技术领域

本发明涉及生物医药领域， 更具体地， 涉及新的具有抑制新生血管作用的 多肽 (H-KI系列多肽）。 该多肽可抑制体外血管内皮细胞增殖、 迁移、 管腔形成 和可抑制体内鸡胚尿囊膜和小鼠视网膜新生血 管。 本发明还涉及所述多肽的制 法和应用以及含所述多肽的药物组合物。 背景技术

血管新生是指在原有毛细血管网的基础上， 通过血管内皮细胞增殖、 迁移 进而形成新生血管的过程。 血管新生在体内胚胎发育、 损伤修复等生理过程中 发挥重要作用， 同时也是众多新生血管性疾病， 如肿瘤生长与转移、 增殖性糖 尿病视网膜病变、 早产儿视网膜病变、 类风湿关节炎等疾病的主要病理变化。 因此新生血管抑制剂的研究与应用对于一些难 治性新生血管相关疾病具有重 要意义。

眼部新生血管与多种眼病都有密切的关系， 它常常导致严重的视力损害并 最终致盲， 例如糖尿病视网膜病变（DR)， 年龄相关性黄斑变性（AMD) , 角膜新 生血管， 新生血管性青光眼等。 目前临床上的治疗手段主要包括手术、 激光和 药物。 手术需要一定的指征， 患者痛苦大， 且风险和并发症相对较高； 激光治 疗亦存在一定的痛苦， 可造成局部视野缺损、 诱发新生血管， 中长期疗效也不 甚理想。 因此， 一种无痛苦、 便捷、 有效、 患者依从性高的药物治疗眼部新生 血管的方法成为了近十余年来国内外研究的热 点。

血管内皮生长因子（VEGF)是相当重要的血管生� ��剌激因子， 目前临床中已 经得到应用或者仍在实验研究中的药物主要是 一些针对 VEGF 或者其受体 (VEGFR)的抗新生血管制剂。 包括抑制 VEGF表达的 VEGF反义寡核苷酸； 抑制 VEGF受体表达的 VEGF受体反义寡核苷酸； 中和血循环中 VEGF的抗 VEGF抗体、 可溶性 VEGF受体、 VEGF Trap , 抗 VEGFR抗体、 酪氨酸激酶抑制剂等， 这些制 剂在肿瘤治疗中应用广泛。

在开发有效的血管新生抑制剂时， 应充分考虑到眼科用药的特殊性。

第一， 眼部存在多个解剖性和功能性的屏障。 全身给药常常由于血 -房水 屏障和血-视网膜屏障而无法在眼组织局部达� �足够的药物浓度； 局部给药， 如玻璃体腔注射， 大于 76. 5kDa的大分子在理论上很难穿透视网膜作用于� �网 膜和脉络膜新生血管。 对于眼表给药， 药物必须要先后穿透亲脂性的角膜上皮 细胞紧密连接和亲水性的角膜基质， 因此只有具备适当脂溶性、 低分子量或能 与眼表组织内的转运体（如： 氨基酸转运体、 寡肽转运体等）结合的药物才能到 达前房发挥作用。

第二， 药物在亲水的泪液、 房水、 玻璃体液中溶解的程度与其有效性呈正 相关。

第三， 基于上述主要原因， 眼科用药的生物利用度很低； 要使之提高， 可 加大给药的浓度。 用于治疗肿瘤新生血管的化合物毒副作用较为 明显， 全身和 局部均无法高剂量给药。

第四， 目前虽然已经有一系列相对安全的内源性血管 新生抑制剂被先后证 实， 如血管抑素（angi ostat in)可明显抑制血管依赖性肿瘤的生长， 但由于其 分子量较大且空间构象复杂， 故在制备过程中存在重组表达纯化工艺繁琐和 内 毒素残留等不足。

正是由于上述种种条件的限制， 目前用于治疗眼部新生血管的药物十分有 限， 比如重组抗人 VEGF单克隆抗体 Bevac i zumab (Avast in， 最初用以治疗转移 性结肠直肠肿瘤）、 重组抗人 VEGF 单克隆抗体片段 Ranibi zumab (Lucent i s，） 等。虽然这几种药物抑制眼部新生血管的作用 已经得到肯定，但它们价格高昂， 已报道有多种眼部或全身不良反应， 且穿透血眼屏障能力低， 给药方式受到限 制。

多肽类新生血管抑制剂与目前研究广泛的蛋白 类新生血管抑制剂相比具 有合成方法简单、 容易进行化学修饰、 免疫原性低、 溶解性好、 生物利用率高、 组织穿透性强、 给药途径多样、 价格低廉等突出优势。 然而， 目前尚没有来自 肝细胞生长因子 (HGF)的、 效果令人满意的小分子多肽。

因此， 本领域迫切需要开发一种适于眼球组织的有效 安全的小分子新生血 管抑制剂。 发明内容

本发明的目的是提供一类适于眼球组织的有效 安全的可抑制血管新生的 小分子多肽以及其片段、 类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供含所述多肽的制法和 应用。 在本发明的第一方面， 提供了一种下式 I表示的多肽， 或其药学上可接受

[XaaO] - [Xaal] - [Xaa2]— [Xaa3] - [Xaa4] - [Xaa5] - [Xaa6] - [Xaa7] - [Xa a8] - [Xaa9] - [XaalO] - [Xaal 1] - [Xaal2] - [Xaal3] - [Xaal4] - [Xaal5] - [Xaa 16] - [Xaal7] - [Xaal8] - [Xaal9] - [Xaa20] - [Xaa21] (I)

式中，

XaaO是无， 或 1-3个氨基酸构成肽段；

Xaal是选自下组的氨基酸 He , Leu, Val， Met或 Ala;

Xaa2是选自下组的氨基酸 He , Leu, Val， Met或 Ala;

Xaa3是选自下组的氨基酸 Gly或 Ala;

Xaa4是选自下组的氨基酸 Lys或 Arg ;

Xaa5是选自下组的氨基酸 Gly或 Ala;

Xaa6是选自下组的氨基酸 Arg, Lys或 Gly;

Xaa7是选自下组的氨基酸 Ser或 Thr

Xaa8是选自下组的氨基酸 Tyr或 Phe

Xaa9是选自下组的氨基酸 Lys或 Arg

XaalO是选自下组的氨基酸 Gly或 Ala;

Xaal l是选自下组的氨基酸 Thr或 Ser _;

Xaal2是选自下组的氨基酸 Val， Leu , He , Met或 Ala;

Xaal3是选自下组的氨基酸 Ser或 Thr _;

Xaal4是选自下组的氨基酸 He , Leu , Val， Met或 Ala;

Xaal5是选自下组的氨基酸 Thr或 Ser _;

Xaal6是选自下组的氨基酸 Lys或 Arg ;

Xaal7是选自下组的氨基酸 Ser或 Thr _;

Xaal8是选自下组的氨基酸 Gly或 Ala;

Xaal9是选自下组的氨基酸 He , Leu , Val， Met或 Ala;

Xaa20是选自下组的氨基酸 Lys或 Arg ;

Xaa21是无， 或 1-3个氨基酸构成肽段；

并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性， 且所述多肽的长度为 20-26 个 在另一优选例中， 所述多肽的长度为 20-23个氨基酸。

在另一优选例中， XaaO和 /或 Xaa21是 1-3个氨基酸构成的肽段。 更佳地， XaaO为 C、 NC、 或 RNC; 和 /或乂3&21为（、 CQ或 CQP。

在另一优选例中， Xaal是选自下组的氨基酸： lie或 Leu;

Xaa2是选自下组的氨基酸： lie或 Leu;

Xaa3是选自下组的氨基酸： Gly或 Ala;

Xaa4是选自下组的氨基酸： Lys或 Arg;

Xaa5是选自下组的氨基酸： Gly或 Ala;

Xaa6是选自下组的氨基酸： Arg或 Lys;

Xaa7是选自下组的氨基酸： Ser或 Thr;

Xaa8是选自下组的氨基酸： Tyr或 Phe;

Xaa9是选自下组的氨基酸： Lys或 Arg;

XaalO是选自下组的氨基酸： Gly或 Ala;

Xaall是选自下组的氨基酸： Thr或 Ser;

Xaal2是选自下组的氨基酸： Val或 Leu;

Xaal3是选自下组的氨基酸： Ser或 Thr;

Xaal4是选自下组的氨基酸： lie或 Leu;

Xaal5是选自下组的氨基酸： Thr或 Ser;

Xaal6是选自下组的氨基酸： Lys或 Arg;

Xaal7是选自下组的氨基酸： Ser或 Thr;

Xaal8是选自下组的氨基酸： Gly或 Ala;

Xaal9是选自下组的氨基酸： lie或 Leu; 和 /或

Xaa20是选自下组的氨基酸： Lys或 Arg。

在另一优选例中， Xaa6为 Gly。

在另一优选例中， 所述多肽选自下组：

(a)具有 SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽；

(b)将 SEQ ID N0:1所示氨基酸序列经过 1-5个（较佳地 1-3， 更佳地 1-2 个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的� �且具有抑制血管新生功能的由（a) 衍生的多肽。

在另一优选例中， 所述的衍生多肽保留了 70%的 SEQ I画： 1的所示多肽 的抑制血管新生活性。 在另一优选例中， 所述的衍生多肽与 SEQ ID NO : 1的相同性 80%， 较佳地 90%; 更佳地 95%。

本发明还提供了抑制血管新生功能的、式 I化合物的二聚体和多聚体形式。 在本发明的第二方面， 提供了一种分离的核酸分子， 它编码本发明上述的 多肽。

在本发明的第三方面， 提供了一种药物组合物， 它含有：

(a) 本发明上述的多肽或其药学上可接受的盐； 和

(b) 药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中， 所述组合物的剂型为眼药水、 针剂（如眼周和眼内注射 液）、 眼用凝胶或眼药膏。

在另一优选例中， 所述的组合物为缓释剂型。

在本发明的第四方面， 提供了一种本发明所述多肽或药学上可接受的 盐的 用途， 它们被用于制备用于抑制血管新生或防治与血 管新生相关疾病的药物。

在另一优选例中， 所述的与血管新生相关疾病的选自下组： 新生血管性眼 病、 肿瘤、 缺血性心脏病、 非炎症性心肌病、 冠状动脉硬化、 闭塞性动脉硬化、 动脉栓塞、 动脉血栓、 Berger's 病、 慢性炎症、 炎症性肠病、 溃疡、 风湿性关 节炎、 硬皮症、 银屑病、 不育症或肉瘤状病等。

在另一优选例中， 所述的新生血管性眼病包括累及脉络膜、 视网膜、 角膜 或虹膜， 包括老年性黄斑变性、 增生性糖尿病视网膜病变、 视网膜血管阻断性 疾病、 早产儿视网膜病变、 角膜感染、 新生血管性青光眼等。

在本发明的第五方面， 提供了一种抑制哺乳动物血管新生的方法， 包括步 骤： 给需要的对象施用本发明所述的多肽或其药学 上可接受的盐。

在另一优选例中， 所述的对象是人。

在另一优选例中， 所述的血管新生是与新生血管性眼病相关的血 管新生。 附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案， 而不用于限定由权利要求书所 界定的本发明范围。

图 1显示了 MTS细胞增殖实验中各组 0D值均值。

对照组 (control)和 VEGF组差异有显著性 (P=0.001)， VEGF组和多肽组差 异有显著性 CP<0.001)， 加入 ΙΟηΜ, ΙΟΟηΜ, 1 μΜ， 10μΜ Η-ΚΙ20后的 OD值， 呈递减趋势。 星号表示该组与 VEGF 组之间差异具有统计学意义 (F=7.684， <0.001) c (con: H-KI20浓度； 1 : Ι ΟηΜ; 2 : ΙΟΟηΜ; 3： Ι μΜ; 4： 10μΜ)。

图 2显示了 Transwel l细胞迁移实验中 VEGF组和 VEGF+不同浓度多肽组通 过多孔膜的细胞数量（条柱图）以及 VEGF组和加不同浓度的 H-KI20组迁移过多 孔膜的细胞情况（彩色照片）。

在条柱图中可以看到， 多肽组较 VEGF 组细胞数目明显减少， 且随浓度增 加呈递减趋势。 组间差异具统计学意义（^=562. 3， 尸<0. 001)。 星号表示该组与 VEGF组之间差异具有统计学意义。 照片中透明的小圆孔为多孔膜的孔， 蓝紫色 的细胞是被苏木苏着染的通过小孔迁移过滤膜 的细胞。

图 3显示了内皮细胞体外管腔形成实验中空白对� �组、 VEGF组和 VEGF+不 同浓度多肽组每 100倍视野形成管腔的平均总长度（条柱图）， 以及空白对照组、 VEGF组和 VEGF+ΙΟμΜ H-KI20组的内皮细胞管腔形成情况（照片）。

在条柱图中可以看到， VEGF+多肽组较 VEGF组管腔形成总长度明显下降， 且随浓度增加呈递减趋势。 组间差异具统计学意义 9， 0. 001)。 星号 表示该组与 VEGF组之间差异具有统计学意义。 （con: H-KI20浓度； 1 : 10nM; 2： Ι ΟΟηΜ; 3： Ι μΜ; 4： 10μΜ)。

图 4显示了 PBS组和多肽组鸡胚尿囊膜（CAM)上血管生长情� �（彩色照片） 以及评估实验中各组 CAM血管计数情况（条柱图）。

照片中白色的圆片为滤纸片， 黑色的线圈划定的范围为血管计数范围， 橙 黄色的血管膜为鸡胚尿囊膜， 可以看到加有 10μ _§ /μ1 Η-ΚΙ20 的滤纸片周围的 血管数目显著少于 PBS组。条柱图中对照组为 PBS组，可以看到 5μ _§ /μ1 Η-ΚΙ20 组以及 10μ _§ /μ1 Η-ΚΙ20组血管数量较 PBS组显著下降， 且随浓度增加呈递减 趋势。 星号表示该组与对照组之间差异具有统计学意 义 762， O. OO D o 图 5是视网膜新生血管模型的视网膜铺片、 眼球切片照片以及对眼球切片 中新生血管管腔数目的统计结果（条柱图）。

在正常氧浓度下饲养的对照组幼鼠视网膜血管 发育良好， 未见无灌注区和 新生血管， 通过高氧环境诱导的视网膜新生血管模型组幼 鼠的视网膜铺片中央 可见大面积无灌注区以及新生血管团（椭圆圈 标示），经过玻璃体腔注射 H-KI20 干预后的视网膜新生血管模型组幼鼠的视网膜 铺片中新生血管团数目明显减 少。 从眼球切片中可以看到， 正常组视网膜前未见新生血管管腔， 视网膜新生 血管模型幼鼠的视网膜前可以看到较多新生血 管管腔（黑色箭头所示）， 经 H-KI20干预后这些新生血管管腔数目显著减少， 星号表示该组与 VEGF组之间 差异具有统计学意义（/^=79. 320， 尸<0. 001)。 （con: H-KI20浓度； 1 : 10mM _; 2： 50mM) o 具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究， 首次制备了一类源自肝细胞生长因子 (HGF)的、 具有抑制血管新生功能的， 分子量小于 5kD (如仅约 2kD)的小分子多 肽。 具体而言， 本发明人应用生物信息学的方法， 基于同源性分析和生物学特 性等分析， 设计了数个候选序列， 采用固相法将其合成后， 再经鸡胚尿囊膜血 管模型、 VEGF 诱导的细胞株增殖模型和缺氧诱导小鼠视网膜 新生血管模型筛 选， 获得了一类新型的、 具有预防和治疗血管新生功能的小分子多肽。

本发明的小肽的分子量小， 可透过各种眼组织屏障； 水溶性好， 能在中性 泪液、 房水和玻璃体液中保持较高的浓度； 安全性高， 对生物组织毒副作用小； 眼局部用药生物利用度高， 能穿透血眼屏障、 可减少剂量， 从而减小全身副作 用。 在此基础上完成了本发明。 活性多肽

在本发明中， 术语 "本发明多肽" 、 "H-KI20多肽" 、 "H-KI20小肽" 、 "短肽 H-KI20 "或 "肽 H-KI20 "可互换使用， 都指具有血管新生抑制活性的肽 H-KI20 氨基酸序列（SEQ ID N0 : 1)的蛋白或多肽。 此外， 所述术语还包括具有 抑制血管新生功能的、 SEQ ID NO: 1 序列的变异形式。 这些变异形式包括（但 并不限于）： 1-5个（通常为 1-4个， 较佳地 1-3个， 更佳地 1-2个， 最佳地 1 个）氨基酸的缺失、 插入和 /或取代， 以及在 C末端和 /或 N末端添加或缺失一 个或数个（通常为 5个以内， 较佳地为 3个以内， 更佳地为 2个以内）氨基酸。 例如， 在本领域中， 用性能相近或相似的氨基酸进行取代时， 通常不会改变蛋 白质的功能。 又比如， 在 C末端和 /或 N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通 常也不会改变蛋白质的结构和功能。 此外， 所述术语还包括单体和多聚体形式 本发明多肽。 该术语还包括线性以及非线性的多肽 (如环肽）。

本发明还包括 H-KI20多肽的活性片段、 衍生物和类似物。 如本文所用， 术 语 "片段" 、 "衍生物" 和 "类似物" 是指基本上保持抑制血管新生功能或活 性的多肽。 本发明的多肽片段、 衍生物或类似物可以是（i)有一个或多个保守� �� 非保守性氨基酸残基 (优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽， 或（i i)在一个或 多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽， 或（i i i) H-KI20 多肽与另一个化合物 (比如延长多肽半衰期的化合物， 例如聚乙二醇）融合所形成的多肽， 或（iv)附 加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多 肽（与前导序列、分泌序列或 6His 等标签序列融合而形成的然后蛋白）。 根据本文的教导， 这些片段、 衍生物和类 似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与式 I的氨基酸序列相比， 有至多 5个， 较佳地 至多 3个， 更佳地至多 2个， 最佳地 1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所 替换而形成多肽。 这些保守性变异多肽最好根据表 I进行氨基酸替换而产生。

表 I

发明还提供 H-KI20多肽的类似物。 这些类似物与天然 H-KI20多肽的差别 可以是氨基酸序列上的差异， 也可以是不影响序列的修饰形式上的差异， 或者 兼而有之。类似物还包括具有不同于天然 L-氨基酸的残基（如 D-氨基酸）的类似 物， 以及具有非天然存在的或合成的氨基酸（如 β、 Υ -氨基酸）的类似物。 应理 解， 本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多 肽。

修饰（通常不改变一级结构）形式包括： 体内或体外的多肽的化学衍生形式 如乙酰化或羧基化。 修饰还包括糖基化， 如那些在多肽的合成和加工中或进一 步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。 这种修饰可以通过将多肽暴露于 进行糖基化的酶（如哺乳动物的糖基化酶或去 糖基化酶）而完成。 修饰形式还包 括具有磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪氨酸， 磷酸丝氨酸， 磷酸苏氨酸）的序列。 还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或 优化了溶解性能的多肽。

本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受 的酸或碱衍生的盐形式使 用。 这些盐包括（但不限于）与如下酸形成的盐： 氢氯酸、 氢溴酸、 硫酸、 柠檬 酸、 酒石酸、 磷酸、 乳酸、 丙酮酸、 乙酸、 琥珀酸、 草酸、 富马酸、 马来酸、 草酰乙酸、 甲磺酸、 乙磺酸、 苯磺酸、 或羟乙磺酸。 其他盐包括： 与碱金属或 碱土金属（如钠、 钾、 钙或镁）形成的盐， 以及以酯、 氨基甲酸酯或其他常规的 "前体药物" 的形式。 编码序列

本发明还涉及编码 Η-ΚΙ20多肽的多核苷酸。 一种优选的编码序列是 atcattggta aaggacgcag ctacaaggga acagtatcta tcactaagag tggcatcaaa (SEQ ID NO : 3)， 它编码 SEQ ID NO : 1所示的氨基酸序列。

本发明的多核苷酸可以是匪形式或 RNA形式。 匪可以是编码链或非编 码链。 编码成熟多肽的编码区序列可以与 SEQ ID NO : 3所示的编码区序列相同 或者是简并的变异体。 如本文所用， 以 SEQ ID N0 : 1 为例， "简并的变异体" 在本发明中是指编码具有 SEQ ID N0 : 1序列的多肽， 但与 SEQ ID NO : 3中相应 编码区序列有差别的核酸序列。

本发明的 H-KI20核苷酸全长序列或其片段通常可以用 PCR扩增法、重组法 或人工合成的方法获得。 目前， 已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明 多肽（或其片段， 或其衍生物）的 DNA序列。 然后可将该 DNA序列引入本领域中 已知的各种现有的 DNA分子（或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体， 以及用本发明的载体或

H-KI20多肽编码序列经基因工程产生的宿主细 胞。 另一方面， 本发明还包括对 H-KI20 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性 的多克隆抗体和单克隆抗体， 尤其是单克隆抗体。 制备方法

本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发 明的多肽可以是化学合成的， 或重组的。 相应地， 本发明多肽可用常规方法人工合成， 也可用重组方法生产。

一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合 成技术，如 Boc固相法、 Fmoc 固相法或是两种方法联合使用。 固相合成可快速获得样品， 可根据目的肽的序 列特征选用适当的树脂载体及合成系统。 例如， Fmoc系统中优选的固相载体如 连接有肽中 C端氨基酸的 Wang树脂， Wang树脂结构为聚苯乙烯， 与氨基酸间 的手臂是 4-垸氧基苄醇； 用 25%六氢吡啶 /二甲基甲酰胺室温处理 20分钟， 以 除去 Fmoc保护基团， 并按照给定的氨基酸序列由 C端逐个向 N端延伸。 合成完 成后， 用含 4% 对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关 肽从树脂上切割 下来并除去保护基， 可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。 将所得产物的溶 液冻干后， 用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的 肽。 当使用 Boc系统 进行固相合成时， 优选树脂为连接有肽中 C端氨基酸的 PAM树脂， PAM树脂结 构为聚苯乙烯， 与氨基酸间的手臂是 4-羟甲基苯乙酰胺； 在 Boc合成系统中， 在去保护、 中和、 偶联的循环中， 用 TFA/二氯甲垸 (DCM)除去保护基团 Boc 并 用二异丙基乙胺 (DIEA/二氯甲垸中和。 肽链缩合完成后， 用含对甲苯酚（5-10%) 的氟化氢 (HF)，在 0°C下处理 1小时，将肽链从树脂上切下， 同时除去保护基团。 以 50-80%乙酸（含少量巯基乙醇）抽提肽，溶液冻 干后进一步用分子筛 S印 hadex G10或 Tsk-40f 分离纯化， 然后再经高压液相纯化得到所需的肽。 可以使用肽 化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联 各氨基酸残基， 例如可使用二环 己基碳二亚胺（DCC)，羟基苯骈三氮唑（HOBt)或 1， 1， 3, 3-四脲六氟磷酸酯（HBTU) 进行直接偶联。 对于合成得到的短肽， 其纯度与结构可用反相高效液相和质谱 分析进行确证。

在一优选例中，本发明多肽 H-KI20 ,按其序列，采用固相合成的方法制备， 行高效液相色谱纯化， 获得高纯度目的肽冻干粉， -2CTC贮存。

另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。 通过常规的重组 DNA技术， 可 利用本发明的多核苷酸可用来表达或生产重组 的 H-KI20多肽。一般来说有以下 步骤： (1) .用本发明的编码 H-KI20多肽的多核苷酸 (或变异体），或用含有该多核 苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细 胞；

(2) .在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3) .从培养基或细胞中分离、 纯化蛋白质。

重组多肽可在细胞内、 或在细胞膜上表达、 或分泌到细胞外。 如果需要， 可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种 分离方法分离和纯化重组的蛋白。 这些方法是本领域技术人员所熟知的。 这些方法的例子包括但并不限于： 常规 的复性处理、 用蛋白沉淀剂处理（盐析方法）、 离心、 渗透破菌、 超处理、 超离 心、 分子筛层析（凝胶过滤）、 吸附层析、 离子交换层析、 高效液相层析 (HPLC) 和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

由于本发明多肽较短， 因此可以考虑将多个多肽串联在一起， 重组表达后 获得多聚体形式的表达产物， 然后通过酶切等方法形成所需的小肽。 药物组合物和施用方法

另一方面， 本发明还提供了一种药物组合物， 它含有（a)安全有效量的本 发明多肽或其药学上可接受的盐； 以及（b)药学上可接受的载体或赋形剂。 本 发明多肽的数量通常为 10微克 -100毫克 /剂， 较佳地为 100-1000微克 /剂。

为了本发明的目的， 有效的剂量为给予个体约 0. 01毫克 /千克至 50毫克 / 千克， 较佳地 0. 05毫克 /千克至 10毫克 /千克体重的本发明多肽。 此外， 本发 明的多肽可以单用， 也可与其他治疗剂一起使用（如配制在同一药 物组合物 中）。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。 术语 "药学上可接受的载体" 指用于治疗剂给药的载体。 该术语指这样一些药剂载体： 它们本身不诱导产生 对接受该组合物的个体有害的抗体， 且给药后没有过分的毒性。 这些载体是本 领域普通技术人员所熟知的。在 Remington ' s Pharmaceut ical Sc i ences (Mack Pub. Co. , N. J. 1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充� ��讨论。 这类 载体包括（但并不限于）： 盐水、 缓冲液、 葡萄糖、 水、 甘油、 乙醇、 佐剂及其 组合。

治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液 体， 如水、 盐水、 甘油和乙 醇。 另外， 这些载体中还可能存在辅助性的物质， 如润湿剂或乳化剂、 pH缓冲 物质等。 通常， 可将治疗性组合物制成可注射剂， 例如液体溶液或悬液； 还可制成 在注射前适合配入溶液或悬液中、 液体载体的固体形式。

一旦配成本发明的组合物， 可将其通过常规途径进行给药，其中包括（但 并 不限于）： 眼表、 眼周、 眼内、 肌内、 静脉内、 皮下、 皮内或局部给药。 待预防 或治疗的对象可以是动物； 尤其是人。

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时， 可根据使用情况而采用各种不 同剂型的药物组合物。 较佳地， 可以例举的有眼药水、 针剂、 眼用凝胶和眼药 这些药物组合物可根据常规方法通过混合、 稀释或溶解而进行配制， 并且 偶尔添加合适的药物添加剂， 如赋形剂、 崩解剂、 粘合剂、 润滑剂、 稀释剂、 缓冲剂、 等渗剂（i sotonic i t i es 防腐剂、 润湿剂、 乳化剂、 分散剂、 稳定 剂和助溶剂， 而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。

例如， 眼药水的配制可这样进行： 将短肽 H-KI20 或其药学上可接受的盐 与基本物质一起溶解于无菌水（在无菌水中溶 解有表面活性剂）中， 调节渗透压 和酸碱度至生理状态， 并可任意地加入合适的药物添加剂如防腐剂、 稳定剂、 缓冲剂、 等渗剂、 抗氧化剂和增粘剂， 然后使其完全溶解。

本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。 例如， 短肽 H-KI20 或其盐 可被惨入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中 ， 然后将该药丸或微囊通过手术 植入待治疗的组织。 此外， 短肽 H-KI20 或其盐还可通过插入预先涂有药物的 眼内透镜而得以应用。 作为缓释聚合物的例子， 可例举的有乙烯 -乙烯基乙酸 酯共聚物、 聚羟基甲基丙烯酸酯（polyhydrometaacrylate 聚丙烯酰胺、 聚 乙烯吡咯垸酮、 甲基纤维素、 乳酸聚合物、 乳酸 -乙醇酸共聚物等， 较佳地可 例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和 乳酸-乙醇酸共聚物。

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时， 作为活性成分的短肽 H-KI20 或其药学上可接受的盐的剂量， 可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别 、 症状程度而合理地加以确定。例如，当局部滴 眼时，通常其浓度约为 0. l-10wt%, 较佳地 l-5wt%， 每日可 2-6次给药， 每次 1-2滴。 工业应用性

含有本发明多肽或其药学上可接受盐作为活性 成分的药物组合物， 对血管 新生有显著的抑制活性。 经动物试验证实， 本发明多肽不仅可以抑制鸡胚尿囊 膜的血管新生， 而且可以抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖、 迁移、 趋化及管 腔形成， 并且可抑制缺氧诱导的小鼠视网膜新生血管。 本发明的主要优点包括：

(a)本发明多肽的分子量小， 可透过眼组织屏障；

(b)水溶性好， 能在中性泪液、 房水和玻璃体液中保持较高的浓度；

(c)安全性高， 对生物组织毒副作用小； 并且眼局部用药生物利用度高， 可减少剂量， 从而减小全身副作用；

(d)可通过固相合成的方法制备， 纯度高， 产量大， 成本低；

(e)本发明多肽的稳定性好。

因此本发明多肽有望开发成药物， 用于治疗新生血管性眼病及相关的新生 血管性疾病， 如肿瘤新生血管等。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方 法， 通常按照常规条件如 Sambrook等人， 分子克隆： 实验室手册（New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或按照制造厂 商所建议的条件。 实施例 1

多肽的合成

以人 HGF氨基酸序列（SEQ ID N0 : 2)为基础， 经生物信息学分析和筛选后， 选择序列如下的四种 T-KI多肽（图 1)。

H-KI20 : I IGKGRSYKGTVSITKSGIK (SEQ ID N0 : 1； SEQ ID NO : 2中第 129-148 位）

H-KA: SEQ ID NO : 2中第 150- 176位；

H-KB : SEQ ID NO : 2中第 178- 188位；

H-KC : SEQ ID NO : 2中第 190- 200位；

步骤如下： 利用 SYMI¾0NY 型 12 通道多肽合成仪（美国 Protein Technologi es公司）， 根据其软件（Vers i on. 201版）计算和配制所需要的 Fmoc 保护氨基酸溶液，缩合试剂和切割试剂。编辑 程序，其中树脂溶涨时间为 30min; 脱保护两次， 时间分别为 5min和 15min; 缩合时间为 30min; 切割时间为 2h。 开机按照上述程序合成多肽， 采用高效液相色谱仪（SHIMADZU公司）纯化多肽� �� 获得纯度〉 95%的白色粉末状多肽（每种多肽各制得 120mg)， 冻干待用。

其中， H-KI20由 20个氨基酸残基组成， 分子量 2093. 52D， 不含半胱氨酸 残基和二硫键。 实施例 2 H-KI20多肽抑制 VEGF诱导的血管内皮细胞增殖

(1) 人脐静脉内皮细胞（Human umbi l ical vein endothel ial cel ls, HUVECs) 的体外培养

原代 HUVECs (购自 Sci enCell公司）采用 ECM培养基添加 ECGS (ScienCell公 司）以及 5%胎牛血清（ScienCell公司）， 培养于 37°C、 含 5%C0 ₂ 的培养箱中。 本发 明中所有体外细胞实验均采用第 3〜8代HUVECs细胞。

(2) MTS方法检测 H-KI系列多肽抑制 VEGF诱导的血管内皮细胞增殖

MTS细胞增殖定量检测方法是一种通过四氮唑和 电子偶联化合物在代谢旺 盛细胞线粒体脱氢酶的作用下， 产生水溶性有色产物， 作为检测信号来比色定 量测定活细胞增殖的方法。

具体实施方法如下： HUVECs生长接近融合后， 传代， 按照 3. 5 X 107ml的密 度接种于 96孔板， 每孔 100μ1， 37°C、 5%C0 ₂ 培养箱中培养 24h后， 更换无血清 ECM 培养基， 细胞饥饿过夜。 吸出 96孔板内培养基， 各组分别加入含有浓度为 1ηΜ、 10 nM、 100 ηΜ、 ΙμΜ 、 ΙΟμΜ Η-ΚΙ系列多肽药物的无血清培养基 50μ1， 37 °C 预处理 30min后， 各孔加入含有 VEGF (R&D公司）的无血清培养基， 使 VEGF的终浓 度为 10ng/ml。 另设空白对照组（无 VEGF无 H-KI多肽组）和 VEGF对照组（无 H-KI多 肽组）， 每个实验组设置 5个平行孔。 37 、 5%C0 ₂ 培养箱中继续培养 24h后， 各 孔中加入 20μ1 MTS溶液（Promega公司）， 37 °C作用 l-4h， 酶标仪（Bio-Rad公 司） 490nm检测各孔的吸光值。

研究结果： 与空白对照组（无 VEGF无 H-KI多肽组）相比， VEGF组各孔 0D值明 显增加， 并且差异具有统计学意义 ^法， 0. 01) ,表明 10ng/mlVEGF能够有 效剌激 HUVECs增殖。

与 VEGF组相比， H-KA和 H-KB多肽在高浓度时的 0D值较对照组略有下降， 但 仅在 H-KB高浓度时的 0D值与对照组相比有统计学意义的差异 ^法， 0. 05 ) , H-KC多肽在 1ηΜ-10μΜ浓度范围内， 各孔 0D值无明显改变， 差异不具有统计学意 义（Z6Y法， Ρ>0.05) ο Η-ΚΙ20组 100ηΜ、 1μΜ、 ΙΟμΜ 时各孔 0D值明显降低， 并 且差异具有统计学意义、LS ， P<0.01)，表明 H-KI20多肽在浓度为 100ηΜ、 1μΜ、 ΙΟμΜ 时能够有效抑制 VEGF诱导的 HUVECs增殖， 并且随着 H-KI20多肽浓度的增 力口， 抑制作用逐渐增强。

结论： H-KI20多肽能够有效抑制 VEGF诱导的血管内皮细胞增殖， 并且具有 良好的剂量依赖性和序列依赖性。 H-KA、 H-KB、 H-KC多肽不具有明显的抑制 VEGF 诱导的血管内皮细胞增殖作用。 实施例 3 MTS细胞增殖实验

将 RF/6A 细胞（猴脉络膜视网膜内皮细胞株， ATCC CRL— 1780)接种于 96 孔板（5X10 ⁴ 细胞 /孔）， RPMI1640培养基培养 24h后， 使细胞血清饥饿过夜， 实验组加入多肽（H-KI20)， 设置浓度梯度（依次为 ΙΟηΜ, ΙΟΟηΜ, 1μΜ， ΙΟμΜ)， 阳性对照组加入重组的人 VEGF ₁₆₅ 100ng/ml(rh-VEGF ₁₆₅ , Sigma, St. Louis, MO), 空白对照组不加任何试剂。 每组每个浓度做 6个复孔。 作用 24h后， 每孔加入 20μ1 MTS (3- (4， 5- dimethylthiazol- 2- yl) - 5- (3- carboxymethoxyphenyl) - 2- (4- sul phophenyl) - 2H- tetrazolium) assay (CellTiter 96 AQ； Promega, Madison, WI, USA) , 继续孵育 4h， 酶标仪 490nm下测量吸光度（0D值）。

结果： 24h时各组平均 0D值如下图 1所示， VEGF组的 0D值较空白组增高， 加入多肽 H-KI20后， 0D值出现回落， 且随多肽浓度升高而逐步下降， 0D值组 间差异具有统计学意义（ ^=7.684, 0.001,ANOVA)；空白组、 VEGF组、 VEGF+10nM H-KI20组、 VEGF+100nM H - KI20组、 VEGF+ΙμΜ H - KI20组、 VEGF+ΙΟμΜ H - KI20 组的 0D值分别为 0.461±0.026、 0.508±0.026、 0.477±0.029、 0.469±0.022、 0.436±0.010、 0.429±0.029， 各浓度组的 0D值随浓度增加而成下降趋势， 表 明 VEGF的促细胞增殖作用受到多肽抑制。

根据国外已发表文献， 在细胞增殖实验（接种浓度是 1.5X10 ⁴ 细胞 /ml)中，

HDF的 K1的抑制细胞增殖活性随浓度增加最快的范围� �� 57nM --- 116nM, 活性增 加缓慢的浓度范围是 116 nM -— 925 nM， 之后随浓度继续增加， 活性无明显改 变。

与之相比，在本实施例的细胞增殖实验中，所 用 H-KI20浓度从 ΙΟηΜ, ΙΟΟηΜ, ΙμΜ到 10μΜ时， 抑制细胞增殖活性增加明显。 另外， 本实施例中的接种浓度更 高（5X10 ⁵ 细胞 /ml)， 因此多肽 H-KI20抑制增殖活性远高于 Kl。 实施例 4 H-KI20多肽抑制内皮细胞迁移

将含有 100 ng/ml rhVEGF ₁₆₅ 的无血清 RPMI1640培养基加入 24孔板下室， 将 RF/6A细胞加入上室（Transwell小室， 多孔膜孔径 8μπι， Corning公司）， 细 胞浓度为 4X10 ⁶ 细胞 /ml， 实验组在上室中另加入多肽 H-KI20, 设置浓度梯度： ΙΟηΜ, ΙΟΟηΜ, ΙμΜ, 对照组上室中不加多肽，另设置空白对照组（ 上室为细胞悬 液， 下室为不含 rhVEGF ₁₆₅ 的无血清培养基）。 每个多肽浓度做两个复孔。 37°C 5%C0 ₂ 培养箱中培养 24h。 棉棒擦去 Transwell小室滤膜上方细胞， 4%多聚甲醛 固定 20min， 苏木素染色， 自来水清洗， 揭下滤膜， 封片。 显微镜下每张膜随 机选取 5个视野（200倍）， 计数细胞。 实验重复 3次。

RF/6A细胞的迁移能力通过计数迁移过 Transwell小室多孔膜的细胞数来 检测， 在这一实验中， 细胞从上室通过多孔滤膜向 VEGF浓度高的方向（下室）迁 移。 在本实验中， 通过向上室中加入多肽， 抑制细胞向下室迁移。

结果如图 2所示， 随多肽浓度的增加， 迁移的细胞数逐渐减少， VEGF组、 VEGF+lOnM H- KI20组、 VEGF+100nM H- KI20组、 VEGF+ΙμΜ H- KI20组迁移细胞平 均数目依次为 76.333±5.354、 43.333±3.670、 16.500±1.517、 1.833±1.169， 组间差异具有统计学意义 3， P<0.001, AN0VA) ₀ 这说明本发明的 H-KI20 多肽可以显著地抑制内皮细胞迁移。 实施例 5 H-KI20多肽抑制内皮细胞体外管腔形成

血管内皮细胞管腔形成实验采用 Matrigel(BD公司）联合 VEGF诱导管腔形 成方法。

具体实施方法如下： 将 96 孔板用基质胶包被（growth factor-reduced Matrigel , BD Biosciences , 美国）。 多肽组 RF/6A 细胞与不同浓度的 Η-ΚΙ20(10ηΜ, ΙΟΟηΜ, 1μΜ， 10μΜ)预处理 30分钟后， 接种至包被过基质胶的 96孔板内， 细胞浓度 4.5X10 ⁵ 细胞 /ml。 并加入 100ng/mlVEGF。 另设立空白对 照组（不含 VEGF和多肽）、 VEGF对照组（仅含 VEGF)。 每组每个浓度设立 3个复 孔。 37 °C 5% C0 ₂ 培养箱中培养 6h。 倒置相差显微镜（Olympus, 日本）下观察并 拍照。 每孔随机取 3个视野（100倍）。 采用 Image-Pro Plus 图像分析软件（版 本 5.1， Media Cybernetics公司， 美国）统计每视野下形成管腔的总长度。 实 验重复 3次。 结果如图 3所示。 lOOng/mlVEGF显著剌激 RF/6A细胞体外管腔形成。 加入浓 度逐渐升高的 H-KI20后， RF/6A细胞体外管腔形成总长度逐渐下降， 表明管腔 形成逐渐受到抑制， 当 H-KI20浓度为 ΙΟμΜ时， 管腔形成几乎完全被抑制。 空白 组、 VEGF组、 VEGF+lOnM H - KI20组、 VEGF+lOOnM H - KI20组、 VEGF+ΙμΜ H - KI20 组、 VEGF+1(^MH-KI20管腔形成平均总长度依次为 11.31±1.59 mm, 23.47±1.18 mm, 15.66±2.01 mm, 15.11±0.55 mm, 10.29±0.92 mm, 3.78±0.65mm， 组 间差异具有统计学意义（ =294.9， P<0.001, AN0VA)。

该实验结果说明： H-KI20具有抑制血管内皮细胞体外管腔形成的能 力， 并 且具有浓度依赖性。 实施例 6 H-KI20多肽抑制体内鸡胚尿囊膜新生血管

本实施例采用体内鸡胚尿囊膜（CAM)实验进一� �证实 H-KI20多肽抑制体内 新生血管的作用。

将 5μ1多肽（实验组， 设置浓度梯度 25μ _§ /5μ1，50μ _§ /5μ1)或 PBS (对照组） 在超净工作台上加至直径 5mm 的滤纸片（Whatman quantitative filter papers, Sigma)上并晾干。 将受精种蛋清洗消毒后放入孵箱， 每日翻动， 至胚 龄第 6日时， 将种蛋开窗， 并将滤纸片放置于鸡胚尿囊膜上微血管相对稀 少的 大血管之间， 密封开窗口并孵育 48小时， 显微镜下计数滤纸片周围 2.5mm距 离的范围内 3-5级血管的数目， 每组每个浓度设置 10只种蛋， 统计比较组间 差异。

鸡胚尿囊膜（CAM)评估实验是一种评估影响血� �生成的小分子物质活性的 稳定模型， 将含或不含多肽的滤纸片放置于 CAM上， 孵育 48h后拍照计数滤纸片 周围小血管数目。

结果如图 4所示。 PBS组、 5μ _§ /μ1 Η-ΚΙ20组， 10μ _§ /μ1 Η-ΚΙ20组血管数目依 次为 79.430±9.829、 48.380±7.308、 27.000±9.407。 Η-ΚΙ20多肽组血管数目 显著低于对照组， 且随多肽浓度增高， 血管数目渐降。 组间差异具有统计学意 义（ =54.762, Ρ<0.001, AN0VA)。

上述研究表明： Η-ΚΙ20多肽能够明显抑制鸡胚尿囊膜毛细血管 的生长， 并 且随着 Η-ΚΙ20多肽剂量的增加， 抑制新生血管的作用增强， 具有良好的剂量依 赖性。 实施例 7 H-KI20多肽抑制视网膜新生血管的生成

选择鼠龄 7天的健康 C57BL / 6J幼鼠 5窝， 每窝 7-9只（由中国科学院上 海实验动物中心提供）。 分成 5组， 每窝为一组。 组 1 : 正常对照组， 与哺乳母 鼠一起在正常空气环境下饲养； 组 2 : 氧诱导的视网膜新生血管模型组， 组 3: PBS注射组； 组 4与组 5为经多肽干预的氧诱导的视网膜新生血管模� �组， 组 2-5与哺乳母鼠一起置于 75 ± 2%高氧环境下饲养 5天， 期间用测氧仪持续监测 容器内的氧分压。 然后回到正常空气环境下饲养 5天以诱导视网膜新生血管的 生成。 在结束高氧环境饲养的当天， 向组 2 (PBS组）和组 3、 4 (多肽组）的幼鼠 左眼行玻璃体腔分别注射 PBS和 H-KI20 (10mM或 50mM)， 每只眼注射 1μ1。 在 鼠龄 17天时将各组幼鼠麻醉后行心腔灌注 4%多聚甲醛， 取出眼球固定， 部分 眼球用作视网膜铺片以及 Alexa Fluor 568 conjugated i solect in B4 (Molecular Probes公司）染色以显示视网膜血管， 在正置荧光显微镜下拍照用 作定性分析； 部分眼球用作石蜡切片苏木素伊红染色， 在光学显微镜下拍照并 统计每张切片中新生血管管腔（定义为生长于 视网膜内界膜之前、 位于玻璃体 腔面的血管腔）的数目。 统计分析并比较组间差异。

结果如图 5所示。 通过对视网膜铺片的定性分析发现， 氧诱导的视网膜新 生血管模型组较正常环境饲养的对照组有大面 积无灌注区以及团状的视网膜 新生血管出现（如椭圆圈所示）， 注射 PBS后无明显变化， 而经 H-KI20玻璃体腔 注射治疗后， 新生血管团显著减少。 H-KI20治疗组眼球切片中新生血管腔数目 较未治疗组明显减少（如箭头所示）， 柱状图提示各组的新生血管管腔数目统计 结果， 组间差异具有统计学意义 320， P<0. 001, AN0VA)。

本实验表明： H-KI20能显著抑制氧诱导的视网膜新生血管的生 成， 并且随 着多肽剂量的增加， 抑制新生血管作用增强， 表明 H-KI20具有良好的抑制体内 新生血管的作用。 实施例 7

眼药水的制备

利用常规技术， 混合以下组分， 制得 1%眼药水， 其配方如下：

H-KI20多肽 10 mg

羟丙基甲基纤维素 0. 03g

无菌水 加至 10 ml 调节渗透压至 3000sm， 酸碱度（pH)至 6. 8-7. 1。

经 5位志愿者试用一周， 每日 3次， 每次 1滴 /眼。 结果表明该眼药水可 抑制眼部的血管新生。 实施例 8

衍生多肽的制备和活性

制备了以下数种衍生多肽， 并按实施例 2所示的方法，

多肽对 VEGF诱导的血管内皮细胞 HUVEC的增殖的抑制作用。

衍生多肽 1 : 序列同 SEQ ID NO 1， 其中第 6位 Arg被 Gly替换

衍生多肽 2 : 序列同 SEQ ID NO 1， 其中第 2位 l ie被 Leu替换； 衍生多肽 3 : 序列同 SEQ ID NO 1， 其中第 15位 Thr被 Ser替换； 衍生多肽 4: 序列同 SEQ ID NO 1， 其中第 4位 Lys被 Arg替换； 衍生多肽 5 : 序列同 SEQ ID NO 1， 其中第 18位 Gly被 Ala替换； 衍生多肽 6 : 序列同 SEQ ID NO 1， 其中在 N端的第 1位之前添加 Cys ; 衍生多肽 7 : 序列同 SEQ ID NO ： 1， 其中在 C端的第 20位之后添加 CQP 结果表明， 上述衍生多肽 1-7的处理组（ΙΟΟηΜ)中， HUVEC细胞增殖显著受 到抑制。 综上所述， 本发明的 H-KI20 及其衍生多肽均显示良好的抗小鼠角膜病理 性新生血管、 抗小鼠视网膜病理性新生血管， 以及在体外抑制血管内皮细胞增 殖、 迁移、 趋化及管腔形成的作用。 因此， 具有广泛的应用前景。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作 为参考， 就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修 改， 这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。