Gegenstand der Erfindung sind Polypeptide mit IL- 16- Aktivität, Verfahren zu ihrer Herstel¬ lung und ihre Verwendung

LL-16 (Interleukin- 16) ist ein Lymphokin, welches auch als "lymphocyte chemoattracting factor" (LCF) oder "immunodeficiency virus suppressing lymphokine" (ISL) bezeichnet wird. IL-16 und seine Eigenschaften sind in der WO 94/28134, der WO 96/31607 sowie von Cruikshank, W W , et al , Proc Natl Acad. Sei USA 91 (1994) 5109-51 13 und von Baier, M , et al., Nature 378 (1995) 563 beschrieben. Dort ist auch die rekombinante Herstellung von IL-16 beschrieben. Danach ist IL-16 ein Protein mit einer molekularen Masse von 13,385 D. Von Cruikshank wurde ebenfalls gefunden, daß ISL in einer Molekularsieb¬ chromatographie als multimere Form mit einem Molekulargewicht von 50-60 bzw. 55-60 kD eluiert Dieser multimeren Form, welche ein kationisches Homotetramer ist (Produktinformation AMS Biotechnology Ltd., Europe, Cat. No. 11177186), wird die "chemoattraetant activity" zugeschrieben Von Baier wird eine homodimere Form von IL-16 mit einem Molekulargewicht von 28 kD beschrieben Die von Cruikshank et al in J Immunol 146 (1991) 2928-2934 beschriebene "chemoattraetant activity" und die von Baier beschrie¬ bene Aktivität von rekombinantem humanem LL-16 sind jedoch sehr gering

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Aktivität von LL-16 zu verbessern und LL-16- Formen bereitzustellen, die geringe Immunogenitat zeigen und vorteilhaft für eine therapeuti¬ sche Anwendung geeignet sind.

Die Aufgabe der Erfindung wird gelost durch eine Nukleinsäure, mit welcher die Expression eines Polypeptids mit Interleukin- 16- Aktivität in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle erreicht werden kann, wobei die genannte Nukleinsäure im für das genannte Poly¬ peptid codierenden Bereich

a) der DNA-Sequenz Nukleotide 54-1175 aus SEQ LD NO 1 oder ihrem komple¬ mentären Strang entspricht,

b) mit der DNA der Sequenz Nukleotide 54-785 aus SEQ LD NO 1 unter stringenten Bedingungen hybridisiert, c) mit der DNA der Sequenz Nukleotide 786- 1175 aus SEQ LD NO.1 unter stringen¬ ten Bedingungen hybridisiert und am 5'-Ende mit den Nukleotiden 756-785 aus SEQ LD NO:l oder einem Teil davon beginnt, der für einen Teil der Sequenz Aminosäure 235-244 aus SEQ LD NO. l codiert, oder d) eine Nukleinsäuresequenz ist, die ohne die Degeneration des genetischen Codes mit den durch a) oder b) definierten Nukleinsäuresequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisieren wurde

In einer bevorzugten Ausführungsform hybridisiert die Nukleinsäure, welche durch b) definiert ist, zusätzlich noch unter stringenten Bedingungen mit der DNA der Nukleotide 786-1 175 aus SEQ LD NO: l.

Vorzugsweise codiert eine solche Nukleinsäure ein Polypeptid mit verbesserter LL-16- Aktivi¬ tät, besonders bevorzugt verbessertes natürliches LL-16 von Primaten, wie humanes LL-16 oder LL-16 einer Affenart oder eines anderen Säugetiers, wie z.B Maus.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß LL-16-Formen mit einer gegenüber den in der WO 94/28134 beschriebenen LL-16 N-terminal verlängerten Sequenz nach wie vor aktiv sind. Solche LL-16-Formen zeigen aufgrund einer verlängerten Halbwertszeit sogar eine erhöhte Aktivität in vivo.

Fig. 2 der WO 94/28134 beschreibt nicht die korrekte Sequenz von LL-16. Das Startcodon "ATG" beginnt nicht mit Nukleotid 783, sondern mit Nukleotid 54. Dieser Leserahmen ergibt sich, wenn nach Nukleotid 156 ein A, nach Nukleotid 398 ein C und nach Nukleotid 780 ein G eingefügt wird. Der korrekte Leserahmen ist in SEQ LD NO:l gezeigt. Diese Sequenz zeigt noch weitere Unterschiede zu Fig. 2 der WO 94/28134. Dabei handelt es sich allerdings nur um Nukleotidaustausche (z.B. 313 G in A, 717 C in A). Die erfindungsgemäße Nukleinsäure codiert auch für ein Polypeptid, welches bei seiner Herstellung prozessiert werden kann. Ein solches Polypeptid, welches damit gegenüber dem aus der WO 94/28134 bekannten LL-16 verlängert ist, zeigt eine verbesserte Aktivität. Monomeres LL-16 mit verbesserter Aktivität besitzt ein Molekulargewicht von 13,9-39 kD, vorzugsweise ca. 15-35 kD, und ist damit etwa bis zu dreimal so groß wie das in der WO 94/28134 beschriebene C-terminale LL-16-Frag- ment

LL-16 kann sich in seiner Sequenz von den von solchen DNA-Sequenzen codierten Protein¬ sequenzen in gewissem Umfang unterscheiden Solche Sequenzvariationen von LL-16 Muteinen können Aminosaureaustausche, -deletionen oder -additionen sein Vorzugsweise ist die Aminosauresequenz von LL-16 jedoch zu wenigstens 75%, besonders bevorzugt zu wenig¬ stens 90% identisch mit der Aminosauresequenz von SEQ LD NO 1 Varianten von Teilen der Amino- und Nukleinsäuresequenz SEQ LD NO 1 / SEQ ID NO.2 sind beispielsweise in der internationalen Anmeldung WO 96/31607 und der deutschen Patentanmeldung 195 47 933 5 beschrieben

Besonders bevorzugte IL-16 Muteine mit verbesserter Aktivität beginnen am N-Terminus mit den Aminosäuren 235-244 aus SEQ LD NO.1/2 bzw einem Teil davon Besonders bevorzugte N-Termini sind in SEQ LD NO 3-12 beschrieben

In einer bevorzugten Ausführungsform können die LL-Muteine mit verbesserter Aktivität am C-Terminus um vorzugsweise 1-20 Aminosäuren verkürzt sein.

Unter Nukleinsäuren im Sinne der Erfindung sind beispielsweise DNA, RNA und Nuklein- saurederivate und -Analoga zu verstehen. Bevorzugte Nukleinsaure-Analoga sind solche Ver¬ bindungen, bei denen das Zuckerphosphatgerust durch andere Einheiten, wie z B Amino¬ säuren, ersetzt ist Solche Verbindungen werden als PNA bezeichnet und sind in der WO 92/20702 beschrieben Da beispielsweise PNA-DNA-Bindungen stärker als DNA-DNA- Bindungen sind, sind die oben beschriebenen stringenten Bedingungen für PNA-DNA-Hybri- disierung nicht anwendbar Geeignete Hybridisierungsbedingungen sind jedoch in der WO 92/20703 beschrieben

Unter dem Ausdruck "IL-16" ist im Sinne der Erfindung ein Polypeptid mit der Aktivität von LL-16 oder vorzugsweise mit einer verbesserten Aktivität zu verstehen Vorzugsweise zeigt LL-16 in dem in der internationalen Anmeldung WO 96/31607 beschriebenen Testverfahren die genannte Wirkung oder stimuliert die Zellteilung gemäß WO 94/28134

LL-16 bindet an CD4 ⁺ Lymphozyten und kann die Replikation von Viren, wie beispielsweise HIV-1, HIV-2 und SIV supprimieren Die Funktion von LL-16 ist nicht durch seine Präsenta¬ tion im MHC-Komplex limitiert.

Insbesondere zeigt LL-16 eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften:

Bindung an T-Zeüen über den CD4-Rezeptor,

Stimulierung der Expression von LL-2-Rezeptor und/oder HLA-DR-Antigen auf CD4 ⁺ -Lymphozyten,

- Stimulierung der Proliferation von T-Helferzellen in Gegenwart von LL-2,

- Suppression der Proliferation von mit Anti-CD3-Antikörpern stimulierten T- Helferzellen,

Suppression der Replikation von Viren, vorzugsweise von HTV-1, HLV-2 oder SIV.

Der Ausdruck "unter stringenten Bedingungen hybridisieren" bedeutet, daß zwei Nukleinsäu- refragmente unter standardisierten Hybridisierungsbedingungen miteinander hybridisieren, wie beispielsweise beschrieben in Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA. Solche Bedingungen sind beispielsweise Hybridisierung in 6,0 x SSC bei etwa 45°C, gefolgt durch einen Waschschritt bei 2 x SSC bei 50°C. Zur Auswahl der Stringenz kann die Salzkonzentration im Waschschritt beispielsweise zwischen 2,0 x SSC bei 50°C für geringe Stringenz und 0,2 x SSC bei 50° für hohe Stringenz gewählt werden. Zusätzlich kann die Temperatur des im Waschschritt zwischen Raumtemperatur, ca. 22°C, für geringe Strin¬ genz und 65°C bei hoher Stringenz variiert werden.

LL-16 wird vorzugsweise rekombinant in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen hergestellt. Derartige Herstellverfahren sind beispielsweise beschrieben in WO 94/28134 und WO 96/31607, die auch hierfür Gegenstand der Offenbarung der vorliegenden Erfindung sind. Um allerdings die erfindungsgemäßen Formen von LL-16 durch rekombinante Herstellung definiert und reproduzierbar zu erhalten, müssen über die dem Fachmann geläufigen Verfahren zur rekombinanten Herstellung zusätzliche Maßnahmen ergriffen werden.

Die Herstellung von rekombinantem LL-16 kann nach den dem Fachmann geläufigen Metho¬ den erfolgen. Dazu wird zunächst eine DNA hergestellt, welche in der Lage ist, ein Protein zu produzieren, welches die Aktivität von LL-16 besitzt. Die DNA wird in einen Vektor kloniert, der in eine Wirtszelle transferiert werden kann und dort replizierbar ist. Ein derartiger Vektor enthält zusätzlich zur LL-16-Sequenz Operator-Elemente, die zur Expression der DNA- Sequenz erforderlich sind. Dieser Vektor, der die LL-16-Sequenz und die Operator-Eiemente enthält, wird in einen Vektor transferiert, der in der Lage ist, die DNA von LL-16 zu exprimie-

ren. Die Wirtszelle wird unter Bedingungen, die zur Amplifikation des Vektors geeignet sind, kultiviert und LL-16 gewonnen. Dabei wird durch geeignete Maßnahmen sichergestellt, daß das Protein eine aktive tertiäre Struktur einnehmen kann, in der es LL-16-Eigenschaften zeigt

Dabei ist es nicht erforderlich, daß das exprimierte Protein die exakte LL-16- Aminosaurese¬ quenz aus SEQ LD NO: l enthält. Ebenso geeignet sind Proteine, welche im wesentlichen die gleiche Sequenz enthalten und analoge Eigenschaften zeigen Insbesondere geeignet sind Pro¬ teine, die N-terminal Aminosäuren deletiert haben

Auch die Nukleinsäuresequenz des Proteins kann modifiziert sein Derartige Modifikationen sind beispielsweise.

- Veränderung der Nukleinsäure, um verschiedene Erkennungssequenzen von Restriktionsenzymen zur Erleichterung der Schritte der Ligation, Klonierung und Mutagenese einzuführen

- Veränderung der Nukleinsäure zum Einbau von bevorzugten Codons für die Wirtszelle

- Ergänzung der Nukleinsäure um zusatzliche Operator-Elemente, um die Expressi¬ on in der Wirtszelle zu optimieren

Die Expression des Proteins erfolgt vorzugsweise in Mikroorganismen, insbesondere in Pro- karyonten, und dort in E coli

Die Expressionsvektoren müssen einen Promotor enthalten, der die Expression des Proteins im Wirtsorganismus erlaubt. Derartige Promotoren sind dem Fachmann bekannt und sind bei¬ spielsweise lac Promotor (Chang et al., Nature 198 (1977) 1056), trp Promotor (Goeddel et al., Nuc. Acids Res. 8 (1980) 4057), λ _PL Promotor (Shimatake et al , Nature 292 (1981) 128) und T5 Promotor (US-Patent Nr. 4,689,406). Ebenfalls geeignet sind synthetische Promoto¬ ren wie beispielsweise tac Promotor (US-Patent Nr 4,551,433) Ebenso geeignet sind ge¬ koppelte Promotorsysteme wie beispielsweise T7-RNA-Polymerase/Promotorsystem (Studier et al , J Mol. Biol. 189 (1986) 113). Ebenso geeignet sind hybride Promotoren aus einem Bacteriophagen-Promotor und der Operator-Region des Mikroorganismus (EP-A 0 267 851). Zusatzlich zum Promotor ist eine effektive Ribosomenbindungsstelle erforderlich Für E. coli wird diese Ribosomenbindungsstelle als Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz bezeichnet (Sambrook

et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual

(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA).

Zur Verbesserung der Expression ist es möglich, das Protein als Fusionsprotein zu exprimie- ren. In diesem Fall wird üblicherweise eine DNA-Sequenz, welche für den N-terminalen Teil eines endogenen bakteriellen Proteins oder ein anderes stabiles Protein codiert, an das 5'-Ende der für LL-16 codierenden Sequenz fusioniert. Beispiele hierfür sind beispielsweise lacZ (Phillips and Silhavy, Nature 344 (1990) 882-884), trpE (Yansura, Meth. Enzymol. 185

(1990) 161 - 166).

Nach Expression des Vektors, vorzugsweise eines biologisch funktionellen Plasmids oder eines viralen Vektors, werden die Fusionsproteine vorzugsweise mit Enzymen gespalten (Carter P. in Ladisch, M.R. et al. eds., Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large-Scale Processes, ACS Symposium Series No. 427, American Chemical Society (1990) 181-193). Beispiele für Spaltstellen sind die IgA-Protease-Spaltstelle (WO 91/11520, EP-A 0 495 398), die Ubiquitin-Spaltstelle (Miller et al., Bio/Technology 7 (1989) 698), die Enterokinase-Spaltstelle (Maroux et al., J. Biol. Chem. 241 (1971) 5031) und die Faktor-Xa- Spaltstelle (Nagai et al., Nature 309 (1984) 810).

Die auf diese Weise in Bakterien exprimierten Proteine werden durch Aufschluß der Bakterien und Proteinisolierung in üblicher Weise gewonnen.

In einer weiteren Ausführungsform ist es möglich, die Proteine als aktive Proteine aus den Mikroorganismen zu sezernieren. Hierzu wird vorzugsweise ein Fusionsprodukt verwendet, welches aus der Signalsequenz, die für die Sekretion von Proteinen in den verwendeten Wirts¬ organismen geeignet ist, und der Nukleinsäure, welche für das Protein codiert, besteht. Das Protein wird dabei entweder in das Medium (bei grampositiven Bakterien) oder in den peri- plasmatischen Raum (bei gramnegativen Bakterien) sezerniert. Zwischen der Signalsequenz und der für LL-16 codierenden Sequenz ist zweckmäßig eine Spaltstelle angebracht, die ent¬ weder bei der Prozessierung oder in einem zusätzlichen Schritt die Abspaltung des Proteins erlaubt. Derartige Signalsequenzen stammen beispielsweise von ompA (Ghrayeb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437), phoA (Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82 (1985) 7212).

Zusätzlich enthalten die Vektoren noch Terminatoren. Terminatoren sind DNA-Sequenzen, die das Ende eines Transkriptionsvorganges signalisieren. Sie zeichnen sich meist durch zwei strukturelle Eigenarten aus: eine umgekehrt repetitive G/C-reiche Region, die intramolekular

eine Doppelhelix bilden kann, sowie eine Anzahl von U(bzw T)-Resten Beispiele sind der Haupt-Terminator in der DNA des Phagen fd (Beck und Zink, Gene 16 (1981) 35-58) sowie rrnB (Brosius et al , J Mol Biol 148 (1981) 107 - 127)

Zusatzlich enthalten die Expressionsvektoren üblicherweise einen selektierbaren Marker, um transformierte Zellen zu selektieren Derartige selektierbare Marker sind beispielsweise die Resistenzgene für Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin, Neomycin und Tetracyclin (Davies et al , Ann Rev Microbiol 32 (1978) 469) Ebenso geeignete selektier¬ bare Marker sind die Gene für essentielle Substanzen der Biosynthese von für die Zelle not¬ wendigen Stoffen wie z B Histidin, Tryptophan und Leucin

Es sind eine Vielzahl von geeigneten baktenellen Vektoren bekannt Beispielsweise sind für die folgenden Bakterien Vektoren beschrieben Bacillus subtilis (Palva et al , Proc Natl Acad Sei USA 79 (1982) 5582), E coli (Aman et al , Gene 40 (1985) 183, Studier et al , J Mol Biol 189 (1986) 1 13), Streptococcus cremoris (Powell et al , Appl Environ Microbiol 54 (1988) 655), Streptococcus lividans und Streptomyces lividans (US-Patent Nr 4,747,056)

Weitere gentechnologische Verfahren zur Herstellung und Expression von geeigneten Vekto¬ ren sind in J Sambrook et al , Molecular Cloning a laboratory manual (1989), Cold Spπng Harbor Laboratory Press, New York, N Y beschrieben

Eine Expression von rekombinanter LL-16 ist außer in prokaryontischen Mikroorganismen auch in Eukaryonten (wie beispielsweise CHO-Zellen, Hefe oder Insektenzellen) möglich Als eukaryonti sches Expressionssystem wird das Hefesystem oder Insektenzellen bevorzugt Die Expression in Hefe kann über drei Arten von Hefevektoren (integrierende YIp (yeast integra- ting plasmids)- Vektoren, replizierende YRp (yeast replicon plasmids)- Vektoren und episomale YEp (yeast episomal plasmids)- Vektoren erfolgen Näheres hierzu ist beispielsweise in S M Kingsman et al, Tibtech 5 (1987) 53-57 beschrieben

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine prokaryontische oder eukaryonti sehe Wirts¬ zelle, welche mit einer Nukleinsäure, welche für ein erfindungsgemaßes LL-16-Polypeptιd codiert, so transformiert oder transfiziert ist, daß die Wirtszelle das genannte Polypeptid exprimiert Eine solche Wirtszelle enthalt üblicherweise einen biologisch funktionellen Nukleinsaurevektor, vorzugsweise einen DNA- Vektor, eine Plasmid-DNA welche diese Nukleinsäure enthalt

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist humanes Interleukin- 16 oder Interleukin- 16 aus Primaten, vorzugsweise humanes LL-16 mit verbesserter Aktivität, wie es als Produkt einer prokaryontischen oder eukaryontischen Expression im wesentlichen frei von anderen Human¬ proteinen erhältlich ist. LL-16 ist ein Protein, welches monomer oder als Multimer bestehend aus monomerem LL-16 (im weiteren auch ais Untereinheiten bezeichnet) vorkommt. Das Molekulargewicht einer monomeren LL-16-Untereinheit beträgt vorzugsweise 13,9-39 kD, besonders bevorzugt 15-35 kD. Weiter bevorzugt ist ein monomeres LL-16-Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 15-30 kD, welches nicht in weitere Untereinheiten aufspaltbar ist.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß die in der WO 94/28134 beschriebene Nuklein¬ säure und Proteinsequenz von LL-16 nicht den natürlichen humanen Sequenzen entsprechen. Es handelt sich hier lediglich um ein LL-16-Fragment mit nicht-natürlichem N-Terminus. Für eine therapeutische Anwendung ist es jedoch bevorzugt, ein Protein zu verwenden, welches entweder mit dem natürlichen Protein identisch ist oder sich vom natürlichen Protein nur geringfügig unterscheidet und/oder mindestens vergleichbare, vorzugsweise verbesserte Akti¬ vität und Immunogenität zeigt. Überraschenderweise wurde gefunden, daß natürliches unpro- zessiertes bzw. noch nicht sekretiertes LL-16 entgegen der bisherigen Annahme ein größeres Protein mit einem Molekulargewicht von 13,9-39 kD ist. Seine Sequenz ist in den Sequenz¬ protokollen enthalten.

Die Nukleinsäuresequenz von LL-16 kann im Rahmen der Erfindung Deletionen, Mutationen und Additionen erhalten. Vorzugsweise ist ein Teil des 5'-Endes in der Größenordnung von 20-240, vorzugsweise 20-90 Codons, vorzugsweise 20-50 Codons, besonders bevorzugt ca. 35, 75, 234, 237 oder 239 Codons deletiert. Ein von einer solchen Nukleinsäure codiertes LL-16 (monomere Form, Untereinheit) hat dann ein Molekulargewicht von ca. 13,9-39 kD. Diese monomere Form von LL-16 kann in einer bevorzugten Ausführungsform multimerisiert sein. Dadurch kann die Aktivität von IL-16 gesteigert werden. Vorzugsweise sind solche mul- timeren Formen dimere, tetramere oder oktamere Formen.

In einer weiteren Ausführungsform können die Polypeptide der Erfindung zusätzlich einen definierten Gehalt an Metallionen enthalten, wobei die Anzahl der Metallionen pro Unterein¬ heit vorzugsweise 0,5 bis 2 beträgt.

Als Metallionen im Sinne der Erfindung, die bei der Herstellung der multimeren Formen von LL-16 in definierter Menge zugesetzt werden, sind eine Vielzahl von Metaliionen geeignet.

Wie sich gezeigt hat, sind sowohl Erdalkalimetalle als auch Elemente der Nebengruppen geeignet. Besonders geeignet sind Erdalkalimetalle, Kobalt, Zink, Selen, Mangan, Nickel, Kupfer, Eisen, Magnesium, Calcium, Molybdän und Silber. Die Ionen können ein-, zwei-, drei- oder vierwertig sein. Besonders bevorzugt werden zweiwertige Ionen wie Cu(II) Ionen. Die Ionen werden vorzugsweise als Lösungen zugesetzt von MgCl2, CaCl2, MnCl2, BaCl2, LiCl ₂ , Sr(Nθ3) ₂ , Na ₂ MoO ₄ , AgCl ₂ oder Cu(II)-Acetat.

Solche multimeren Formen, deren Herstellung in Gegenwart von Metallionen und metall- ionenhaltige Formen von LL-16 sind in der deutschen Patentanmeldung Nr. 195 47 933.5 beschrieben

Das erfindungsgemaße Polypeptid kann dadurch hergestellt werden, daß eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, die mit einer Nukleinsäuresequenz nach den Ansprüchen 1 oder 2 transformiert oder transfiziert ist, unter geeigneten Nährbedingungen kultiviert wird und das gewünschte Polypeptid gegebenenfalls isoliert wird Falls die Herstellung des Poly¬ peptids im Rahmen einer gentherapeutischen Behandlung in vivo erfolgen soll, wird das Poly¬ peptid naturlich nicht aus der Zelle isoliert.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein erfindungsgemaßes Polypeptid in einer für eine therapeutische Anwendung ausreichenden Menge und/oder spezifische Aktivität sowie gegebenenfalls ein pharmazeutisch geeignetes Verdünnungsmittel, Adjuvans und/oder Tragermittel enthalt

Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind insbesondere geeignet zur Behandlung von patholo¬ gischen Zustanden, die durch virale Repiikation, insbesondere retrovirale Replikation, verur¬ sacht sind, und zur Immunmodulation. Derartige therapeutische Anwendungen sind ebenfalls in der WO 94/28134 sowie der WO 96/31607 beschrieben. In letzterer sind auch diagnosti¬ sche Testverfahren beschrieben

Vorzugsweise können die erfindungsgemäßen Polypeptide zur Immunsuppression verwendet werden. Diese Immunsuppression erfolgt vorzugsweise über eine Hemmung der Helferfunk¬ tion der THQ und/oder TH] und TH2 Zellen. Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind dem¬ nach bei allen Erkrankungen von therapeutischem Wert, bei denen eine immundisregulatori- sche Komponente bei der Pathogenese postuiert wird, insbesondere eine Hyperimmunitat. Als EL-16-therapierbare Erkrankungen können in der Kardiologie/ Angiologie Erkrankungen wie Myokarditis, Endokarditis und Perikarditis in Frage kommen, in der Pulmonologie beispiels-

weise Bronchitis, Asthma, in der Hämatologie Autoimmunneuropenien und Transplantatab- stoßung, in der Gastroenterologie chronische Gastritis, in der Endokrinologie Diabetes mellitus Typ I, in der Nephrologie Glomerulonephritis, Erkrankungen im rheumatischen Formenkreis, Erkrankungen in der Ophthalmologie, in der Neurologie, wie Multiple Sklerose, in der Dermatologie Ekzeme. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Polypeptide bei Autoimmunerkrankungen, Allergien und zur Vermeidung von Transplantatabstoßungen ver¬ wendet werden

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemaßen Nuklein¬ säuren im Rahmen der Gentherapie Hierfür geeignete Vektorsysteme sind beispielsweise retrovirale oder nicht-virale Vektorsysteme

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein polyklonaler oder monoklonaler Anti-LL-16- Antikorper oder ein immunoaktives Fragment davon sowie Verfahren zur Herstellung von solchen Antikörpern und ihre Verwendung zur Bestimmung von LL-16 sowie zur Bestimmung von viralen Infektionen in eukaryontischen Zellen und insbesondere in Saugerzellmaterial Mit LL-16 können auch Virus-aktivierte Säugerzellen, insbesondere T Zellen, bestimmt werden Die Herstellung solcher Antikörper erfolgt durch Immunisierung mit einem erfindungsge¬ maßen Polypeptid, welches vorzugsweise im wesentlichen der Sequenz Aminosäuren 1-244 aus SEQ LD NO 1/2 entspricht und welches an ein solches Peptid bindet Vorzugsweise wird ein Antikörper verwendet, der nicht an das Polypeptid der Sequenz Aminosäuren 245-374 aus SEQ LD NO 1/2 bindet Die Herstellung eines solchen Antikörpers wird nach den dem Fach¬ mann gelaufigen Verfahren durchgeführt

Die folgenden Beispiele und Publikationen sowie das Sequenzprotokoll erläutern die Erfin¬ dung, deren Schutzumfang sich aus den Patentansprüchen ergibt, weiter Die beschriebenen Verfahren sind als Beispiele zu verstehen, die auch noch nach Modifikationen den Gegenstand der Erfindung beschreiben

Beispiel 1

Klonierung, Expression und Reinigung von IL-16

1.1 RNA Isolierung

5 x lO^PBMC (vom Menschen oder Affen) wurden 48 Stunden mit 10 μg/ml Concanavalin A und 180 U/ml LL-2 kultiviert. Zur Herstellung der RNA wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und anschließend mit 5 ml Denaturierungslosung (RNA Isolation Kit, Stratagene)

lysiert Nach Zugabe von 1 ml Na-Acetat, 5 ml Phenol und 1 ml Chloroform/Isoamyl-Alkohol (24 1) wurde das Lysat 15 min auf Eis gehalten Die wäßrige Phase wurde anschließend mit 6 ml Isopropanol vermischt, um die RNA auszufallen, und 2 Stunden bei -20°C gelagert Das Präzipitat wurde schließlich einmal mit reinem Ethanol gewaschen und in 150 μl H2O gelost Die Ausbeute wurde photometrisch bestimmt und betrug 120 μg

1.2 cDNA Synthese

Die Mischung für die cDNA Synthese enthielt 10 μg RNA, 0,2 μg Oligo-dT, 13 mM DTT und 5 μl "bulk first Strand reaction mix" (First-Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia) in einer Menge von 15 μl. Die Mischung wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert und anschließend bei -20°C zur spateren Verwendung gelagert

Amplifikation, Klonierung von LL-16 cDNA und Herstellung eines Expressionsklons erfolgen wie in der WO 94/28134 oder der WO 96/31607 beschrieben, unter Berücksichtigung der veränderten Sequenzen Für die Reinigung nach Beispiel 3 ist eine N-terminale Verlängerung um mehrere Histidinreste erforderlich

Beispiel 2

10 I Fermentation eines E. coli Expressionsklons für LL-16 und Hochdruckaufschluß

Aus Stammkulturen (Plattenausstrich oder bei -20°C gelagerten Ampullen) werden Vorkultu¬ ren angesetzt, die geschüttelt bei 37°C inkubiert werden Das Ubenmpfvolumen in die nächst¬ höhere Dimension betragt jeweils 1-10 Voi -% Zur Selektion gegen Plasmidverlust wird in Vor- und Hauptkultur Ampicillin (50-100 mg/l) eingesetzt

Als Nährstoffe werden enzymatisch verdautes Eiweiß und/oder Hefeextrakt als N- und C- Quelle sowie Glycerin und/oder Glucose als zusatzliche C-Quelle verwendet. Das Medium wird auf pH 7 gepuffert und Metallsalze werden zur Stabilisierung des Fermentationsprozesses in physiologisch vertraglichen Konzentrationen zugesetzt. Die Fermentation wird als Feed- batch mit einer gemischten Hefeextrakt/C-Quellen-Dosage durchgeführt Die Fermentations¬ temperatur betragt 25-37°C Über Beluftungsrate, Drehzahlregulierung und Dosage- geschwindigkeit wird der geloste Sauerstoffpartialdruck (pθ2) < 20% gehalten

Das Wachstum wird über Ermittlung der optischen Dichte (OD) bei 528 nm bestimmt Mittels LPTG wird die Expression des LL-16 induziert Nach einer Fermentationsdauer von ca 10 Stunden wird bei OD-Stillstand die Biomasse durch Zentrifugation geerntet Die Biomasse

wird in 50 mM Natriumphosphat, 5 mM EDTA 100 mM Natriumchlorid, pH 7 aufgenommen und über eine kontinuierliche Hochdruckpresse bei 1000 Bar aufgeschlossen. Die so erhaltene Suspension wird erneut abzentrifugiert und der Überstand, der das gelöste IL-16 enthält, wird weiterverarbeitet.

Beispiel 3

Reinigung von rekombinantem humanem LL-16

550 ml Aufschlußüberstand in 50 mM Natriumphosphat, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 7,2 wurden mit 55 ml 5 M NaCl, 60 mM MgCl _2> pH 8,0 versetzt, 30 min. gerührt und anschließend 30 min. bei 20.000 g zentrifugiert. 400 ml des Überstandes wurden auf eine Nickel-Chelat-Sepharose-Säule (V=60 ml; Pharmacia) aufgezogen, die vorher mit 30 μMol NiCl ₂ /ml Gel beladen und mit 50 mM Natriumphosphat, 0,2 M NaCl, pH 8,0 äquilibriert wor¬ den war. Die Säule wurde anschließend mit 300 ml 50 mM Natriumphosphat, 0,5 M NaCl, pH 7,0 gespült und das LL-16-Fusionsprotein dann mit einem Gradienten von 0 M bis 300 mM Imidazol, pH 7,0 in 50 mM Natriumphosphat, 0,1 M NaCl, pH 7,0 (2* 0,5 1 Gradientenvolu¬ men) eluiert. LL-16 enthaltende Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE identifiziert und ver¬ einigt.

300 mg des so erhaltenen Fusionsproteins wurden bei 4°C gegen 20 1 20 mM Imidazol, pH 5,5 dialysiert und anschließend zur Entfernung von Trübungen 30 min. bei 20.000 g zentrifugiert. Der Überstand der Zentrifugation wurde anschließend mit NaOH auf pH 8,5 eingestellt, mit 0,3 mg Thrombin (Boehringer Mannheim GmbH) versetzt und 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der Spaltansatz mit HCl auf pH 6,5 und die Leitfähigkeit durch Verdün¬ nung mit H ₂ O auf 1,7 mS eingestellt. Die Probe wurde auf eine Q-Sepharose FF-Säule (45 ml; Pharmacia) aufgetragen, die vorher mit 20 mM Imidazol, pH 6,5 äquilibriert worden war. Die Elution von LL-16 erfolgte mit einem Gradienten von 0 bis 0,3 M NaCl in 20 mM Imidazol, pH 6,5. LL-16 enthaltende Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE identifiziert, vereinigt und die LL-16-Identität über Massenanalyse und N-terminale Sequenzanalyse bestätigt.

Das so erhaltene LL-16 wies in der SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen eine Rein¬ heit von mehr als 95% auf. Die analytische Superdex 75 FPLC-Säule (Pharmacia) wurde mit 25 mM Na-Phosphat, 0,5 M NaCl, 10% Glycerin, pH 7,0 und einer Flußrate von 1 ml/min. eluiert. Die aufgetragene Proteinmenge in einem Volumen von 100 bis 150 μl betrug 1,5 bis 15 μg Protein. Die Detektion erfolgte bei 220 nm.

Zur Reinheitsanalyse mittels RP-HPLC wurde eine Vydac, Protein & Peptide C18, 4x180 mm Säule verwendet. Die Elution erfolgt durch einen linearen Gradienten von 0% nach 80% B (Lösungsmittel B: 90% Acetonitril in 0,1% TFA; Lösungsmittel A: 0, 1% TFA in H2O) inner¬ halb von 30 min. mit einer Flußrate von 1 ml/min. Die Detektion erfolgte bei 220 nm.

Referenzliste

Aman et al., Gene 40 (1985) 183

Baier, M., et al., Nature 378 (1995) 563

Beck und Zink, Gene 16 (1981) 35-58

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Davies et al., Ann. Rev. Microbiol. 32 (1978) 469

Deutsche Patentanmeldung Nr. 195 47 933.5

EP-A 0 267 851

EP-A 0 495 398

Ghrayeb et al., EMBO J 3 (1984) 2437

Goeddel et al., Nuc. Acids Res. 8 (1980) 4057

Kingsman, S M , et al, Tibtech 5 (1987) 53-57

Mack et al., Analyt. Biochem. 200 (1992) 74-80

Maroux et al., J. Biol. Chem. 241 (1971) 5031

Miller et al., Bio/Technology 7 (1989) 698

Nagai et al., Nature 309 (1984) 810

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WO 91/11520

WO 92/20702

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WO 94/28134

WO 96/31607

Yansura, Meth. Enzymol. 185 (1990) 161-166

SEQUENZPROTOKOLL

ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER:

(A) NAME: Bundesrepublik Deutschland vertreten durch den Bundesminister fuer Gesundheit

(B) STRASSE: -

(C) ORT: Bonn

(E) LAND: Deutschland

(F) POSTLEITZAHL: D-54108

(A) NAME: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH

(B) STRASSE: Sandhofer Str. 112-116

(C) ORT: Mannheim

(E) LAND: Deutschland

(F) POSTLEITZAHL: D-68305

(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Polypeptide mit IL-16-Aktιvitaet, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung

(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 12

(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:

(A) DATENTRÄGER: Floppy disk

(B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30B (EPA)

(vi) DATEN DER URANMELDUNG:

(A) ANMELDENUMMER: DE 195 48 295.6

(B) ANMELDETAG: 22-DEC-1995

(vi) DATEN DER URANMELDUNG:

(A) ANMELDENUMMER: DE 196 03 492.2

(B) ANMELDETAG: 31-JAN-1996

(vi) DATEN DER URANMELDUNG:

(A) ANMELDENUMMER: DE 196 13 866.3

(B) ANMELDETAG: 06-APR-1996

(vi) DATEN DER URANMELDUNG:

(A) ANMELDENUMMER: DE 196 13 886.8

(B) ANMELDETAG: 06-APR-1996

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LANGE: 1178 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Doppelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE:54..1178

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

TTCCTCGAGA GCTGTCAACA CAGGCTGAGG AATCTCAAGG CCCAGTGCTC AAG ATG 56

Met 1

CCT AGC CAG CGA GCA CGG AGC TTC CCC CTG ACC AGG TCC CAG TCC TGT 104 Pro Ser Gin Arg Ala Arg Ser Phe Pro Leu Thr Arg Ser Gin Ser Cys 5 10 15

GAG ACG AAG CTA CTT GAC GAA AAG ACC AGC AAA CTC TAT TCT ATC AGC 152 Glu Thr Lys Leu Leu Asp Glu Lys Thr Ser Lys Leu Tyr Ser Ile Ser 20 25 30

AGC CAA GTG TCA TCG GCT GTC ATG AAA TCC TTG CTG TGC CTT CCA TCT 200 Ser Gin Val Ser Ser Ala Val Met Lys Ser Leu Leu Cys Leu Pro Ser 35 40 45

TCT ATC TCC TGT GCC CAG ACT CCC TGC ATC CCC AAG GAA GGG GCA TCT 248 Ser Ile Ser Cys Ala Gin Thr Pro Cys Ile Pro Lys Glu Gly Ala Ser 50 55 60 65

CCA ACA TCA TCA TCC AAC GAA GAC TCA GCT GCA AAT GGT TCT GCT GAA 296 Pro Thr Ser Ser Ser Asn Glu Asp Ser Ala Ala Asn Gly Ser Ala Glu

70 75 80

ACA TCT GCC TTG GAC ACA GGG TTC TCG CTC AAC CTT TCA GAG CTG AGA 344 Thr Ser Ala Leu Asp Thr Gly Phe Ser Leu Asn Leu Ser Glu Leu Arg 85 90 95

GAA TAT ACA GAG GGT CTC ACG GAA GCC AAG GAA GAC GAT GAT GGG GAC 392 Glu Tyr Thr Glu Gly Leu Thr Glu Ala Lys Glu Asp Asp Asp Gly Asp 100 105 110

CAC AGT TCC CTT CAG TCT GGT CAG TCC GTT ATC TCC CTG CTG AGC TCA 440 His Ser Ser Leu Gin Ser Gly Gin Ser Val Ile Ser Leu Leu Ser Ser 115 120 125

GAA GAA TTA AAA AAA CTC ATC GAG GAG GTG AAG GTT CTG GAT GAA GCA 488 Glu Glu Leu Lys Lys Leu Ile Glu Glu Val Lys Val Leu Asp Glu Ala 130 135 140 145

ACA TTA AAG CAA TTA GAC GGC ATC CAT GTC ACC ATC TTA CAC AAG GAG 536 Thr Leu Lys Gin Leu Asp Gly Ile His Val Thr Ile Leu His Lys Glu

150 155 160

GAA GGT GCT GGT CTT GGG TTC AGC TTG GCA GGA GGA GCA GAT CTA GAA 584

Glu Gly Ala Gly Leu Gly Phe Ser Leu Ala Gly Gly Ala Asp Leu Glu 165 170 175

AAC AAG GTG ATT ACG GTT CAC AGA GTG TTT CCA AAT GGG CTG GCC TCC 632 Asn Lys Val Ile Thr Val His Arg Val Phe Pro Asn Gly Leu Ala Ser 180 185 190

CAG GAA GGG ACT ATT CAG AAG GGC AAT GAG GTT CTT TCC ATC AAC GGC 680 Gin Glu Gly Thr Ile Gin Lys Gly Asn Glu Val Leu Ser Ile Asn Gly 195 200 205

AAG TCT CTC AAG GGG ACC ACG CAC CAT GAT GCC TTG GCA ATC CTC CGC 728 Lys Ser Leu Lys Gly Thr Thr His His Asp Ala Leu Ala Ile Leu Arg 210 215 220 225

CAA GCT CGA GAG CCC AGG CAA GCT GTG ATT GTC ACA AGG AAG CTG ACT 776 Gin Ala Arg Glu Pro Arg Gin Ala Val Ile Val Thr Arg Lys Leu Thr

230 235 240

CCA GAG GCC ATG CCC GAC CTC AAC TCC TCC ACT GAC TCT GCA GCC TCA 824 Pro Glu Ala Met Pro Asp Leu Asn Ser Ser Thr Asp Ser Ala Ala Ser 245 250 255

GCC TCT GCA GCC AGT GAT GTT TCT GTA GAA TCT ACA GCA GAG GCC ACA 872 Ala Ser Ala Ala Ser Asp Val Ser Val Glu Ser Thr Ala Glu Ala Thr 260 265 270

GTC TGC ACG GTG ACA CTG GAG AAG ATG TCG GCA GGG CTG GGC TTC AGC 920 Val Cys Thr Val Thr Leu Glu Lys Met Ser Ala Gly Leu Gly Phe Ser 275 280 285

CTG GAA GGA GGG AAG GGC TCC CTA CAC GGA GAC AAG CCT CTC ACC ATT 968 Leu Glu Gly Gly Lys Gly Ser Leu His Gly Asp Lys Pro Leu Thr Ile 290 295 300 305

AAC AGG ATT TTC AAA GGA GCA GCC TCA GAA CAA AGT GAG ACA GTC CAG 1016 Asn Arg Ile Phe Lys Gly Ala Ala Ser Glu Gin Ser Glu Thr Val Gin

310 315 320

CCT GGA GAT GAA ATC TTG CAG CTG GGT GGC ACT GCC ATG CAG GGC CTC 1064 Pro Gly Asp Glu Ile Leu Gin Leu Gly Gly Thr Ala Met Gin Gly Leu 325 330 335

ACA CGG TTT GAA GCC TGG AAC ATC ATC AAG GCA CTG CCT GAT GGA CCT 1112 Thr Arg Phe Glu Ala Trp Asn Ile Ile Lys Ala Leu Pro Asp Gly Pro 340 345 350

GTC ACG ATT GTC ATC AGG AGA AAA AGC CTC CAG TCC AAG GAA ACC ACA 1160 Val Thr Ile Val Ile Arg Arg Lys Ser Leu Gin Ser Lys Glu Thr Thr 355 360 365

GCT GCT GGA GAC TCC TAG 1178

Ala Ala Gly Asp Ser * 370 375

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 375 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

Met Pro Ser Gin Arg Ala Arg Ser Phe Pro Leu Thr Arg Ser Gin Ser 1 5 10 15

Cys Glu Thr Lys Leu Leu Asp Glu Lys Thr Ser Lys Leu Tyr Ser Ile 20 25 30

Ser Ser Gin Val Ser Ser Ala Val Met Lys Ser Leu Leu Cys Leu Pro 35 40 45

Ser Ser Ile Ser Cys Ala Gin Thr Pro Cys Ile Pro Lys Glu Gly Ala 50 55 60

Ser Pro Thr Ser Ser Ser Asn Glu Asp Ser Ala Ala Asn Gly Ser Ala 65 70 75 80

Glu Thr Ser Ala Leu Asp Thr Gly Phe Ser Leu Asn Leu Ser Glu Leu

85 90 95

Arg Glu Tyr Thr Glu Gly Leu Thr Glu Ala Lys Glu Asp Asp Asp Gly 100 105 110

Asp His Ser Ser Leu Gin Ser Gly Gin Ser Val Ile Ser Leu Leu Ser 115 120 125

Ser Glu Glu Leu Lys Lys Leu Ile Glu Glu Val Lys Val Leu Asp Glu 130 135 140

Ala Thr Leu Lys Gin Leu Asp Gly Ile His Val Thr Ile Leu His Lys 145 150 155 160

Glu Glu Gly Ala Gly Leu Gly Phe Ser Leu Ala Gly Gly Ala Asp Leu

165 170 175

Glu Asn Lys Val Ile Thr Val His Arg Val Phe Pro Asn Gly Leu Ala 180 185 190

Ser Gin Glu Gly Thr Ile Gin Lys Gly Asn Glu Val Leu Ser Ile Asn 195 200 205

Gly Lys Ser Leu Lys Gly Thr Thr His His Asp Ala Leu Ala Ile Leu 210 215 220

Arg Gin Ala Arg Glu Pro Arg Gin Ala Val Ile Val Thr Arg Lys Leu 225 230 235 240

Thr Pro Glu Ala Met Pro Asp Leu Asn Ser Ser Thr Asp Ser Ala Ala

245 250 255

Ser Ala Ser Ala Ala Ser Asp Val Ser Val Glu Ser Thr Ala Glu Ala 260 265 270

Thr Val Cys Thr Val Thr Leu Glu Lys Met Ser Ala Gly Leu Gly Phe 275 280 285

Ser Leu Glu Gly Gly Lys Gly Ser Leu His Gly Asp Lys Pro Leu Thr 290 295 300

Ile Asn Arg Ile Phe Lys Gly Ala Ala Ser Glu Gin Ser Glu Thr Val 305 310 315 320

Gin Pro Gly Asp Glu Ile Leu Gin Leu Gly Gly Thr Ala Met Gin Gly

325 330 335

Leu Thr Arg Phe Glu Ala Trp Asn Ile Ile Lys Ala Leu Pro Asp Gly 340 345 350

Pro Val Thr Ile Val Ile Arg Arg Lys Ser Leu Gin Ser Lys Glu Thr 355 360 365

Thr Ala Ala Gly Asp Ser * 370 375

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(l) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LANGE: 7 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(il) ART DES MOLEKÜLS: Peptid

(Xl) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

Arg Lys Leu Thr Pro Glu Ala 1 5

[2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

(l) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LANGE: 6 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(il) ART DES MOLEKÜLS: Peptid

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

Arg Lys Leu Thr Pro Glu 1 5

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:

(l) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LANGE: 5 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(il) ART DES MOLEKÜLS: Peptid

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5

Arg Lys Leu Thr Pro 1 5

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:

(1) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LANGE: 4 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(il) ART DES MOLEKÜLS: Peptid

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

Arg Lys Leu Thr 1

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:

(l) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 3 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(11) ART DES MOLEKÜLS: Peptid

(Xl) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

Arg Lys Leu 1

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:

(l) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LANGE: 7 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid

(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

Leu Thr Pro Glu Ala Met Pro 1 5

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:

(l) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LANGE: 6 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:

Leu Thr Pro Glu Ala Met 1 5

[ 2 ) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LANGE: 5 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:

Leu Thr Pro Glu Ala 1 5

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:

Leu Thr Pro Glu

1

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 3 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid

(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:

Leu Thr Pro 1