Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Herstellung einer Hefemasse mit hohem Polyphosphatanteil umfassend der Fermentierung von Hefezellen in einem Orthophosphat-Mangelmedium, Trocknung der Zellen, Überführung und Fermentierung der Zellen in ein orthophosphat-haltiges Medium, und weiterer Trocknung der Zellen. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung von Hefeextrakten mit hohem Polyphosphatanteil, insbesondere in Pasten- oder Pulverform. Zudem umfasst die vorliegende Erfindung Hefemassen und Hefeextrakte mit hohem Polyphosphatanteil, erhältlich durch die erfindungsgemäßen Verfahren.

Anorganisches Polyphosphat (polyP) ist das lineare Polymer von Orthophosphat (Pi). Sowohl polyP als auch Pi werden oft als Nahrungsmittelzusätze verwendet. Die Nahrungseigenschaften von PolyP gehen einher mit seinen chemischen Eigenschaften: Es enthält energiereiche Phosphoanhydrid-Bindungen (z.B. Stabilisierung und Zartmachung von Fleischprodukten wie Wurst), fungiert als löslicher Kation-Austauscher (z.B. Komplexierung bivalenter Kationen, um Weichkäse seine einzigartige Viskosität zu verleihen), seine starke Hydrophilie (z.B. um Fleischprodukte saftig zu halten), seine bakteriostatische Wirkung (z.B. in Döner Kebab, wo das Fleisch für längere Zeit bei Umgebungstemperatur gehalten wird), puffert den pH, ist nicht toxisch für Menschen und ist biologisch abbaubar ( Kulaev et al., 2nd Ed. John Wiley & Sons, Ltd., West Sussex, England (2005)).

Da jeweils nur die erste und letzte P-Untereinheit jeder polyP-Kette eine Hydroxylgruppe mit puffernden Eigenschaften bei neutralem pH besitzt, wird Pi zur pH-Stabilisierung in Nahrungsprodukten bevorzugt. PolyP ₂ findet in Fleischprodukten eine einzigartige Anwendung. Myosin ist der primäre wasser-, protein-, und fettbindende Stoff in Muskelprodukten. In Fleisch ohne PolyP ₂ -Zusatz hat Myosin verringerte Funktionalität, da es innerhalb der dicken Filamente der Myofibrillen gebunden ist. Innerhalb der Muskelmatrix muss Myosin umstrukturiert und/oder freigesetzt werden, um geeignete Funktionalität zu erhalten (d.h. zartes Fleisch). Dies wird durch Zugabe oder Injektion von PolyP ₂ erreicht (Shen et al., Meat Science (2010), 84: 364). PolyP ₂ erleichtert dann die Extraktion von Myosin aus dem dicken Filament des A-Bandes. Das Ergebnis ist eine Schwellung der Myofibrillen und eine erhöhte Wasserspeicherkapazität des Fleisches. Zusammenfassend besitzt Pi die höchste pH-Pufferfähigkeit, welche mit zunehmender PolyP-Kettenlänge abnimmt. Im Gegensatz dazu nehmen Eigenschaften wie Komplexierungsfähigkeit, Anzahl der Phosphoanhydrid-Bindungen, bakteriostatische Eigenschaften sowie Hydrophilie mit wachsender polyP-Kettenlänge zu. Die Aktivierung von Myosin in Fleischprodukten ist mit PolyP ₂ am ausgeprägtesten.

Derzeit wird polyP für die Nahrungsmittelindustrie chemisch durch hitze-induzierte Kondensationsreaktion von Pi synthetisiert. Allerdings erlaubt die chemische Synthese von polyP nur Kettenlängen von bis zu 40 P-Untereinheiten (Christ & Blank, Anal Biochem (2018), 548: 82-90, inter alia Tabelle 4 darin). Um die Eigenschaften längerkettiger polyP- Polymere in Nahrungsmitteln nutzen zu können, müssen daher mitunter hohe Konzentrationen chemisch synthetisierten polyP eingesetzt werden, was eine höhere P- Aufnahme durch die Konsumenten mit sich bringt. Außerdem ist hochreines Pi für die chemische Synthese von PolyP vonnöten. Dieses hochreine Pi wird von geologischen Phosphat-Fels Ablagerungen gewonnen, die vor allem in Marokko und der West-Sahara Vorkommen. Der Abbau benötigt große Mengen Schwefelsäure und Wasser und produziert erhebliche Mengen Abfall. Weiterhin müssen Lebensmittel mit zugesetztem chemisch synthetisiertem PolyP gekennzeichnet werden.

Das technische Problem, dass sich durch die genannten und andere Nachteile ergibt, wird vom Gegenstand der vorliegenden Erfindung gelöst, wie er in den Ansprüchen und der nachfolgenden Beschreibung definiert wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Hefemasse mit hohem Polyphosphatanteil von mindestens etwa 5 Gew%, vorzugsweise von mindestens 25 Gew% bezogen auf die Trockenzellmasse (hier auch „Zelltrockengewicht“ genannt), umfassend folgende Schritte:

(1 ) Fermentieren von Hefe in einem Orthophosphat-Mangelmedium für etwa 4 bis 9 h (in einer Ausführungsform etwa 6 bis 8 h, in einer besonderen Ausführungsform etwa 6 h) bei etwa 23 bis 32 °C (in einer Ausführungsform etwa 28 bis 32 °C, in einer besonderen Ausführungsform etwa 30 °C) bei einem pH von etwa 4 bis 6 (in einer Ausführungsform etwa 4,5 bis 5,5, in einer besonderen Ausführungsform etwa 5),

(2) Trocknung der Zellen,

(3) optional Lagerung der Zellen bis etwa 24 h (in einer Ausführungsform etwa 6 bis 18 h, in einer besonderen Ausführungsform etwa 17 h) bei etwa 2 bis 10 °C (in einer Ausführungsform etwa 2 bis 6 °C, in einer besonderen Ausführungsform etwa 4 °C),

(4) Überführung der Zellen in ein Orthophosphat-haltiges Medium und Fermentieren für etwa 1 ,0 bis 3,5 h (in einer Ausführungsform etwa 2 bis 3 h, in einer besonderen Ausführungsform etwa 2,5 h) bei etwa 23 bis 32 °C (in einer Ausführungsform etwa 28 bis 32 °C, in einer besonderen Ausführungsform etwa 30 °C) bei einem pH von etwa 4 bis 7 (in einer Ausführungsform etwa 4,5 bis 6,5, in einer besonderen Ausführungsform etwa 6), und

(5) Trocknung der Zellen, wobei

das Polyphosphat (polyP) als KP0 ₃ gemessen wird,

vorzugsweise enthält das Orthophosphat-Mangelmedium:

• etwa 30 bis 300 mM Glucose,

• etwa 5 bis 50 mM (NH ₄ )S0 ,

• etwa 5 bis 30 mM KCl,

• etwa 5 bis 30 mM Na ₂ Succinat,

• etwa 2 bis 10 mM CaCI ₂ ,

• Vitaminlösung umfassend ein oder mehrere Vitamine ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Myo-inositol, Nicotinsäure, Pyridoxalhydrochlorid, Thiaminhydrochlorid, Ca-D-pantothenat, P-Aminobenzoesäure, und D-Biotin, und

• Spurenelementelösung umfassend Spurenelemente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Na ₂ EDTA, CaCI ₂ , H ₃ B0 ₃ , ZnS0 ₄ , FeS0 ₄ , MnCI ₂ , Na ₂ Mo0 ₄ , CoCI ₂ , CuS0 ₄ , und Kl,

noch mehr bevorzugt enthält das Orthophosphat-Mangelmedium:

etwa 133 mM Glucose,

etwa 10 mM (NH ₄ )S0 ₄ ,

etwa 13 mM KCl,

etwa 12,5 mM Na ₂ Succinat,

etwa 4 mM CaCI ₂ ,

Vitaminlösung umfassend Myo-inositol, Nicotinsäure, Pyridoxalhydrochlorid, Thiaminhydrochlorid, Ca-D-pantothenat, P-Aminobenzoesäure, und D-Biotin, und • Spurenelementelösung umfassend Na ₂ EDTA, CaCI ₂ , H ₃ B0 ₃ , ZnS0 ₄ , FeS0 ₄ , MnCI ₂ , Na ₂ Mo0 ₄ , CoCI ₂ , CuS0 ₄ , und Kl.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung beträgt der Polyphosphatanteil einer erfindungsgemäß hergestellten Hefemasse (d.h. Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bis Schritt (5)) mind. etwa 5, mind. etwa 6, mind. etwa 7, mind. etwa 8, mind. etwa 9, mind. etwa 10, mind. etwa 1 1 , mind. etwa 12, mind. etwa 13, mind. etwa 14, mind. etwa 15, mind. etwa 16, mind. etwa 17, mind. etwa 18, mind. etwa 19, mind. etwa 20, mind. etwa 21 , mind. etwa 22, mind. etwa 23, mind. etwa 24, oder mind. etwa 25 Gew%, bezogen auf die Trockenzellmasse. Als „Polyphosphat“ oder „polyP“ wie hier beschrieben wird das lineare Polymer von Orthophosphat (Pi; Salz der Orthophosphorsäure) verstanden, wobei von „Polyphosphat“ oder „polyP“ wie hier verwendet mindestens 2 P-Untereinheiten umfasst sind. Die Kettenlänge von polyP kann bestimmt werden mit Verfahren wie dem Fachmann allgemein bekannt (bspw. Christ & Blank, Anal Biochem (2018), 548: 82-90) und wie hier auch exemplarisch beschrieben.

Christ & Blank (2018), Anal Biochem 563, 71 -78, zeigen auf Seite 74, Abbildung 1 Ergebnisse verschiedener Extraktionsverfahren von PolyP aus S. cerevisiae. Dazu wurde S. cerevisiae, so wie in Liss und Langen (1962), Arch. Mikrobiol. 41 , 383-392 beschrieben, gezüchtet. Anschließend wurde PolyP aus S. cerevisiae extrahiert. Der PolyP-Gehalt war im besten Fall ca. 1 1 % bezogen auf die Trockenzellmasse, wenn die Extraktion gemäß dem Protokoll von Bru et al. (2016), Microbial Cell 4, 6-15 erfolgte (siehe Abbildung 1 von Christ und Blank (loc. cit.). Unter Verwendung des ursprünglichen Extraktionsprotokolls von Liss und Langen (loc. cit.) erhielten Christ und Blank (loc. cit.) nur ca. 3 Gew% PolyP-Gehalt aus S. cerevisiae bezogen auf die Trockenzellmasse (siehe Abbildung 1 von Christ und Blank (loc. cit.), obgleich Liss und Langen (loc. cit.) behaupten, ca. 23 Gew% PolyP-Gehalt in S. cerevisiae bezogen auf die Trockenzellmasse erhalten zu haben. Nichtsdestotrotz erreicht die vorliegende Erfindung mehr als die behaupteten ca. 23 Gew% PolyP-Gehalt bezogen auf die Trockenzellmasse von Liss und Langen (loc. cit.), nämlich mehr als 23 Gew%, z.B. mindestens 25 Gew% oder mehr, z.B. 28 Gew%; siehe Figur 3A.

Zu ihrer Überraschung stellten die Erfinder der vorliegenden Erfindung fest, dass die Anwesenheit von Vitaminlösung und Spurenelementelösung im Orthophosphat- Mangelmedium synergistisch auf den PolyP-Gehalt in Hefen wirkt. Dieser Synergismus ist an Hand von Figur 1 C, 1 ter Balken, Figir 1 D, 1 ter Balken und Figur 1 D, 3ter Balken ersichtlich. Ohne Vitaminlösung, aber mit Spurenelementlösung im Orthophosphat-Mangelmedium erhält man ca. 8 Gew% PolyP bezogen auf die Trockenzellmasse (Figur 1 C, 1 ter Balken). Mit Vitaminlösung, jedoch ohne Spurenelementlösung im Orthophosphat-Mangelmedium erhält man ca. 14 Gew% PolyP bezogen auf die Trockenzellmasse (Figur 1 D, 1 ter Balken). Mit Vitaminlösung und Spurenelementelösung erhält man ca. 28 Gew% PolyP bezogen auf die Trockenzellmasse (Figur 1 D, 3ter Balken), d.h. mehr als die Summe des PolyP-Gehalts bei Anwesenheit von nur Spurenelementelösung oder Vitaminlösung. Dieser synergistische Effekt war überraschend und zudem gibt es im Stand der Technik darauf keinen Hinweis, geschweige denn konnte dieser Effekt erwartet werden, so dass Hefen unter Heranziehen der erfindungsgemäßen Lehre mit einem so hohen PolyP-Gehalt gezüchtet werden können, der im Stand der Technik bis zum Zeitpunkt der vorliegenden Erfindung nicht erreicht wurde (siehe Tabelle 3 in Christ & Lang (2019), FEMS Yeast Res 19, foz01 1 ). Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Hefemassen können neben PolyP grundsätzlich auch Orthophosphat (Pi) enthalten.

Die„Trockenzellmasse“ Trockenzellmasse (hier auch„Zelltrockengewicht“ genannt), auf die sich erfindungsgemäß der polyP-Anteil der Hefemasse (in Gew%) bezieht, weist bevorzugt einen Wassergehalt von mind. etwa 5, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, oder 70 Gew% (bevorzugt mind. etwa 65 oder 70 Gew%), und/oder bevorzugt nicht mehr als etwa 70, 75, 80, oder 85 Gew% Wasser auf, bevorzugt nicht mehr als etwa 75 Gew% Wasser. Der Trockenanteil bzw. die Trockenzellmasse kann dabei nach üblichen Methoden ermittelt werden wie dem Fachmann allgemein bekannt und wie hier auch exemplarisch beschrieben.

Die Trocknung gemäß Schritt (2) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in einer Ausführungsform durchgeführt bis zu einem Trockenanteil von mind. etwa 20 Gew%, mind. etwa 25 Gew%, oder mind. etwa 30 Gew%, bevorzugt etwa 25 Gew%, und/oder bevorzugt nicht mehr als etwa 35, 33, 30 oder 25 Gew%, bezogen auf die Gesamtzellmasse. Mögliche Trocknungsverfahren umfassen hierbei im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Lufttrocknung (auf oder ohne phosphatfreies Filterpapier) oder Heiß- oder Trockenlufttrockner. Der Trockenanteil bzw. die Trockenzellmasse kann dabei nach üblichen Methoden ermittelt werden wie dem Fachmann allgemein bekannt und wie hier auch exemplarisch beschrieben.

Die Trocknung gemäß Schritt (5) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in einer Ausführungsform durchgeführt bis zu einem Trockenanteil von mind. etwa 20 Gew%, mind. etwa 25 Gew%, oder mind. etwa 30 Gew%, bevorzugt mind. etwa 25 Gew%, bevorzugt etwa 25 Gew%, und/oder bevorzugt nicht mehr als etwa 35, 33, 30 oder 25 Gew%, bezogen auf die Gesamtzellmasse. Mögliche Trocknungsverfahren umfassen hierbei im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Lufttrocknung (auf oder ohne phosphatfreies Filterpapier) oder Heiß- oder Trockenlufttrockner. Der Trockenanteil bzw. die Trockenzellmasse kann dabei nach üblichen Methoden ermittelt werden wie dem Fachmann allgemein bekannt und wie hier auch exemplarisch beschrieben.

Bei der Überführung gemäß Schritt (4) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann bspw. das Orthophosphat-haltige Medium bevorzugt mit etwa 2,5 bis 10 g CDW („Cell Dry Weight“, Trockenzellmasse) pro Liter der getrockneten Zellen aus Schritt (2) bzw. (3) angeimpft werden. In einer besonderen Ausführungsform wird das Orthophosphat-haltige Medium mit etwa 7,5 g CDW / 1 (entspricht dann 30 g CWW („Cell Wet Weight“, Zellfeuchtgewicht) / 1 bei 25 Gew% Trockenanteil nach Trocknung gemäß Schritt (2)) angeimpft. Verfahren zur analytischen polyP-Extraktion sind bekannt und bspw. auch beschrieben in Christ & Blank, Anal Biochem (2018), 563: 71 -78. Der Polyphosphat (polyP) Anteil wird erfindungsgemäß als KP0 ₃ gemessen mit Verfahren wie dem Fachmann allgemein bekannt (bspw. Christ & Blank, Anal Biochem (2018), 548: 82-90) und wie hier auch exemplarisch beschrieben. Zum Beispiel und bevorzugt kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung folgende Formel 1 verwendet werden:

PolyP (als KP0 ₃ )-Gehalt in Trockenzellgewicht [Gew%] = echte polyP-Konzentration [mM Pi] * Molekulargewicht polyP [g*mol ¹ ] * Eluatvolumen [pl] * Verdünnung [Verdünnungsgrad]

Zellfeuchtmasse [mg] * Trockenanteil [Gew%] * 10 ⁵

V. J

(Formel 1 ) wobei polyP als KP0 ₃ definiert wird mit einem Molekulargewicht von 1 18,07 g ^* mol ¹ .

Verfahren zur polyP-Extraktion sind dem Fachmann allgemein bekannt (bspw. Bru et al., Microbial Cell (2016), 4: 6-15; insb. auch das dort beschriebene Verfahren ohne Ethanol- Präzipitierung oder Christ & Blank, Anal Biochem (2018), 563: 71 -78 zur analytischen polyP- Extraktion) oder auch hier exemplarisch beschrieben.

In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Hefemasse mit hohem Polyphosphatanteil von mindestens etwa 5 Gew%, vorzugsweise von mindestens 25 Gew% bezogen auf die Trockenzellmasse, umfassend folgende Schritte:

(1 ) Fermentieren von Hefe in einem Orthophosphat-Mangelmedium für etwa 6 h bei etwa 30 °C bei einem pH von etwa 5,

(2) Trocknung der Zellen, bevorzugt zu einem Trockenanteil von etwa 25 Gew%,

(3) optional Lagerung der Zellen für etwa 17 h bei etwa 4 °C,

(4) Überführung der Zellen in ein Orthophosphat-haltiges Medium, bevorzugt mit etwa 7,5 g CDW / 1, und Fermentieren für etwa 2,5 h bei etwa 30 °C bei einem pH von etwa 6, und

(5) Trocknung der Zellen, bevorzugt zu einem Trockenanteil von etwa 25 Gew%, wobei das Polyphosphat (polyP) als KP0 ₃ gemessen wird,

vorzugsweise enthält das Orthophosphat-Mangelmedium:

• etwa 30 bis 300 mM Glucose,

• etwa 5 bis 50 mM (NH ₄ )S0 ₄ ,

• etwa 5 bis 30 mM KCl, • etwa 5 bis 30 mM Na ₂ Succinat,

• etwa 2 bis 10 mM CaCI ₂ ,

• Vitaminlösung umfassend ein oder mehrere Vitamine ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Myo-inositol, Nicotinsäure, Pyridoxalhydrochlorid, Thiaminhydrochlorid, Ca-D-pantothenat, P-Aminobenzoesäure, und D-Biotin, und

• Spurenelementelösung umfassend Spurenelemente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Na ₂ EDTA, CaCI ₂ , H ₃ B0 ₃ , ZnS0 ₄ , FeS0 ₄ , MnCI ₂ , Na ₂ Mo0 ₄ , CoCI ₂ , CuS0 ₄ , und Kl,

noch mehr bevorzugt enthält das Orthophosphat-Mangelmedium:

etwa 133 mM Glucose,

etwa 10 mM (NH ₄ )S0 ,

etwa 13 mM KCl,

etwa 12,5 mM Na ₂ Succinat,

etwa 4 mM CaCI ₂ ,

Vitaminlösung umfassend Myo-inositol, Nicotinsäure, Pyridoxalhydrochlorid, Thiaminhydrochlorid, Ca-D-pantothenat, P-Aminobenzoesäure, und D-Biotin, und • Spurenelementelösung umfassend Na ₂ EDTA, CaCI ₂ , H ₃ B0 ₃ , ZnS0 ₄ , FeS0 ₄ , MnCI ₂ , Na ₂ Mo0 ₄ , CoCI ₂ , CuS0 ₄ , und Kl.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Hefemasse mit hohem Polyphosphatanteil von mindestens etwa 25 Gew% bezogen auf die Trockenzellmasse, umfassend folgende Schritte:

(1 ) Fermentieren von Hefe in einem Orthophosphat-Mangelmedium für etwa 6 h bei etwa 30 °C bei einem pH von etwa 5,

(2) Trocknung der Zellen, bevorzugt zu einem Trockenanteil von etwa 25 Gew%,

(3) optional Lagerung der Zellen für etwa 17 h bei etwa 4 °C,

(4) Überführung der Zellen in ein Orthophosphat-haltiges Medium, bevorzugt mit etwa 7,5 g CDW / 1, und Fermentieren für etwa 2,5 h bei etwa 30 °C bei einem pH von etwa 6, und

(5) Trocknung der Zellen, bevorzugt zu einem Trockenanteil von etwa 25 Gew%, wobei das Polyphosphat (polyP) als KP0 ₃ gemessen wird,

vorzugsweise enthält das Orthophosphat-Mangelmedium:

• etwa 30 bis 300 mM Glucose,

• etwa 5 bis 50 mM (NH ₄ )S0 ,

• etwa 5 bis 30 mM KCl,

• etwa 5 bis 30 mM Na ₂ Succinat, • etwa 2 bis 10 mM CaCI ₂ ,

• Vitaminlösung umfassend ein oder mehrere Vitamine ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Myo-inositol, Nicotinsäure, Pyridoxalhydrochlorid, Thiaminhydrochlorid, Ca-D-pantothenat, P-Aminobenzoesäure, und D-Biotin, und

• Spurenelementelösung umfassend Spurenelemente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Na ₂ EDTA, CaCI ₂ , H ₃ B0 ₃ , ZnS0 ₄ , FeS0 ₄ , MnCI ₂ , Na ₂ Mo0 ₄ , CoCI ₂ , CuS0 ₄ , und Kl,

noch mehr bevorzugt enthält das Orthophosphat-Mangelmedium:

etwa 133 mM Glucose,

etwa 10 mM (NH ₄ )S0 ,

etwa 13 mM KCl,

etwa 12,5 mM Na ₂ Succinat,

etwa 4 mM CaCI ₂ ,

Vitaminlösung umfassend Myo-inositol, Nicotinsäure, Pyridoxalhydrochlorid, Thiaminhydrochlorid, Ca-D-pantothenat, P-Aminobenzoesäure, und D-Biotin, und • Spurenelementelösung umfassend Na ₂ EDTA, CaCI ₂ , H ₃ B0 ₃ , ZnS0 ₄ , FeS0 ₄ , MnCI ₂ , Na ₂ Mo0 ₄ , CoCI ₂ , CuS0 ₄ , und Kl.

Durch die vorliegende Erfindung wird kein chemisch synthetisiertes, sondern biologisch produziertes polyP hergestellt, als Bestandteil der erfindungsgemäß herzustellenden Hefemasse, bzw. des erfindungsgemäß herzustellenden Hefeextraktes. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt dabei überraschenderweise die Herstellung von Hefemassen bzw. Hefeextrakten mit besonders hohem polyP-Anteil, wie es bislang nicht möglich war. Nur durch diesen hohen polyP-Anteil können die erfindungsgemäß hergestellten polyP-reichen Hefemassen bzw. Hefeextrakte in vorteilhafter weise eingesetzt werden wie hier dargestellt und beschrieben. Die erfindungsgemäß hergestellten polyP- reichen Hefemassen bzw. Hefeextrakte können alternativ zum chemisch synthetisierten polyP als Nahrungsmittelzusätze eingesetzt werden und bieten dabei verschiedene Vorteile.

Wie bereits beschrieben, nehmen Eigenschaften wie Komplexierungsfähigkeit (bspw. bei Weichkäse wünschenswert), Anzahl der Phosphoanhydrid-Bindungen, bakteriostatische Eigenschaften (bspw. Dönerfleisch) sowie Hydrophilie mit wachsender polyP-Kettenlänge zu. Durch die höheren polyP-Ketten kann auch eine geringere polyP-Konzentration eingesetzt werden. Weiterhin kann Pi durch Mikroorganismen (Hefe) bspw. aus Abwasserströmen aufgenommen und recycelt werden. Zudem kann erfindungsgemäß biologisch hergestelltes polyP als Bestandteil von Hefemassen bzw. Hefeextrakten unter Umständen weniger restriktiven Kennzeichnungspflichten unterliegen, so dass die damit versetzten Nahrungsmittel ggf.„label-free“ bleiben könnten. Schließlich bietet der Zusatz von polyP zu Nahrungsmitteln als Bestandteil von Hefemassen bzw. Hefeextrakten wie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung möglich und beschrieben gegenüber dem Zusatz von reinem, chemisch synthetisierten polyP den Vorteil, dass verbesserter Geschmack, erhöhte Bioverfügbarkeit sowie reduzierte T oxizität zutage tritt, wie bspw. schon bei natürlich eisen-, selenium- und zinkhaltigen Hefeextrakten gezeigt werden konnte (Sabatier et al., Eur J Nutr (2017), 56: 1551 -1560; El-Bayoumy et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev (2002), 1 1 : 1459-1465; Vinson & Hsiao, Nutr Rep Int (1985), 32; Tompkins et al., Biol Trace Eiern Res (2007), 120: 28-35).

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung enthält das Orthophosphat- Mangelmedium bevorzugt kein oder keine substantiellen Mengen an Orthophosphat (Pi). In einer Ausführungsform enthält das Orthophosphat-Mangelmedium kein oder keine substantiellen Mengen an Magnesium (Mg)-Quellen, bspw. MgCI ₂ oder MgS0 ₄ . In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Orthophosphat- Mangelmedium weder Pi noch Mg-Quellen, bzw. substantielle Mengen davon. Das Weglassen von Mg-Quellen im Orthophosphat-Mangelmedium brachte positive Effekte hinsichtlich der polyP-Ausbeute (Daten nicht gezeigt).

„Substantielle Mengen“ eines Stoffes, wie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet, bedeutet das Vorliegen mehr als 10.000 ppm, bevorzugt mehr als 1.000 ppm, weiter bevorzugt mehr als 100 ppm oder mehr als 10 ppm des jeweiligen Stoffes.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Orthophosphat-

Mangelmedium Hexosen und/oder Pentosen, Di- und/oder Oligosaccharide aus Hexose und/oder Pentose, und/oder Alkohole wie bspw. Glycerol oder Ethanol als Kohlenstoffquelle (auch C-Quelle genannt). Erfindungsgemäße Beispiele für Hexosen umfassen unter anderem Glucose, Fructose, Mannose oder Galactose, erfindungsgemäße Beispiele für Pentosen umfassen Ribose, Arabinose und Xylose. In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Orthophosphat-Mangelmedium Glucose als hauptsächliche (d.h. mind. 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 oder 99 mol% in Bezug auf alle C- Quellen im Medium) oder alleinige C-Quelle. Erfindungsgemäße Beispiele für Disaccharide umfassen unter anderem Maltose, Isomaltose, Saccharose und Lactose.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Orthophosphat-

Mangelmedium einen oder mehrere Inhaltsstoffe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus • mind. einer C-Quelle (bspw. Hexosen/Pentosen/Disaccharide/Alkohole wie hier beschrieben, bspw. Glucose als hauptsächliche oder als alleinige C-Quelle),

• Stickstoff (N)-Quelle, bspw. (NH ₄ )S0 ₄ ,

• Kalium (K)-Quelle, bspw. KCl,

• Na ₂ Succinat,

• Calcium (Ca)-Quelle, bspw. CaCI ₂ ,

• Vitamine, und

• Spurenelemente.

In einer besonderen Ausführungsform in diesem Zusammenhang enthält das

Orthophosphat-Mangelmedium mind. eine C-Quelle (bspw.

Hexosen/Pentosen/Disaccharide/Alkohole wie hier beschrieben, bevorzugt Glucose als hauptsächliche oder als alleinige C-Quelle), N-Quelle (bspw. (NH ₄ )S0 ₄ ), K-Quelle (bspw. KCl), Na ₂ Succinat, Ca-Quelle (bspw. CaCI ₂ ), Vitamine, und Spurenelemente. In einer ganz besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Orthophosphat- Mangelmedium Glucose, (NH ₄ )S0 ₄ , KCl, Na ₂ Succinat, CaCI ₂ , Vitamine, und Spurenelemente.

In einer spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das

Orthophosphat-Mangelmedium einen oder mehrere Inhaltsstoffe:

• etwa 30 bis 300 mM oder bevorzugt etwa 70 bis 150 mM (besonders bevorzugt etwa 133 mM) Glucose,

• etwa 5 bis 50 mM oder bevorzugt etwa 5 bis 20 mM (besonders bevorzugt etwa 10 mM) (NH ₄ )S0 ₄ ,

• etwa 5 bis 30 mM oder bevorzugt etwa 5 bis 20 mM (besonders bevorzugt etwa 13 mM) KCl,

• etwa 5 bis 30 mM oder bevorzugt etwa 7 bis 20 mM (besonders bevorzugt etwa 12,5 mM) Na ₂ Succinat,

• etwa 2 bis 10 mM oder bevorzugt etwa 2 bis 6 mM (besonders bevorzugt etwa 4 mM) CaCI ₂ ,

• Vitaminlösung umfassend Vitamine ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Myo- inositol, Nicotinsäure, Pyridoxalhydrochlorid, Thiaminhydrochlorid, Ca-D-pantothenat, p-Aminobenzoesäure, und D-Biotin, und/oder

• Spurenelementelösung umfassend Spurenelemente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Na ₂ EDTA, CaCI ₂ , H ₃ B0 ₃ , ZnS0 ₄ , FeS0 ₄ , MnCI ₂ , Na ₂ Mo0 ₄ , CoCI ₂ , CuS0 ₄ , und Kl (Kaliumjodid). In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Orthophosphat- Mangelmedium folgende Inhaltsstoffe:

• etwa 30 bis 300 mM oder bevorzugt etwa 70 bis 150 mM (besonders bevorzugt etwa 133 mM) Glucose,

• etwa 5 bis 50 mM oder bevorzugt etwa 5 bis 20 mM (besonders bevorzugt etwa 10 mM) (NH ₄ )S0 ₄ ,

• etwa 5 bis 30 mM oder bevorzugt etwa 5 bis 20 mM (besonders bevorzugt etwa 13 mM) KCl,

• etwa 5 bis 30 mM oder bevorzugt etwa 7 bis 20 mM (besonders bevorzugt etwa 12,5 mM) Na ₂ Succinat,

• etwa 2 bis 10 mM oder bevorzugt etwa 2 bis 6 mM (besonders bevorzugt etwa 4 mM) CaCI ₂ ,

• Vitaminlösung umfassend Vitamine ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Myo- inositol, Nicotinsäure, Pyridoxalhydrochlorid, Thiaminhydrochlorid, Ca-D-pantothenat, P-Aminobenzoesäure, und D-Biotin, und

• Spurenelementelösung umfassend Spurenelemente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Na ₂ EDTA, CaCI ₂ , H ₃ B0 ₃ , ZnS0 ₄ , FeS0 ₄ , MnCI ₂ , Na ₂ Mo0 ₄ , CoCI ₂ , CuS0 ₄ , und Kl (Kaliumjodid).

In einer besonders spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Orthophosphat-Mangelmedium

• etwa 133 mM Glucose,

• etwa 10 mM (NH ₄ )S0 ₄ ,

• etwa 13 mM KCl,

• etwa 12,5 mM Na ₂ Succinat,

• etwa 4 mM CaCI ₂ ,

• Vitaminlösung umfassend Myo-inositol, Nicotinsäure, Pyridoxalhydrochlorid, Thiaminhydrochlorid, Ca-D-pantothenat, P-Aminobenzoesäure, und D-Biotin, und

• Spurenelementelösung umfassend Na ₂ EDTA, CaCI ₂ , H ₃ B0 ₃ , ZnS0 ₄ , FeS0 ₄ , MnCI ₂ , Na ₂ Mo0 ₄ , CoCI ₂ , CuS0 ₄ , und Kl .

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Orthophosphat- Mangelmedium eine 0,1 x bis 100x oder 0, 1 bis 10 (bevorzugt 1x) Vitamin-Lösung und/oder eine 0, 1x bis 30x oder 0, 1 x bis 10x (bevorzugt 1x) Spurenelemente-Lösung, wobei

(a) eine 1 .000x Vitamin-Lösung folgende Inhaltsstoffe in etwa folgenden Mengen enthält:

138,77 mM Myo-inositol, 8, 12 mM Nicotinsäure, 4,91 mM Pyridoxalhydrochlorid, 2,96 mM Thiaminhydrochlorid, 2, 10 mM Ca-D-pantothenat, 1 ,46 mM p-

Aminobenzoesäure, und 0,20 mM D-Biotin; und

(b) eine 100x Spurenelemente-Lösung folgende Inhaltsstoffe in etwa folgenden Mengen enthält: 4,45 mM Na ₂ EDTA, 3,06 mM CaCI ₂ , 1 ,61 mM H ₃ B0 ₃ , 1 ,56 mM ZnS0 ₄ , 1 ,07 mM FeS0 ₄ , 0,61 mM MnCI ₂ , 0, 16 mM Na ₂ Mo0 , 0, 12 mM CoCI ₂ , 0, 12 mM CuS0 , und 0,06 mM Kl.

In einer spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das

Orthophosphat-Mangelmedium eine 1x Vitamin-Lösung und eine 1x Spurenelemente- Lösung, wobei

(a) eine 1 .000x Vitamin-Lösung folgende Inhaltsstoffe in etwa folgenden Mengen enthält:

138,77 mM Myo-inositol, 8, 12 mM Nicotinsäure, 4,91 mM Pyridoxalhydrochlorid, 2,96 mM Thiaminhydrochlorid, 2, 10 mM Ca-D-pantothenat, 1 ,46 mM p-

Aminobenzoesäure, und 0,20 mM D-Biotin; und

(b) eine 100x Spurenelemente-Lösung folgende Inhaltsstoffe in etwa folgenden Mengen enthält: 4,45 mM Na ₂ EDTA, 3,06 mM CaCI ₂ , 1 ,61 mM H ₃ B0 ₃ , 1 ,56 mM ZnS0 , 1 ,07 mM FeS0 ₄ , 0,61 mM MnCI ₂ , 0, 16 mM Na ₂ Mo0 ₄ , 0, 12 mM CoCI ₂ , 0, 12 mM CuS0 ₄ , und 0,06 mM Kl.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann das orthophosphat-haltige Medium Orthophosphat (Pi) in jedweder geeigneten Form enthalten, wobei es in Lösungen in der Regel dissoziiert vorliegt. In einer Ausführungsform enthält das Orthophosphat-haltige Medium im Rahmen der vorliegenden Erfindung Pi in Form von K ₂ HP0 ₄ oder KH ₂ P0 ₄ , beispielsweise als K ₂ HP0 . In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das orthophosphat-haltige Medium zudem eine C-Quelle, bevorzugt in Form einer Hexose, Pentose, Di- und/oder Oligosaccharid aus Hexose und/oder Pentose, und/oder Alkohole wie bspw. Glycerol oder Ethanol. Erfindungsgemäße Beispiele für Hexosen umfassen unter anderem Glucose, Fructose, Mannose oder Galactose, erfindungsgemäße Beispiele für Pentosen umfassen Ribose, Arabinose und Xylose. In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Orthophosphat-haltige Medium Glucose als hauptsächliche (d.h. mind. 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 oder 99 mol% in Bezug auf alle C- Quellen im Medium) oder alleinige C-Quelle. Erfindungsgemäße Beispiele für Disaccharide umfassen unter anderem Maltose, Isomaltose, Saccharose und Lactose. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Orthophosphat-haltige Medium eine Magnesium (Mg)-Quelle, beispielsweise MgCI ₂ . In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Orthophosphat-haltige Medium neben Orthophosphat (Pi, bevorzugt als K ₂ HP0 ₄ oder KH ₂ P0 ₄ , bevorzugt als K ₂ HP0 ₄ ), eine C-Quelle (bevorzugt Glucose als alleinige oder hauptsächliche C-Quelle), und eine Mg-Quelle (bevorzugt MgCI ₂ ).

In einer spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Orthophosphat-haltige Medium

• etwa 100 bis 400 mM oder bevorzugt etwa 200 bis 300 mM (besonders bevorzugt etwa 250 mM) Glucose,

• etwa 5 bis 100 mM oder bevorzugt etwa 25 bis 90 mM oder etwa 40 bis 80 mM (besonders bevorzugt etwa 60 mM) KH ₂ P0 ₄ , und/oder

• etwa 1 bis 50 mM oder bevorzugt etwa 10 bis 40 mM oder etwa 15 bis 30 mM (besonders bevorzugt etwa 20 mM) MgCI ₂ ,

in einer ganz spezifischen Ausführungsform

• etwa 250 mM Glucose,

• etwa 60 mM KH ₂ P0 ₄ , und

• etwa 20 mM MgCI ₂ .

Das orthophosphat-haltige Medium enthält erfindungsgemäß bevorzugt eine Mg-Quelle, beispielsweise MgCI ₂ . Um Komplexierung oder Verklumpungen im Medium zu vermeiden, kann die Mg-Quelle (bspw. MgCI ₂ ) dem Orthophosphat-haltigen Medium (zu diesem Zeitpunkt dann noch ohne Mg-Quelle, bzw. noch ohne MgCI ₂ ) erst unmittelbar, d.h. bis zu 6 h, 5 h, 4 h, 3 h, 2 h, 1 h, 0,5 h, oder kürzer vor Schritt (4) des erfindungsgemäßen Verfahrens zugeführt werden.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können Schritte (1 ) und/oder (4) des hier beschriebenen und bereit gestellten Verfahrens (d.h. die Fermentationsschritte) unter aeroben, anaeroben, oder teilaeroben bzw. teilanaeroben Bedingungen durchgeführt werden. Da durch (teil)anaerobe Bedingungen Kosten gespart und ggf. auch der polyP-Anteil weiter erhöht werden kann, findet das erfindungsgemäße Verfahren in einer Ausführungsform unter (teil)anaeroben Bedingungen statt.

Im Rahmen der hier vorgelegten und beschriebenen Erfindung kann prinzipiell jede Hefe eingesetzt werden, bspw. Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces marxianus oder Candida utilis, bevorzugt Saccharomyces cerevisiae (Bäcker- oder Backhefe (bspw. Stamm VH2.200 (von der Versuchsanstalt der Hefeindustrie e. V., Berlin)), ober- oder untergärige Bierhefe (Weißbierhefe, Pilshefe)). In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Bäckerhefe eingesetzt, bevorzugt nicht gentechnisch veränderte Bäckerhefe (non- GMO) oder GRAS (Generally Regarded As Safe) Hefe, um Kennzeichnungs- oder Zulassungspflichten zu vermeiden.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die hergestellte Hefemasse weiter verarbeitet werden, um Hefeextrakte zu erhalten. Der polyP-Anteil der so hergestellten Hefeextrakte kann dabei erfindungsgemäß mind. etwa 1 , mind. etwa 2, mind. etwa 3, mind. etwa 4, mind. etwa 5, mind. etwa 6, mind. etwa 7, mind. etwa 8, mind. etwa 9, mind. etwa 10, mind. etwa 1 1 , mind. etwa 12, mind. etwa 13, mind. etwa 14 (bis hierher sowohl für einen pastenförmigen als auch als auch für einen pulverförmigen Hefeextrakt erhältlich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren einschließlich Schritt (9)), mind. etwa 15, mind. etwa 16, mind. etwa 17, mind. etwa 18, mind. etwa 19, oder mind. etwa 20 Gew% (für einen pastenförmigen Hefeextrakt erhältlich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ausschließlich Schritt (9)), bezogen auf das Trockengewicht (Hefeextrakttrockengewicht), betragen. Diese Hefeextrakte können ggf. noch besser zum Einsatz als Nahrungsmittelzusätze geeignet sein. So betrifft die vorliegende Erfindung ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Hefeextraktes mit einem hohen Polyphosphatanteil von mind. etwa 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, oder 14 für pasten- oder pulverförmige Hefeextrakte, oder mind. etwa 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, oder 20 Gew% für pastenförmige Hefeextrakte, jeweils bezogen das Trockengewicht (Hefeextrakttrockengewicht), wobei im Anschluss an das hier beschriebene Verfahren zur Herstellung einer Hefemasse mit hohem polyP-Anteil folgende Schritte durchgeführt werden:

(6) Hitzeinaktivierung der Zellen ,

(7) Hydrolyse durch Enzyme umfassend eine oder mehrere Proteasen, und

(8) Feststoffabtrennung (bspw. Zentrifugation oder Filtration) und Trocknung des Überstandes zum Erhalt eines pastenförmigen Hefeextraktes, und

(9) optional weiterer Trocknung und Mahlung des Hefeextraktes aus (8) zum Erhalt eines pulverförmigen Hefeextraktes.

Das„Trockengewicht“ (hier auch„Hefeextrakttrockengewicht“ genannt) eines Hefeextraktes, auf das sich erfindungsgemäß der polyP-Anteil des Hefeextraktes (in Gew%) bezieht, weist bevorzugt einen Wassergehalt von mind. etwa 1 , 5, 10, 12, 15, 18, oder 20 Gew%, und/oder bevorzugt nicht mehr als etwa 25 Gew % oder etwa 30% Gew% Wasser auf (bei einem pastenförmigen Hefeextrakt), bzw. einen Wassergehalt von mind. etwa 1 , 2, 3, 4 oder 5 Gew%, und/oder nicht mehr als etwa 10, 8, 7 oder 6 Gew%, bevorzugt nicht mehr als etwa 5, 4, oder 3 Gew%, oder besonders bevorzugt nicht mehr als etwa 2 oder 1 Gew % Wasser auf (bei einem pastenförmigen Hefeextrakt), bezogen auf die Gesamtmasse. Der Trockenanteil bzw. die Trockenzellmasse kann dabei nach üblichen Methoden ermittelt werden wie dem Fachmann allgemein bekannt und wie hier auch exemplarisch beschrieben.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Hefeextrakte können neben PolyP grundsätzlich auch Orthophosphat (Pi) enthalten. Beispielsweise kann erfindungsgemäß erhältliches pulverförmiges Hefeextrakt mehr als etwa 7,4, 7,5, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 14,2, oder 14,4 Gew% Pi enthalten, bezogen auf das Trockengewicht (Hefeextrakttrockengewicht), und erfindungsgemäß erhältliches pastenförmiges Hefeextrakt kann bspw. mehr als etwa 7,4 oder 7,5 Gew% Pi enthalten, bezogen auf das Trockengewicht (Hefeextrakttrockengewicht).

Die durchschnittliche Kettenlänge des PolyP im erfindungsgemäß erhältlichen Hefeextrakt kann bspw. mind. etwa 25, 26, 27, 28, 29, 30 oder 31 P-Untereinheiten (bei pastenförmigen Hefeextrakt) oder mind. etwa 2,0, 2,5 oder 3,0 P-Untereinheiten (bei pulverförmigen Hefeextrakten) umfassen.

In einer Ausführungsform wird als Ausgangsmaterial für Schritt (6) des erfindungsgemäßen Verfahrens eine nach Schritt (5) erhaltene Hefemasse mit mind. etwa 20 Gew%, mind. etwa 25 Gew%, oder mind. etwa 30 Gew% (bevorzugt etwa 25 Gew%) Trockenanteil bezogen auf die Gesamtzellmasse verwendet.

Die Hitzeinaktivierung der Zellen gemäß Schritt (6) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird wie dem Fachmann bekannt durchgeführt. Beispielsweise kann die Hitzeinaktivierung bei mind. etwa 85 oder mind. etwa 90 °C (bevorzugt mind. etwa 95 °C) erfolgen, für einen Zeitraum von mind. etwa 5, 10, oder 15 Minuten (bevorzugt etwa 10 min, insbesondere bei etwa 95 °C), wobei bei höherer Temperatur ein kürzerer Zeitrahmen notwendig ist und umgekehrt.

Durch die Hydrolyse durch Enzyme gemäß Schritt (7) mit vorhergehender Hitzeinaktivierung gemäß Schritt (6) des vorliegenden Verfahrens wird erfindungsgemäß und überraschenderweise ein besonders hoher Polyphosphatanteil im Hefeextrakt erreicht, insbesondere im Vergleich zu gängigen Extraktionsverfahren wie Autolyse, Plasmolyse, saure Hydrolyse, oder enzymatische Hydrolyse ohne vorhergehende Hitzeinaktivierung (s. Schritt (6) des erfindungsgemäßen Verfahrens) (Figur 3A). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Hydrolyse durch Enzyme umfassend eine oder mehrere Proteasen mit vorhergehender Hitzeinaktivierung der Zellen u.a. durchgeführt werden nach allgemeinem Wissen des Fachmanns oder wie hier exemplarisch beschrieben. Ein erfindungsgemäß möglicher Ansatz kann bspw. sein: etwa 5 - 70 % (m / v) Suspension (bspw. etwa 15 %) mit feuchter (etwa 5 bis 33 % Trockenanteil der Zellmasse, bspw. etwa 25 %) polyP-reicher Hefe in Wasser, anschließend Erhitzen auf etwa 80 bis 100 °C (bspw. etwa 95 °C) für etwa 1 bis 30 min (bspw. etwa 10 min) zur Abtötung der hefeeigenen Enzyme, dann Abkühlen auf Raumtemperatur, dann Zugabe von etwa 0, 1 bis 10 vol% (bspw. etwa 2 vol%) Flavourzyme® (bevorzugt > etwa 500 U/g) oder andere dem Fachmann geeignete Proteasen. Anschließend Einstellung pH auf etwa 5 bis 8 (bspw. etwa 6), dann Inkubieren bei etwa 40 bis 65 °C (bspw. etwa 50 °C), gefolgt von Inkubieren bei etwa 70 bis 100 °C für etwa 1 bis 60 min (bspw. etwa 80 °C für etwa 30 min), gefolgt von Zentrifugation (bspw. etwa 13.000 g, etwa 20 min), alternativ bspw. Filtration, zum Abtrennen der Feststoffe wie dem Fachmann bekannt. Es folgt Einfrieren des Überstandes bei etwa -85 bis -5 (bspw. etwa -80 °C), dann Trocknung (bspw. Gefriertrocknung) des Überstandes bis zur Gewichtskonstanz für etwa 5 bis 48 h (bspw. etwa 24 h), dann ggf. weitere Trocknung bspw. durch Erhitzen bei etwa 60 bis 150 °C (bspw. etwa 120 °C) bis zur Gewichtskonstanz für etwa 1 bis 24 h (bspw. etwa 21 h) trocknen und dann Mahlen. Alternativ zur Hitzetrocknung wären im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch andere dem Fachmann bekannte Trocknungsverfahren wie bspw. Eindampfen des Überstandes nach Feststoffentfernung (bspw. Zentrifugationsüberstand oder Filtrat) und dann Sprühtrocknung.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann es sich bei den Proteasen um alle gängigen Proteasen handeln, bevorzugt mindestens eine Protease aus Aspergillus oryzae. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann es sich bei den Proteasen in Schritt (7) der vorliegenden Erfindung um einen Enzymmix handeln aus verschiedenen Proteasen aus Aspergillus oryzae, beispielsweise wie kommerziell erhältlich als Flavourzyme® (Novozymes, Dänemark).

Die Feststoffabtrennung (bspw. Zentrifugation oder Filtration) in Schritt (8) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt dabei nach dem Fachmann allgemein als üblich bekannten Verfahren. Bei Einsatz von Zentrifugation im erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt diese wie dem Fachmann bekannt zur Abtrennung von Zelltrümmern und Erhalt des Hefeextraktes. Alternativ zur Zentrifugation sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch andere Verfahren zur Feststoffabtrennung möglich wie dem Fachmann allgemein bekannt, bspw. Filtration.

Zur Trocknung gemäß Schritt (8) des erfindungsgemäßen Verfahrens sind alle gängigen Trocknungsverfahren geeignet wie dem Fachmann bekannt und hier exemplarisch beschrieben, beispielsweise Gefriertrocknung (Lyophilisierung), Sprühtrocknung (bevorzugt mit vorhergehendem Eindampfen des Überstandes nach Feststoffabtrennung, bspw. Zentrifugationsüberstand oder Filtrat). Um einen pastenförmigen Hefeextrakt zu gewinnen, wird die Trocknung gemäß Schritt (8) der vorliegenden Erfindung in einer Ausführungsform durchgeführt, bis der Trockenanteil des Hefeextraktes mind. etwa 60 Gew%, mind. etwa 70 Gew%, mind. etwa 75 Gew%, mind. etwa 80 Gew%, mind. etwa 85, oder mind. etwa 90 Gew% (bevorzugt mind. etwa 75, 80, 85 oder 90 Gew%) bezogen auf das Trockengewicht beträgt. Der Trockenanteil sollte zum Erhalt eines pastenförmigen Hefeextraktes etwa 90 Gew% bezogen auf das Trockengewicht nicht überschreiten.

Wie bereits erwähnt, stellten die Erfinder der vorliegenden Erfindung zu ihrer Überraschung fest, dass kommerziell erhältliche Hefepasten und Hefeextrakte nahezu kein PolyP enthalten (siehe Tabelle 1 ), wohingegen erfindungsgemäße Pasten bzw. Extrakte einen hohen PolyP - Gehalt aufweisen. Dies mag an der Herstellung von Pasten bzw. Extrakten liegen. Üblicherweise werden dafür Autolyse, Plasmolyse oder exogen zugesetzte Enzyme verwendet, wohingegen in der vorliegenden Erfindung eine Hitzeinaktivierung der Hefezellen erfolgt, ehe dann eine Hydrolyse durchgeführt wird. Der Stand der Technik schlägt keine Hitzeinaktivierung, geschweige denn gibt er einen Hinweis darauf und schon gar nicht, dass dadurch eine Paste oder ein Extrakt einen hohen PolyP-Gehalt aufweisen würde.

In der Tat zeigen die Erfinder in der vorliegenden Anmeldung, dass die drei herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Pasten bzw. Extrakten, nämlich der Autolyse, Plasmolyse oder exogene Enzyme zu einem immensen Verlust von PolyP im einer Paste oder einem Extrakt führen (siehe Figur 3A, 2ter, 3ter, 4ter Balken im Vergleich zum 1ten Balken, der den PolyP-Gehalt des Ausgangsmaterials zeigt, nämlich PolyP-haltige Hefezellen, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden), wohingegen eine Hitzeinaktivierung der Hefezellen nur zu geringeren Verlusten an PolyP führt (siehe Figur 3A, 5ter und 6ter Balken). D.h. auf Grund des Schritts der Hitzeinaktivierung erreichen die Erfinder der vorliegenden Erfindung Hefepasten und -extrakte mit einem hohen PolyP-Gehalt. D.h. der Stand der Technik ist letztlich nicht nacharbeitbar bzw. gibt keinen Hinweis darauf, wie man Pasten oder Extrakte mit einem hohen PolyP-Gehalt bereitstellt. Die von den Erfindern vermessenen kommerziell erhältlichen Hefeepasten/extrakte sind letztlich der Beleg dafür, dass es bis dato kein Verfahren gibt, um in Pasten oder Extrakten einen hohen PolyP-Gehalt nach Aufarbeitung von PolyP-haltigen Hefezellen bereitzustellen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung beträgt der Polyphosphatanteil eines erfindungsgemäß hergestellten pastenförmigen Hefeextraktes (d.h. Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bis Schritt (8)) mind. etwa 1 , mind. etwa 2, mind. etwa 3, mind. etwa 4, mind. etwa 5, mind. etwa 6, mind. etwa 7, mind. etwa 8, mind. etwa 9, mind. etwa 10, mind. etwa 1 1 , mind. etwa 12, mind. etwa 13, mind. etwa 14, mind. etwa 15, mind. etwa 16, mind. etwa 17, mind. etwa 18, mind. etwa 19, oder mind. etwa 20 Gew%, bezogen auf das Trockengewicht.

Um einen pulverförmigen Hefeextrakt zu erhalten, kann im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens noch ein weiterer Schritt (9) wie beschrieben angeschlossen werden, gefolgt von einer Mahlung zum Erhalt eines Pulvers. Die Mahlung kann dabei separat mit einem mechanischen Gerät (bspw. Stößel o.ä.) erfolgen, oder bereits im Rahmen der Trocknung durch Reibung und/oder Aufeinanderprallen der Hefeextraktpartikel. Für die weitere Trocknung gemäß Schritt (9) kann jede dem Fachmann bekannte und hier exemplarisch beschriebene Methode angewandt werden, bspw. Sprühtrocknung (bspw. auch mit vorhergehendem Eindampfen des Hefeextraktes), Gefriertrocknung, Heißlufttrocknung, bevorzugt Gefriertrocknung, Sprühtrocknung mit vorhergehendem Eindampfen, oder Heißlufttrocknung. Um einen pulverförmigen Hefeextrakt zu gewinnen, wird die Trocknung gemäß Schritt (9) der vorliegenden Erfindung in einer Ausführungsform durchgeführt, bis der Trockenanteil des Hefeextraktes mind. etwa 90 Gew%, mind. etwa 95 Gew%, oder mind. etwa 98 Gew% (bevorzugt mind. etwa 98 Gew%) bezogen auf das Trockengewicht beträgt

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung beträgt der Polyphosphatanteil eines erfindungsgemäß hergestellten pulverförmigen Hefeextraktes (d.h. Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bis Schritt (9)) mind. etwa 1 , mind. etwa 2, mind. etwa 3, mind. etwa 4, mind. etwa 5, mind. etwa 6, mind. etwa 7, mind. etwa 8, mind. etwa 9, mind. etwa 10, mind. etwa 1 1 , mind. etwa 12, mind. etwa 13, oder mind. etwa 14 Gew%, bezogen auf das Trockengewicht.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Hefemasse mit hohem Polyphosphatanteil von mindestens etwa 5, mind. etwa 6, mind. etwa 7, mind. etwa 8, mind. etwa 9, mind. etwa 10, mind. etwa 1 1 , mind. etwa 12, mind. etwa 13, mind. etwa 14, mind. etwa 15, mind. etwa 16, mind. etwa 17, mind. etwa 18, mind. etwa 19, mind. etwa 20, mind. etwa 21 , mind. etwa 22, mind. etwa 23, mind. etwa 24, oder mind. etwa 25 Gew%, bezogen auf das Trockengewicht, erhältlich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wie hier bereitgestellt und beschrieben, einschließlich Schritt (5).

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Hefeextrakt mit hohem Polyphosphatanteil von mind. etwa 1 , mind. etwa 2, mind. etwa 3, mind. etwa 4, mind. etwa 5, mind. etwa 6, mind. etwa 7, mind. etwa 8, mind. etwa 9, mind. etwa 10, mind. etwa 1 1 , mind. etwa 12, mind. etwa 13, mind. etwa 14, mind. etwa 15, mind. etwa 16, mind. etwa 17, mind. etwa 18, mind. etwa 19, oder mind. etwa 20 Gew%, bezogen auf das Trockengewicht, erhältlich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wie hier bereitgestellt und beschrieben, bevorzugt einschließlich Schritt (8) (und/oder bevorzugt ausschließlich Schritt (9)), wobei der Hefeextrakt bevorzugt pastenförmig ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Hefeextrakt mit hohem Polyphosphatanteil von mind. etwa 1 , mind. etwa 2, mind. etwa 3, mind. etwa 4, mind. etwa 5, mind. etwa 6, mind. etwa 7, mind. etwa 8, mind. etwa 9, mind. etwa 10, mind. etwa 1 1 , mind. etwa 12, mind. etwa 13, oder mind. etwa 14 Gew%, bezogen auf das Trockengewicht, erhältlich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wie hier bereitgestellt und beschrieben, einschließlich Schritt (9), wobei der Hefeextrakt bevorzugt pulverförmig ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft überdies ein Lebensmittel, enthaltend die erfindungsgemäße Hefemasse oder den erfindungsgemäßen Hefeextrakt, entweder als pastenförmigen Hefeextrakt oder als pulverförmigen Hefeextrakt, wie hierin beschrieben.

Die Ausführungsformen, welche den Gegenstand der vorliegenden Erfindung charakterisieren, sind hier beschrieben, in den Figuren gezeigt, in den Bespielen dargestellt, und/oder in den Ansprüchen definiert.

Im Rahmen der hier vorliegenden Erfindung umfassen die Begriffe „der/die/das“ oder „ein/eine“ im Singular und im Plural, auch jeweils den Plural bzw. den Singular, soweit nichts anderes bestimmt ist oder sich aus dem Kontext nichts anderes eindeutig herleiten lässt.

Der Begriff „mindestens“, „mind.“, oder„mehr als“ vor einer Serie von Elementen ist im Rahmen der hier vorliegenden Erfindung so aufzufassen, dass er jeweils auch jedes einzelne Element dieser Serie bestimmt. Gleiches gilt analog für Begriffe wie„max(imal)“, „bis zu“ oder„höchstens“.

Der Begriff „und/oder“ wie im Rahmen der hier vorliegenden Erfindung verwendet umfasst sowohl den Begriff „und“ allein,„oder“ allein, als auch jede mögliche Kombination aus den Elementen, die von dem Begriff„und/oder“ verbunden sind.

Der Begriff „etwa”, „ungefähr“, „ca.” oder ähnlich wie im Rahmen der hier vorliegenden Erfindung verwendet ist synonym zu verstehen und bedeutet, sofern nicht explizit anders angegeben, innerhalb 20%, bevorzugt innerhalb 15%, weiter bevorzugt innerhalb 10%, weiter bevorzugt innerhalb 5%, weiter bevorzugt innerhalb 3%, weiter bevorzugt innerhalb 2% oder - besonders bevorzugt - 1% des jeweils folgenden Wertes oder Bereichs. Es ist jeweils auch exakt der folgende Wert oder Bereich umfasst.

Die Begriffe „umfassen“, „einschließen“, „beinhalten“, „inkludieren“ oder ähnlich sowie Beugungen davon wie im Rahmen der hier vorliegenden Erfindung verwendet implizieren die Einschließung der folgenden Elemente oder Gruppe(n) von Elementen, aber nicht die Ausschließung der jeweiligen Elemente oder Gruppen davon. Diese Begriffe umfassen auch den einschränkenden Begriff „bestehen aus“ oder ähnlich sowie Beugungen davon, welcher wiederum, wenn expressis verbis aufgeführt, alles andere außer den darauf folgenden Elementen oder Schritten ausschließt.

Der Begriff „bestehend aus” oder ähnlich sowie Beugungen davon schließt, wenn expressis verbis aufgeführt, alles andere außer den darauf folgenden Elementen oder Schritten aus. Der Begriff „im Wesentlichen bestehend aus“ oder ähnlich sowie Beugungen davon hingegen schließt keine Elemente oder Schritte aus, welche den grundlegenden Charakter des folgenden Elements oder Schrittes nicht in relevanter Weise beeinflussen.

Der Begriff„erhältlich durch“ (oder„herstellbar durch“ oder ähnliche Begrifflichkeiten) wie hier verwendet bedeutet, dass das nach dem entsprechenden beschriebenen Verfahren erhältliche Produkt auch durch andere Verfahren erhalten werden kann, soweit sich das Produkt strukturell nicht von einem Produkt unterscheidet, welches durch genau das beschriebene Verfahren erhalten wurde. Der Begriff„erhältlich durch“ umfasst insoweit auch den einschränkenden Begriff „erhalten durch“ (oder „hergestellt durch“ oder ähnliche Begrifflichkeiten), wobei bei letzterem das Produkt tatsächlich durch genau das beschriebene Verfahren erhalten wurde.

Die Definitionen und Beschreibungen verschiedener Termini wie hier beschrieben dient lediglich dem Zweck der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen und darf nicht als limitierend hinsichtlich des Gegenstands der Erfindung verstanden werden, welcher ausschließlich in den Ansprüchen definiert wird.

Alle Publikationen und Referenzen, soweit hier zitiert, gelten hiermit als vollumfänglich in die Beschreibung inkludiert. Die Figuren zeigen:

Figur 1 : Vergleiche im Orthophosphat-Mangelmedium. Gemessenes polyP nach Pi-

Zuführung (als KP0 ₃ ) in CDW (Zelltrockenmasse oder Zelltrockengewicht; Cell Dry Weight) in Gew% auf y-Achse. pH bei 5,0. Fermentation bei B, C, D für 6 h bei 30 °C im Orthophosphat-Mangelmedium. 17 h Lagerung bei 4 °C. Durchführung analog wie in den Beispielen gezeigt.

A: Inkubationszeit während Fermentation im Orthophosphat-Mangelmedium, 30 °C.

B: Glucose-Anteile im Orthophosphat-Mangelmedium. Weitere Zusatzstoffe im Medium: 40 mM (NH ₄ )S0 ₄ , 13,3 mM KCl, 12,5 mM Na ₂ Succinat, 8 mM MgS0 , 4 mM CaCI ₂ .

C: Vitaminlösung-Verdünnungen im Orthophosphat-Mangelmedium (1 x Vitaminlösung: 138,77 mM Myo-inositol, 8, 12 pM Nicotinsäure, 4,91 pM Pyridoxalhydrochlorid, 2,96 pM Thiaminhydrochlorid, 2,10 pM Ca-D- pantothenat, 1 ,46 pM p-Aminobenzoesäure, und 0,20 pM D-Biotin). Weitere Zusatzstoffe in Medium: 133 mM Glucose, 10 mM (NH ₄ )S0 ₄ , 13,3 mM KCl, 12,5 mM Na ₂ Succinat, 4 mM CaCI ₂ , 1x Spurenelementelösung wie hier beschrieben. 1. Balken: Referenz ohne Vitamin- oder Spurenelementelösung, andere Balken mit 1x Spurenelementelösung und variierender Vitaminlösungszusätze wie dargestellt.

D: Spurenelementelösung-Verdünnungen im Orthophosphat-Mangelmedium (100x Spurenelementelösung: 4,45 mM Na ₂ EDTA, 3,06 mM CaCI ₂ , 1 ,61 mM H ₃ BO ₃ , 1 ,56 mM ZnS0 , 1 ,07 mM FeS0 , 0,61 mM MnCI ₂ , 0, 16 mM Na ₂ Mo0 , 0, 12 mM CoCI ₂ , 0, 12 mM CuS0 , und 0,06 mM Kl). Weitere Zusatzstoffe in Medium: 133 mM Glucose, 10 mM (NH ₄ )S0 , 13,3 mM KCl, 12,5 mM Na ₂ Succinat, 4 mM CaCI ₂ , und 1x Vitaminlösung wie hier beschrieben; Spurenelementelösung variiert wie dargestellt.

Figur 2: Vergleiche im Orthophosphat-haltigen Medium. Gemessenes polyP nach Pi-

Zuführung (als KPO ₃ ) in CDW (Zelltrockenmasse oder Zelltrockengewicht; Cell Dry Weight) in Gew% auf y-Achse. pH bei 6,0. Fermentation bei 30 °C. Durchführung analog wie in den Beispielen gezeigt.

A: Pi im Orthophosphat-haltigen Medium (als KH ₂ P0 ); 250 mM Glucose, 20 mM MgCI ₂ und variierende Mengen Pi.

B: Glucose-Anteile im Orthophosphat-haltigen Medium. Weitere Zusatzstoffe im Medium: 60 mM KH ₂ P0 , 20 mM MgCI ₂ . C: MgCI ₂ -Anteile im Orthophosphat-haltigen Medium. Weitere Zusatzstoffe im Medium: 60 mM KH ₂ P0 ₄ , 250 mM Glucose. Das Weglassen von Mg-Quellen im Orthophosphat-Mangelmedium brachte überraschenderweise positive Effekte hinsichtlich der polyP-Ausbeute (Daten nicht gezeigt).

D: Inkubationszeit während Fermentierung. „Start“ der Fermentierung im Orthophosphat-haltigen Medium ab 6 h (davor im Orthophosphat- Mangelmedium).

Figur 3: Analyse der Hefeextrakt-Produktion.

Die vorliegende Erfindung kann ergänzend auch durch die folgenden Gegenstände beschrieben werden:

(1 ) Verfahren zur Herstellung einer Hefemasse mit hohem Polyphosphatanteil von mindestens etwa 5 Gew% bezogen auf die Trockenzellmasse, umfassend folgende Schritte:

(1 ) Fermentieren von Hefe in einem Orthophosphat-Mangelmedium für etwa 4 bis 9 h bei etwa 28 bis 32 °C bei einem pH von etwa 4 bis 6,

(2) Trocknung der Zellen,

(3) optional Lagerung der Zellen bis etwa 24 h bei etwa 2 bis 10 °C,

(4) Überführung der Zellen in ein Orthophosphat-haltiges Medium und Fermentieren für etwa 1 ,0 bis 3,5 h bei etwa 23 bis 32 °C bei einem pH von etwa 4 bis 7, und

(5) Trocknung der Zellen, wobei

das Polyphosphat als KP0 ₃ gemessen wird.

(2) Verfahren nach Gegenstand 1 , wobei das Orthophosphat-Mangelmedium keine Mg- Quelle und/oder kein Orthophosphat enthält.

(3) Verfahren nach Gegenstand 1 oder 2, wobei das Orthophosphat-Mangelmedium Glucose als primäre C-Quelle enthält.

(4) Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 3, wobei das Orthophosphat- Mangelmedium einen oder mehrere Inhaltsstoffe enthält ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glucose, (NH ₄ )S0 ₄ , KCl, Na ₂ Succinat, CaCI ₂ , Vitamine und Spurenelemente. (5) Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 4, wobei das Orthophosphat- Mangelmedium einen oder mehrere Inhaltsstoffe enthält:

• etwa 30 bis 300 mM Glucose,

• etwa 5 bis 50 mM (NH ₄ )S0 ₄ ,

• etwa 5 bis 30 mM KCl,

• etwa 5 bis 30 mM Na ₂ Succinat,

• etwa 2 bis 10 mM CaCI ₂ ,

• Vitaminlösung umfassend ein oder mehrere Vitamine ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Myo-inositol, Nicotinsäure, Pyridoxalhydrochlorid, Thiaminhydrochlorid, Ca-D-pantothenat, P-Aminobenzoesäure, und D-Biotin, und/oder

• Spurenelementelösung umfassend Spurenelemente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Na ₂ EDTA, CaCI ₂ , H ₃ B0 ₃ , ZnS0 ₄ , FeS0 ₄ , MnCI ₂ , Na ₂ Mo0 ₄ , CoCI ₂ , CuS0 ₄ , und Kl.

(6) Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 5, wobei das Orthophosphat- Mangelmedium eine 0,1 x bis 100x Vitamin-Lösung und/oder eine 0,1 x bis 30x Spurenelemente-Lösung enthält, wobei

(a) eine 1 .000x Vitamin-Lösung folgende Inhaltsstoffe in etwa folgenden Mengen enthält: 138,77 mM Myo-inositol, 8, 12 mM Nicotinsäure, 4,91 mM Pyridoxalhydrochlorid, 2,96 mM Thiaminhydrochlorid, 2, 10 mM Ca-D- pantothenat, 1 ,46 mM p-Aminobenzoesäure, und 0,20 mM D-Biotin; und

(b) eine 100x Spurenelemente-Lösung folgende Inhaltsstoffe in etwa folgenden Mengen enthält: 4,45 mM Na ₂ EDTA, 3,06 mM CaCI ₂ , 1 ,61 mM H ₃ B0 ₃ , 1 ,56 mM ZnS0 ₄ , 1 ,07 mM FeS0 ₄ , 0,61 mM MnCI ₂ , 0, 16 mM Na ₂ Mo0 ₄ , 0, 12 mM CoCI ₂ , 0, 12 mM CuS0 , und 0,06 mM Kl.

(7) Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 6, wobei das Orthophosphat-haltige Medium einen oder mehrere Inhaltsstoffe enthält ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glucose, MgCI ₂ , und KH ₂ P0 ₄ .

(8) Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 7, wobei das Orthophosphat-haltige Medium neben Orthophosphat einen oder mehrere Inhaltsstoffe enthält:

• etwa 100 bis 400 mM Glucose,

etwa 25 bis 100 mM KH ₂ P0 ₄ , und

etwa 10 bis 50 mM MgCI ₂ . (9) Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 8, wobei dem Orthophosphat-haltigen Medium erst unmittelbar vor Schritt (4) MgCI ₂ zugeführt wird.

(10) Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 9, wobei die Fermentationsschritte aus Schritten (1 ) und/oder (4) unter (teil)anaeroben Bedingungen durchgeführt werden.

(1 1 ) Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 10, wobei die Hefe ausgewählt ist der Gruppe bestehend aus Bäckerhefe und Bierhefe.

(12) Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 1 1 , wobei ferner aus der erhaltenen Hefemasse ein Hefeextrakt mit einem hohen Polyphosphatanteil von mindestens etwa 1 Gew% bezogen auf das Trockengewicht, hergestellt wird, umfassend folgende Schritte:

(6) Hitzeinaktivierung der Zellen,

(7) Hydrolyse durch Enzyme umfassend eine oder mehrere Proteasen, und

(8) Feststoffabtrennung und Trocknung des Überstandes zum Erhalt eines pastenförmigen Hefeextraktes, und

(9) optional weitere Trocknung und Mahlung des Hefeextraktes aus (8) zum Erhalt eines pulverförmigen Hefeextraktes.

(13) Hefemasse mit hohem Polyphosphatanteil von mindestens etwa 5 Gew% bezogen auf die Trockenzellmasse, erhältlich nach einem der Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 1 1 .

(14) Hefeextrakt mit hohen Polyphosphatanteil von mindestens etwa 1 Gew% bezogen auf das Trockengewicht, erhältlich nach Gegenstand 12 ausschließlich Schritt (9).

(15) Hefeextrakt mit hohen Polyphosphatanteil von mindestens etwa 1 Gew% bezogen das Trockengewicht, erhältlich nach Gegenstand 12 einschließlich Schritt (9).

Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Illustration der vorliegenden Erfindung und dürfen nicht als Limitierung des erfindungsgemäßen Gegenstands verstanden werden, welcher ausschließlich in den Ansprüchen definiert wird. Beispiele

Chemikalien und Enzyme

In TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5 - 8,0) gesättigtes Phenol und phosphatfreie Filterpapiere wurden von Carl Roth (Deutschland) bezogen. PolyP Budit 7 wurde von Budenheim (Deutschland) bezogen. Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren und Proteasen von Aspergillus oryzae (Flavourzyme®) wurden von Sigma-Aldrich (MO, USA) bezogen. Dow Corning Hochvakuum-Fett wurde von VWR (PA, USA) bezogen. S. cerevisiae Exopolyphosphatase 1 und S. cerevisiae Pyrophosphatase 1 wurden als Doppel-Strep-Tag Fusionsprotein in E. coli exprimiert und durch Affinitätschromatographie aufgereinigt (Christ & Blank, Anal Biochem (2018), 548: 82-90). Alle Chemikalien, die zur Pi-Analyse und Fermentation verwendet wurden, hatten Analyse-Reinheitsgrad.

Analytische polyP-Extraktion für S. cerevisiae

Lösungen wurden aufbewahrt in frischer Plastik- oder Glasware, welche 1 x mit 0, 1 M HCl und 3x mit Aqua bidest. ausgewaschen wurde. Alle Schritte wurden bei RT durchgeführt. S. cerevisiae Zellmasse wurde 2x mit sterilem Aqua bidest. durch wiederholte Zentrifugation (5.000 g, 10 min) und Resuspendierung gewaschen. Die Zellmasse wurde für 5 min bei RT auf phosphatfreiem Papier getrocknet, was zu einer Zellpaste mit einem Gehalt von etwa 25 % Trockengewicht bezogen auf die Gesamtmasse führte. Der Trockenmassengehalt wurde bestimmt durch ÜN-Trocknung bei 120 °C und folgendem Trocknen / Wiegen bis zu einer konstanten Masse bei 120 °C in einem Feuchtigkeits-Analysegerät. Für die polyP-Extraktion wurde 24 bis 26 g, vorzugsweise 24 bis 26 mg, feuchte S. cerevisiae Zellpaste (enthaltend ca. 25 Gew% Trockenmasse) in ein 2 ml Reaktionsröhrchen eingewogen und bei -20 °C bis zur Extraktion aufbewahrt. Zur Zellmasse wurden 400 mI ME-Puffer (25 mM MOPS, 2,5 mM Na ₂ EDTA, pH 7,0 mit HCI/NaOH, gefiltert (0,2 pm Poren), Lagerung bei 4 °C) zugefügt. Um die Zellen vollständig zu resuspendieren, wurden die Röhrchen für 20 Sek gevortext. Nach einem kurzen Schleudern der Röhrchen bei 1 .000 g (um Flüssigkeit vom Röhrchendeckel zu entfernen), wurde 300 mI Phenol zugefügt. Das gesättigte Phenol wurde mit TE-Puffer eingestellt und unter einer Schicht von TE-Puffer bei 4 °C gelagert und vor Verwendung auf RT gebracht. Um die Bildung einer durchgängigen Phenol-Wasser-Emulsion zu ermöglichen, wurde das Röhrchen für 20 sek gevortext. Als nächstes wurde das Röhrchen für 10 min bei 45 °C inkubiert und 2 min auf Eis gestellt. Das Röhrchen wurde wieder kurz bei 1.000 g geschleudert, um den Deckel von Flüssigkeit zu befreien. Nach Zugabe von 1 ml Chlorform wurde das Röhrchen für 20 sek gevortext, damit das Chloroform das Phenol, das in der wässrigen Phase gelöst war, zu entfernen. Das Röhrchen wurde erneut kurz bei 1.000 g geschleudert. Mit einem kleinen Spatel wurden ca. 200 mg des Low-density Phase-Iock Gels innerhalb des Deckels des Röhrchens aufgebracht. Zwischen den Proben wurde der Spatel mit 70 vol% EtOH gereinigt. Nach Zentrifugation des Röhrchens bei 12.000 g für 5 min wurde die obere wässrige Phase quantitativ in ein anderes Reaktionsgefäß überführt. Das Extraktionsvolumen betrug ca. 500 mI. Der pH war bereits neutral und musste nicht weiter eingestellt werden. Die Extrakte wurden bei -20 °C gelagert bis zur polyP-Quantifizierung.

PolyP-Quantifizierung

Die Extrakte wurden vor Verwendung mit Aqua bidest. verdünnt. Mit der Beschreibung für analytische polyP-Extraktion (s. oben) und einer zellulären polyP-Konzentration von bspw. 28 Gew% polyP (als KP0 ₃ ) im Trockenzellgewicht wurden die Proben 300-fach verdünnt. PolyP-Quantifizierung wurde gern. Christ & Blank, Anal Biochem (2018), 548: 82-90 durchgeführt: 9 Versenkungen einer 96-Well-Platte wurden jeweils mit 100 mI verdünntem Extrakt gefüllt.50 mI Enzym reaktionspuffer (15 mM Magnesiumacetat, 60 mM Tris, 150 mM Ammoniumacetat, pH 7,5), 50 mI Enzymreaktionspuffer mit 1 ,1 ^* 10 ⁴ U S. cerevisiae Exopolyphosphatase 1 und 1 ,3 ^* 10 ² U S. cerevisiae Pyrophosphatase 1 wurden jeweils zu den 3 Versenkungen zugeführt. Andernorts auf der 96-Well-Platte wurden 100 mI KH ₂ P0 Standardmixturen mit 50 mI Enzymreaktionspuffer platziert. Nach 1 h bei 37 °C wurde zu jeder Versenkung 50 mI Lösung B (2,4 mM Ammoniumheptalybdat, 600 mM H ₂ S0 ₄ , 0,6 mM Antimon Kaliumtartrat, 88 mM Ascorbinsäure) gegeben. Nach 2 min bei RT wurde die Absorption bei 882 nm gemessen (indikativ für die Pi-Konzentration). Die polyP- Konzentration und durchschnittliche Kettenlänge wurden basierend auf dem enzymatisch freigesetzten Pi berechnet. Der PolyP-Gehalt im Zelltrockengewicht wurde gemäß Formel 1 berechnet. Die echte PolyP-Konzentration war definiert durch Gesamt-PolyP minus blankes Pi. PolyP wurde definiert als KP0 ₃ und hatte daher ein Molekulargewicht von 1 18,07 g ^* mol 1.Wenn eine Probe verdünnt wurde, bspw. 300-fach, wurde die Verdünnung mit 300 angegeben.

(Formel 1 )

Herstellung von polvP-reichen S. cerev/s/ae-Zellen Dieses Protokoll wurde verwendet zur Herstellung von S. cerevisiae Zellen mit 28 Gew% polyP (als KP0 ₃ ) in Trockenzellgewicht. Zwei Medien wurden verwendet für dieses Verfahren, wobei„Nährmedium Komponente A“ und „Nährmedium Komponente B“ als ein Medium angesehen wurden, da sie beide Bestandteil eines orthophosphat-haltigen Mediums waren, jedoch nicht unverzüglich gemeinsam angesetzt sondern erst kurzfristig zusammengebracht wurden, um Verklumpungen zu vermeiden.

• Orthophosphat-Mangelmedium:

o 133 mM Glucose, 10 mM (NH ₄ )S0 , 13,3 mM KCl, 12,5 mM Na ₂ Succinat, 4 mM CaCI ₂ , 1x Vitamin- und 1 x Spurenelementelösung (1.000x Vitaminlösung: 138,77 mM Myo-inositol, 8, 12 mM Nicotinsäure, 4,91 mM Pyridoxalhydrochlorid, 2,96 mM Thiaminhydrochlorid, 2, 10 mM Ca-D-pantothenat, 1 ,46 mM p-Aminobenzoesäure, und 0,20 mM D-Biotin; 100x Spurenelementelösung: 4,45 mM Na ₂ EDTA, 3,06 mM CaCI ₂ , 1 ,61 mM H ₃ B0 ₃ , 1 ,56 mM ZnS0 ₄ , 1 ,07 mM FeS0 ₄ , 0,61 mM MnCI ₂ , 0, 16 mM Na ₂ Mo0 , 0, 12 mM CoCI ₂ , 0, 12 mM CuS0 , und 0,06 mM Kl) o pH 5 mit HCl/ NaOH, gefiltert (0,2 pm Poren), Lagerung bei 4 °C

• Orthophosphat-haltiges Medium:

o Nährmedium Komponente A

^■ 277,5 mM Glucose, 66,6 mM KH ₂ P0 ₄

^■ pH 6,4 mit HCl/ KOH, gefiltert (0,2 pm Poren), Lagerung bei 4 °C o Nährmedium Komponente B

^■ 200 mM MgCI ₂

^■ gefiltert (0,2 pm Poren), Lagerung bei RT

Das Orthophosphat-Mangelmedium wurde versetzt mit 1 ml 1 000x Vitamin-Lösung pro I und 10 ml 100x Spurenelementelösung pro I, um jeweils eine 1x Lösung im Medium zu erhalten . Zur Herstellung der Vitaminlösung wurde das D-Biotin in 10 ml 100 mM NaOH gelöst, alle anderen Bestandteile wurden nach Verdünnung auf 750 ml unter pH-Kontrolle (pH 6,5 mit HCl/ NaOH) gelöst. Das Volumen wurde auf 1 I aufgefüllt und die Lösung gefiltert (0,2 pm Poren), die Lagerung erfolgte bei 4 °C. Zur Herstellung der Spurenelementelösung wurde Na ₂ EDTA und ZnS0 in 750 ml Aqua bidest. gelöst. Nach Einstellung auf pH 6,0 mit 1 M NaOH wurden die übrigen Chemikalien hinzugegeben. Nach Einstellung auf pH 4,0 mit 1 M HCl wurde die Lösung gefiltert (0,2 pm Poren) und bei -20 °C gelagert.

Die Nährmedien-Komponenten A und B wurden 1 , 1 1 -fach (A) bzw. 10-fach konzentriert und im Volumenverhältnis A:B=9:1 gemischt, und zwar unmittelbar vor Inokulierung, um die Bildung (Verklumpung) von Magnesium-Phosphat-Präzipitaten zu vermeiden. Alle Medien wurden vor Inokulierung auf 30 °C erwärmt.

Die Fermentation selbst erfolgte aerob oder anaerob, wobei die anaerobe Fermentation kaum nennenswert höhere PolyP-Mengen erzielte. Zellmasse wurde durch SD (synthetic defined; 0,68 Gew% Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren, 2 Gew% Glucose, pH 5,4, gefiltert (0,2 pm Poren)) Medium erzeugt. Als Hefe wurden S. cerevisiae Zellen VH2.200 oder kommerziell erhältliche Hefe (Bäckerhefe, aus dem Supermarkt) eingesetzt. Nach Ernte durch Zentrifugation (5.000 g, 10 min) wurde die Zellmasse mit Aqua bidest. gewaschen und getrocknet (verstrichen auf Pi-freiem Filterpapier, Lufttrocknung 5 min bei RT). Das führte zu einer Zellpaste mit ca. 25 Gew% Trockenanteil, die bei 4 °C bis zu 2 Wochen gelagert wurde.

Das Animpfen (Inokulieren) des Orthophosphat-Mangelmediums erfolgte mit 2,5 g CWW (Zellfeuchtmasse oder Zellfeuchtgewicht, Cell Wet Weight) pro I (0,62 g CDW, Zelltrockenmasse oder Zelltrockengewicht, Cell Dry Weight). Die Fermentation erfolgte für 6 h bei 30 °C, gefolgt von Zentrifugation (5.000 g, 10 min), Waschen mit Aqua bidest. und Trocknung (auf Pi-freiem Filterpapier, Lufttrocknung 5 min bei RT). Anschließend wurden die Zellen für 17 h bei 4 °C gelagert. Die 17 h Lagerung begann bzw. endete, als die Schüttel oder Rührplatte, die bei der Fermentation genutzt worden waren, ab- bzw. angestellt wurde. Die Zelldichte bei Animpfen des Orthophosphat-haltigen Mediums war 30 g CWW pro I (7,5 g CDW), die Fermentation erfolgte für 2,5 h bei 30 °C, gefolgt von Zentrifugation (5.000 g, 10 min), Waschen mit Aqua bidest. und Trocknung (auf Pi-freiem Filterpapier, Lufttrocknung 5 min bei RT). Zur polyP-Analyse wurden Aliquots von 24 bis 26 mg in 2 ml Gefäßen bei -20 °C gelagert.

PolyP-Ausbeuten siehe Figuren 1 und 2 (Durchführung bei anderen Mengen an Mediumsinhaltsstoffen als hier in den Beispielen angegeben analog für die in Figur 1 und 2 angegeben Mengen der Inhaltsstoffe).

HPLC-Analvse des Fermentationsmediums

Glucose, Ethanol und Glycerol im Orthophosphat-Mangelmedium und im Orthophosphat- haltigen Medium wurden mittels HPLC quantifiziert. Proben wurden auf einer Fermentations- Beobachtungssäule (150 x 7,8 mm, Bio-Rad, CA, USA) getrennt bei 60 °C, 8,8 ml/min, mit 5 mM H ₂ S0 ₄ als mobile Phase und einem Refraktionsindexdetektor. Produktion eines polyP-reichen Hefeextrakts

Es wurden verschiedene Extraktionsverfahren durchgeführt und hinsichtlich der polyP- Ausbeute verglichen: Autolyse, Plasmolyse, enzymatische Hydrolyse ohne oder mit vorhergehender Hitzeinaktivierung. Dabei zeigte sich, dass insbesondere die enzymatische Hydrolyse mit vorhergehender Hitzeinaktivierung zur einer deutlich erhöhten PolyP-Ausbeute führte.

Das Protokoll zur Durchführung der Autolyse zur Herstellung eines Hefeextraktes folgte nach Tanguler et al., Turk J Agric For (2009), 33: 149-154. Der pH einer 15 Gew% Suspension von frisch hergestellten, feuchten, polyP-reichen S. cerev/ ^' s/ ^' ae-Zellen (ca. 25 Gew% Trockenanteil) in sterilem Aqua bidest. wurde auf 6,0 eingestellt mit HCl/ NaOH. Die Zellsuspension wurde bei 50 °C für 24 h inkubiert und weitere 30 min bei 80 °C im Wasserbad. Die lösliche Masse wurde von den unlöslichen Zelltrümmern durch Zentrifugation (13.000 g, 20 min) getrennt. Der Überstand wurde bei -80 °C eingefroren und anschließend gefriergetrocknet für 24 h in flachen Edelstahlschalen zum Erhalt eines pastenförmigen Hefeextraktes.

Bei der Plasmolyse wurde das Autolyse-Protokoll angepasst nach Münch et al., J Agric Food Chem (1997), 45: 1338-1344. Es wurden der Hefesuspension vor pH-Einstellung 5 g NaCI / 1 und 4,5 g Ethylacetat/ 1 zugegeben.

Für die enzymatische Hydrolyse ohne vorhergehende Hitzeinaktivierung wurde das Autolyse-Protokoll angepasst nach Bayajargal (Lee et al., Prev Nutr Food Sei (2015), 20: 284-291 ; Bayarjargal et al., Mong J Chem (201 1 ), 12: 88-91 ). Es wurden vor der pH- Einstellung 2 vol% Flavourzyme® zugegeben.

Für die enzymatische Hydrolyse mit vorhergehender Hitzeinaktivierung wurde das Autolyse- Protokoll angepasst nach Milic et al., J Serb Chem Soc (2007), 72: 451 -457. Die Hefe- Suspension wurde bei 95 °C für 10 min inkubiert, abgekühlt, 2 vol% Flavourzyme® (vgl. „enzymatische Hydrolyse ohne vorhergehende Hitzeinaktivierung“ oben) hinzugegeben und dann der pH eingestellt.

Das Hefeextraktpulver wurde hergestellt durch Trocknen der Hefeextraktpaste bei 120 °C für etwa 21 h im Heißluftinkubator und anschließendem Mahlen (alternativ wäre bspw. auch Eindampfen und Sprühtrocknung des Zentrifugationsüberstandes ohne Mahlung im Rahmen der vorliegenden Erfindung möglich). Der Anteil an Trockenmasse wurde ermittelt durch Trocknung der gefriergetrockneten Hefeextraktpaste bei 120 °C ÜN in einem Feuchtigkeits-Analysegerät bis zur konstanten Masse. Zur polyP-Analyse wurden ca. 25 mg Hefeextraktpaste oder -pulver in 0,5 ml ME- Puffer gelöst. Nach angemessener Verdünnung in sterilem Aqua bidest wurde die polyP- Quantifizierung wie beschrieben durchgeführt.

Bei der Herstellung von Hefeextrakten nach Autolyse, Plasmolyse, enzymatischer Hydrolyse ohne vorhergehende Hitzeinaktivierung lag der polyP-Anteil unter 3 Gew% (2.-4. Balken Figur 3A). Hingegen führte die Herstellung von Hefeextrakten mithilfe enzymatischer Hydrolyse mit vorhergehender Hitzeinaktivierung zu einem polyP-Anteil von 20,1 Gew% (5. Balken Figur 3A; Tabelle 1 ). Die Mengen an Pi sind hingegen bei Herstellung von Hefeextrakten nach Autolyse, Plasmolyse, enzymatischer Hydrolyse ohne vorhergehende Hitzeinaktivierung am höchsten (bis zu 50 Gew%) und bei Herstellung von Hefeextrakten nach enzymatischer Hydrolyse mit vorhergehender Hitzeinaktivierung am niedrigsten (7,6 Gew%; 5. Balken Figur 3B). Die Herstellung von Hefeextrakten nach enzymatischer Hydrolyse mit vorhergehender Hitzeinaktivierung führte auch zur längsten polyP-Kettenlänge (durchschnittlich 31 ,2 P-Untereinheiten; 4. Balken Figur 3C; Tabelle 1 ).

Der Wasseranteil des pastenförmigen Hefeextraktes (vgl. Schritt (8) des erfindungsgemäßen Verfahrens) lag bei etwa 13,2 bis 22,2 Gew% (Figur 3C), d.h. der Trockenanteil lag bei mind. 75 (77,8) bis 85 (86,8) Gew%.

Nach weiterer Trocknung des Hefeextraktpaste zum Erhalt eines Hefeextraktpulvers (vgl. Schritt (9) der vorliegenden Erfindung) und Mahlung wie beschrieben wurden noch 14,6 Gew% (als KP0 ₃ ) polyP gemessen (Figur 3A-C; Tabelle 1 ).

Anteil polyP in frei erhältlichen Hefeextrakten

Alle Messungen und Analysen wurden durchgeführt wie hierin oben beschrieben. Herstellung der erfindungsgemäßen Hefeextrakte der beiden unteren Spalten von Tabelle 1 (Paste und Pulver) gemäß der Beschreibung in obigem Abschnitt„Produktion eines polyP- reichen Hefeextrakts“.

Tabelle 1. Analyse frei erhältlicher Hefeextrakte auf Orthophosphat und Polyphosphat. Für die oberen acht Produkte ist der Mittelwerte ± dem Standardfehler des Mittelwertes von einer Untersuchung mit drei technischen Replikaten in der Analytik dargestellt. Für die unteren beiden (erfindungsgemäßen) Produkte ist der Mittelwert ± dem Standardfehler des Mittelwertes von zwei Hefeextrakt-Chargen mit jeweils drei Replikaten in der Analytik gezeigt. Die Nachweisgrenze betrug < 0.08 % Polyphosphat. Bei den Hefeextraktpulvern Typ Bioreal Bouillon und Typ Fond war der Salzgehalt (38 und 33 % (m/m), jeweils) von Seiten des Herstellers bekannt und wurde rechnerisch von der Trockenmasse abgezogen, um Konzentrationen bezogen auf reinen Hefeextrakt zu erhalten. Marmite® ist ein flüssiger Brotaufstrich auf Hefeextrakt-Basis. Der Wassergehalt von Marmite® wurde durch Trocknung bei 120 °C bestimmt und betrug 29 % (m/m). Für alle Pulver wurde ein Trockenanteil von 100 % (m/m) angenommen.