Es ist bekannt, dass die Replikation der Enden von eukaryotischen Chromosomen spezialisierte Zellbestandteile erfordert. Die Replikation eines linearen DNA-Stranges erfolgt in der Regel in 5'-3'-Richtung. Durch die Entfernung der zum äußeren 3'-Ende der chromosomalen DNA komplementären RNA-Primer, die für die Replikations- initiation essentiell sind, bleiben bei jeder Replikationsrunde die 5'-Enden neusynthetisierter DNA- Stränge unvollständig. Dadurch kommt es zu einer fortschreitenden Verkürzung der Tochterstränge bei jeder Replikationsrunde (End-Replikationsproblem) [Levy et al.].

Diese Verkürzung an den als Telomere bezeichneten

Chromosomenenden ist unter anderem für die Steuerung der Proliferationsfähigkeit und damit für die Alterung von Zellen verantwortlich [Harley]. Die Struktur dieser Telomere ist in zahlreichen lebenden Systemen untersucht.

Das Ribonukleoenzym'Telomerase besitzt in einer Vielzahl von Organismen die Aufgabe, die Telomere proliferierender Zellen zu verlängern und zu stabilisieren, womit das End- Replikationsproblem nivelliert wird [Greider et al.]. Diese reverse Transkriptase besteht aus zwei essentiellen Untereinheiten : einer RNA-Komponente (hTR) und einer katalytischen Untereinheit (hTERT) [Beattie et al.].

Übereinstimmend mit der Beziehung zwischen Telomeren und der Telomerase sowie der Proliferationsfähigkeit der Zellen wurde in immortalisierten Zelllinien sowie in >85% der untersuchten Tumoren eine Telomerase-aktivität nachgewiesen [Kim et al.]. Diese korreliert mit der Expression der hTERT-Komponente, wie beim Harnblasenkarzinom gezeigt wurde [Ito et al. ]. Weiterhin ist ein Zusammenhang zwischen dem hTERT-Expressionsniveau im Harnblasenkarzinom und dem klinischen Verlauf der Tumorerkrankung bekannt (de Kok et al. ]. Daher ist die humane Telomerase ein ideales Ziel für die Diagnose und Behandlung menschlicher Krankheiten, die mit zellulärer Proliferation im Zusammenhang stehen, wie beispielsweise Krebs. Verfahren zur Diagnose und Behandlung von Krebs und anderen mit der Telomerase assoziierten Krankheiten sind unter anderem offenbart in der US 5 489 508 oder US 5 645 986. Die Hemmung der Telomerase wurde als spezifische Möglichkeit zur therapeutischen Kontrolle von Tumorzellen

beschrieben. Wichtige Bemühungen, die Aktivität der Telomerase im Zusammenhang von Krebserkrankungen zu modifizieren, sind in der EP 666313, WO 97/37691, WO 99/50279, US 2002/0045588 A1 oder der WO 98/28442 offenbart. Derartige allgemeine Lehren offenbaren dem Fachmann'aber keine konkreten Lehren zum technischen Handeln. Eine Substanz bzw. ein Molekül, das mit dem gesamten für hTERT kodierenden Sequenzbereich wechselwirkt, führt zwar dazu, dass die entsprechende Telomeraseaktivität - beispielsweise in einer Zellkultur-reduziert wird, derartige Substanzen eignen sich aber nicht zur Applikation in Organismen, da sie in der Regel viel zu groß sind und vom Immunsystem des betreffenden Organismus angegriffen und zerstört werden. Darüber hinaus kann eine Vielzahl unerwünschter Wechselwirkungen bzw. Nebenwirkungen auftreten. Aufgabe der Erfindung war es daher, alternative kompakte Moleküle bereitzustellen, die mit ausgewählten, spezifischen Struktureinheiten, die die Telomerase kodieren, einfach und effektiv inhibierend wechselwirken.

Die Erfindung löst dieses technische Problem durch die Bereitstellung eines Polynucleotids, das gegen eine mRNA der katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase (hTERT) gerichtet ist, wobei das Polynucleotid insbesondere mit Primärstrukturen dieser hTERT-mRNA in zwei Zielsequenzbereichen von 2176 bis 2250 und 2296 bis 2393 gemäß dem Gendatenbankeintrag AF 015950 spezifisch interagiert. Die Zahlen repräsentieren-auch in folgenden Anschnitten-die entsprechenden'Nukleotidpositionen innerhalb der hTERT-mRNA (Gesamtlänge 4015 Nukleotide). Die Erfindung betrifft also die überraschende Lehre, dass gegen

tumorassoziierte abnorme hTERT-mRNA-ExpressionsmusLer sowie Telomeraseaktivitätsniveaus durch eine mögliche hTERT- Inhibition mit den erfindungsgemäßen Polynucleotiden vorgegangen werden kann. Diese Polynucleotide sind gegen definierte hTERT-mRNA-Sequenzmotive im Bereich von 2000 bis 2500 gerichtet. Sie können biologische und/oder chemische Strukturen sein, die in der Lage sind, so mit dem Zielsequenzbereich zu interagieren, dass eine spezifische Erkennung/Bindung und Wechselwirkung bestimmt werden kann. Beispiele für Polynucleotide können insbesondere Nukleinsäurekonstrukte und deren Derivatesein.

Selbstverständlich ist es auch möglich, anstatt oder in Kombination mit den Polynucleotiden andere Erkennungs- moleküle zu verwenden, wie z. B. Antikörper, Lektine, Affiline, Aptamere, Chelatoren und andere.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform interagiert das Polynucleotid spezifisch mit zwei Zielsequenzbereichen 2176 bis 2250 und 2296 bis 2393. Vorteilhafterweise ist in diesen Sequenzbereichen eine besonders effiziente hTERT- Inhibition möglich. Bevorzugt sind ebenfalls kürzere Bereiche mit Veränderungen innerhalb dieser Zielsequenzen oder mit veränderten Randbereichen oder unterschiedlichen Derivatisierungen/Modifizierungen/Fusionen/Komplexierungen, die auch mit anderen Erkennungsmolekülen wie Polynucleotiden kombiniert und/oder gekoppelt sein können.

Durch diese bevorzugten Zielsequenzbereiche ist es dem Fachmann möglich, insbesondere sehr kleine und/oder kompakte Polynucleotid bereitzustellen, die im Wesentlichen

nicht mit anderen Strukturen, insbesondere immunologischen Abwehrstrukturen, innerhalb des Zellgewebes bzw. des Organismus interagieren oder von diesen angegriffen werden, sondern spezifisch mit dem Zielsequenzbereich der hTERT- mRNA interagieren können.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass der Sequenzbereich oder das Erkennungsmolekül, insbesondere das Polynucleotid durch Addition, Amplifikation, Inversion, Missense-Mutation, Nonsense-Mutation, Punktmutation, Deletion und/oder Substitution modifiziert ist. Diese Modifikationen können beispielsweise beim Polynucleotid dazu führen, dass es mit einer höheren Avidität oder Spezifität an die mRNA der katalytischen hTERT-Untereinheit bindet. Es kann jedoch selbstverständlich auch vorgesehen sein, dass das Polynucleotid mit geringerer Spezifität oder Avidität bindet. Bei den Mutationen im hTERT-Sequenzbereich kann es sich im Sinne der Erfindung zum Beispiel um vererbbare oder nicht vererbbare Veränderungen handeln. Die Modifikationen können so beschaffen sein, dass sie direkt auf der mRNA- Ebene oder auf der DNA-Ebene detektierbar werden. Zu den Mutationen können beispielsweise auch Mutationen im Zusammenhang mit einer zytologisch sichtbaren Genom- und/oder Chromosomenmutationen zählen, die mit Veränderungen der hTERT assoziiert sind. Derartige Mutationen können dadurch entstehen, dass Teile des Chromosoms verloren gehen, verdoppelt werden, in umgekehrter Orientierung vorliegen oder auf andere Chromosomen übertragen werden. Selbstverständlich ist es auch möglich, dass die Mutation nur ein oder wenige

benachbarte Basenpaare betrifft, wie dies beispielsweise bei der Punktmutation der Fall ist. Geht beispielsweise ein Basenpaar in Form einer Deletion verloren oder wird ein Basenpaar zusätzlich, wie bei der Insertion, eingeschoben, so verschiebt sich das Leseraster des betroffenen Gens zu einer Leserastermutation. Bei der Substitutionsmutation im Sinne der Erfindung wird beispielsweise eine Base gegen eine andere ausgetauscht, wobei die daraus resultierenden Konsequenzen unterschiedlich sein können : (a) Es kann beispielsweise ein Kodon in ein synonymes Kodon umgewandelt werden, (b) oder die Mutation verändert die Kodonspezifität und führt damit zum Einbau anderer Aminosäuren bzw.

(c) durch die Mutation wird die Translation an einer bestimmten Stelle beendet, wobei die gebildeten hTERT-Fragmente inaktiv oder aktiv sein können.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Polynucleotid ein Nukleinsäurekonstrukt. Nukleinsäure- konstrukte im Sinne der Erfindung können alle Strukturen sein, die im Wesentlichen auf Nukleinsäuren basieren oder deren aktives Zentrum im Wesentlichen auf Nukleinsäuren basiert. Das Polynucleotid kann Bestandteil von Komplexen oder Formulierungen sein, bestehend aus Lipiden, Kohlenhydraten oder Proteinen bzw. Peptiden, beispielsweise in Form einer Nanokapsel. Dieser Komplex bzw. diese Formulierung umfasst einen Bereich, der Nukleinsäuren enthält, die mit hTERT wechselwirken können. Dem Fachmann

sind verschiedene Möglichkeiten bekannt, derartige Konstrukte bereitzustellen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Nukleinsäurekonstrukt ein Antisense (AS)-Oligonukleotid (ON), ein DNAzym, ein Ribozym, eine siRNA und/oder eine Peptid-Nukleinsäure (PNA).

Bei AS-Konstrukten handelt es sich um synthetisch hergestellte Moleküle, die eine selektive Inhibition der Biosynthese ausgewählter Proteine ermöglichen. Zum Einsatz kommen zum Beispiel ON, PNAs, Ribozyme, DNAzyme. Die AS- Wirkung beruht auf der sequenzspezifischen Hybridisierung der Konstrukte durch Watson-Crick-Basenpaarung mit der für das zu reprimierende Protein kodierenden Ziel-mRNA, was über verschiedene Mechanismen zu einer Verhinderung der Proteinsynthese führt (Tab. l).

Tab. 1 AS-Effekte und ihre Wirkungsmechanismen ss-"single stranded" (Einzelstrang) Effekt Mechanismus Referenzen Transkriptions-Bindung der AS-Konstrukte an [Moser et inhibition genomische DNA durch al.] Hoogsten-Triplex-Bildung Modulation der a) Blockierung von Spleiß- [Kole et RNA-Prozes-stellen führt zur Verhin al., Crooke] sierung derung des Spleißvorgangs b) Verhinderung der Poly- adenylierung destabilisiert die mRNA c) Behinderung des mRNA-Trans- ports ins Zytoplasma Hemmung der kompetitive Bindung des [Boiziau et Translation AS-Konstrukts an die al.] Ziel-mRNA verhindert Initiations-bzw. Elongationsprozess Spaltung der a) selektiver Abbau des [Crooke, Ziel-mRNA RNA-Stranges in Agrawal et RNA-DNA-Hybriden durch die al., Sun et Endonuklease RNase H al. b) Abbau von ss-RNA durch die Endonuklease RNase L nach Aktivierung durch 2', 5'-Tetraadenylat- modifizierte ON c) durch Ribozyme/DNAzyme katalysierte, sequenz- spezifische Spaltung der Ziel-mRNA

Die Entwicklung von AS-ON als therapeutische Substanzen stellt neben verschiedenen anderen Anwendungsfeldern auch ein neues erfolgversprechendes Therapiekonzept für onkologische Erkrankungen dar [Tamm et al.]. Während es bei der konventionellen Chemotherapie zu einer unspezifischen Hemmung der Zellproliferation kommt, werden mit der AS- Therapie ganz gezielt solche mRNAs inaktiviert, die die molekulare Grundlage oder einen wesentlichen Bestandteil des entarteten, deregulierten Wachstums und der Tumorprogression darstellen sowie für die Inhibierung der körpereigenen Immunabwehr verantwortlich sein können.

AS-ON unterscheiden sich von anderen Therapeutika, wie Antikörpern, Toxinen oder Immuntoxinen dahingehend, dass es sich um relativ kleine Moleküle mit einem Molekulargewicht von üblicherweise etwa 5 kDa handelt. Die geringe Größe der AS-ON ermöglicht eine gute Gewebepenetration. Außerdem ist

bekannt, dass Tumorblutgefäße im Gegensatz zu Blutgefäßen normaler Gewebe für Substanzen in einem Größenbereich zwischen 4-10 kDa durchlässig sind. Das bedeutet, dass therapeutische AS-ON gezielt Tumorblutgefäße penetrieren können. Ein weiterer Vorteil dieser Substanzen, zum Beispiel gegenüber Antikörpern, die nahezu ausschließlich gegen extrazelluläre Proteine wirksam sind, besteht darin, dass über die jeweilige Ziel-mRNA prinzipiell alle, also sowohl zytoplasmatische als auch kernlokalisierte sowie membranständige Proteine angegriffen werden können.

Die gegen einen Nuklease-Angriff relativ resistenten Phosporthioat-AS-ON werden gegenwärtig in einer Reihe von klinischen Studien (Phase I-III) hinsichtlich ihres Potentials als Anti-Krebs-Therapeutika evaluiert. Dabei werden in Tumoren überexprimierte Ziel-mRNA-Moleküle angegriffen.

Bei Verwendung der Phosphothioat-ON (PS-ON) wurde eine Reihe von unerwarteteten, so genannten"non-AS"-Effekten beobachtet, die zudem zu einer unspezifischen Hemmung des Zellwachstums führen können. Diese Effekte sind stark von der ON-Sequenz bzw. von bestimmten Sequenzmotiven abhängig und treten auf Grund der starken polyanionischen Ladung der PS-ON auf, welche eine Bindung der PS-ON an lebenswichtige Proteine zur Folge haben kann. Die erwähnten negativen Effekte können insbesondere durch Verwendung von partiell phosphothioat-modifizierten AS-ON oder durch weitere Modifikationen, z. B. Einbau von Ribonukleotiden anstatt Desoxyribonukleotiden, überwunden werden. Eine partielle endständige Modifizierung von ON-Konstrukten (bevorzugt 2

bis 5 Bindungen vom 3'-und 5'-Nukleinsäureterminus sind modifiziert) bietet eine erhöhte Stabilität im extra-und intrazellulären Milieu der Zielzellen (Schutz vor Abbau durch Exonukleasen), insbesondere bei einer Applikation in vivo. Ein positiver Nebeneffekt, der bei Verwendung der PS- ON beobachtet wurde, ist deren immunstimulatorische Wirkung, die bei einigen Tumoranwendungen durchaus einen möglichen Therapieerfolg unterstützen kann.

Zur Erhöhung der Stabilität und Spezifität von AS-ON und zur Verminderung der non-AS% %-Effekte können weitere chemische Modifikationen zum Einsatz kommen, z. B. Einbau von 2'-O-Methylribonukleotiden, Methylphosphonat-Segmenten, n locked nucleic acids" (Methylenbrücke zwischen 2'- Sauerstoff und 4'-Kohlenstoff der Ribose), Austausch des Cytosins durch 5'-Methylcytosin und/oder eine 2'-5'- Tetraadenylat-Modifizierung.

Dabei kann es sich sowohl um partiell modifizierte öder vollständig via dieser chemischen Modifikation veränderte ON-Konstrukte handeln.

Ribozyme sind als katalytisch aktive RNA-Moleküle in der Lage, zelluläre RNA-Strukturen als Substrate zu erkennen und sequenzspezifisch an einer Phosphordiesterbindung zu spalten. Die Erkennung erfolgt über AS-Arme, die aufgrund komplementärer Sequenzen eine Hybridisierung mit der Ziel-mRNA ermöglichen. Gegenüber AS-ON besitzen Ribozyme den grundsätzlichen Vorteil, dass ein Ribozym-Molekül als echter Katalysator eine große Anzahl identischer Substratmoleküle umsetzen kann. Daher sind Ribozyme bereits

in wesentlich geringerer Konzentration als ON wirksam und führen darüber hinaus durch die Substrat-Spaltung zu einem irreversiblen RNA-Abbau [Sun et al.].

Unter den bisher bekannten Ribozymtypen ist das Hammerhead-Ribozym (Review : Birikh et al., 1997 ; Tanner, 1999) für derartige Anwendungen besonders interessant, weil es als vergleichsweise kleines Molekül (ca. 30-50 Nukleotide) bereits katalytisch aktiv sein kann. Ein sehr wirksames trans-spaltendes Hammerhead-Ribozym besteht zum Beispiel aus lediglich 14 konservierten Nukleotiden in der katalytischen Domäne und zwei variablen Stammsequenzen (vorteilhafterweise aus jeweils 6-8 Nukleotiden), die durch Watson-Crick-Basenpaarung (analog der AS-ON) die sequenzspezifische Erkennung des zu spaltenden Substrates realisieren und dieses anschließend durch Spaltung einer Phosphordiester-Bindung inaktivieren. In dieser Form lässt sich praktisch gegen jedes beliebige RNA-Molekül, welches eine potentielle Spaltstelle mit der minimalen Sequenzanforderung-NUX-besitzt, ein spezifisch spaltendes Hammerhead-Ribozym konstruieren und somit beispielsweise zelluläre mRNA oder virale RNA inhibieren. Weitere katalytische Nukleinsäuren vom DNA-Typ (z. B. DNAzyme) sind analog einsetzbar.

RNAi ("RNA interference") ist eine neue Methodik, die eine spezifische Geninhibition von Zielmolekülen auf mRNA-Ebene ermöglicht. Hierfür müssen doppelsträngige RNA-Moleküle ("small interference RNA", siRNA) mit ihren zwei Nukleotiden langen 3'-Überhängen, bestehend bevorzugt aus Thymidin-Nukleotiden, in Zellen transfiziert werden.

Zunächst erfolgt eine Assoziation der siRNA-Konstrukte mit spezifischen zellulären Proteinen, gefolgt durch die Erkennung der Ziel-mRNA-Sequenz aufgrund der Komplemen- tarität des AS-si-RNA-Stranges. Die intrinsische Endonukleaseaktivität des Ribonukleoproteinkomplexes ermöglicht eine spezifische Degradation der zu inhibierenden mRNA.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist das AS-ON ein PS-ON bzw. ein mit weiteren chemischen Veränderungen modifiziertes Nukleinsäurekonstrukt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Sequenzbereich der hTERT-mRNA, zu der das Polynucleotid komplementär ist, ausgewählt aus der Gruppe umfassend 2183-2205,2206-2225, 2315-2334,2317-2336, 2324- 2346, 2331-2350 und/oder 2333-2352.

Mit diesen Sequenzbereichen ist es vorteilhafterweise möglich, die hTERT-Expression zu inhibieren. Durch die Inhibition können unter anderem Krankheiten, die mit der Expression dieses Gens assoziiert sind, unterdrückt werden, wie zum Beispiel Tumoren.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Polynucleotid immobilisiert. Im Sinne der Erfindung werden unter Immobilisierung verschiedene Verfahren und Techniken zum Fixieren der Polynucleotide auf bestimmten Trägern verstanden. Die Immobilisierung kann beispielsweise der Stabilisierung der Polynucleotide dienen, wodurch diese insbesondere bei Lagerung oder bei einmaligem Batch-Ansatz

durch biologische, chemische oder physikalische Einwirkungen in ihrer Aktivität nicht reduziert oder nachteilig modifiziert werden. Durch die Immobilisierung der Polynucleotide ist ein wiederholter Einsatz unter technischen oder klinischen Routine-Bedingungen möglich ; weiterhin kann die Probe mit den Polynucleotiden kontinuierlich umgesetzt werden. Dies kann insbesondere durch verschiedene Immobilisierungstechniken erreicht werden, wobei die Bindung der Polynucleotide an andere Polynucleotide oder Moleküle bzw. an einen Träger so erfolgt, dass die dreidimensionale Struktur am aktiven Zentrum der entsprechenden Moleküle, insbesondere der Polynucleotide, nicht verändert wird. Vorteilhafterweise geht die Spezifität zu hTERT und die Spezifität der eigentlichen Bindungsreaktion durch die Immobilisierung nicht verloren. Im Sinne der Erfindung können drei grundsätzliche Methoden zur Immobilisierung verwendet werden : (i) Quervernetzung : Bei der Quervernetzung werden die Polynucleotide miteinander fixiert, ohne dass ihre Aktivität nachteilig beeinflusst wird. Sie sind vorteilhafterweise durch die Quervernetzung nicht mehr löslich.

(ii) Bindung an einen Träger : Die Bindung an einen Träger erfolgt zum Beispiel durch Adsorption, Ionenbindung oder kovalente Bindung. Dies kann auch innerhalb von mikrobiellen Zellen bzw. Liposomen oder anderen membranhaltigen geschlossenen bzw. offenen Strukturen erfolgen. Das Polynucleotid wird durch die Fixierung

vorteilhafterweise nicht in seiner Aktivität beeinflusst.

Es kann mit Vorteil zum Beispiel in der Klinik in Diagnose oder Therapie trägergebunden mehrfach oder kontinuierlich eingesetzt werden.

(iii) Einschluss : Der Einschluss erfolgt im Sinne der Erfindung insbesondere in eine semipermeable Membran in Form von Gelen, Fibrillen oder Fasern. Gekapselte Polynucleotide sind durch eine semipermeable Membran so durch die umgebende Probenlösung getrennt, dass sie vorteilhafterweise noch mit der katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase oder mit Fragmenten dieser interagieren können.

Für die Immobilisierung stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung, wie beispielsweise die Adsorption an einen inerten oder elektrisch geladenen anorganischen oder organischen Träger. Solche Träger können beispielsweise poröse Gele, Aluminiumoxid, Betonid, Agarose, Stärke, Nylon oder Polyacrylamid sein. Die Immobilisierung erfolgt hierbei durch physikalische Bindungskräfte, oft unter Beteiligung von hydrophoben Wechselwirkungen und ionischen Bindungen. Derartige Methoden sind vorteilhafterweise einfach zu handhaben und sie beeinflussen die Konformation der Polynucleotide nur in geringem Umfang. Durch elektrostatische Bindungskräfte zwischen den geladenen Gruppen der Polynucleotide und dem Träger kann die Bindung vorteilhafterweise verbessert werden, zum Beispiel durch die Verwendung von Ionenaustauschern, wie zum Beispiel Sephadex. Ein weiteres Verfahren ist die kovalente Bindung an Trägermaterialien. Die Träger können dazu reaktive

Gruppen aufweisen, die mit Aminosäure-Seitenketten homöopolare Bindungen eingehen. Geeignete Gruppen in Polynucleotiden sind Carboxy-, Hydroxy-und Sulfidgruppen und insbesondere die endständigen Aminogruppen von Lysinen.

Aromatische Gruppen bieten die Möglichkeit für Diazo- Kupplungen. Die Oberfläche von mikroskopischen porösen Glaspartikeln kann durch Behandlung mit Silanen aktiviert und anschließend mit Polynucleotiden besetzt werden.

Hydroxy-Gruppen natürlicher Polymere können zum Beispiel mit Bromzyan aktiviert und anschließend mit Polynucleotiden gekoppelt werden. Mit Polyacrylamid-Harzen können zahlreiche Polynucleotide vorteilhafterweise direkte kovalente Bindungen eingehen. Bei dem Einschluss in dreidimensionale Netzwerke werden die Polynucleotide in ionotrophe Gele oder andere dem Fachmann bekannte Strukturen eingeschlossen. Die Poren der Matrix sind insbesondere so beschaffen, dass die Polynucleotide zurückgehalten werden und eine Interaktion mit den Ziel- Molekülen möglich ist. Bei der Quervernetzung werden die Polynucleotide durch Vernetzung mit bifunktionellen Agenzien in polymere Aggregate umgewandelt. Derartige Strukturen sind gelatinös und leicht verformbar und insbesondere für den Einsatz in verschiedenen Reaktoren geeignet. Durch Zugabe anderer inaktiver Komponenten, wie zum Beispiel Gelatine, bei der Vernetzung können die mechanischen und enzymatischen Eigenschaften vorteilhafterweise verbessert werden. Bei der Mikroverkapselung wird der Reaktionsraum der Polynucleotide mit Hilfe von Membranen eingegrenzt. Die Mikroverkapselung kann zum Beispiel als Grenzflächenpolymerisation durchgeführt werden. Durch die Immobilisierung bei der

Mikroverkapselung werden die Polynucleotide unlöslich und dadurch wiederverwendbar. Im Sinne der Erfindung sind immobilisierte Erkennungsmoleküle, insbesondere Polynucleotide alle Erkennungsmoleküle oder Polynucleotide, die sich in einem Zustand befinden, der ihre Wiederverwendung erlaubt. Die Einschränkung der Beweglichkeit und der Löslichkeit der Polynucleotide auf chemischem, biologischem oder physikalischem Wege führt vorteilhafterweise zu niedrigen Verfahrenskosten.

Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend die erfindungsgemäßen Polynucleotide, gegebenenfalls in einer Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Dieser pharmazeutische Träger kann insbesondere zusätzliche Stoffe und Substanzen, wie beispielsweise medizinische und/oder pharmazeutisch-technische Hilfsstoffe, umfassen.

Medizinische Hilfsstoffe sind beispielsweise solche Stoffe, die zur Produktion als Ingredienzien von pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzt werden. Pharmazeutisch- technische Hilfsstoffe dienen der geeigneten Formulierung der pharmazeutischen Zusammensetzung oder des Arzneimittels und können sogar-sofern sie nur während des Herstellungsverfahrens benötigt werden-anschließend entfernt werden oder können als pharmazeutisch verträgliche Trägersubstanzen Teil der pharmazeutischen Zusammensetzung sein. Die pharmazeutische Zusammensetzung erfolgt gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel. Hierbei kann es sich beispielsweise um phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Wasser, Emulsionen, wie beispielsweise Öl/Wasser-

Emulsionen, verschiedene Arten von Detergenzien, sterile Lösungen und ähnliches handeln. Die Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung kann beispielsweise im Zusammenhang mit einer Gentherapie geschehen.

Im Sinne der Erfindung ist eine Gentherapie eine Behandlungsform unter Einsatz von natürlichen oder rekombinant veränderten Nukleinsäure-Konstrukten, einzelner Gensequenzen oder ganzer Gen-bzw. Chomosomenabschnitte bzw. kodierter Transkriptbereiche, deren Derivate/ Modifizierungen mit dem Ziel einer biologisch-basierten und selektiven Hemmung bzw. Revertierung der Krankheitssymptome und/oder deren kausalen Ursachen, wobei im speziellen Fall darunter die Inhibition eines im Verlauf einer Krankheit überexprimierten Zielmoleküls auf Ebene der Nukleinsäuren, insbesondere auf der Transkriptebene, verstanden wird.

Die Gentherapie kann beispielsweise auch über geeignete Vektoren, wie beispielsweise virale Vektoren oder/und eine Komplexierung mit Lipiden oder Dendrimeren erfolgen. Die Gentherapie kann insbesondere auch über die Verpackung in Proteinhüllen erfolgen. Weiterhin ist es möglich, dass das Polynucleotid mit einem weiteren Molekül fusioniert oder komplexiert ist, welches den gerichteten Transport zum Zielort, die Aufnahme in und/oder die Verteilung innerhalb der Zielzelle unterstützt. Die Art der Dosierung und des Verabreichungsweges kann vom behandelnden Arzt entsprechend den klinischen Anforderungen bestimmt werden. Es ist dem Fachmann bekannt, dass die Art der Dosierung von verschiedenen Faktoren abhängig ist, wie beispielsweise der Größe, der Körperoberfläche, dem Alter, dem Geschlecht oder

dem allgemeinen und krankheitsspezifischen Gesundheits- zustand des Patienten, aber auch von dem speziellen Mittel, welches verabreicht wird, der Dauer und Art der Verabreichung und von anderen Medikamenten, die möglicherweise parallel, insbesondere in einer Kombinationstherapie, verabreicht werden.

Die Erfindung betrifft auch einen Kit umfassend das Polynucleotid und/oder die pharmazeutische Zusammensetzung.

Weiterhin betrifft die Erfindung auch ein Array umfassend das Polynucleotid und/oder die pharmazeutische Zusammensetzung. Der Kit und der Array können zur Diagnose und/oder Therapie von Krankheiten eingesetzt werden, die mit der Funktion der katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase assoziiert sind. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Polynucleotids, des Kits, des Arrays zur Diagnose, Prophylaxe, Verminderung, Therapie, Verlaufskontrolle und/oder Nachbehandlung von mit Zellwachstum, -differenzierung und/oder-teilung im Zusammenhang stehenden Krankheiten.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die mit Zellwachstum, -differenzierung und/oder-teilung im Zusammenhang stehende Krankheit ein Tumor. Besonders bevorzugt ist der Tumor ein solider Tumor und/oder ein Blut-oder Lymphdrüsenkrebs.

Insbesondere kann es sich bei den Tumoren, die epithelialen oder mesodermalen Ursprungs sein können, im Sinne der Erfindung um gut-oder bösartige Krebsarten der Organe der Lunge, der Prostata, der Harnblase, der Niere, der

Speiseröhre, des Magens, der Bauchspeicheldrüse (Pankreas), des Hirns, des Ovars, des Skelettsystems handeln, wobei besonders das Adenokarzinom der Brust, der Prostata, der Lunge und des Darms, Knochenmarkkrebs, das Melanom, das Hepatom, die Kopf-Hals-Tumoren explizit als Vertreter bösartiger (so genannte maligne) Tumoren bevorzugt sind.

Zur Gruppe der Blut-und Lymphdrüsenkrebsarten werden im Sinne der Erfindung alle Formen von Leukämien (z. B. in Zusammenhang mit B-Zellen-Leukämie, Gemischt-Zellen- Leukämie, Nullzellen-Leukämie, T-Zellen-Leukämie, chronische T-Zellen-Leukämie, HTLV-II-assoziierte Leukämie, akute lymphatische Leukämie, chronisch-lymphatische Leukämie, Mastzell-Leukämie und myeloische Leukämie) und Lymphomen gezählt. Beispiele von mesenchymalen bösartigen Tumoren (sogenannte Knochen-und Weichteilsarkome) sind : Fibrosarkom ; das maligne Histiozytom ; das Liposarkom ; Hämangiosarkom ; das Chondrosarkom und das Osteosarkom ; Ewing-Sarkom ; das Leio-und Rhabdomyosarkom, das Synovialsarkom ; Karzinosarkom. Als weitere Tumorarten, die im Sinne der Erfindung auch unter dem Begriff"Neoplasmen" zusammengefasst werden, sind bevorzugt : Knochen-Neoplasmen, Brust-Neoplasmen, Neoplasmen des Verdauungssystems, colorektale Neoplasmen, Leber-Neoplasmen, Pankreas- Neoplasmen, Hirnanhang-Neoplasmen, Hoden-Neoplasmen, Orbita-Neoplasmen, Neoplasmen des Kopfes und Halses, des Zentralnervensystems, Neoplasmen des Hörorgans, des Beckens, des Atmungstrakts und des Urogenitaltrakts).

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist die Krebserkrankung oder der Tumor, die/der behandelt oder verhindert wird, ausgewählt aus der Gruppe : Tumoren des

Hals-Nasen-Ohren-Bereichs umfassend Tumoren der inneren Nase, der Nasennebenhöhlen, des Nasopharynx, der Lippen, der Mundhöhle, des Oropharynx, des Larynx, des Hypopharynx, des Ohres, der Speicheldrüsen und Paragangliome, Tumoren der Lunge umfassend nicht-kleinzellige Bronchialkarzinome, kleinzellige Bronchialkarzinome, Tumoren des Mediastinums, Tumoren des Gastrointestinaltraktes umfassend Tumoren des Ösophagus, des Magens, des Pankreas, der Leber, der Gallenblase und der Gallenwege, des Dünndarms, Kolon-und Rektumkarzinome und Analkarzinome, Urogenitaltumoren umfassend Tumoren der Nieren, der Harnleiter, der Blase, der Prostata, der Harnröhre, des Penis und der Hoden, gynäkologische Tumoren umfassend Tumoren der Zervix, der Vagina, der Vulva, Korpuskarzinom, maligne Trophoblastenerkrankung, Ovarialkarzinom, Tumoren des Eileiters (Tuba Faloppii), Tumoren der Bauchhöhle, Mammakarzinome, Tumoren endokriner Organe umfassend Tumoren der Schilddrüse, der Nebenschilddrüse, der Nebennierenrinde, endokrine Pankreastumoren, Karzinoidtumoren und Karzinoidsyndrom, multiple endokrine Neoplasien, Knochen-und Weichteilsarkome, Mesotheliome, Hauttumoren, Melanome umfassend kutane und intraokulare Melanome, Tumoren des zentralen Nervensystems, Tumoren im Kindesalter umfassend Retinoblastom, Wilms Tumor, Neurofibromatose, Neuroblastom, Ewing-Sarkom-Tumorfamilie, Rhabdomyosarkom, Lymphome umfassend Non-Hodgkin-Lymphome, kutane T-Zell-Lymphome, primäre Lymphome des zentralen Nervensystems, Morbus Hodgkin, Leukämien umfassend akute Leukämien, chronische myeloische und lymphatische Leukämien, Plasmazell-Neoplasmen, myelodysplastische Syndrome, paraneoplastische Syndrome, Metastasen ohne

bekannten Primärtumor (CUP-Syndrom), peritoneale Karzinomastose, Immunsuppression-bedingte Malignität umfassend AIDS-bezogene Malignitäten wie Kaposi-Sarkom, AIDS-assoziierte Lymphome, AIDS-assoziierte Lymphome des zentralen Nervensystems, AIDS-assoziierten Morbus Hodgkin und AIDS-assoziierte anogenitale Tumoren, Transplantations- bedingte Malignitäten, metastasierte Tumoren umfassend Gehirnmetastasen, Lungenmetastasen, Lebermetastasen, Knochenmetastasen, pleurale und perikardiale Metastasen und maligne Aszites.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem soliden Tumor um einen Tumor des Urogenitaltraktes und/oder des Gastrointestinaltraktes.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass der Tumor ein Kolonkarzinom, ein Magenkarzinom, ein Pankreaskarzinom, ein Dickdarmkrebs ; ein Dünndarmkrebs, ein Ovarialkarzinom, ein Zervikalkarzinom, ein Lungenkrebs, ein Nierenzellkarzinom, ein Hirntumor, ein Kopf-Halstumor, ein Leberkarzinom und/oder eine Metastase dieser Tumoren/Karzinome ist.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist der solide Tumor ein Mamma-, Bronchial-, Kolorektal- und/oder Prostatakarzinom.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Tumor des Urogenitaltraktes ein Harnblasenkarzinom (BCa).

Das BCa stellt in der Bundesrepublik Deutschland die vierthäufigste Krebsform und siebthäufigste Krebstodes-

ursache bei Männern dar. Die TUR-B als generelle Primärtherapie des BCa erlaubt eine organerhaltende Entfernung von oberflächlichen Tumoren. Trotz dieser histopathologisch definierten vollständigen Entfernung des Tumors ist mit 50-70 % der Patienten ein relativ hoher Anteil innerhalb von zwei Jahren von einem Rezidiv betroffen [Stein et al.]. Ein Diagnose-sowie Therapieproblem stellt das synchrone oder metachrone multifokale Auftreten von Tumorherden dar,. wodurch das Auftreten von Rezidiven entfernt von der resezierten Primärtumorlokalisation bedingt sein kann [Sidransky et al. ]. Bei Auftreten eines Rezidivs oder bei primär als oberflächlich eingestuften Tumoren erfolgt in der Regel nach der TUR-B eine Langzeitprophylaxe mit einem Immun- (Bazillus Calmette-Guerin-BCG) oder Chemotherapeutikum (z. B. Mitomycin-C, Taxol, Gemcitabin/Cisplatin). Patienten mit muskelinvasiven BCa und mit entdifferenzierten, oberflächlichen Tumoren, die trotz dieser Therapie rezidivieren, werden in der Regel radikal zystektomiert bzw. unter Erhalt der Blase mittels Mono-/Polychemo-, Immun-oder Strahlentherapie bzw. Kombinationsverfahren dieser Methoden behandelt. Chemo-, Immun-oder Strahlenbehandlungen sind aufgrund ihrer relativ unspezifischen Wirkmechanismen von einer hohen therapieinduzierten Toxizität begleitet.

Aufgrund der gesundheitspolitischen Bedeutung des BCa (insbesondere in den westlichen Industrieländern), dem Fehlen tumorspezifischer Marker sowie der bekannten tumorbiologischen und zellulären Heterogenität des Tumors gibt es eine intensive Suche auf dem klinischen

Forschungsgebiet zum BCa, die insbesondere auf die Identifizierung neuer oder/und ergänzender Therapieoptionen zielen.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung werden das Polynucleotid, die pharmazeutische Zusammensetzung, der Kit und/oder der Array für eine Verlaufskontrolle verwendet, die im Wesentlichen eine Überwachung der Wirksamkeit einer Antitumorbehandlung darstellt. Weiterhin ist es bevorzugt, dass das Polynucleotid in einer Kombinationstherapie, insbesondere zur Behandlung von Tumoren, verwendet wird. Besonders bevorzugt ist hierbei, dass die Kombinationstherapie eine Chemotherapie, eine Zytostatikabehandlung und/oder eine Strahlentherapie umfasst. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Kombinationstherapie eine adjuvante biologisch-spezifizierte Therapieform. Ganz besonders bevorzugt ist hierbei, dass diese Therapieform eine Immuntherapie ist. Weiterhin ist besonders bevorzugt, dass die Kombinationstherapie eine Gentherapie und/oder eine Therapie mit einem Polynucleotid gegen dasselbe oder ein anderes Zielmolekül umfasst. Dem Fachmann sind verschiedene Kombinationstherapien, insbesondere zur Behandlung von Tumoren, bekannt. Es kann zum Beispiel vorgesehen sein, dass innerhalb einer Kombinationstherapie eine Zytostatikabehandlung erfolgt oder beispielsweise eine Bestrahlung eines bestimmten Tumorareals, wobei diese Behandlung mit einer Gentherapie kombiniert wird, wobei das erfindungsgemäße Polynucleotid als Antikrebsmittel eingesetzt wird. Das erfindungsgemäße Polynucleotid kann jedoch auch in Kombination mit anderen Polynucleotiden

gegen das selbe oder ein anderes Zielmolekül eingesetzt werden. Demgemäß kann es ganz besonders bevorzugt sein, dass das Polynucleotid zur Erhöhung der Sensitivität von Tumorzellen gegenüber Zytostatika und/oder Strahlen verwendet wird. Weiterhin ist es bevorzugt, dass das Polynucleotid zur Hemmung der Vitalität, der Proliferationsrate von Zellen und/oder zur Induktion von Apoptose und eines Zellzyklus-Arrests verwendet wird.

Im Folgenden soll die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.

Beispiel 1 Die gut transfizierbare humane Harnblasenkarzinom-Zelllinie EJ28 zeigte nach Transfektion insbesondere bei Verwendung von fünf spezifischen anti-hTERT-AS-Konstrukten (vgl. Tab.

2) eine unmittelbar einsetzende und kontinuierliche Reduktion ihrer Viabilität um mehr als 65 % gegenüber der Nonsense (NS) -Kontrolle (Abb. 2). Dabei war die Beobachtung besonders auffällig, dass vier der wirksamsten Konstrukte gegen ein einzelnes mRNA-Sequenzmotiv gerichtet waren.

Bereits nach vier von fünf Behandlungen mit dem Konstrukt ASte12331-50 waren nahezu keine lebenden Zellen mehr im Kulturgefäß nachweisbar. Die Behandlung telomerasenegativer humaner Fibroblasten führte hingegen zu keinen signifikanten Unterschieden zwischen AS-und NS-ON- behandelten Zellen, was eine Spezifität der AS-O-N-Wirkung auf die BCa-Zelllinie EJ28 indirekt belegt (Daten nicht

gezeigt). Die AS-spezifische Wirksamkeit wurde anschließend detailliert untersucht : in Übereinstimmung mit dem Viabilitätstest konnte in Bezug auf das Proliferations-und Zellkoloniebildungsverhalten (Abb. 3) ein Hemmeffekt dieser fünf AS-ON belegt werden. Zudem konnte die AS-spezifische Verringerung des Zellanteils in der DNA-Synthesephase (bis ca. 30 %) in Richtung einer Gl-Arretierung nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Der Beweis für die AS- spezifische Wirkung der gegen die Zielmotive gerichteten AS-ON wurde in Form einer signifikanten und zeitabhängigen Reduktion der hTERT-Transkriptmenge erbracht (Abb. 4). In Übereinstimmung damit wurde auch die hTERT- Proteinexpression reprimiert. Außerdem wurde als Folge davon die Telomeraseaktivität der EJ28-Zellen um mehr als 60 % gehemmt (Daten nicht gezeigt).

Die AS-ODN spezifischen Effekte bezüglich einer Wachstums- und Proliferationsinhibierung wurden zudem für andere humane BCa-Zellinien belegt (Kraemer et al.).

Beispiel 2 In Experimenten zur Wirkung von verschiedenen Chemotherapeutika (Mitomycin-C, Cisplatin, Gemcitabin) auf das Wachstumsverhalten von verscheidenen BCa-Zellinien wurde unerwarteterweise ein signifikanter Verstärkungseffekt, bedingt durch die Zugabe einzelner Polynucleotide im Sinne der Erfindung, beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). Am Beispiel der gut transfizierbaren BCa-Zellinie 5637 konnte mit den AS-ON-Konstrukten ASte12206 und AStel2331 eine signifikante Steigerung der viabilitätsinhibitorischen Wirkung des Chemotherapeutikums Cisplatin in zwei verschiedenen Dosierungen nachgeweisen werden (Abb. 5).

Tab. 2 hTERT-AS-und NS-ON : Nukleotid-und Zielsequenzen

, Bezelchnung. ss-Motlv ! Sequenz3 (5'X 3') _'_. _ AS-ON ! t ! ; g ggggg 9'g J g i |AS-ON ......... ........................ ! ASte12315-2334 Ittgaaggccttgcggacgtg AStel2317-2336.. ! : ÄSte12331-235Ö -ggtägagäcgtggctcttgä ......... _ j i _ _.. _......, ASte12333-2352 ; ? aaggtagagacgtggctctt ; i NUS-ON i i NS-K2 lcagtctcagtactgaagctg E _ i I NS K3 cägcttcagtactgagactg

Der Name beinhaltet den Sequenzbereich der hTERT-mRNA (Acc. No. : AF015950), zu der das jeweilige AS-ON komplementär ist ; 2 Die dargestellten Motive enthalten am 5'-und 3'-Terminus jeweils 10 nt doppelsträngige RNA ; 3 Die fett gedruckten Nukleotide stellen den Bereich im AS- ON dar, der komplementär zur eigentlichen ss-Region des Zielmotivs ist.

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