinucleótido de ARN o ADN aislado capaz de traducirse a una secuencia aminoacídica que comprende un péptido que presenta una identidad de al menos un 99% con la secuencia aminoacídica que codifica para la proteína APOPTINA (SEQ ID NO: 2).

g) Una construcción genética de ADN o ARN, que comprende, al menos uno de los siguientes tipos de secuencias:

i) Secuencia de nucleótidos, que comprende, al menos, un polinucleótido según (e) o (f), para su transcripción in vitro o in vivo.

ii) Secuencia de nucleótidos, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende un polinucleótido según (e) o (f), operativamente enlazado con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar. h) La secuencia aminoacídica que codifica para la proteína APOPTINA (SEQ ID NO: 2).

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la composición es una composición farmacéutica. Más preferiblemente la composición además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. Aún más preferiblemente, además comprende otro principio activo.

Otro aspecto de la invención se refiere a una preparación combinada, de ahora en adelante preparación combinada de la invención, que comprende un componente A de la invención y un componente B de la invención. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la preparación combinada además comprende otro principio activo.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un polinucleótido de la invención, de una construcción genética de la invención, de una composición de la invención, o de la preparación combinada de la invención, en la elaboración de un medicamento, o alternativamente, a un polinucleótido de la invención, una construcción genética de la invención, una composición de la invención, o la preparación combinada de la invención, para su uso como medicamento.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un polinucleótido de la invención, de una construcción genética de la invención, de una composición de la invención, o de la preparación combinada de la invención, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad que cursa con proliferación celular anormal, o alternativamente, a un polinucleótido de la invención, una construcción genética de la invención, una composición de la invención, o la preparación combinada de la invención, para el tratamiento de una enfermedad que cursa con proliferación celular anormal. En una realización preferida de este aspecto de la invención la enfermedad que cursa con proliferación celular es el cáncer. En otra realización más preferida, la enfermedad es el cáncer de colon. Otro aspecto de la invención se refiere al uso del componente A y el componente B de la invención, por separado, combinado o secuencial, en la elaboración de un medicamento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Determinación del efecto de la expresión de los genes gef y/o apoptina en la proliferación celular. Las células (a una concentración de 25 x 10 ³ células por disco) se cultivaron durante 10 días para determinas su tasa de crecimiento. Los valores representan la media ± la desviación estándar de los cultivos por cuadruplicado.

Fig. 2. Cuantificación de la inducción de apoptosis en células DLD-1 control y transformadas mediante fluorescence-activated cell sorting analysis. Las células fueron teñidas con Anexina V y Pl para evaluar la muerte celular por apoptosis después de ser tratados con Dox durante 2 y 6 días, como se describe en la sección Materiales y Métodos. Los datos que se muestran pertenecen a 3 experimentos independientes.

Fig. 3. FACScan analysis of the cell cycle. Se analizaron las diferentes fases del ciclo celular de las células DLD-1 , DLD1/gef, DLD1/apoptina, y DLD1/gef-apoptina tratadas con Dox durante 2 y 6 días. Los datos que se muestran pertenecen a 3 experimentos independientes.

Fig. 4. Análisis del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨΓΠ). Tanto las células transfectadas como las no transfectadas, tratadas con Dox durante 2 y 6 días, fueron teñidas con JC-1. La fluorescencia roja representa las mitocondrias que tienen la membrana intacta, mientras que la fluorescencia verde representa las mitocondrias que tienen una baja despolarización de la membrana.

Fig. 5.. Morfología ultraestructural de las células DLD-1 , DLD1/gef, DLD1/apoptina, and DLD1/gef-apoptina tratadas con Dox durante 2 días para inducir la expresión de gef y/o apoptina. (Imágenes a y b). La morfología típica de las células parentales DLD-1 demostraron una complexión citoplasmática ligera. (Imágenes c,d y e). Células DLD1/gef que presentan gránulos y condensación de la cromatina, formación de vesículas y pronunciadas protuberancias en las mitocondrias. (Imágenes f, g y h). Célula DLD1/apoptina con membrana nuclear retorcida, retículo endoplasmático dilatado y sin estructura y formación de vesículas. (Imágenes i, j y k). Células DLD1/gef-apoptina con mitocondrias dilatadas y retículo endoplasmático y aparato de Golgi desorganizados. La masa de la cromatina compactada es muy densa y homogénea en textura. Se observaron tanto células necróticas como células apoptóticas con formación de vesículas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han desarrollado un nuevo sistema de terapia génica basado en la transfección de dos genes suicidas: 1. El gen gef, procariótico, que parece actuar de forma lesiva sobre las células a través de modificaciones en la membrana.

2. La apoptina, un gen codificado por un virus aviar, que induce apoptosis en los timocitos de pollos jóvenes, así como en las células transformadas del pollo bajo condiciones de cultivo tisular. Utilizando como modelo experimental la línea DLD-1 derivada de carcinoma de colon humano, hemos conseguido transfectar satisfactoriamente estos genes mediante un vector de inducción controlable, lo que nos ha permitido analizar los efectos de su expresión sobre las características biológicas de las células tumorales.

La expresión de los genes gef y apoptina solos o combinados inducida mediante doxyciclina en la línea DLD-1 provoca alteraciones morfológicas que indican la entrada de determinadas subpoblaciones celulares en un proceso de muerte celular programada o apoptosis, Sin embargo, el hecho más significativo es que, tal como se muestra en las Fig.1 a la Fig.3 la expresión combinada de ambos genes induce una significativa reducción de la tasa de proliferación en comparación tanto con las líneas parentales como con las que expresan dichos genes por separado, que se acompaña de una notable alteración de la proporción de células en cada una de las fases del ciclo celular. Los resultados demuestran por primera vez que la acción combinada de los genes gef y apoptina es mucho más citotóxica y tiene actividad antitumoral más intensa de la que tiene la expresión de dichos genes por separado. Por lo tanto, la invención se refiere al uso de los genes gef y apoptina (bien directamente de su secuencia aminoacídica, o bien mediante su aplicación en terapia génica en polinucleótidos y vectores que codifiquen y expresen los genes gef y apoptina, esto es, su secuencia aminoacídica) en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades proliferatívas, preferiblemente para el tratamimento del cáncer, y aún más preferiblemente para el tratamiento del cáncer de colon.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido de ARN o ADN aislado, de ahora en adelante polinucleótido de la invención, capaz de traducirse a una secuencia aminoacídica que comprende un péptido que presenta una identidad de al menos un 95% con la secuencia aminoacídica de la proteína GEF (SEQ ID NO: 1) y otro pépido que presenta una identidad de al menos un 95% con la secuencia aminoacídica de la proteína APOPTINA (SEQ ID NO: 2). Más preferiblemente se refiere a un polinucleótido de ARN o ADN aislado capaz de traducirse a una secuencia aminoacídica que comprende un péptido que presenta una identidad de al menos un 99% con la secuencia aminoacídica de la proteína GEF (SEQ ID NO: 1) y a otro péptido que presenta una identidad de al menos un 99% con la secuencia aminoacídica de la proteína APOPTINA (SEQ ID NO: 2). Puede esperarse que el grado de identidad/similaridad de las proteínas recogidas en las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, sean de al menos de un 80% o mayor, y más preferiblemente de al menos un 85%, un 90, un 95% o un 99%. La correspondencia entre la(s) secuencia(s) aminoacídica(s) de la(s) secuencia(s) putativa(s) y las secuencias recogidas en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, se puede determinar por métodos conocidos en la técnica. Los métodos de comparación de secuencias son conocidos en el estado de la técnica, e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa BLASTP o BLASTN, y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1999).

El término "homología", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la semejanza entre dos estructuras debida a una ascendencia evolutiva común, y más concretamente, a la semejanza entre dos o más secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Puesto que dos secuencias se consideran homologas si tienen el mismo origen evolutivo, en general, se asume que valores superiores de similitud o identidad del 95% indicarían homología. Podemos considerar, por tanto, que porcentajes de identidad de, al menos, un 95%, y preferiblemente un 99%, podrían mantener la función de las secuencias aminoacídicas recogidas en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

El término "identidad", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de nucleótidos o aminoácidos idénticos entre dos secuencias nucleotídicas o aminoacídicas que se comparan. Los métodos de comparación de secuencias son conocidos en el estado de la técnica, e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa GAG, incluyendo GAP (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 287 (1984) Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl); BLAST, BLASTP o BLASTN, y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1999).

La proteína GEF también está codificada por el locus UTI89_C0018 de E.Coli.

Su secuencia aminoacídica se encuentra en la SEQ ID NO: 1 , (de secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 3 con número de acceso en el GenBank (NCBI) GenBank (NCBI) AE005174.2). También se refiere a cualquiera de sus variantes biológicamente activas (actualmente se conocen 3 variantes).

En el contexto de la presente invención, la proteína GEF se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 1 , y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) Moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 1 ,

b) Moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),

c) Moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,

d) Moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 1 , y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína GEF. Entre las secuencias nucleotídicas que codifican para la proteína GEF se encuentra la secuencia recogida en el GenBank (NCBI) AE005174.2, recogida en la secuencia SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 1

MLNTCRVPLTDRKVKEKRAMKQHKVMIVALIVXCITAWAALVTRKDLCEVHIRTGQ

TEVAVFTAYESE

SEQ ID NO: 3

ttactcggattcgtaagccgtgaaaacagcaacctccgtctggccagttcggatgtg aacctcacagaggtcttttctc gttaccagcgccgccactacggcggtgatacasatgacgatcagggcgacaatcatcacc ttatgctgcttcattgct ctcttctccttgaccttacggtcagtaagaggcactctacatgtgttcagcat

La proteína APOPTINA también llamada Cux-1 , ORF1 , hypothetical protein o proteína de la nucleocapsida, esta codificada por el locus CAVgp2 del virus de la anemia del pollo.

Su secuencia aminoacídica se encuentra en la SEQ ID NO: 2, con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_056774).

En el contexto de la presente invención, la proteína APOPTINA se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 2, y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) Moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2,

b) Moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),

c) Moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,

d) Moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 2, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína APOPTINA. Entre las secuencias nucleotídicas que codifican para la proteína APOPTINA se encuentra la secuencia recogida en el GenBank (NCBI) M55918.1 , entre los pares de base 486-851 , recogida en la secuencia SEQ ID NO: 4.

SEQ ID NO: 2

MNALQEDTPPGPSTVFRPPTSSRPLETPHCREIRIGIAGITITLSLCGCANARAPTLR SATADNSESTGFKNVPDLRTDQPKPPSKKRSCDPSEYRVSELKESLITTTPSRPRT AKRRIRL SEQ ID NO: 4

ATGAACGCTCTCCAAGAAGATACTCCACCCGGACCATCAACGGTGTTCAGGCC

ACCAACAAGTTCACGGCCGTTGGAAACCCCTCACTGCAGAGAGATCCGGATTG

GTATCGCTGGAATTACAATCACTCTATCGCTGTGTGGCTGCGCGAATGCTCGC

GCTCCCACGCTAAGATCTGCAACTGCGGACAATTCAGAAAGCACTGGTTTCAA

GAATGTGCCGGACTTGAGGACCGATCAACCCAAGCCTCCCTCGAAGAAGCGAT

CCTGCGACCCCTCCGAGTACAGGGTAAGCGAGCTAAAAGAAAGCTTGATTACC

ACTACTCCCAGCCGACCCCGAACCGCAAAAAGGCGTATAAGACTGTAA

Otro aspecto de la invención se refiere a una construcción genética de ADN o ARN, de ahora en adelante construcción genética de la invención, que comprende al menos uno de los siguientes tipos de secuencias:

a) Secuencia de nucleótidos, que comprende, al menos, un polinucleótido de la invención, para su transcripción in vitro o in vivo. b) secuencia de nucleótidos, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende un polinucleótido de la invención, operativamente enlazado con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar.

Un gran número de estas construcciones, sistemas o vectores de expresión pueden ser obtenidos por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia y forman parte de la presente invención.

Un "vector" es un replicón, o un vector integrativo, al que se ha unido otro segmento polinucleótido, para realizar la replicación y/o expresión del segmento unido.

Un "replicón" es cualquier elemento genético que se comporta como una unidad autónoma de replicación polinucleotídica dentro de una célula; esto es, capaz de replicarse bajo su propio control.

Un vector integrativo es cualquier elemento genético que se integra y se mantiene estable en el genoma de una célula.

"Secuencia de control" se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión de las secuencias a las que están ligadas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen un promotor, un sitio de unión ribosomal, y señales de terminación; en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores, señales de terminación, intensificadores y, en ocasiones, silenciadores. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa.

Como se usa aquí, el término "promotor" hace referencia a una región del ADN aguas arriba del punto de inicio de la transcripción, y en el particular, que es capaz de iniciar la transcripción en una célula vegetal, sea el origen del promotor una planta o no. Ejemplos de promotores incluyen, pero no se limitan a, promotores obtenidos de plantas, virus de plantas, y bacterias que pueden expresar genes en células de plantas, como Agrobacterium o Rhizobium. Ejemplos de promotores bajo el control del desarrollo incluyen promotores que preferentemente inician la transcripción en ciertos tejidos, tales como hojas, raíces, o semillas. Tales promotores se denominan en esta memoria como preferentes de un tipo de tejidos. Hay otros promotores que inician la transcripción en un determinado tipo de tejidos, y se denominan como "tejido específicos". Un promotor "inducible" o "reprimible" es un promotor que se encuentra bajo el control del medio ambiente. Ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar la transcripción son las condiciones anaeróbicas, o la presencia de luz. Los promotores de tejido específico, tejido preferido, específicos de un tipo celular, o promotores inducibles son tipos constituyen la clase de promotores "no constitutivos". Un promotor "constitutivo" es un promotor que está activo en la mayoría de las condiciones ambientales.

"Unidos de forma operativa" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos tienen una relación que les permite funcionar en la manera intencionada. Una secuencia de control "unida de forma operativa" a una secuencia que se transcribe a la secuencia nucleotídica de la invención, está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificadora se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.

Una "secuencia codificadora" o "secuencia codificante" es una secuencia de polinucleótidos que se transcribe a mRNA y/o se traduce a un polipéptido cuando está bajo control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan mediante un codón de inicio de traducción en el extremo 5' y un codón de finalización de la traducción en el extremo 3'. Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a mRNA, cDNA, y secuencias de polinucleótidos recombinantes.

Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxiribonucleótidos (ADN ó DNA).

Los términos "secuencia aminoacídica", "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden estar, o no, química o bioquímicamente modificados.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende:

I) un polinucleótido de la invención, y/o II) al menos dos componentes, un componente A, de ahora en adelante componente A de la invención, que se seleccionan de entre:

a) un polinucleótido de ARN o ADN aislado capaz de traducirse a una secuencia aminoacídica que comprende un péptido que presenta una identidad de al menos un 95% con la secuencia aminoacídica que codifica para la proteína GEF (SEQ ID NO: 1),

b) Un polinucleótido de ARN o ADN aislado capaz de traducirse a una secuencia aminoacídica que comprende un péptido que presenta una identidad de al menos un 99% con la secuencia aminoacídica que codifica para la proteína GEF (SEQ ID NO: 1).

c) Una construcción genética de ADN o ARN, que comprende, al menos uno de los siguientes tipos de secuencias:

i) secuencia de nucleótidos, que comprende, al menos, un polinucleótido según (a) o (b), para su transcripción in vitro o in vivo,

ii) secuencia de nucleótidos, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende un polinucleótido según (a) o (b), operativamente enlazado con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar.

d) la secuencia aminoacídica de la proteína GEF (SEQ ID NO: 1)

y un componente B, de ahora en adelante componente B de la invención, que se selecciona de entre:

e) un polinucleótido de ARN o ADN aislado capaz de traducirse a una secuencia aminoacídica que comprende un péptido que presenta una identidad de al menos un 95% con la secuencia aminoacídica de la proteína APOPTINA (SEQ ID NO: 2), f) Un polinucleótido de ARN o ADN aislado capaz de traducirse a una secuencia aminoacídica que comprende un péptido que presenta una identidad de al menos un 99% con la secuencia aminoacídica que codifica para la proteína APOPTINA (SEQ ID NO: 2).

g) Una construcción genética de ADN o ARN, que comprende, al menos uno de los siguientes tipos de secuencias:

i) secuencia de nucleótidos, que comprende, al menos, un polinucleótido según (e) o (f), para su transcripción in vitro o in vivo. ii) secuencia de nucleótidos, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende un polinucleótido según (e) o (f), operativamente enlazado con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar.

h) la secuencia aminoacídica que codifica para la proteína APOPTINA (SEQ ID NO: 2).

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la composición es una composición farmacéutica. Más preferiblemente la composición además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. Aún más preferiblemente, además comprende otro principio activo.

Otro aspecto de la invención se refiere a una preparación combinada, de ahora en adelante preparación combinada de la invención, que comprende un componente A de la invención y un componente B de la invención. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la preparación combinada además comprende otro principio activo.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un polinucleótido de la invención, de una construcción genética de la invención, de una composición de la invención, o de la preparación combinada de la invención, en la elaboración de un medicamento, o alternativamente, a un polinucleótido de la invención, una construcción genética de la invención, una composición de la invención, o la preparación combinada de la invención, para su uso como medicamento.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un polinucleótido de la invención, de una construcción genética de la invención, de una composición de la invención, o de la preparación combinada de la invención, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad que cursa con proliferación celular anormal, o alternativamente, a un polinucleótido de la invención, una construcción genética de la invención, una composición de la invención, o la preparación combinada de la invención, para el tratamiento de una enfermedad que cursa con proliferación celular anormal. En una realización preferida de este aspecto de la invención la enfermedad que cursa con proliferación celular es el cáncer. En otra realización más preferida, la enfermedad es el cáncer de colon. Por proliferación anormal » se entiende una proliferación que es independiente de los mecanismos de regulación normales, por ejemplo la interrupción de la proliferación celular causada por la intervención de la apoptosis (muerte celular programada)

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del componente A y el componente B de la invención, por separado, combinado o secuencial, en la elaboración de un medicamento. Más preferiblemente, se refiere al uso del componente A y el componente B de la invención, por separado, combinado o secuencial, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer, y aún más preferiblemente, para el tratamiento del cáncer de colon.

El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención, la enfermedad es una enfermedad que cursan con proliferación celular, más preferiblemente el cáncer, y aún más preferiblemente el cáncer de colon.

Debe enfatizarse que el término "preparación combinada" o también denominada "yuxtaposición", en esta memoria, significa que los componentes de la preparación combinada no necesitan encontrarse presentes como unión, por ejemplo en una composición, para poder encontrarse disponibles para su aplicación separada o secuencial. De esta manera, la expresión "yuxtapuesta" implica que no resulta necesariamente una combinación verdadera, a la vista de la separación física de los componentes.

Como se emplea aquí, el término "principio activo", "substancia activa", "substancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" o "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto.

Tanto las composiciones de la presente invención, así como la preparación combinada de la invención pueden formularse para su administración a un animal, y más preferiblemente a un mamífero, incluyendo al hombre, en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Así, pueden estar, sin limitarse, en disolución acuosa estéril o en fluidos biológicos, tal como suero. Las disoluciones acuosas pueden estar tamponadas o no tamponadas y tienen componentes activos o inactivos adicionales. Los componentes adicionales incluyen sales para modular la fuerza iónica, conservantes incluyendo, pero sin limitarse a, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, y similares. Alternativamente, las composiciones pueden prepararse para su administración en forma sólida. Las composiciones pueden combinarse con varios vehículos o excipientes inertes, incluyendo pero sin limitarse a; aglutinantes tales como celulosa microcristalina, goma tragacanto, o gelatina; excipientes tales como almidón o lactosa; agentes dispersantes tales como ácido algínico o almidón de maíz; lubricantes tales como estearato de magnesio, deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina; o agentes aromatizantes tales como menta o salicilato de metilo.

Se conocen numerosas formulaciones y vehículos para la terapia génica. Así, el ADN de interés puede introducirse en las células diana mediante métodos virales o no virales, o mediante métodos mixtos. Entre los métodos virales se encuentran, por ejemplo, pero sin limitarnos, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados (AAV), herpes virus, o vectores conocidos como "pseudotyped", en los cuales la cubierta vírica de proteínas silvestre ha sido remplazada por péptidos de otros virus, o por proteínas quiméricas, que constan de las partes de la proteína vírica necesarias para su incorporación en el virión, así como las secuencias que supuestamente a interaccionar con receptores específicos de proteínas celulares. Entre los métodos no virales se encuentran los métodos para introducir ADN desnudo, como la electroporación, la sonicación, o el uso de la biobalística, nanopartículas, dendrímeros, lipoplexes y poliplexes, entre otros. Entre los métodos mixtos se encuentran, por ejemplo, los virosomas, que combinan liposomas con un virus inactivado. Estos métodos son ilustrativos y no limitativos de la invención. En una realización preferida de este aspecto de la invención, se emplea un vector viral que es el sistema de expresión RevTet-On, y que contiene los vectores pRevTet-On y pRev-TRE.

Tales composiciones o preparaciones combinadas y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a, intraperitoneal, intravenoso, intramuscular, subcutáneo, intracecal, intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal o dérmico.

La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, la edad, peso, sexo, tolerancia,... del mamífero. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de un polinucleótido, de una construcción genética, de una composición, o de la preparación combinada que produzcan el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dichos un polinucleótido, de una construcción genética, de una composición, o de la preparación combinada y el efecto terapéutico a conseguir. Los "adyuvantes" y "vehículos farmacéuticamente aceptables" que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en la materia.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores que pone de manifiesto el aumento del efecto antitumoral de la terapia génica en la que se combinan los genes gef y apoptina.

Material y métodos:

1. Cultivo celular

La línea celular DLD-1 de carcinoma colorectal fue obtenida del Servicio de Inmunología del Hopital Virgen de las Nieves (Granada, España). La línea celular empaquetadora de vectores virales PT67 fue comprada a Clontech, Palo Alto, Caifornia, EEUU. Las líneas DLD-1 y PT67 se cultivaron a 37 °C en una atmosfera al 5% de C0 ₂ con un medio de cultivo DMEM (Dubelcco ^' s modified Eagle Medium)( Sigma, St. Louis, MO, EEUU) suplementado con un 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) (Sigma), 2% de L-glutamina, 2.7% de bicarbonato sódico, 1 % de tampón Hepes, 40 mg/l de gentamicina y 500 mg/l de ampicilina. Para el cultivo de las líneas DLD1/Tet-On-gef, DLD1/Tet-On-apoptina, and DLD1/Tet-On-gef-apoptina se utilizaron las mismas condiciones y el mismo medio suplementado con higromicina B (0.4 mg/mL, Sigma) y doxiciclina (Dox, 0.2 mg/mL). Este último se utiliza para inducir la expresión de los genes gefy apoptina. Los estudios se realizan por tanto en cuatro líneas celulares:

1. DLD-1 derivada de carcinoma de colon, fue suministrada por la Sección de Análisis Clínicos del Hospital Universitario Virgen de Las Nieves de Granada.

2. DLD-1/gef que expresa el gen gef (obtenida mediante infección de la línea DLD-1 con un vector viral que expresa el gen gef).

3. DLD-1 /apop que expresa el gen apoptina (obtenida mediante infección de la línea DLD-1 con un vector viral que expresa el gen apoptina).

4. DLD-1/gef-apop que expresa los genes gef y apoptina (obtenida mediante infección de la línea DLD-1 con vectores que expresan los genes gefy apoptina).

2. Construcción de los plásmidos retrovirales

Para la construcción de los vectores se usó el sistema RevTet-On que incluye los vectores pRevTet-On y pRev-TRE, y la línea celular RetroPack PT67, comprados a Clontech, Palo Alto, California, EEUU. El gen apoptina fue cecido por el Dr. Mahvash Tavassoli, del Instituto Rayne, King's College, London, y el gen gef fue cedido por el Dr. J.L. Ramos, de la Estación experimental del Zaidín del CSIC, Granada, España. El inserto completo de gef, flanqueado en sus extremos 3' y 5' por los sitios de restricción BamH I y Hind III respectivamente, fue amplificado mediante PCR. El producto de PCR fue digerido por BamH I y Hind III e insertado en el vector pRev-TRE. Esta construcción se usó para transformar E.Coli. Las células se pusieron en un medio de cultivo LB con ampicilina. Se seleccionó un clon positivo (con pRevTRE-gef) para la transfección de las células DLD-1 después de haber comprobado mediante enzimas de restricción y PCR que la secuencia del inserto y su orientación son conrrectas. El vector pRevTet-On y el vector pRevTRE- apoptina fueron clonados de la misma forma.

3. Estudio de la proliferación celular

Las células DLD1, DLD1/Tet-On-gef, DLD1/Tet-On-apoptina, and DLD1/Tet-On- gef-apoptina (25x10 ³ ) fueron cultivadas en placas de 6 pocilios bajo las condiciones descritas anteriormente. Después de 24h, se renovó el medio de cultivo y se añadió 0.2 mg/mL de Dox (Sigma) para inducir la expresión de los genes. Las células pertenecientes a los grupos control no fueron tratadas con Dox. El objetivo de tratar las células DLD 1 con Dox es verificar que Dox no tiene efectos en el crecimiento celular. El medio (con o sin Dox) de todas las células se renovó en días alternativos hasta el final del experimento. El experimento fue realizado por cuadriplicado. En los días 0, 2, 4, 6, 8, y 10 del tratamiento, las células fueron teñidas con sulforodamina B (SRB) para realizar un ensayo colorimétrico usando el aparato Titertek Multiscan (Flow, Irvine, California) a 492 nm. La recta de calibrado para el ensayo con SRB se realizó para cada pase de células DLD 1 antes de cada experimento de proliferación celular.

4. Detección de la apoptosis mediante tinción con anexina V-FITC y yoduro de propidio.

Se utilizó el kit Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (Pharmingen, San Diego, CA, EEUU) para la detección de apoptosis mediante citometría de flujo. Las células (1 10 ⁶ ) DLD1 , DLD1/Tet-On-gef, DLD1/Tet-On-apoptina, and DLD1/Tet-On-gef- apoptina se colocaron en frascos de cultivo de 75-cm ² y se cultivaron toda la noche. Seguidamente se incubaron con Dox durante 2 y 6 días. Las 4 líneas celulares fueron despegadas con PBS-EDTA, lavadas dos veces con PBS frió (1.4 M NaCI, 27 mM KCI, 100 mM KH2P04/K2HP04, pH 7.2) y centrifugadas a 500g durante 10 min. A continuación fueron resuspendidas en 100 μΙ de la solución de binding buffer (10 mM hepes, pH 7.1 ; 150 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM MgCI2, 1.8 mM CaCI2), teñidas con anexina V (1 μΙ de anexina V-FITC (25 μg/ml), 10 μΙ de binding buffer, 10 μΙ yoduro de propidio (Pl) (50 μg/ml), 79 μΙ H ₂ 0) e incubadas en oscuridad durante 15 min a temperatura ambiente. Al cabo de ese tiempo, se les añadió 500 μΙ de la solución binding buffer y las células (10 000 por muestra) fueron inmediatamente procesadas con citometría de flujo (Becton Dickinson, San José, CA, EEUU).

5. Análisis ultraestructural

Las células DLD1 , DLD1/Tet-On-gef, DLD1/Tet-On-apoptina and DLD1/Tet-On-gef- apoptina tratadas con Dox durante 6 días fueron fijadas con glutaraldehido al 2,5% en un tampón (pH 7.4) con cacodilato de sodio 0.1 M durante 1 h a temperatura ambiente. El pellet y la monocapa fueron fijadas posteriormente con tetraoxido de osmio al 1 % en un tampón con cacodilato 0.1 M durante una hora a temperatura ambiente y posteriormente, deshidratados en etanol. Las células fueron despegadas del recipiente mediante el tratamiento con oxido de propileno y fueron embebidas en Epon 812. Después de la polimerización, el plástico fue eliminado y se cortaron secciones ultrafinas paralelas y perpendiculares a la superficie del frasco de cultivo. Las secciones se tiñeron con citrato de acetato de uranilo y plomo y se examinaron en un microscopio electrónico de transmisión Hitachi H7000.

6. Análisis del ciclo celular

Las células cultivadas en monocapa fueron despegadas, lavadas dos veces con un tampón simple (100 mg glucose; 100 mi PBS sin Ca2+ or Mg2+) y fijadas con etanol frió al 70% (vol/vol) durante una semana. A continuación, las células fueron centrifugadas, lavadas una vez con un tampón simple y resuspendidas en una solución de Pl (50 μg/ml Pl, 0.5 mg/ml RNasa en tampón simple, pH 7.4) durante 30 min en oscuridad. El análisis con Fluorescence-activated cell sorter se llevó a cabo a las 2 y 96h después de la inducción. Los datos de 10 000 células por muestra fueron recogidos y analizados con el programa Cellfit de FACScan flow cytometer (Becton Dickinson, San José, CA, EEUU).

7. Medida del potencial de membrana mitocondrial (Δψιη)

Se usó la sonda dual-emission potential-sensitive , 5', 6, 6'-tetra-chloro-1 , 1 ', 3, 3'- tetraetil-imidacarbocianina iodida (JC-1) para medir el potencial mitocondrial de membrana (Δψηι). JC-1 es un monómero verde fluorescente a bajo potencial de membrana, que forma agregados rojo fluorescentes promovido por un elevado potencial de membrana.

La proporción de fluorescencia roja /verde de JC-1 depende únicamente del potencial de membrana e indica la despolarización de la misma. Las células fueron lavadas dos veces con PBS frío, incubadas con 2 mg/L de JC-1 a 37 °C durante 20 min y analizadas por citometria de flujo (Becton Dickinson, San José, CA, EEUU) con unos valores de excitación y emisión de 485 y 535 nm, respectivamente.

Resultados

1. Detección de la expresión de los genes gef y apoptina en las células transfectadas. El chequeo en gel de agarosa al 2% de los productos de la PCR permitió observar la amplificación de un fragmento de 170 pb correspondiente al gen gef otro de 473pb correspondiente al gen de la apoptina, resultado de la presencia del ARNm de ambos genes, en las células transfectadas lo que demuestra una correcta expresión tras la inducción con dexametasona. La PCR fue negativa para las células transfectadas con el vector vacío y para las células no transfectadas. Para demostrar la integridad de las preparaciones de ARN, se realizó PCR utilizando primers específicos de -actina. En todos los casos el producto de esta amplificación fue detectado y fue de la misma intensidad, lo que indicó la no- degradación del ARN y que la PCR fue realizada a partir de las mismas cantidades de ARN.

2. Estudio del crecimiento celular

El efecto inducido por los genes suicidas se analizó mediante la medida de la proliferación celular con el ensayo MIT (Figura 1). En la curva que representa la tasa de inhibición del crecimiento celular no se aprecian diferencias significativas entre las células DLD-1 tratadas con Dox y las que no tratadas. Se observó una inhibición del crecimiento del 36.86% en las células DLD1/Tet-On-gef con respecto a las células control después de 2 días de incubación con Dox, y una inhibición del 50.19%, 29.53%, 31.44%, y 35.34% después de 4, 6, 8, y 10 días de incubación, respectivamente (P < 0.001). En las células DLD1/Tet-On-apoptina tratadas con Dox se observó una inhibición del crecimiento del 50.41 %, 71.4%, 64.7%, 43.46%, y 47.8% después de 2, 4, 6, 8, y 10 días de incubación, respectivamente (P < 0.001). En las células DLD1/Tet-On-gef-apoptina transducidas con los genes gef y apoptina, se observó una inhibición del crecimiento del 51.30% después de 2 días de incubación con Dox respecto a las células control. De la misma forma, se observó una inhibición del crecimiento del 64.1 %, 45.45%, 51.9%, y 65.07% después de 4, 6, 8, y 10 días de incubación, respectivamente (P < 0.001). Por tanto, hasta el día 6 de tratamiento con Dox, la inhibición de la proliferación en las células DLD1/Tet-On-gef-apoptina fue mayor que en las células que solo expresan el gen gef. Sin embargo, dicha inhibición fue muy similar en las células que solo expresan apoptina, sin diferencias estadísticas significativas. Sin embargo, a los 10 días de incubación, los genes gef y apoptina causan una inhibición de la proliferación del 35.9% y el 47.95%, mientras que la acción conjunta de ambos genes causa una inhibición del 65.13% (P < 0.001). 3. Análisis del efecto apoptótico

Para cuantificar el alcance de la apoptosis mediante citometría de flujo, se tiñeron las células simultáneamente con anexina V-FITC y IP nonvital dye para diferenciar: células viables (negativas para ambas tinciones), células en apoptosis temprana (positivo para anexina V-FITC y negativo para Pl), células en apoptosis tardía (positivas para anexina V-FITC y Pl) y células necróticas (positivas para Pl). En el cultivo control de DLD-1 , el 85% de las células era viables, el 2, 11 % estaban en apoptosis temprana, 2.76% estaban en apoptosis tardía o en las últimas etapas de la apoptosis, y un 10, 12% eran necróticas (P < 0.001), tal y como se observa en la figura 2. No se observaron diferencias entre las células DLD-1 tratadas con Dox y las no tratadas durante la primera semana. En el grupo DLD1/Tet-On-gef tratado con Dox durante 2 y 6 días, el 66.23% y 24.81 % de las células eran viables, el 14.19 % y el 4.59% fueron apoptóticas, el 0.92% y el 37.18% estaban en apoptosis tardía o en las últimas etapas de la apoptosis, y el 18.66% y el 33.41 % fueron necróticas, respectivamente. En el grupo DLD1/Tet-On-apoptina tratado con Dox durante 2 y 6 días, los porcentajes correspondientes son 35.7% y 23.35%, 6.8 % y 13.42%, 29.34% y 40.10%, y 28.16% y 23.36%, respectivamente (P < 0.001). Finalmente, en las células DLD1/Tet-On-gef-apoptina tratadas con Dox durante 2 y 6 días, los porcentajes correspondientes son 31.77% y 8.69%, 23.07% y 6.76%, 8.96% y 38.61 %, y 36.19% y 45.94%, respectivamente (P < 0.001).

4. Modulación del ciclo celular

El cultivo de células DLD-1 contenía un 70.76% de células en G1/G0, un 19.23% de células de fase S y un 10.01 % de células en G2/M. Sin embargo, después de 2 días de inducción con Dox, las células DLD1/Tet-On-gef-apoptina mostraron una disminución gradual de células en fase G1 y una acumulación de células en fase S y en fase G2/M. Después de 6 días de inducción, el incremento del número de células en fase S (29.94%), y en fase G2/M (27.01 %) y la disminución de la población de células en fase G1 (43.04% G1/G0) fueron aún más acentuadas.

After 6 days of induction, the increase in S-phase (29.94%), and G ₂ /M-phase (27.01 %) cell populations and the decrease in Gi phase cells (43.04% Gi/G ₀ cells) were even more marked (Figura 3).

5. Cambios morfológicos

Se observó al microscopio óptico la morfología de las células DLD-1 transfectadas con un solo gen y las transfectadas con ambos genes después de la inducción con Dox, y se apreciaron células más redondeadas y la pérdida de su adherencia al frasco de cultivo. No se apreciaron cambios morfológicos en las células DLD-1 transfectadas con el vector vacío con respecto a las no transfectadas (no se muestran los datos). Las células DLD-1 transfectadas con los genes gef y/o apoptina se analizaron con un microscopio electrónico de transmisión profundizar en el estudio de la citotoxicidad de dichos genes. Mediante el análisis de imágenes ultraestructurales, se confirmó la presencia de células muertas por apoptosis tanto en las células transfectadas con el gen gef como en las transformadas con el gen apoptina. Como se puede apreciar en las imágenes a y b de la figura 5, las células control son grandes y redondeadas o poligonales, con bordes bien definidos y abundante citoplasma granular, con núcleos de tamaños variables; las células tienen mitocondrias con crestas bien definidas, retículo endoplásmico, aparato de Golgi así como ribosomas libres o asociados al retículo endoplasmático. El núcleo de las células que expresa el gen gef y/o el gen apoptina presentan las características ultraestructurales de la apoptosis, incluyendo condensación de la cromatina, forma de media luna, marginación y formación de vesículas, tal y como se observa en las imágenes c, d, e, f, g, h, I, j y k de la figura 5. En las células transfectadas únicamente con el gen gef, se observaron grandes protuberancias en las mitocondrias en el día 2 del tratamiento con Dox. (Imágenes c, d y e de la figura 5). En las células transfectadas únicamente con el gen apoptina, se apreció la dilatación y destrucción del retículo endoplasmático (imágenes e, f y g de la figura 5). En las células transducidas con ambos genes, se observó la dilatación de la mitocondria y el RE y la destrucción de aparato de Golgi (imagen j de la figura 5), así como la presencia de células necróticas (imagen i de la figura 6).

6. Modulación del potencial de membrane mitochondrial.

Se midió el potencial de membrane de la mitochondria (Δψηι) mediante la sonda JC-1 con el objetivo de determinar si la apoptosis de las células DLD-1 inducida por los genes gef y apoptina, solos o combinados, se lleva a cabo por la vía mitocondrial. LA sonda se acumula específicamente en la mitocondria en cantidades que varían según el potencial de membrana. En las organelas con bajo potencial de membrana se acumula una pequeña cantidad de moléculas JC-1 , por lo que emiten fluorescencia verde (485 excitación/535 emisión). A altas concentraciones (alto potencial de membrana), los monómeros de la sonda forman agregados y emiten una fluorescencia roja (535 excitación /590 emisión). Por tanto, la pérdida de potencial de membrana se traduce en un cambio de rojo a verde. Después de 2 y 6 días de tratamiento con Dox, las células transformadas con ambos genes suicidas mostraron una disminución del potencial de membrana mucho mayor que en el caso de las células que solo expresan gef o apoptina, o las control, tal y como se observa en la figura 4. Este resultado sugiere que la coexpresión de gef y apoptina induce la apoptosis mediante un mecanismo dependiente de la mitocondria.

En resumen, estos experimentos muestran que la expresión de los genes gef y apoptina, solos o combinados, inducida mediante doxyciclina en la línea DLD-1 provoca alteraciones morfológicas que indican la entrada de determinadas subpoblaciones celulares en un proceso de muerte celular programada o apoptosis. Sin embargo, el hecho más significativo es que la expresión combinada de ambos genes induce una significativa reducción de la tasa de proliferación en comparación tanto con las líneas parentales como con las que expresan dichos genes por separado, que se acompaña de una notable alteración de la proporción de células en cada una de las fases del ciclo celular.

Los resultados demuestran por primera vez que la acción combinada de los genes gef y apoptina es mucho más citotóxica y tiene actividad antitumoral más intensa de la que tiene la expresión de dichos genes por separado.