PRODUCTIVIDAD DE ASTAXANTINA.

Sector técnico

La presente invención puede ser utilizada en el área industrial, más específicamente permite el cultivo de una cepa que produce una mayor cantidad de pigmento tipo astaxantina, el cual es de interés en la industria alimenticia, tanto humana como animal.

Técnica Anterior

El creciente interés de la población por la ingesta de alimentos de origen natural ha provocado un aumento en la demanda por antioxidantes naturales (Ibáñez et al. 2003). Según la Global Industry Analysts Inc 2015, a nivel mundial, se espera que la demanda de antioxidantes carotenoides aumente, con ventas estimadas de US$1.300 millones para el 2017, incluyendo tan solo un 10% de productos naturales, no obstante el mercado está en crecimiento debido principalmente a un aumento en la percepción del consumidor de una vida más saludable (Joysa 2012).

Un antioxidante es una sustancia que a bajas concentraciones, retarda o previene la oxidación, actuando algunos a nivel intracelular y otros en la membrana de las células, protegiendo diferentes órganos y sistemas. Dentro de los antioxidantes naturales, los carotenoides constituyen un grupo destacado de alta eficiencia, siendo carotenoides y xantofilas poderosos agentes de protección en contra del daño producido por radicales libres, procesos oxidativos mediados por luz (fotooxidación) y reacciones de peroxidación por radicales (Bartley y Scolnik, 1995).

Dentro de los llamados químicos finos producidos por microalgas, el pigmento rojo astaxantina posee una alta demanda gracias a sus importantes características. Se utiliza como pigmento en acuicultura e industria alimentaria, para lograr el color anaranjado o rojizo en salmones y truchas mantenidas en cautiverio, las que solo pueden obtenerlo desde su alimentación (Liu, 2010), además es indispensable para el desarrollo normal y reproducción de salmónidos, acelerando la madurez sexual e incrementando la fertilización, maduración de los huevos y defensa frente a estrés oxidativo (Nakano y i cois.1995). La astaxantina posee 100 veces más capacidad antioxidante que el a- tocoferol (vitamina E), mostrando la capacidad de absorción de radicales libres (ORAC) más alta de todos los carotenoides (Nguyen, 2013), despertando gran interés para su uso como suplemento en alimentación humana. Adicionalmente el pigmento posee aplicaciones en la industria farmacéutica y nutracéutica (Lorenz y Cysewsky, 2000), en el caso del consumo humano, ha demostrado capacidad para la prevención de enfermedades degenerativas (Iwamoto y cois. 2000; Guerin y cois. 2003), prevención del cáncer (McCarty, 2012), mejoramiento de la respuesta inmune (Kobayashi y cois. 1997; Lorenz y Cysewsky, 2000; Lignell y Bottiger, 2001), prevención de enfermedades oculares (Cort y cois. 2008), cuidado de la piel (Lorenz, 2002; Tominaga y cois. 2012), agente antiinflamatorio (Speranza y cois. 2012), e inhibición del colesterol LDL (Choi y cois. 2011). Estas sobresalientes cualidades hacen que la astaxantina sea considerada el "rey de los carotenoides", con un renovado interés para el consumo humano (Nguyen, 2013). Esta gran variedad de efectos benéficos ha permitido el ingreso de la astaxantina algal al mercado de productos nutracéuticos, con una enorme variedad de productos con propiedades antioxidantes que se comercializan en tiendas de alimentos naturales (McCoy, 1999).

Las excepcionales características de astaxantina han creado un importante mercado para su producción, que se estima alcanzará los US$ 200 millones el 2015 (Frost y Sullivan 2008). Incluso cuando la mayor parte del pigmento que se utiliza en la industria de la acuicultura es de origen sintético, el mercado para consumo humano está en activo crecimiento y se estima que alcanzó los US$ 35 a 60 millones el 2008 (Frost y Sullivan 2008), principalmente en forma de encapsulados o en formulación de cosméticos, bebidas y alimentos funcionales.

La mayoría de la astaxantina comercial se produce mediante síntesis química, destinada a la industria acuícola, representando un mercado de 150 a 200 millones de dólares (Higuera-Ciapara y cois. 2006), sin embargo este producto artificial solo consta de un 8% de astaxantina, con una actividad biológica, estabilidad y absorción disminuidas en comparación al producto natural. Adicionalmente, la astaxantina artificial es una mezcla de vahos isómeros y solo es permitido su uso en alimentación animal (Fang y Cheng, 1993, Capelli et al. 2013), no así la de origen natural que provee de una pigmentación más intensa en acuicultura (Osterlie y cois. 1999). De forma natural el hongo Xanthophyllomyces dendrorhous y la microalga verde Haematococcus pluvialis, son los únicos organismos con potencialidad para competir con la astaxantina sintética (Tinoi y cois. 2006). H. pluvialis es el organismo más productivo, acumulando grandes cantidades de astaxantina al esporular, alcanzando hasta un 4% del compuesto en base a peso seco (Ambati y cois. 2014; Boussiva, 2000). Pese a que la producción de astaxantina derivada de esta microalga es más costosa comparada con la artificial y de levaduras, es la de mejor calidad en cuanto a su índice de capacidad antioxidante ORAC, y tiene aprobación para uso en consumo humano (Nguyen, 2013). Adicionalmente la astaxantina natural está asociada a otros compuestos que estabilizan el pigmento, evitando su oxidación e incrementando su duración en almacenamiento (Holtin y cois. 2009; Nguyen, 2013), sin embargo la astaxantina natural representa solo un 30% de la producción actual (Frost y Sullivan 2008), existiendo una baja productividad de cultivo (Lorenz & Cysewski, 2000) y necesitando grandes extensiones de terreno y elevados costos de producción (Nguyen, 2013), lo que indica una clara necesidad de nuevas fuentes naturales de astaxantina con mayores productividades que permitan una producción comercial suficiente para cubrir su creciente mercado.

H. pluvialis posee células verdes que son cultivadas hasta que se logra la densidad deseada, luego de lo cual acumula grandes cantidades de astaxantina al someterlas a alta intensidad lumínica, bajo aporte de nitratos, o estrés por salinidad elevada, modificándose su forma celular y su color a un rojo intenso (Fabregas y cois. 2001; Zhang y cois. 2009). El pigmento obtenido de H. pluvialis se utiliza como suplemento alimentario en USA, Japón y algunos otros países (Liu, 2010). Pese a sus excepcionales características, H. pluvialis crece relativamente lento en comparación con otras microalgas, y es sensible a ambientes contaminados y presencia de otros microorganismos (Olaizola, 2000).

Las cepas silvestres de la microalga H. pluvialis logran una producción máxima de 4% en condiciones ideales controladas a nivel de laboratorio, para mejorar la productividad se ha utilizado mutagénesis, logrando incrementos de 2,5 - 2,6% (Chen y cois, 2003; Gómez y cois. 2013), pero con problemas de reversión, baja biomasa y acumulación de otros compuestos (An y cois. 1989). La generación de transgénicos puede ser exitosa (Liu, 2010; Teng, 2002; Steinbrenner y Sandmann, 2006; Kathiresan y cois. 2009) pero no está permitido su uso a nivel nacional ni en alimentación humana, enfatizando la necesidad de fuentes naturales (Nguyen, 2013).

En resumen, la demanda por astaxantina de origen natural está en fuerte incremento, al poseer características superiores de calidad y efectividad para el uso en diferentes industrias, y además es la única que se puede utilizar para consumo humano, sin embargo, su producción está limitada por la productividad de H. pluvialis, la cual ha sido escasamente mejorada con cepas naturales o mutantes, tampoco se pueden utilizar OGM de esta microalga para consumo humano o animal sin cumplir con extensos y onerosos estudios.

Se han utilizado diferentes técnicas para mejorar la producción de astaxantina de H. pluvialis como por ejemplo la mutagénesis en la cual se aplican agentes químicos o radiaciones para la obtención de diferentes variedades microorganismos, induciendo cambios en el material genético. En H. pluvialis se han utilizado etil- metanosulfonato (EMS), N-metil-N ^' -nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), o bien radiación UV, con diferentes dosis y tiempos de exposición. En general las mejoras en las tasas de producción son modestas, Chen y cois. (2003) obtuvieron un incremento de un 2,5% con radiación UV, mientras que Hu y cois. (2008) reportaron un muíante que acumula cerca de dos veces más astaxantina, sin embargo estos rendimientos corresponden a un 3,9%, no superando el máximo de 4% encontrado para cepas naturales, lo que implica que la cepa original no era muy sobreproductora. A nivel nacional, cepas chilenas mutagenizadas con EMS resultaron en un 2,6% de incremento en materia seca (Gómez y cois. 2013). Un problema potencial de estos protocolos de mutagénesis, es que se trata de procesos al azar, donde no se tiene control acerca de qué es cambiado a nivel genético, con la posibilidad de múltiples mutaciones presentes en los microorganismos tratados, que pueden tener impacto en el crecimiento y reproducción, adicional a los modestos incrementos en producción. Pese a ello es una técnica muy empleada, existiendo bastante información relativa a su utilización.

Otra técnica utilizada es la ingeniería genética la cual ha sido exitosa para lograr una producción acelerada de astaxantina en H. pluvialis (Steinbrenner y Sandman, 2006), pero existen múltiples impedimentos por parte del público en general para productos que se destinarán a consumo humano o animal, e incluso cuando dichos potenciales problemas no son respaldados por la literatura científica, la mayoría de los mercados basados en productos orgánicos o naturales no aceptará un origen transgénico para cualquier antioxidante. Un problema adicional se presenta con la bioseguridad, al ser necesaria la contención de grandes volúmenes de células, que pueden generar estados de resistencia y deben ser cultivados en espacios abiertos, todo lo cual debe ser debidamente certificado, encareciendo enormemente el cultivo de estos organismos genéticamente modificados.

Una tercera alternativa corresponde a la poliploidia natural la cual no está suficientemente estudiada en la literatura. En un organismo típico animal o vegetal, todas las células no reproductivas poseen dos sets de cromosomas (Kehr, 1996), este tipo de organismo se conoce como diploide, y es el estado normal de muchas especies. La poliploidia es la condición heredable donde más de dos sets de cromosomas están presentes (Comai, 2005), incluyendo triploides (3x) y tetraploides con 4 sets, que es la condición más frecuente (Comai, 2005). La poliploidia es muy común en vegetales, con estimaciones que indican que entre un 30% a un 80% de las plantas modernas (angiospermas) son poliploides, o fueron originadas a partir de poliploides ancestrales (Meyers y Levin, 2006). El incremento en el número de cromosomas causa grandes cambios en el fenotipo, la fisiología y la fertilidad de los poliploides (Levin, 1983), muchos de estos presentan un incremento en el tamaño celular en comparación con las células originales, incluyendo el núcleo, cloroplastos y mitocondrias (Stebbins, 1950; Levin, 1983). En el caso de plantas pluricelulares, el incremento en el tamaño celular implica un incremento de los órganos, incluyendo hojas más grandes y de mayor grosor (Morgan y cois. 2003), esta característica se denomina el efecto gigas.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Imagen de microscopía confocal de BEA IDA 0064B (Poly Strain P3) mostrando el núcleo teñido con SYBR Green, donde se puede notar su tamaño en relación al resto de la célula.

Figura 2: Comparación de volumen celular en cepas de H. pluvialis vegetativas. Se destaca la comparación entre la cepa base sin poliploidizar (CB) y la cepa BEA IDA 0064B (P3), resultados corresponden a 3 repeticiones del cultivo. Figura 3: Comparación de volumen celular en cepas de H. pluvialis enquistadas. Se destaca la comparación entre la cepa base sin poliploidizar (CB) y la cepa BEA IDA 0064B (P3), resultados corresponden a 3 repeticiones del cultivo.

Figura 4: Comparación en la producción de astaxantina. Se destaca la comparación entre la cepa base sin poliploidizar (CB) y la cepa BEA IDA 0064B (P3), resultados corresponden a 3 repeticiones del cultivo.

Figura 5: Extracción astaxantina visualizada con microscopía óptica antes y después del proceso, para cepa original y BEA IDA 0064B (P3). A la izquierda, células enquistadas de H. pluvialis antes de proceso extractivo, a la derecha células rotas mostrando pared celular e indicando que toda la astaxantina ha sido extraída.

Figura 6: Comparación de contenido de ADN en vahas cepas de H. pluvialis. Se destaca la comparación entre la cepa base sin poliploidizar (CB) y la cepa BEA IDA 0064B (P3), resultados corresponden a 3 repeticiones de la extracción de ADN.

Figura 7: Histogramas de citometría de flujo, donde se puede ver la intensidad de señal fluorescente en las células sin poliploidizar (cepa base, panel de la izquierda), y de la cepa BEA IDA 0064B (P3) que presenta una intensidad mayor, indicada por la flecha negra.

Divulgación de la invención

La presente tecnología corresponde a una cepa mejorada de la microalga Haematococcus pluvialis, la cual posee un mayor rendimiento en la producción del pigmento astaxantina.

A partir de un cultivo de cepas de H. pluvialis obtenidas desde muestras de agua dulce, se induce el mejoramiento de las cepas utilizando colchicina y orizalina, ambos agentes de inducción de poliploidía. La cepa poliploide con mejores rendimientos en biomasa y astaxantina fue seleccionada.

Dicha cepa, que originalmente se denominó como cepa Poly Strain P35E, se encuentra depositada en el Banco Español de Algas (BEA) bajo el código de acceso BEA IDA 0064B, el deposito fue realizado con fecha 21 de noviembre de 2017. Dentro de las ventajas que presenta el uso de esta cepa podemos destacar que su cultivo permite la producción entre 70.000 a 350.000 células por mi a los 15 días de cultivo, lo que permite obtener entre 0,37 a 1 g/l de biomasa seca. Las células vegetativas de la cepa BEA IDA 0064B (P3) poseen un volumen celular de 3630 ± 900 mΐti ³ , lo cual es un 60% mayor a la cepa original. Las mismas células una vez enquistadas, poseen un volumen celular de 22000 ± 5000 mΐti ³ , presentando por tanto un 67% mayor volumen celular que la cepa base.

La principal característica de la cepa BEA IDA 0064B es la producción aumentada de astaxantina en condiciones de laboratorio, la cual se encuentra entre 2,59 a 2,71 mg de astaxantina por cada gramo de la cepa, produciendo por tanto entre un 30% y hasta un 40% más que la cepa original no poliploide.

En la figura 1 podemos ver la cepa BEA IDA 0064B (P3) donde se aprecia que su tamaño general y nuclear se encuentra aumentado en comparación con la cepa original. Donde el tamaño medio de las células BEA IDA 0064B (P3) es un 60% superior a la cepa base, tanto en estado vegetativo como en el enquistado.

A diferencia de las alternativas precedentes, el uso de la cepa poliploide BEA IDA 0064B (P3), está libre de restricciones, facilitando la producción de astaxantina, por lo cual su uso evita requerir de extensas y laboriosas búsquedas en diferentes ambientes naturales para el aislamiento de nuevas cepas, que no garantizan el obtener productividades mayores a las anteriormente reportadas en la literatura, ni depende de mutaciones al azar o introducción de material genético foráneo, sino que es el propio material genético del individuo, duplicado. En la Tabla 1 se aprecia las diferencias en las condiciones de cultivo y en el porcentaje de astaxantina obtenido en los diferentes cultivos.

Tabla 1: Comparación del contenido de astaxantina obtenidos en los diferentes tipos de cultivo.

Valor comercial

Tipo de

Sistema de cultivo Biomasa por piscina cultivo

cosechada

Sistema abierto de 60 Kg de biomasa con

Industrial

200 m ³ , densidad un 2,5% de USD $15.000 tradicional

promedio 0,3 gL- ¹ astaxantina.

Industrial Sistema abierto de 60 Kg de biomasa con

H. pluvialis 200 m ³ , densidad un 2,6% de USD $15.600 muíante promedio 0,3 gL- ¹ astaxantina.

Industrial

H. pluvialis Sistema abierto de 60 Kg de biomasa con Entre USD poliploide 200 m ³ , densidad un rango entre 30 - $15.600 a USD

BEA IDA promedio 0,3 gL- ¹ 40 % astaxantina. $27.600

0064B (P3)

Los usos proyectados de esta cepa poliploidizada, es la producción a escala industrial de astaxantina, en sistemas tipo Raceway u otro sistema, logrando una mayor concentración del pigmento en su biomasa, y por ende, una mayor productividad del proceso industrial, sin requerir de cambios en el sistema productivo, lo cual se traducirá en una mayor ganancia al obtener biomasa de mejor calidad. La astaxantina obtenida puede ser destinada a mercados orgánicos, nutracéutica humana, cosmética, etc.

EJEMPLOS DE APLICACIÓN

Ejemplo 1: Protocolo para inducir poliploidización

Se obtuvieron cepas de H. pluvialis desde muestras de agua dulce de la región del Biobío y la región de Tarapacá, identificando dichas cepas mediante inspección visual en microscopía de luz visible, las cuales fueron aisladas de otras microalgas presentes en las muestras mediante subcultivos repetidos y tratamiento con antibióticos para eliminar la presencia de bacterias contaminantes del cultivo, utilizando ampicilina sódica en dosis de 100 pg/ml en placas con medio sólido. Tiempos de exposición y dosis de agentes inductores

Los cultivos de H. pluvialis, fueron sometidos a diferentes tiempos de exposición a los agentes de inducción de poliploidía colchicina y orizalina, para determinar los tiempos de exposición a los diferentes agentes químicos y utilizar la dosis de máxima efectividad para obtener poliploides sin una letalidad completa. Se realizaron múltiples experimentos en los cuales se sometieron las células en medio líquido, a tiempos de exposición en el rango de 12 horas a 7 días en cada uno de los agentes de inducción. Se probaron adicionalmente concentraciones acuosas de ambos agentes de poliploidización en el rango de 0,025 a 10%, determinándose las dosis letales medias y la dosis de máxima efectividad sin eliminar toda la población. Luego de los diferentes tratamientos, las células supervivientes fueron aisladas en placas con medio sólido Bristol y subcultivadas por múltiples generaciones, como se detalla a continuación.

Determinación del grado de ploidía

Las cepas de H. pluvialis de mejores rendimientos en biomasa y astaxantina, fueron analizadas por citometría de flujo, utilizando un protocolo de tinción con ¡oduro de propidio (PI) modificado para microalgas de Mazalova y cois (2011). Resumido, el protocolo consta de concentración de las células mediante centrifugación, tratamiento con mezcla de digestión (2% celulasa, 0,5% macerozyma, Duchefa Biochem), incubada y luego filtrada en malla de 42 pm con buffer de lisis.

Luego de incubar en hielo, se removió el sedimento y se tiñó con ¡oduro de propidio (PI), se incubó en hielo en presencia de un estándar interno de núcleos de una planta adecuada ( Lycopersicon esculentum o Raphanus sativus ), para su lectura en el citómetro, donde se evalúan 10.000 a 20.000 o más eventos.

La determinación del porcentaje de células vivas se realizó mediante conteo en cámara Neubauer con tinción en azul Evans al 0,1% en agua.

Aislamiento de cepas poliploides vivas

Luego de determinar las condiciones óptimas de agente inductor, concentración y tiempo de exposición de las cepas de H. pluvialis, las cepas originales fueron sometidas a dichas condiciones, aislándose las células poliploidizadas de la población mediante el cell sorter del equipo de citometría de flujo en un equipo FACS ARIA III (BD biosciences), ajustando las condiciones de selección, tamaño celular, fluorescencia e intensidad de señal para sensores FS y SSC del equipo, para el aislamiento de los eventos de poliploidización. Las células fueron cultivadas en placas de agar con medio 3N-BBM+ vitaminas y antibióticos adecuados para evitar contaminación (ampicilina), cultivándose a intensidad lumínica media, según protocolos habituales para cultivo de H. pluvialis e placas. En el proceso se obtuvieron en total 82.600 unidades formadoras de colonias (CFU), de las cuales solo se seleccionaron para el resto de los análisis las de mejor desempeño, las que fueron repicadas en tubos con medio líquido para su multiplicación y determinación de los demás parámetros de interés, constituyendo este material el cepario de prueba de potenciales poliploides.

Caracterización molecular de las cepas

La identidad de las cepas fue confirmada mediante análisis por secuenciación de la zona ITS, previamente amplificada mediante la técnica de PCR, y contrastada con bases de datos internacionales como Genbank mediante el algoritmo BLAST. Para el análisis de microsatélites, se utilizaron 14 marcadores ISSR previamente empleados en H. pluvialis, empleando la información y protocolos descritos en Mostafa y cois. (2011). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue realizada utilizando 20 pL de mezcla de reacción conteniendo 13,5 pL de agua libre de nucleasas, 2 pL de buffer PCR lOx, 1,4 pL de MgCI2 (50mM), 0,6 pL de partidor (5mM), 0,4 pL de un mix equimolar de dNTP (25mM), 1,6 pL de ADN genómico y 0,5 U Taq ADN polimerasa. El programa de PCR: 97°C por 6 min, seguido por 35 ciclos de 94°C por 45s, 48 a 69°C por 45s, 72°C por 60s, finalmente un paso de extensión final de 72°C por 5 min.

Cada marcador ISSR fue ajustado a la temperatura de hibridación óptima de amplificación correspondiente. Para el análisis de datos, cada perfil de bandeo ISSR fue registrado para generar una matriz de datos de presencia (1) o ausencia (0) de bandas. Para análisis de similitud se empleará NTSYS pe versión 2.10e y el índice de similitud de Jacard que es confiable para marcadores moleculares dominantes como es el caso de los ISSR. Para la construcción del dendrograma se empleó NJoin y SAHN. El dendrograma fue construido en UPGMA para discriminar cepas diferentes en clusters. La técnica MSAP es una modificación de los AFLP, para su aplicación se utilizará el protocolo para MSAP descrito por Schrey y cois. (2012). Se realizaron las modificaciones correspondientes para lograr resultados reproducibles en el material de estudio. La principal diferencia entre AFLP y MSAP es que en esta última se reemplazó la enzima de corte frecuente (Msel) por una enzima de restricción sensible a metilación. Las enzimas Hpall y MspI son isoesquizómeros y sirven para discriminar polimorfismos debidos a metilación diferencial de aquellos derivados de variaciones genéticas, como es el caso con corte de EcoRI.

Se definieron 4 tipos de bandas, Tipo I en que ambas enzimas cortan, indicando sitios no mediados, tipo II y tipo III, solo una de las enzimas, MspI o Hpall cortan, indicando un sitio de metilación en C, y tipo IV, ninguna enzima corta. Las bandas polimórficas resultantes al comparar células normales y poliploidizadas fueron consideradas marcadores cualitativos para la estabilidad del ADN. El análisis informático de matriz de datos fue realizado mediante programa msap (basado en R) http://msap.r-forge.r- project.org/. Para el resto de los análisis, incluyendo secuenciación directa de algunos genes marcadores, se utilizó el software comercial Geneious Pro V7.

Ejemplo 2: Caracterización de cepas poliploides de H. pluvialis

Las cepas aisladas fueron cultivadas en volúmenes de entre 5 a 500 mi, utilizando el medio de cultivo Bristol, el cual contiene las siguientes sales inorgánicas en mg por litro de solución: NaN0 ₃ 0,25, CaCI ₂ x 2H ₂ 0 0,025, MgSCh x 7H ₂ 0 0,075, K ₂ HP0 ₄ 0,075, KH ₂ P0 ₄ 0,175, NaCI 0,025 a una temperatura de 24±1°C, fotoperiodo de 16:8 día/noche (D:N) y aireación constante.

Se analizaron los siguientes parámetros para la caracterización de las cepas naturales y poliploidizadas de H. pluvialis.

A) Conteo celular: Se tomaron muestras de 1 mi de cultivo día por medio, durante los primeros 10 a 15 días luego de la inoculación de la cepa en medio de cultivo líquido. La densidad celular fue determinada por conteo celular en cámara de Neubauer y por D.O. a 660 nm. Una vez construidas las curvas de crecimiento (Cel/ml v/s tiempo), se calcularon las tasas de crecimiento k (divisiones/día) durante la fase de crecimiento exponencial, de acuerdo a la fórmula k = (3,322/t2-tl) x log N2/N1 (t=tiempo; N=número de células/ml). La cepa poly strain P3 produce entre 70.000 a 350.000 células por mi a los 15 días de cultivo.

B) Volumen celular: pasado el tiempo de enquistamiento y síntesis de astaxantina, se tomaron muestras de 1 mL para determinar volumen celular. Luego cada muestra fue visualizada al microscopio y se obtuvieron fotografías con aumento de objetivo lOx con el Modulo de Imágenes en vivo del software Motic Images Plus 2.0 ML. Posteriormente se midieron 100 células de cada réplica por cada una de las cepas, obteniendo 300-400 mediciones por cepa con un total de 2.100 a 2.800 mediciones dependiendo del número de réplicas utilizadas en cada experimento. El software entregó una tabla con el área, perímetro y radio en pm. Posteriormente se tabuló toda la información obtenida de los radios celulares y se calculó el volumen celular expresado en pm ³ . En las figuras 2 y 3 se muestra el volumen celular de cepas en estado vegetativo (fig. 2) y enquistado (fig. 3), donde se comparan la cepa original (CB) con varias otras cepas. Donde se observa que la cepa BEA IDA 0064B (P3) es un 60% mayor a la cepa original. Las mismas células una vez enquistadas, poseen un volumen celular de 22.000 ± 5.000 pm ³ , presentando por tanto un 67% mayor volumen celular que la cepa base.

C) Determinación de peso seco: Al final del cultivo se filtró una alícuota de cultivo (10 mi), utilizando filtros de nitrocelulosa de 0,45pm de poro, pre pesados y secados a 80°C hasta peso constante. Los filtros conteniendo las células se secaron nuevamente a 80°C hasta peso constante. El peso de la biomasa seca fue obtenido por la diferencia de peso del filtro con y sin células. La cepa BEA IDA 0064B (P3), produce entre 0,37 a 1 g/l de biomasa seca.

D) Determinación de astaxantina: se tomó un volumen de 15 mL de cada una de las réplicas, se centrifugaron a 4.000 rpm por 10 min, se descartó el sobrenadante. Se agregaron 5 bolas de ebullición de vidrio de 3 mm y se procedió a extraer el pigmento. Se adicionaron 5 mL de DMSO y se incubó por 15 min a 50°C. Luego se agitaron en vortex por 30 s y se centrifugaron a 4.000 rpm por 5 min y el sobrenadante se traspasó a un balón aforado de 25 mL. Posteriormente se continúa la extracción con 5 mL de acetona a temperatura ambiente, agitando por 30 s y centrifugando a 4.000 rpm por 5 min. Este ciclo se repitió hasta que el extracto fue incoloro. Se aforó a 25 mL con acetona, se realizó una dilución de 1: 10 en balón aforado de 10 mL y se midió absorbancia a 474 nm contra blanco de acetona. Los valores se calcularon según la siguiente fórmula: %p/p = (Abs/250)*(25mL*Fd/mg)*100.

En la figura 4 se comparan la cepa original (CB) con varias otras cepas, incluida la cepa poly strain P3, la cual produce entre 2,59 a 2,71 mg/g de astaxantina en condiciones de laboratorio, produciendo por tanto entre un 30% y hasta un 40% más que la cepa original no poliploide.

Adicionalmente se verificó que se lograra la extracción total del material, revisando alícuotas del material mediante microscopía óptica como se indicó con anterioridad, donde se observa que todas las células han perdido la coloración y solo se ven restos celulares y células rotas sin astaxantina en su interior. Comparando con la cepa base, se logró un 100% de extracción de astaxantina en la cepa BEA IDA 0064B (P3). Extracción astaxantina visualizada con microscopía óptica (figura 5) antes (i) y después (¡i) del proceso, para cepa original (A) y BEA IDA 0064B (P3) (B).

E) Determinación del contenido de ADN

La determinación del contenido relativo de ADN de las células poliploidizadas se realizó por citometría de flujo, cultivando las CFU individuales en 10 mi de medio líquido como se describe anteriormente. La citometría de flujo mediante tinción con ¡oduro de propidio y otros agentes tales como SYBR green, indicaron que las células BEA IDA 0064B (P3) poseen el doble de contenido de ADN que las contrapartes no poliploidizadas con este método, lo cual fue verificado mediante el canal FITC del equipo. Empleando los mismos materiales en medio líquido, se realizaron extracciones de ADN total genómico, empleando el kit Zymobeads genomic DNA kit (Zymo Research) de acuerdo a instrucciones del fabricante. La concentración de ADN fue determinada usando un fluorímetro Qubit (Invitrogen), mientras que la integridad de este mismo fue confirmada en electroforesis de geles de agarosa al 1% (p/v) en TAE, siguiendo protocolos habituales de biología molecular.

En la cepa BEA IDA 0064B (P3), se obtuvo una cantidad promedio de 2,34 pg de ADN por célula, lo cual la separa de las demás cepas y representa un notorio incremento en el contenido de ADN celular de esta variedad poliploide. La figura 6 muestra la comparación entre la cepa original (CB) con varias otras cepas, incluida BEA IDA 0064B (P3). F) Determinación de estabilidad de poliploidía

La determinación de estabilidad de cada cepa obtenida fue realizada mediante citometría de flujo, comprobando la presencia de poblaciones de ploidías superiores con respecto a las cepas originales, según procedimiento descrito anteriormente. Mediante esta técnica, se ha determinado que la cepa BEA IDA 0064B (P3) , se ha mantenido estable por lo menos 24 generaciones (un año, con subcultivos regulares cada 15 días).

Los resultados indican que se mantiene de manera estable la poliploidía de las células, lo cual es verificado en los histogramas que relacionan intensidad de fluorescencia versus número de células, que muestran claramente una intensidad mayor con respecto a la cepa original de H. pluvialis (figura 7).

Ejemplo 3: Evaluación de viabilidad de cultivo de cepa BEA IDA 0064B (P3) en escalamiento.

Se realizó un escalamiento del cultivo de la cepa a un volumen de 200 L, donde de los cultivos iniciales de 500 mL de 10 a 15 días de cultivo, se procedió a inocular matraces de 2 L, luego de dos semanas de cultivo se inocula un botellón de 20 L el cual será utilizado como inoculo para el cultivo de 200 L que será realizado en kalwalls de acrílico. Hasta los cultivos de 2 L se utilizó el medio de cultivo 3N-BBM+V (CCAP) a una temperatura de 24±1°C, con un fotoperiodo de 16:8 D: N a 200 pmoles de fotones m2 s y aireación constante. Luego desde el inoculo de 20 L a los 200 L se utilizó un medio de cultivo industrial y se mantendrán las condiciones de cultivo por 10 días, para luego inducir las células vegetativas a formar quistes para la acumulación de astaxantina por adición de NaCI y aumento del flujo fotónico. Estos cultivos serán de tipo indoor. En forma paralela, también se realizaron cultivos de 200 L outdoor, en los cuales se evaluó la inducción de la síntesis de pigmento por la irradiación natural de la luz solar. Se evaluó día a día el crecimiento celular, la biomasa y el contenido de astaxantina y clorofila.

Análisis de tasas de crecimiento y biomasa de poliploides en escalamiento

Las cepas poliploides obtenidas en la etapa anterior, fueron cultivadas en un volumen de 500 mL en las mismas condiciones de las cepas originales. Las tasas de crecimiento, biomasa de las cepas poliploides, contenido de astaxantina, y estabilidad de la poliploidía, fueron determinadas de la misma manera que en el ejemplo 2.