B E S C H R E I B U N G

Gegenstand der vorliegenden Erfindung εind Verfahren zur Herstellung perl- bzw. kugelförmiger Polymerpartikel (Beads) auf der Basis von Polyvinylalkohol (PVAL), in die ein magnetisches Kolloid eingekapselt ist, das den Polymerpartikeln magnetische Eigenschaften verleiht und dazu befähigt, Biomoleküle oder Zellen zu binden.

Magnetische Polymerpartikel wurden in den letzten Jahren vor allem in der Biochemie und Medizin vornehmlich zur Abtrennung von Zellen, Proteinen und Nukleinsäuren verwendet. Aufgrund der magnetischen Eigenschaften lassen sie sich auch als Transportsysteme für bestimmte Pharmaka in bestimmte Körperareale nutzen. Der Einsatz von Magnetpartikeln bietet von der praktischen Handhabung her große Vorteile gegenüber herkömmlichen Separationsystemen, da die meist als feine Suspensionen oder Emulsionen vorliegenden Magnetpartikel mittels magnetischer Kräfte aus der Mischung abgetrennt werden können. Diese Abtrenntechnik macht die übliche Zentrifugation überflüssig. Die magnetische Fraktion kann ferner innerhalb einer Minute abgetrennt werden, was im Vergleich zu den herkömmlichen chromatographischen Säulentrenntechniken eine erhebliche Zeitersparnis bedeutet. Bei letzterer Technik fallen vor allem das zeitaufwendige Equilibrieren und Eluieren ins Gewicht, Prozesse also, die bei der Magnet-Bead-Technik praktisch entfallen. Ein weiterer wesentlicher Vorteil, die die Magnet-Bead-Technologie auszeichnet, besteht in der Art der Reaktionskinetik. Bei den Füllmedien für die Säulenchromatographie greift man in der Regel auf Korngrößen von 50 - 100 μm zurück. Da bei solchen Korngrößen die

Trennkapazitäten jedoch vielfach nicht ausreichen, geht der Trend zunehmend dahin, Korngrößen von < 50 μm und sogar < 10 um anzuwenden. Damit die beim Säulendurchlauf erzeugten hohen Drucke widerstanden werden können, weisen solche Medien praktisch keine Porositäten mehr auf, weshalb man in praxi von den durchsichtigen Kunststoff- bzw. Glassäulen zu druckstabilen Stahlsäulen übergehen mußte. Die dafür erforderlichen leistungsfähigen Pumpsysteme sind ein weiterer Nachteil der heutigen Säulenchromatographie- Technik. Diese Nachteile, die letztlich in der ungenügenden Umsatzkinetik begründet sind, können durch die Anwendung der Magnet-Bead-Technologie völlig umgangen werden. Durch Verwendung feindisperser PVAL Partikel, die eine Teilchengröße von 1-10 um, vorzugsweise eine solche von 1-4 um, aufweisen, verbleiben die Teilchen über mehrere Stunden hinweg im suspendierten Zustand, so dass die Umsatzkinetik der einer quasi-homogenen Lösung entspricht. Infolge der stabilen Suspension kann auch in den meisten Fällen auf Rühren oder Schütteln verzichtet werden.

Verfahren zur Herstellung von magnetischen Eisen-Dextran Mikropartikeln sind in der U.S. Patentschrift 4,452,773 beschrieben. Durch Mischen einer Fe(II)- und Fe(III)- Salzlösung in Gegenwart einer definierten Menge Dextran und anschließender Zugabe von Alkali werden 30-40 nm große kolloidale Fe-Oxid Teilchen gewonnen, an die Dextran adsorbiert ist. Ein ähnliches Verfahren liegt der PCT Anmeldung WO 90/07380 zugrunde. Es werden Fe(II)- und Fe(III)-Salzlösungen unter Zugabe von Dextran bei 40°C behandelt und anschließend mit NaOH titriert, aufgrund dessen superparamagnetische Partikel mit einer Größe von 40- 100 nm erhalten werden. Der Nachteil beider Verfahren im Hinblick auf rasche und einfache Abtrennung, besteht darin, daß aufgrund der Feinheit der Partikel eine Separation nur mittels eines hochgradienten Magnetfeldes (High Gradient

Magnetic Field) möglich ist. Dieses hochgradiente Magnetfeld wird durch eine Trennsäule, die mit Stahlwolle oder ähnlichen mikropartikulären Substanzen dicht gefüllt ist, und sich zwischen den Polschuhen zweier starker Elektro- bzw. Handmagnete befindet, erzeugt. Die Trennung der Teilchen erfolgt durch Hindurchleiten der Suspension durch die gefüllte Trennsäule. Eine Abtrennung solcher .Kolloide ist mittels herkömmlicher Handmagnete nicht möglich. Grundsätzliche experimentelle Unterschiede zu der herkömmlichen Chromatographie-Technik bestehen somit kaum. Ein weiterer Nachteil der zitierten Herstellungsverfahren ist, daß durch den eigentlichen Herstellungsprozess keine einheitlichen Teilchengrößen gewonnen werden, vielmehr werden diese erst durch eine fraktionierte Magnetseparation erhalten. Erschwerend für den Nachweis dieser Magnetpartikel ist ferner der Umstand, daß die Teilchen unter dem Lichtmikroskop nicht mehr sichtbar sind. In einem weiteren Verfahren, das dem U.S. Patent 4,070,246 zugrunde liegt, werden Magnetpartikel durch Umsetzen von p-Aminobenzoesäure und einem Aldehyd unter Zugabe eines ferromagnetischen Pulvers gewonnen. Die Herstellung definierter perlförmiger Partikel, wie sie für diagnostische Tests erforderlich sind, ist mit diesem Verfahren nicht möglich. Chemische Kopplungen von Biomolekülen an den Träger sind ebenfalls nicht möglich. Gleiches gilt auch für die in den U.S. Patentschriften 4,106,448, 4,136,683 und 4,735,796 beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Dextran eingekapselten magnetischen Partikeln für die Diagnostik und für die Tumortherapie. Auch bei den vorgenannten Verfahren sind kovalente Kopplungen von Biomolekülen nicht beschrieben. In der U.S. Patentschrift 4,647,447 wird die Herstellung ferromagnetischer Partikel für die NMR-Diagnostik beschrieben. Hierbei wird entweder von Fe(II)/Fe(III)-Salzlösungen oder direkt von mikropartikulären Ferriten ausgegangen, die in Gegenwart

eines Komplexbildners in Form von Serum Albumin, Polysacchariden, Dextran oder Dextrin zu MagnetSuspensionen umgesetzt werden. Weitere ferromagnetische Partikel, die in einer Silan-Matrix eingekapselt sind, werden in der U.S. Patentschrift 4,628,037 behandelt. Ebenfalls als Kontrastmittel für die NMR-Diagnostik dienen superparamagnetische Eisenoxide, die in dem U.S. Patent 4,827,945 behandelt werden. Durch Ausfällen von Fe(II)/Fe(III)-Salzmischungen mittels Basen in Gegenwart von Serum Albumin, Polypeptiden oder Polysacchariden lassen sich mit diesen Substanzen beschichtete Magnetpartikel herstellen. Durch Ankopplung bestimmter Antikörper an die Matrix können die Magnetteilchen in bestimmte Körperareale dirigiert werden (Targeting) . Die Herstellung von Eisenoxiden durch Ausfällen von Eisensalzen in Gegenwart von z.B. Dextranen oder Polyglutaraldehyden liegt den U.S. Patenten 2,870,740 und 4,267,234 zugrunde. Allen vorgenannten Verfahren und Produkten ist gemeinsam, daß die ferromagnetischen oder superparamagnetischen Partikel erst durch Ausfällen einer Fe-Salzlösung, die ein bestimmtes molares Verhältnis von Fe(II) und Fe(III)-Salzen voraussetzt, in Gegenwart eines Komplexbildners bzw. Beschichtungsagens hergestellt werden. Die beschriebenen Teilchen weisen eine mehr oder weniger breite Korngrößenverteilung auf. Definierte perl- bzw. kugelförmige Partikel, lassen sich mit den vorgenannten Verfahren nicht herstellen. Die beschriebenen Mittel weisen eine mehr oder weniger amorphe geometrische Struktur auf. Aufgrund ihrer Feinheit, die durchweg im nm-Bereich liegt, eignen sie sich daher vorwiegend als Kontrastmittel für die NMR-Diagnostik oder als Zell-Markierungsmittel (Zellmarker) . Die Abtrennung der magnetischen Fraktionen sind darüberhinaus in den meisten Fällen mittels einfacher Handmagnete, wie sie für schnelle diagnostische Tests oder

äffinitätschromatographische Abtrennungen vorteilhaft sind, nicht möglich.

Die Präparation magnetischer Albumin- bzw. Protein- Mikropartikel, die mit bestimmten Bindungsagenzien beschichtet sind und für die Virus- und Zeil-Separationen sowie diagnostische Tests eingesetzt werden können, sind in den U.S. Patenten 4,345,588; 4,169,804; 4,115,534 ; 4,230,685; 4,247,406 und 4,357,259 beschrieben. Magnetpartikel mit einer definierten perlförmigen Struktur sind aus den U.S. Patenten 4,861,705 bekannt. Gegenstand des vorgenannten Patentes εind Agaroεe-Polyaldehyd-Komposit- Partikel, die durch Suspension der Polymerphase in einer Öl- Phase gewonnen werden. Durch Zumischen eines Ferrofluides, dieε sind definitionsgemäß sehr feine superparamagnetische, wäßrige Eisenoxide-Kolloide, zu der Polymerphase werden magnetische Polymerpartikel mit einer Teilchengröße von 40- 1000 μm erhalten.

Ideal-kugelförmig Partikel werden in dem U.S. Patent 4,654,267 beschrieben. Daε Verfahren unterscheidet sich grundsätzlich von den vorgenannten dadurch, daß Polyacrylate oder Polysεtyrol als Matrix verwendet werden, die zunächst mittels Suεpensionspolymerisation zu perlförmigen Partikeln radikalisch polymerisiert werden. Anεchließend werden die Teilchen in einer organiεchen Phase unter definierten Bedingungen gequollen. Eε folgt eine Inkubation der Polymerpartikiel in einer Fe(II)/Fe(III)-Salzlösung, die, nachdem sie in die Teilchen diffundiert ist, mittels Ammoniak zu superparamagnetischen Eisenoxiden oxidiert werden. Das Verfahren liefert perlförmige Partikel mit Korngrößen zwischen 0.5 und 20 μm. Das Verfahren selber ist technisch sehr aufwendig. Neben der Verwendung hochtoxischer Substanzen beträgt der Zeitaufwand für die Präparation der Grundmatrix 10-30 Stunden. Ferner bedarf eε zusätzlicher Nitro-, Nitroεo- oder Amino-Gruppen, die durch einen

zusätzlichen Präparationsschritt in die Polymermatrix eingeführt wird, um eine ausreichende Absorption der Fe- Salze zu gewährleisten. Der entscheidende Nachteil der dort beschriebenen Partikel liegt in dem Grundpolymer Polystyrol begründet. Polystyrol stellt ein äußerst hydrophobes Material dar, das im Kontakt mit Proteinlösungen oder anderen Biomolekülen stark zur unspezifischen Adsorption neigt, ein Phänomen, daε besonderε bei Immunoaεεayε und äffinitätschromatographischen Auftrennungen nachteilig ist. Die Nachteile der vorgenannten Verfahren in Bezug auf Herstellungsaufwand, Partikelgeometrie, magnetisches Separationsverhalten, Eigenschaften der Polymermatrix oder Art der Kopplungεweise können durch ein neuartiges Wasser¬ in-Öl-Suspensionsverfahren umgangen werden. Als Polymermatrix wird Polyvinylalkohol (PVAL) verwendet, der als wäßrige Lösung in einer organischen, nicht mit Wasεer mischbaren Phase unter Rühren εuεpendiert und vernetzt wird. Beiεpiele für εolche organiεchen Phasen sind allgemein auε dem Stand der Technik der

Suεpenεionεpolymeriεation bekannt. Vorzugεweise werden für das erfindungsgemäße Verfahren handelsübliche Pflanzenöle verwendet. Um zu den gewünschten magnetischen Eigenschaften der Polymerpartikel zu gelangen, wird die Polymerphase vor der Suspension mit einem magnetischen Kolloid z.B. in Form von Eisenoxid-Pulvern oder Ferrofluiden vermischt und anschließend in der Ölphase εuεpendiert. Die Herεtellung perlförmiger PVAL Partikel durch Suspension einer wäßrigen Polymerlösung ist in der DE-OS 4127657 beschrieben. Durch Zugabe von Magnetit-Pulver zur Polymerlösung können magnetische Partikel hergestellt werden. Das dort beschriebene Verfahren verwendet Polymerlösungen und Ölphasen, die keine Zusätze in Form von Emulgatoren oder sonstigen oberflächenaktiven Substanzen enthält. Dadurch bedingt, liegen die Partikelgrößen durchweg zwiεchen 50 und

500 μm. Die Korngrößen werden bei dem vorgenannten Verfahren in erster Linie durch die Viskoεität der organischen- und/oder der Polymer-Phase bestimmt.

Das Ziel der vorliegenden Erfindung sind demgegenüber Magnetpartikel, die eine Partikelgröße im Bereich von 1-10 μm, vorzugsweiεe zwischen 1-4 μm aufweisen und darüberhinaus eine sehr enge Korngrößenverteilung aufweisen. Nur solche Teilchen lassen sich für die Zellseparation/-markierung, die Aufreinigung von Biosubstanzen in Suspension sowie für diagnostische Assays einεetzen.

Eε wurde überraschenderweise gezeigt, daß εolche Polymer Partikel durch Zugabe von beεtimmten Emulgator-Miεchungen zu der Ölphaεe realisiert werden können. Der Begriff Emulgator wird im folgenden definitionsgemäß als Oberbegriff für alle oberflächenaktiven Substanzen wie Tenεide, Detergenzien oder Suspenεionεεtabiliεatoren verwendet. Emulgatoren, die sich als Zusätze für die Ölphase eignen sind z.B.: Propylenoxid-Äthylenoxid-Blockcopolymere, Sorbitan- Fettsäureester, Komplexmischester aus Pentaerythrit- Fettsäureester mit Citronensäure, Polyäthylenglykol- Caεtoröl-Derivate, Blockcopolymere auε Rizinusöl-Derivaten, Polyäthylenglykole, modifizierte Polyester, Polyoxyäthylen- Sorbitan-Fettεäureeεter, Polyoxyäthylen-Polyoxypropylen- Äthylendiamin-Blockcopolymere, Polyglyceryl-Derivate, Polyoxyäthylen-Alkohol-Derivate,

AlkyIphenylpolyäthylenglykol-Derivate, Polyhydroxyfettεäure- Polyäthylenglykol-Blockcopolymere, Polyäthylenglykol- Ätherderivate. Substanzen dieεer Art εind im Handel u.a. unter der Handelεbezeichnung: Pluronic®, Synperonic®, Tetronic®, Triton®, Arlacel®, Span®, Tween®, Brij®, Renex®, Hypermer®, Lameform®, Dehymulε® oder Eumulgin® bekannt.

Im Hinblick auf einheitliche, perlförmige Polymer Partikel mit den geforderten Partikelgrößen von 1-10 μm hat sich

überraschenderweise gezeigt, daß für die Ölphaεe nur eine Miεchung auε mindestens zwei, vorzugsweiεe drei bis vier oberflächenaktiven Substanzen, zu der geforderten Partikelspezifikation führt. Voraussetzung für die Realisierung der geforderten Partikelgroßen ist eine entsprechende Verringerung der Grenzflächenspannung der Phaεen. Dies wird überraschenderweise durch Mischen von einer lipohilen Emulgatorkomponente mit mindestenε einem Emulgator ermöglicht, der semi-hydrophile Eigenschaften aufweist, d.h. der εowohl wasser- als auch öllöslich iεt. Emulgatoren, die die letzteren Eigenschaften erfüllen εind z.B.: Äthylenoxid-Propylenoxid-Blockcopolymer-Derivate mit überwiegendem Äthylenoxid-Anteil, Polyäthylenglykol- hexadecyläther, kürzerkettige Polyoxyäthylen-Sorbitan- Fettsäureester, Polyäthylenglykole oder kürzerkettige Sorbitan-Fettsäureester.

Die Konzentration der Emulgatoren in der Ölphase beträgt in der Regel 2-6 Vol.%, vorzugsweise 3.5-5.0 Vol%. In Bezug auf Feinheit und enge Korngrößenverteilung der Polymertröpfchen sind solche Emulgatormischungen von Vorteil, die mindestens zwei lipophile Komponenten und einen semi-hydrophilen Emulgator enthalten. Die Konzentration deε semi-hydrophilen Emulgators liegt in der in der Regel zwischen 15 und 30 Vol%, bezogen auf die Gesamt- Emulgatormenge. Die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen neben der Feinheit der Teilchen auch die Herstellung perlförmiger Teilchen, die Voraussetzung für eine homogene Suspenεion εind. Dadurch wird exaktes Pipettieren, wie in der biochemiεchen-mediziniεchen Analytik/Diagnostik erforderlich, ermöglicht.

Neben den Emulgatoren für die Ölphaεe tragen auch spezielle oberflächenaktive Substanzen, die in der wäßrigen Polymerphase löslich εind, zur Verbesserung der Suspenεionεqualität vor allem von Polymerlösungen mit

niedrigen Molmasεen (20.000-80.000) bei. Darüberhinaus hat sich überraschenderweise gezeigt, daß sich die in fester Form zugesetzten magnetischen Kolloide erεt durch Zugabe ionischer Emulgatoren fein dispergieren lassen. Beispiele für solche Emulgatoren, die auch als binäre Mischungen eingeεetzt werden können, εind: Serum Albumin, Gelatine, aliphatische und aromatische Sulfonsäure-Derivate, Polyäthylenglykole, Poly-N-Vinylpyrrolidon oder Cellulose- acetat-butyrat. Die Mengen der eingesetzten Emulgatoren betragen in der Regel 0.01 - 2 % Gew%, bezogen auf die Polymerphase, wobei die Konzentration der ionischen Emulgatoren durchweg zwischen 0.01 und 0.05 Gew% liegt. Die Einflüsεe wie Rührgeschwindigkeit sowie Konzentration und Viskoεität der beiden Phaεen auf die Teilchengröße, wie in der DE-OS 4127657 gezeigt, εpielen beim erfindungsgemäßen Verfahren aufgrund der Emulgatorzusätze nur eine untergeordnete Rolle. Zur Realisierung der erforderlichen Teilchengrößen von 1-10 μm reichen Rührgeschwindigkeiten von 1500-2000 U/Min. aus, wobei herkömmliche Zweiblatt- Propellerrührer zum Einsatz kommen. Der determinierende Einfluß der Emulgatoren des vorliegenden Verfahrens auf die Teilchengröße wird daraus ersichtlich, daß bei Erniedrigung der Rührgeschwindigkeit von 2000 auf 1300 U/Min. die Teilchengrößen von zuvor 1-5 um auf 2-8 μm ansteigen. Bei Erhöhung der Rührgeschwindikeit von 2000 auf 5000 U/Min. ist praktisch keine Teilchengrößenveränderung festzustellen. Demgegenüber variieren die Teilchengrößen der nach der vorgenannten Methode hergestellten Partikel bei analoger Änderung der Rührgeschwindigkeiten zwiεchen 10 und 80 μm. Auch der in der vorgenannten Patentschrift beobachtete Einfluß der Viskositäten sowohl der Suspensionsphase als auch der Polymerphase auf die Teilchengrößen wirken sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren gegenüber dem Einfluß der Emulgatoren nur minimal aus. So schwanken die Teilchengrößen

der PVAL-Partikel bei Veränderung der Viskoεität der Polymerphaεe von 10 auf 1000 mPa ε bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nur zwischen 2 und 8 μm, beim vorgenannten Verfahren unter sonεt gleichen Bedingungen dagegen zwiεchen 50 und 140 μm.

Alε Magnetpartikel, die während deε Suspensions- Vernetzungsprozesses in die Polymermatrix eingekapselt werden, können grundsätzlich solche ferro- oder superparamagnetischen Kolloide verwendet werden, die eine entsprechende Partikelgröße aufweisen und in der Regel über eine magnetische Sättigung von 50-400 Gauss verfügen. Ein weitere Forderung, die die Magnetpartikel erfüllen müssen, ist die Dispergierbarkeit in der wäßrigen Polymerphase. Im Gegensatz zu dem im U.S. Patent 4,654,267 beschriebenen Verfahren zur Erzeugung magnetischer Partikel, dem ein aufwendiger Quellungsprozesε mit Eisensalzen und anschließender Oxidation zu Magnetit-Kolloiden zugrunde liegt, können bei dem vorliegenden Verfahren die magnetischen Kolloide direkt in der Polymerphase dispergiert werden. Bei der anschließenden Suspenεion in der organiεchen Phase werden die Magnet-Kolloide dann simultan in den Polymertröpfchen eingeschlossen. Diese Verfahrensweise stellt eine deutliche verfahrenstechnische Vereinfachung gegenüber dem vorgenannten Verfahren dar, womit auch eine erhebliche Zeitersparnis für den Herstellungsprozess verbunden ist. Während zur Herstellung der vorgenannten Mittel auf Polystyrolbasis Präparationszeiten von 10 bis 30 Stunden erforderlich sind, benötigt man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren lediglich 5- 30 Minuten zur Gewinnung der Basis-Magnetpartikel.

Als magnetische Kolloide kommen vorzugsweiεe Magnetite mit Partikelgrößen von 10-200 nm in Frage, wobei daε erfindungsgemäße Verfahren nicht auf diese Verbindungsklasse beschränkt ist. Solche Substanzen sind z.B. unter der

Handelsbezeichnung Bayferrox oder Ferrofluidics im Handel erhältlich. Da die Herεtellung εolcher Kolloide allgemeiner Stand der Technik iεt, können die Magnetteilchen auch nach den bekannten Verfahren, wie z.B. von Shinkai et al., Biocatalyεiε, Vol. 5, 1991, 61, Reimers und Khalafalla, Br. Patent 1,439,031 oder Kondo et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol 41, 1994, 99, beschrieben, hergestellt werden. Die Konzentrationen der Kolloide in der Polymerphase liegen, jeweils bezogen auf die Polymephase, in der Regel zwiεchen 4 und 14 Vol% bei den Kolloiden, die herεtellungεbedingt bereits alε wäßrige Kolloide vorliegen, und 0.3-2 Gew.% bei den Feεtεubεtanzen. Für die Herεtellung werden die magnetischen Kolloide der Polymerphase direkt zugemischt. Um eine feindiεperεe, gleichmäßige Verteilung der Partikel zu gewährleiεten, iεt ein kurzzeitiges Vermischen der wäßrigen Dispersion mittels eines hochtourigen Dispergierwerkzeuges (Ultra-Turrax) mit anschließender Ultraschallbehandlung förderlich. Die zur Herstellung der Magnetpartikel benötigte Polymerphase besteht in der Regel aus 2.5-10 Gew% PVAL - Löεung. Wie auε der DE-OS 4127657 bekannt iεt, wird die Poroεität der Polymerteilchen letztlich durch die Knäueldichte bestimmt, die ihrerseits durch die mittlere Molmasse des Polymeren und die Konzentration feεtgelegt ist. Zunehmende Molmasse und/oder verringerte Polymerkonzentration bedeutet geringere Knäueldichte und damit zunehmende Porosität. Da die Praktikabilität eines Testverfahrens besonderε im Rahmen routinemäßiger diagnoεtischer oder analytischer Verfahren auch von der Quantität der pro Trägermenge absorbierten Substanzen abhängt, spielt die Porosität als hierfür mitentscheidender Parameter eine wesentliche Rolle bei der

Magnetpartikelherstellung. Bei den erfindungsgemäßen Mitteln kommen daher vorzugsweiεe Polymerkonzentrationen von 2.5-5

Gew?s und Molmassen von >50..000 zum Einsatz. Auf diese Weise hergestellte Polymerpartikel weisen eine hohe Porosität und eine entsprechend hohe Bindungskapazität sowohl in Bezug auf die an die Matrix gekoppelten Liganden, als auch für die von den Liganden gebundenen Ligaten bzw. Biomoleküle auf. Ein weiterer Faktor, der in die Porosität und somit auch in die Funktionalität der Magnetpartikel einfließt, ist die Wahl des Vernetzers sowie deεsen Konzentration. Im Hinblick auf hohe Beladungskapazitäten werden die

Vernetzerkonzentrationen so gewählt, daß eine entεprechende Porosität in Verbindung mit ausreichender Formstabilität gewährleistet ist. Als Vernetzer kommen prinzipiell alle wasserlöslichen mit den Hydroxyl-Gruppen des PVAL reagierende bifunktionelle Verbindungen wie z.B. Aldehyde, Säurechloride oder Divinylsulfon in Frage. Vorzugsweiεe wird Glutaraldehyd unter Säurekatalyse als Vernetzer verwendet, da diese Substanz bereitε innerhalb weniger Minuten mit dem Polymeren unter Bildung feεtvernetzter Partikel abreagiert. Bei den übrigen Subεtanzen εind ein biε zwei Stunden Reaktionεzeit erforderlich. Die Verwendung von Glutaraldehyd bietet darüberhinaus überraschenderweise die Möglichkeit, durch simultane Zugabe eines wasserlöslichen Diamins, z.B. Äthylendiamin oder Hexamethylendiamin, die Vernetzereinheit entsprechend um die Länge der Diaminkette zu verlängern und dadurch die Porosität der Polymermatrix zu erhöhen. Die Vernetzerkonzentrationen liegen, bezogen auf die wäßrige Polymerphase, in der Regel zwischen 0.2 und 1 Vol% und für Glutaraldehyd zwiεchen 2 und 7 Vol% . Glutaraldehyd wird durchweg in Form einer 6-25%igen wäßrigen Löεung eingeεetzt. Bei den Diaminen werden in der Regel zwischen 10 und 50 Mol%, bezogen auf die Glutaraldehyd Menge, eingesetzt. Für die Herεtellung der Magnetpartikel wird im allgemeinen zunächεt die 20-25fache Volumenmenge einer organischen Phase, vorzugεweiεe handelsübliches Pflanzenöl, vorgegeben.

in der anεchließend die Polymer-Magnet-Kolloid-Mischung unter Rühren suεpendiert wird. Die Zugabe der Säure im Falle der Glutaraldehyd-Vernetzung wird dabei von der Stabilität deε Magnet-Kolloids bestimmt. Manche Magnet-Kolloide neigen dazu, bei Säurezugabe zu agglomerieren. Dies kann überraschenderweise dadurch umgangen werden, daß die Säure erst während oder am Ende deε Suspensionsvorganges zugesetzt wird. Da die Magnet-Kolloide zu diesem Zeitpunkt bereits in der Polymermatrix feindiεpers veteilt sind, kann ein Agglomerieren gänzlich vermieden werden. Bei den säurestabilen Magnet-Kolloiden kann die Säure vor dem Suspenεionεprozeεε auch direkt zu der Polymer-Phase zugegeben werden. Die Zugabe des Vernetzers erfolgt jeweils während deε Suεpensionsvorganges.

Neben den bisher beschriebenen Teilchengröße und - geometrie bestimmenden Parametern kann überraschenderweise gezeigt werden, daß die Säurekonzentration einen entscheidenden Einfluß auf die Suspendierbarkeit der Magnet-Teilchen hat. Gute Suspendierbarkeit bedeutet, daß die Teilchen völlig isoliert voneinander sind und in wäßrigen Lösungen keinerlei Agglomerate bilden. Diese Eigenschaft, die Vorauεεetzung für eine lange Verweilzeit im εuεpendierten Zustand ist, wird durch Säurekonzentrationen von 15-50 Vol%, bezogen auf die Polymerphase, erzielt. Es wird vorzugsweiεe 1-3N HCl verwendet. Die Verweilzeiten in der Suspension sind dementsprechend bei den PVAL-Partiklen sehr hoch, sie liegen zwiεchen 12 und 48 Stunden gegenüber 4 Stunden bei den Polyεtyrol-Beadε aus der U.S. Patentschrift 4,654,267. Den εo gewonnenen Magnetpartikeln, deren beεondere Vorzüge in den durch die vielfältigen Verfahrensparameter gestaltbaren und adaptierbaren Eigenschaften wie Porosität, Korngröße, magnetischeε Verhalten und chemische Funktionalität begründet sind, eröffnen sich eine Vielzahl

von Anwendungen, die in ihrer Gesamtheit den bisher beschriebenen Magnetträgern nicht zugänglich sind. Aufgrund der hohen chemischen Funktionalität des Basiεpolymeren PVAL können bei den erfindungsgemäßen Mitteln sämtliche bei den herkömmlichen Affinitätschromatographie- Medien bekannten Aktivierungs- und Kopplungsverfahren angewendet werden. Beispiele für solche Aktivierungsagenzien sind: BrCN, 2-Fluor-1-methyl- pyridinium-toluol-4-sulfonat, 1,1'-Carbonyl-diimidazol, Epichlorhydrin, Hexamethylendiisocyanat oder l-Cyano-4- dimethylamino-pyridinium-tetrafluorborat. Die entsprechenden Kopplungεmethoden für Bioliganden bzw. Biomoleküle εind allgemeiner Stand der Technik und u.a. in Methods in Enzymology, Vol. 135, K. Moεbach Hrsg., 1987, beschrieben. Die Kopplungsverfahren in dem vorgenannten U.S. Patent 4,654,267 sind demgegenüber auf die Aktivierung und Kopplung von Carboxyl-Gruppen beschränkt.

Die vorhandenen Hydroxyl-Gruppen deε hier beεchriebenen erfindungεgemäßen Basiεpolymeren bieten darüberhinaus überraschenderweise die Möglichkeit, Vinylmonomere auf die Polymermatrix aufzupfropfen. Durch diesen Pfropfprozess können zusätzliche, funktionelle Molekülketten (Spacermoleküle) eingeführt werden. Die Kopplung der Biomoleküle an solche Spacermoleküle fördern allgemein die Erhaltung der nativen Struktur und damit die biologische Aktivität der gekoppelten Biomoleküle. Dadurch, daß das Biomolekül nicht mehr direkt mit der Matrixoberfläche in Kontakt kommt, werden mögliche Konformationsänderungen innerhalb des Biomoleküls unterbunden. Die Pfropfung mit Vinylmonomeren geschieht unter katalytischer Wirkung von Cer(IV)-Salzen, z.B. Cer(IV)-ammoniumnitrat oder Cer(IV)- ammoniumsulfat, die als Redoxinitiatoren für die Radikalpolymeriεation fungieren. Die Cer(IV)-Salze werden bevorzugt als 0.03-0.1 molare Löεungen in 0.5- 1 N

Schwefelsäure oder Salpetersäure eingesetzt. Als Vinylmonomere kommen solche Substanzen zum Einsatz, die über funktionelle oder reaktive Gruppen z.B. in Form von HO-, HOOC-, NH2-, NCO-, CHO- oder Oxiran-Gruppen verfügen. Bezüglich der Einzelheiten des an sich bekannten Pfropfverfahrene wird auf die in den Offenlegungsεchriften DE-OS 2157902 und DE-OS 3811042 beεchriebenen Verfahren verwiesen. Die hier vorgestellten erfindungsgemäßen Polymermatrizes unterscheiden εich jedoch hinsichtlich ihrer physikalischen und chemischen Struktur, Eigenschaften und Anwendtbarkeit grundsätzlich von der vorgenannten Pfropfmatrizeε. Ein weiterer Unterεchied zu den vorgenannten Pfropfverfahren besteht darin, daß bei den erfindungsgemäßen Mitteln nicht unter Sauerstoffauεεchluß gearbeitet werden muß, sondern daß die Gegenwart eines mit Wasεer nicht mischbaren organiεchen Löεungεmittels wie z.B. Hexan, Heptan, Cyclohexan oder Petroläther auεreicht, um hohe Pfropfauεbeuten zu realisieren. Die Pfropfzeiten lasεen εich darüberhinaus gegenüber den vorgenannten Verfahren bis zu 90% verringern. Die Mengen der eingesetzten Vinylmonomeren bewegen sich zwischen 10 und 50 Vol%, bezogen auf die Magnetpartikel-Suspension.

Aufgrund der vielfältigen Aktivierungs- und

Modifikationsmöglichkeiten der PVAL-Magnetpartikel kann eine praktisch unbegrenzte Anzahl von Biomolekülen an die Matrix gekoppelt werden. Es ergeben sich so weitreichende Einsatzmöglichkeiten, die von der medizinischen Diagnostik biε hin zur molekularbiologischen Analytik reichen. Eine wichtige Anwendung innerhalb der Biowissenschaften stellen die Auftrennungen nach dem Affinitätsprinzip dar. Die hierfür normalerweise verwendete Säulentechnik ist jedoch mit erheblichen experimentellen Aufwand verbunden, so dasε vor allem für kleine, routinemäßige Auftrennungen praktische Alternativen wünschenwert εind. Die erfindungsgemäßen Mittel

bieten solche Alternativen, da der Zeit- und experimentelle Aufwand nur einen Bruchteil gegenüber dem herkömmlicher Techniken erfordert. Als Liganden können grundsätzlich sämtliche heute in der Affinitätschromatographie verwendeten Liganden gekoppelt werden. Beispiele hierfür, die auch aus praktiεcher Sicht interessante Perspektiven eröffnen, sind: Protein A, Protein G, Heparin, Antikörper, Serum _. Albumin, Gelatine, Lysin, Concavalin A, Oligosaccharide, Oligonucleotide oder Enzyme. Die speziellen Auftrennungen, die sich mit solchen Affinitätsmatrizes durchführen lassen, sind allgemeiner Stand der Technik. Bezüglich der Einzelheiten dieser an sich bekannten Verfahren wird auf die Ausführungen im J. of Chromatography, Vol. 510, 1990, verwiesen. Neben der experimentellen Vereinfachung liegt der besondere Vorteil der Magnetpartikel-Technologie jedoch in einer deutlichen Verkürzung der Auftrennzeiten. Dieε liegt darin begründet, daß die Magnetpartikel-Suspension eine quasi-homogene Phase darstellt, die eine Umsatzkinetik analog der einer homogenen Lösung ermöglicht. Auf diese Weise lassen εich Auftrennungen ohne größeren Aufwand je nach Größe deε Ansatzes innerhalb von 2-5 Minuten durchführen.

Ein weiterer, interessanter Bereich, der mit der Magnetpartikel-Technologie abgedeckt werden kann, ist der Bereich der Diagnostik, im besonderen der Bereich des Immunoassayε. Daε grundlegende Prinzip beεteht darin, εpezifische Substanzen quantitativ zu erfassen. Die Qualität des Nachweises iεt dabei unmittelbar an die εpezifische Isolierung der betreffenden Substanz, sei es durch chromatographische Verfahren oder durch Bindung an einen polymeren Festkörper, geknüpft. In der Praxis geschieht diese spezifische Bindung in der Regel über einen immobilisierten Antikörper, der dann photometrisch oder nephelometrisch analysiert wird. Die neu entwickelten PVAL-

Medien bieten hier nun eine hervorragende Basis, für Immunoasεayε eingesetzt zu werden. Dazu werden in der bekannten Art und Weise Antikörper gegen bestimmte, für die Diagnose relevante Antigene an die Magnetpartikel chemisch gebunden. Beispiele solcher Antikörper sind: anti-Insulin, anti-Thyroxin, Antikörper gegen das Thyroid-stimulierende Hormon (TSH), Antikörper gegen daε Thyroid bindende Globulin, anti-Cortiεon, anti-Ferritin, anti-Chorionic Gonadotropin, anti-Carcinogen-Embryonaleε-Antigen (CEA), anti-Progeεteron, anti-Teεtoεteron, anti-Estradiol, anti- Prolactin, anti-Human-Growth-Hormon, anti-Digoxin, anti-ß2- Microglobulin, anti-α2-Macroglobulin, anti-Vitamin B12, anti-Faktor VIII oder anti-AFP. Die Inkubationzeiten der Antikörper-gekoppelten Magnetpartikel mit den Substanzgemiεchen beträgt in der Regel 2-5 Minuten. Nach magnetischer Abtrennung werden die isolierten Antikörper- Antigen Komplexe photometrisch mit Hilfe der bekannten Analysenmethoden quantitativ detektiert. Durch die Verwendung der Magnetpartikel-Technologie lassen sich die Inkubationszeiten um den Faktor 10-100 gegenüber der herkömmlichen Mikrotiterplatten- oder Säulentrenntechnik, wie εie in der DE-OS 4126436 beschrieben ist, verkürzen. Außer Antikörper können auch andere Substanzen an die Magnetpartikel gekoppelt werden und zur Detektierung bestimmter Substanzen genutzt werden. Eine solche Substanz ist 3-Aminophenylboronsäure, die an die PVAL-Matrix gekoppelt, zur Detektion deε BlutZuckergehaltes verwendet wird. Zur Immobilisierung des Liganden wird der PVAL-Träger im erεten Schritt mit Diisocyanaten aktiviert. Anεchließend erfolgt die Umεetzung mit dem Liganden. Für die Umεetzung werden in Regel 15-30 mg 3-Aminophenylboronεäure pro 100 mg Magnetphase eingesetzt. Die Analyse deε Blutzuckergehaltes geschieht über das im Blut vorhandene glykierte Hämoglobin, das sich spezifiεch an die Boronεäure-Liganden bindet. Durch

anεchließende Elution der gebundenen glykierten Fraktion von der Matrix wird diese quantitativ mittels photometrischer Methoden analysiert. Der besondere Vorzug gegenüber den früheren Testverfahren iεt der geringere arbeitstechnische Aufwand. Die Methode kann daher besonders für routinemäßige Analysen eingesetzt werden,

Die in den letzten Jahren im Zuge neuer therapeutischer- und diagnostischer Maßnahmen sehr in den Vordergrund gerückten molekularbiologischen Analysen stellen ein weiteres Anwendungsfeld für die PVAL-Magnetpartikel dar. Bei vielen analytischen Verfahren innerhalb der Molekularbiologie wird die hohe Affinität zwischen Streptavidin/Avidin und Biotin genutzt. Durch Ankopplung von Streptavidin bzw. Avidin an polymere Festphaεen können biotinylierte Biomoleküle jeglicher Art wie z.B. DNA- Fragmente, Oligonukleotide, Proteine, Antikörper oder Antigene iεoliert werden. Die Verwendung der PVAL-Matrix bietet hier aufgrund der einfachen Kopplungstechnik in Verbindung mit der hohen Suspendierfähigkeit die Möglichkeit, solche Trennungen in einfacher Weise durchzuführen. Praktische Anwendungsbereiche, wo die Magnet- Bead-Technik vorzugsweiεe eingeεetzt werden kann, εind z.B.: DNA-Festphasen-Sequenzierungen, DNA-Synthesen oder Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) . Die PVAL-Magnetpartikel bieten ferner über die Kopplung von Antikörpern, die gegen bestimmte Zellmarker gerichtet εind, z.B. anti-CD4, anti- CD15, anti-CD35, anti-CD8, Zellseparationen und Markierungen (Labelling) durchzuführen.Bezüglich der Einzelheiten wird auf die bekannte Literatur verwiesen: Haukanes und Kram, Biotechnology, Vol .11, 1993, 60.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Ein Magnetit-Kolloid wird analog der Vorschrift von Kondo et al., Appl. Microbiol Biotechnologie, Vol. 41, 1994, 99-105, hergestellt. 10 ml des Kolloids werden in eine Mischung, bestehend auε 80 ml 10% PVAL-Lösung (mittlere Molmasse 48.000), 5 ml 2.5% Polyvinylpyrrolidon Lösung, 20 ml 2 N HCl und 0.4 ml 3.5% Na-Dodecylεulfat, diεpergiert. Nach einminütiger Behandlung im Ultraschallbad (100 W) wird die Miεchung bei 20°C in 2 Liter eineε herkömmlichen Pflanzenöls, daε 2% Pluronic 6100, 0.8% Pluronic 6200, 0.4 % Dehymulε FCE und 0.6% Dehymulε HRE 7 enthält unter Rühren εuεpendiert. Die Rührgeεchwindigkeit beträgt 2000 U/Min. Nach 10 Sek. werden 6.4 ml 12%ige Glutaraldehyd-Lösung zugegeben. Es wird noch 20 Sek. weitergerührt. Danach wird die Suεpenεion bei 5000 x g 30 Sek. zentrifugiert und die Ölphaεe abdekantiert. Die verbleibende Suεpenεion wird einmal mit je ca. 300 ml n-Hexan und Methyläthylketon nachgewaschen. Die gewonnene magnetische Suεpension wird in ca. 400 ml Wasεer/Methanol 1:1 (v/v) diεpergiert und wiederum abzentrifugiert. Danach erfolgt lOmaligeε Waεchen der Magnetfraktion durch Diεpergieren in ca. 400 ml Wasser mit jeweils dazwiεchengeεchaltetem Zentrifugationεchritt. Eε werden Magnetpartikel mit einer Größenverteilung von 2-4 um und einem Eisengehalt von 7% gewonnen. (Alle %-Angaben hier und im folgenden sind in Vol.% , sofern es sich um eine flüssige Substanz und in Gew.% , sofern eε εich um eine Feεtεubεtanz handelt) .

Beispiel 2

5 ml Magnet-Kolloid gemäß Beispiel 1 werden in 40 ml PVAL- Phase gemäß Beiεpiel 1 diεpergiert und anεchließend in 880 ml handelsüblichem Pflanzenöl, in dem 1.5% Pluronic 8100, 0.4 % Pluronic 6200 und 0.4% Dehymuls FCE gelöst εind, unter

Rühren suspendiert (Rührgeschwindigkeit 2000 U/Min.). Sodann werden 4% 25%ige Glutaraldehyd-Lösung zugegeben; die Suspension wird für weitere 10 Sek. gerührt. Nach 10 Minuten wird die Suspenεion abzentrifugiert und gemäß Beiεpiel 1 mit Methanol/Waεεer, n-Hexan und Methyläthylketon gewaεchen. Eε werden Magnetpartikel mit einer Größe von 1-3 um gewonnen. Der Eisenoxid-Anteil beträgt 7.3 %.

Beispiel 3

4 ml Ferrofluidics EMG 807 werden in 100 ml 5% PVAL-Löεung (mittlere Molmasse 224.000) dispergiert. Die Dispersion wird

5 Min. im Ultraschallbad behandelt und anschließend in 2300 ml Pflanzenöl, das 2% Arlacel 83, 0.8% Tween 85 und 0.4% Dehymuls FCE enthält, unter Rühren (Rührgeschwindigkeit 1800 U/Min.) suspendiert. Nach 5 Sek. werden 25 ml 2.5 N HCl zugegeben und nach weiteren 5 Sek. 7 ml 12%ige Glutaraldehyd-Lösung. Eε wird noch 10 Sek. weitergerührt. Die Suεpenεion wird nach 10 Min., wie unter Beiεpiel 1 beschrieben, abzentrifugiert und gewaschen. Es entstehen Magnetpartikel mit einer Korngröße von 2-5 μm und einem Eisenoxidgehalt von 24.6%.

Beiεpiel 4

180 mg Bayferrox Eiεenoxid-Pigment PR 5044 N werden in 20 ml 7%iger PVAL-Löεung (mittlere Molmasse 88.000), die 0.01% Polystyrolεulfonsäure und 0.05 % Polyäthylenglykol 1000 enthält, vermischt und eine Min. mit einem Dispergierwerkzeug (Ultra-Turrax ) bei 20.000 U/Min. dispergiert. Es folgt eine zweimal 2minütige Behandlung im Ultraschallbad. Die Mischung wird anschließend unter Rühren (Rührgeschwindigkeit 2000) in 460 ml Pflanzenöl, daε 1.9% Arlacel 83, 0.4% Tween 20, 0.3% Dehymulε FCE und 1%

Dehymuls HRE 7 enthält, diεpergiert. Nach 10 Sek. wird 0.8 ml 25%ige Glutaraldehyd-Lösuing zugefügt und nach weiteren 5 Sek. 8 ml 1 N HCl. Die Suspension wird noch 10 Sek. weitergerührt. Nach 10 Min. erfolgt die Isolierung und Aufarbeitung der Fraktion gemäß Beispiel 1. Es fallen Magnetpartikel mit einer Korngrößenverteilung von 2-4 um und einem Eisenoxidgehalt von 12.3% an.

Beispiel 5

50 mg Bayferrox 318 M werden in 10 ml einer Mischung, bestehend aus 5% PVAL (mittlere Molmaεεe 224.000), 0.01% Na- Dodecylsulfat und 0.1% Polyäthylenglykol 1000 mittelε Ultra- Turrax diεpergiert (20.000 U/Min.). Anεchließend wird die Polymerphaεe in 250 ml Pflanzenöl, daε 2.2% Span 80, 0.4% Dehymulε FCE und 0.4% Pluronic 6200 enthält, unter Rühren suspendiert (Rührgeschwindigkeit 1800). Nach 5 Sek. werden 10 ml 1 N HCl zugefügt und nach weiteren 10 Sek. 0.6 ml 25%ige Glutaraldehyd-Lösung. Es wird 10 Sek. weitergerührt und die Suspenεion nach 5 Min. abzentrifugiert. Die gewonnene Fraktion wird gemäß Beispiel 1 gewaschen. Es bilden εich Magnetpartikel mit einer Korngrößenverteilung von 3-6 μm, deren Eisengehalt 10.2 % beträgt.

Beispiel 6

In eine Mischung, bestehend aus 50 ml 4%iger PVAL-Lösung (mittlere Molmasεe 103.000), in der 0.1% Rinder Serum Albumin und 0.5% Polyäthylenglykol 1000 gelöst sind, werden 6.4 ml Magnet-Kolloid gemäß Beispiel 1 diεpergiert. Die Dispersion wird 5 Min im Ultraschallbad beschallt und anschließend in 1100 ml Pflanzenöl, das 1.8% Span 85, 0.8% Synperonic Pl 61, 0.8% Tetronic 901 und 0.4% Dehymuls FCE enthält, suspendiert (Rührgeschwindigkeit 2000). Nach 10 Sek. werden 4 ml 12%ige Glutaraldehyd-Lösung zugegeben und nach weiteren 5 Sek. 12.5 ml 2.5 N HCl. Die Suspenεion wird

noch 10 Sek. weitergerührt. Nach 15 Min. erfolgt die Zentrifugation und weitere Aufarbeitung gemäß Beiεpiel 1. Es werden Magnetpartikel mit einer Korngrößenverteilung von 1-3 μm und einem Eisenoxidgehalt von 8.3% erhalten.

Beispiel 7

100 ml 3.5 %ige PVAL-Löεung (mittlere Molmasεe 224.000), die 20% 3 N HCl enthält, werden mit 13 ml Ferrofluidicε EMG 507 vermiεcht und 0.5 Min. im Ultraschallbad beschallt. Die Magnetit-Polymer-Phaεe wird εodann in 2.3 Liter Pflanzenöl, das 1.8% Pluronic 6100, 0.2% Pluronic 6200, 0.2% Hypermer A60 und 1.8% Dehymuls HRE 7 enthält unter Rühren suspendiert (Rührgeschwindigkeit 2000). Nach 10 Sek. werden 8 ml 12%ige Glutaraldehyd-Lösung zugegeben und 15 Sek. weitergerührt. Nach 10 Min. wird die Suspension abzentrifugiert und gemäß Beispiel 1 gewaschen. Die gewonnenen Teilchen haben eine Korngrößenverteilung von 1-2 μm und weisen einen Eisenoxidgehalt von 14.2% auf.

Beispiel 8

100 ml 7.5% ige PVAL-Lösung (mittlere Molmasεe 88.000), in der 0.05% Gelatine gelöst sind, werden mit 12.5 ml Ferrofluidicε EMG 707 vermiεcht und 3 Min. im Ultraschallbad behandelt. Die Miεchung wird anεchließend in 2.5 Liter Pflanzenöl, daε 1% Arlacel 83, 0.4% Pluronic 6100 und 0.2% Brij 52 und 0.4% Tween 60 enthält, unter Rühren εuεpendiert (Rührgeschwindigkeit 2000). Nach 10 Sek. werden 4 ml 12%ige Glutaraldehyd-Lösung und nach weiteren 5 Sek. 26.5 ml 1 N HCl zugefügt. Die Suspenεion wird noch 15 Sek. weitergerüht. Nach 15 Min. wird die Suspension abzentrifugiert und gemäß Beiεpiel 1 gewaschen. Es fallen Magnetteilchen mit einer Korngrößenverteilung von 2-4 μm und einem Eisenoxidgehalt von 26.0% an.

Beiεpiel 9

10 ml 7.5 % ige PVAL-Lösung (mittlere Molmasse 103.000) werden mit 0.5 N NaOH auf pH 9.5 eingestellt und 75 μl Divinylsulfon zupipettiert. In der wäßrigen Phase werden sodann 1.2 ml Magnet-Kolloid gemäß Beispiel 1 dispergiert. Nach 3minütiger Beschallung im Ultraschallbad wird die Miεchung in 220 ml Pflanzenöl, in dem 2% Span 60, 0.4% Tween 80 und 0.4% Dehymuls FCE gelöεt εind, unter Rühren suspendiert (Rührgeschwindigkeit 2000) . Es wird noch 30 Sek. weitergerührt. Danach wird die Suεpenεion 60 Min. bei Raumtemperatur stehengelassen und anschließend gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Es werden Partikel mit einer Korngrößenverteilung von 4-8 μm gewonnen. Der Eisenoxidgehalt beträgt 7.7%.

Beiεpiel 10

100 ml 3.5%ige PVAL-Löεung (mittlere Molmaεεe 224.000), in der 40% 1 N HCl und 0.015 % Na-Dodecylsulfat gelöεt εind, werden mit 5 ml Ferrofluidicε EMG 707 verεetzt und eine Min. im Ultraεchallbad beschallt. Die Polymerphase wird sodann in 2.3 Liter Pflanzenöl, in dem l%Arlacel 83, 1% Pluronic 6100, 0.8% Tween 80 und 2% Dehymuls HRE gelöεt εind, unter Rühren (Rührgeεchwindigkeit 2000) 10 Sek. suεpendiert. Nach 10 Sek. werden 6 ml 25%ige Glutaraldehyd-Lösung zugegeben; es wird für weitere 10 Sek. gerührt. Nach 10 Min. wird die Suspenεion gemäß Beiεpiel 1 abzentrifugiert und gewaschen. Es bilden sich Magnetpartikel mit einer Korngrößenverteilung von 2-4 um, die einen Eisenoxidgehalt von 24% aufweisen

Beispiel 11

14.5 ml Magnetit-Kolloid gemäß Beispiel 1 werden in 100 ml Polymerphase, die 4% PVAL (mittlere Molmasεe 224.000) und 0.1% Rinder Serum Albumin enthält, diεpergiert und eine Min. im Ultraschallbad behandelt. Danach wird die Dispersion

zunächεt für 15 Sek. in 2.5 Liter Pflanzenöl, in dem 3.8% Pluronic 3100, 0.8% Pluronic 6200 und 1.5% Tetronic 304gelöεt sind, unter Rühren suεpendiert

(Rührgeschwindigkeit 2000). Es werden εodann 7.5 ml 12%ige Glutaraldehyd-Löεung und nach weiteren 10 Sek. 25 ml 3 N HCl zugegeben ; eε wird noch für 10 Sek. weitergerührt. Nach 10 Min. wird die Suspenεion gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Es werden Magnetpartikel mit einer Korngrößenverteilung von 1-2 μm und einem Eisenoxidgehalt von 9.6 % gewonnen.

Beispiel 12

In 1200 ml Pflanzenöl, daε2.2% Arlacel 80, 0.8% Span 85 und 0.8% Triton CF 10 enthält, werden 50 ml Polymerphase beεtehend auε 5% PVAL (mittlere Molmaεεe 224.000), 0.5% Polyäthylenglykol 3350 und 12% Ferrofluidicε EMG 707 unter Rühren (Rührgeschwindigkeit 1800) 10 Sek. suspendiert. Es folgt in je 5 Sek. Abständen die Zugabe von 4 ml 25%ige Glutaraldehyd-Lösung und 25 ml 1 N HCl. Rühren wird für 15 Sek. fortgesetzt. Nach 10 Min. wird abzentrifugiert und gewaschen gemäß Beiεpiel 1. Man erhält Magnetpartikel, die eine Korngrößenverteilung von 1-2 um aufweisen und einen Eiεenoxidgehalt von 18.3% aufweisen.

Beispiel 13

In 100 ml 5%ige PVAL-Löεung (mittlere Molmaεεe 203.000), in der 0.05% Polyεtyrolεulfonεäure und 0.1%

Polyvinylpyrrolidon gelöst εind, werden mit 12 ml Magnetit- Kolloid gemäß Beiεpiel 1 diεpergiert und 2 Min. im Ultraεchallbad beschallt. Eε erfolgt die Suεpenεion in 2.2 Liter Pflanzenöl, deεεen Zusammensetzung analog Beispiel 12 ist. Nach 10 Sek. werden in Abständen von je 10 Sek. 8 ml 12%ige Glutaraldehyd-Lösung und 20 ml 2.5 N HCl zugegeben. Nach entsprechender Aufarbeitung analog Beispiel 1 erhält

man 2-4 μm große Magnetpartikel mit einem Eiεenoxidgehalt von 7.5%

Beiεpiel 14

6.5 ml Ferrofluidicε EMG 807 werden in 100 ml Polymer¬ phaεe, beεtehend auε 10% PVAL (mittlere Molmasse 88.000), 0.05% Cellulose-acetat-butyrat und 0.1% Polyvinylpyrrolidon, dispergiert und 3 Min. im Ultraschallbad beschallt. Die Dispersion wird anschließend in 2300 ml Pflanzenöl , daε 1.8% Synperonic L61, 0.2% Tetronic 1101 und 1% Dehymulε FCE enthält, unter Rühren (Rührgeschwindigkeit 2000 U/Min.) suεpendiert. Nach 10 Sek. werden in je 10 sekündigen Intervallen je 8 ml 12%ige Glutaraldehyd-Lösung, die 20 Mol% Athylendiamin enthält, und 23 ml 2.5 N HCl zugegeben. Es wird 10 Sek. weitergerührt und die Suspension nach 10 Minuten analog Beiεpiel 1 aufgearbeitet. Man erhält Magnetpartikel mit einer Korngrößenverteilung von 1-3 μm und einem Eiεenoxidgehalt von 10.4 %.

Beiεpiel 15

300 mg, der nach Beiεpiel 1 hergestellten Polymerpartikel, werden in 10 ml Wasser εuεpendiert, mit 10 ml 3.5 M NaOH und 15 ml Epichlohydrin verεetzt und 2 h bei 55°C unter intensivem Rühren umgesetzt. Danach werden die Magnetpartikel mittels eineε Neodym-Eiεen-Bor-Magneten abgetrennt. Das Produkt wird in ca.10 ml Wasεer εuεpendiert und nochmals magnetisch abgetrennt. Dieser Wasch/Abtrennvorgang wird lOmal wiederholt, gefolgt von einmaligem Waεchen mit Aceton. 30 mg der εo aktivierten Magnetpartikel werden εodann mit 2 ml 0.1 M Borat-Puffer, pH 11.4, der 10% Hexamethylendiamin enthält, bei 50°C 2 h

umgesetzt. Es wird lOmal mit Wasεer nachgewaschen. Das gewonnene Produkt wird anεchließend mit 2 ml 0.1 M K- Phosphat-Puffer, pH 7.0, in dem 12.5% Glutaraldehyd gelöst ist, für 2 h bei 30°C zur Reaktion gebracht. Anschließend wird über einen Zeitraum von 30 Min. zunächst lOmal mit Wasser und dann 2mal mit 0.1 M K-Phosphat-Puffer, pH 7.5, nachgewaεchen. Durch Zugabe von 1 ml 0.1 M K-Phosphat- Puffer, pH 7.5, in dem 0.3 mg Streptavidin gelöst sind, werden nach 12 εtündiger Inkubation bei 4 °C 0.11 mg Streptavidin an die Matrix gebunden. An die Matrix laεεen εich nach den bekannten Methoden biotinylierte DNA-Fragmente binden, die zur DNA-Sequenzierungen eingeεetzt werden.

Beiεpiel 16

30 mg der gemäß Beiεpiel 15 gewonenen

Epichlorhydrin/Hexamethylendiamin/Glutaraldehyd-aktiviert en

Magnetpartikel werden mit 2 ml 0.1 M K-Phoεphat-Puffer, pH

7.5, in dem 0.3 mg anti-Insulin Antikörper gelöst sind, 24 h bei 4°C umgesetzt. Eε werden 0.2.8 mg Antikörper gebunden.

Beispiel 17

60 mg Magnetpartikel gemäß Beiεpiel 3 werden durch sukzesεive Zugabe von Aceton/Waεεer-Miεchungen 1:3, 1:1, 3:1 (v/v) und schließlich absolutem Aceton entwässert. Danach wird die Suspension in 2 ml absolutem Dimethylsulfoxid, das 0.1% Zinn-octoat enthält, diεpergiert und durch Zugabe von 0.5 ml Hexamethylendiisocyanat für 30 Min. bei 45°C aktiviert. Danach wird je 5mal abwechselnd mit einigen ml Dimethylsulfoxid und Aceton gewaschen. 30 mg der aktivierten Fraktion werden mit 1 ml absolutem Dimethylsulfoxid, in dem 20% Polyäthylenglykol 400 und 0.05% DABCO gelöst sind , 4 h bei 30°C umgesetzt. Es wird einmal mit Dimethylsulfoxid und 5mal mit Wasεer gewaεchen und die Fraktion wiederum mit

den obigen Aceton/Waεser-Mischungen entwässert. Die Poiyäthylenglykol-gekoppelte Fraktion wird sodann mit je 1 ml Dimethylsulfoxid, in dem 6 mMol 4-Dimethylamino-pyridin und 5 mMol 2-Fluor-methyl-pyridinium-toluol-εulfonat gelöεt ist, 45 Min. bei Raumtemperatur umgesetzt. Es folgt 5maliges abwechselndes Waschen mit Dimethylsulfoxid und Aceton. Das aktivierte Produkt wird anschließend bei 4°C durch Inkubation mit einer anti-Thyroxin Antikörper-Lösung (0.25 mg Antikörper/ml 0.05 M K-Phoεphat-Puffer, pH 7.5) gekoppelt. Eε werden 0.23 μg Antikörper gekoppelt. Nach mehrfachem Waschen mit dem Kopplungspuffer werden die reεtliehen aktiven Gruppen durch 4stundige Inkubation mit 2 ml 20 mMol Mercaptoäthanol enthaltendem 0.1 M Tris-HCl Puffer, pH 8.5, deεaktiviert. Danach werden Magnetpartikel mit PBS Puffer, pH 7.2, gewaεchen. Die gekoppelten Magnetpartikel werden nach den bekannten Verfahren für die Thyroxin-BeStimmung eingeεetzt.

Beiεpiel 18

30 mg der gemäß Beiεpiel 17 mittelε Hexamethylendiisocyanat aktivierten Fraktion werden 5 h mit 2 ml 0.3 KOH/MeOH-Lösung 1:1 (v/v) verεetzt. Nach 5εtündiger Reaktion bei Raumtemperatur wird mehrfach mit Waεser gewaεchen. Die Äminogruppen enthaltende Fraktion wird dann gemäß Beiεpiel 15 mit Glutaraldehyd aktiviert. Eε folgt merfaches Wasschen mit Wasser über einen Zeitraum von 30 Min.. Durch 20stündige Inkubation bei 4°C mit 1 ml 0.1 M K-Phoεphat-Puffer, pH 7.5, in dem 0.35 mg anti-Maus IgG gelöst sind, werden 0.28 mg IgG gebunden. Das gekoppelte Produkt wird nach den bekannten Verfahren für die Zellseparation eingesetzt.

Beispiel 19

30 mg Magnetpartikel gemäß Beispiel 10 werden bei 0°C mit 4 ml Wasεer, in dem 100 mg BrCN gelöεt sind, versetzt. Durch

Zugabe von 2 N NaOH wird der pH auf 11.5 eingestellt. Die Reaktion wird nach 5 Min. durch magnetische Abtrennung der Magnetfraktion beendet. Eε folgt 4maligeε Waschen mit Eiswasser. Danach wird je einmal mit 0.01 N HCl und 0.1 M Bicarbonat-Puffer, pH 8.2, nachgewaschen. 1 ml 0.1 M Bicarbonat-Puffer, pH 8.2, in dem 0.2 mg anti-CD4 Antikörper gelöst sind, wird mit den aktivierten Magnetbeads für 12 h bei 4°C inkubiert. Es wird mehrfach mit PBS-Puffer, pH 7.2, der 0.5 M NaCl und 0.1 % Triton X100 enthält, nachgewaεchen. Man erhält einen Träger an den 0.18 mg Antikörper gebunden εind. Die gewonnen Träger werden zur Iεolierung von T- Helferzellen verwendet.

Beispiel 20

30 mg Magnetpartikel gemäß Beispiel 5 werden analog Beispiel 19 mit BrCN aktiviert. Ankopplung von Heparin (Molmaεεe 6000) erfolgt durch 12εtündige Inkubation von 1 ml Bicarbonat-Puffer, pH 8.2, der 0.5 mg gelöstes Heparin enthält. Danach wird für 2 h bei Raumtemperatur mit 0.1 M Äthanolamin-Lösung, pH 8.0, inkubiert und anschließend 4mal mit 0.1 M Acetat-Puffer, pH 4, nachgewaεchen. Die gewonnene Fraktion wird nach den bekannten Verfahren zur Trennung von Antithrombin III verwendet.

Beiεpiel 21

30 mg Magnetpartikel gemäß Beiεpiel 4 werden durch sukzessive Zugabe von Aceton/Wasεer Mischungen, wie oben beschrieben, entwässert. Je 1 ml Dimethylsulfoxid, in dem 6 mMol 4-Dimethylamino-pyridin und 5 mMol 2-Fluor-methyl- pyridinium-toluol-εulfonat gelöεt sind, wird mit den Magnetbeads für 45 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird je 5mal abwechselnd mit Aceton und Dimethylsulfoxid sowie einmal mit 0.05 M K-Phoεphat-Puffer, pH 7.5,

gewaεchen. Anεchließend wird 1 ml 0.05 K-Phoεphat-Puffer, pH 7.5, der 0.3 mg Protein A enthält zugeεetzt. Die Kopplung erfolgt über einen Zeitraum von 12 h bei Raumtemperatur. Es folgt mehrfaches Waschen mit PBS-Puffer, in dem 0.5% NaCl und 0.1%Triton X100 gelöst εind. Eε werden 0.27 mg Protein gebunden. Die Magnetpartikel Fraktion wird zur Abtrennung von IgG -Subklassen analog den bekannten Verfahren benutzt.

Beispiel 22

30 mg Magnetpartikel Fraktion gemäß Beispiel 12 werden einmal mit 2 ml 0.5 M Carbonat-Puffer, pH 11 gewaschen. Die anschließende Aktivierung mit 100 μl Divinylsulfon erfolgt unter Zugabe von 1 ml Wasch-Puffer über einen Zeitraum von 70 Min. bei Raumtemperatur. Es folgt mehfaches Waεchen mit Wasser über eine Zeitraum von 30 Min. 1 ml Carbonat-Puffer, pH 10, der 10% Lactose enthält, wird für 20 h bei Raumtemperatur mit der Magnetbead Fraktion inkubiert. Es werden 0.68 mg Lactose gebunden. Der Träger wird zur Aufreinigung von Lektinen aus Mistelextrakten nach den bekannten Verfahren verwendet.

Beispiel 23

30 mg Magnetpartikel gemäß Beispiel 7, die analog Beispiel 15 mit Epichlorhydrin aktiviert wurden, werden 16 h bei Raumtemperatur mit 0.3 M Adipinsäuredihydrazid in 0.2 M Carbonat-Puffer, pH 9, zum Hydrazid-Derivat umgesetzt. Es wird mehrfach mit 0.1 M Tris-HCl Puffer, pH 8.5, nachgewaschen. Restliche Oxiran-Gruppen werden durch 4stündige Inkubation mit 0.3 M Mercaptoäthanol-Lösung enthaltendem Waεchpuffer-Löεung deεaktiviert. Eε wird mit 3 ml 0.1 M Na-Acetat-Puffer, pH 5.5, nachgewaεchen. 1 ml Waεch-Puffer, in dem 0.3 mg anti-HGH und 10 mMol Na-m- Perjodat gelöεt εind, werden unter Lichtabεchluß für 40 Min. bei 4°C inkubiert. Eε folgt 5maligeε Waεchen mit Na-

Acetat-Puffer und 2maligeε Waschen mit PBS Puffer. Es werden 0.21 mg Antikörper gebunden. Der gekoppelte Träger wird zur Bestimmung von HGH verwendet.

Beispiel 24

30 mg Magnetpartikel gemäß Beispiel 9 werden in Wasεer εuspendiert und per Handmagnet abgetrennt. Die abgetrennte Fraktion wird in 0.5 ml 0.1 M Salpetersäure, die 0.1 M Cer(IV)-ammoniumnitrat enthält, für 15 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Danach werden die Magnetpartikel magnetisch abgetrennt und einmnal mit Wasεer nachgewaschen. Die Fraktion wird sodann unter Zugabe von 0.5 ml Acrylsäure und 0.5 ml n-Hexan für 15 Min. bei 50 °C zur Reaktion gebracht. Es wird lOmal mit Waεεer über einen Zeitraum von 30 Min. nachgewaεchen. Die Pfropfauεbeute beträgt 85 %. Die gepfropfte Fraktion wird mit 1ml 0.1 M MOPS-Puffer (3- Morpholino-propanεulfonεäure) , pH 7.5, der 5% N-Cyclohexyl- N-' (2-morpholinoäthyl)-carbodiimid-methyl-p-toluolsulfonat enthält, 30 Min. bei Raumtemperatur aktiviert. Eε wird 5mal mit Eiεwaεεer nachgewaschen und 0.3 mg anti-LDL Antikörper, gelöst in 1 ml MOPS-Puffer, pH 7.5, zugesetzt. Reaktionεdauer 24 h bei 4°C. Danach wird der Träger durch 4stündige Inkubation mit 5 ml 5mM Äthanolamin/0.1 M Tris- HCl-Puffer, pH 8.5, desaktiviert. Eε werden 0.25 mg Antikörper gebunden. Die gekoppelte Matrix wird zur Entfernung von LDL (Low-denεity-Lipoprotein) aus biologischen Flüssigkeiten eingesetzt.

Beispiel 25

30 mg Magnetpartikel gemäß Beispiel 3 werden analog Beispiel 24 mit Acrylεäure gepfropft. 100 μg Oligo(dT)20 werden entεprechend der Vorεchrift in DNA, Vol. 4, 1988, 327 mit Athylendiamin am 5'-Ende εubεtituiert. Daε NH2-modifizierte Oligonukleotid wird in 1 ml 0.1 M Imidazol-Puffer, pH 7.0,

gelöst und mit der Magnetpartikel Fraktion für 20 h bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird mehrfach mit dem Imidazol-Puffer, der 0.1% Triton X100 enthält, gewaschen. Es werden 38 μg Oligonukleotid gebunden. Die gewonnenen Magnetpartikel werden zur Isolierung von mRNA nach den bekannten Verfahren verwendet.

Beispiel 26

100 mg Magnetpartikel gemäß Beispiel 9 werden zunächst mit Hilfe der Aceton/Wasεer-Miεchungen gemäß obiger Vorεchrift entwässert. Es folgt die Aktivierung mittels Hexamethylendiisocyanat gemäß Beispiel 17. 2 ml Dimethylsulfoxid, in dem 0.1% Zinn-Octoat und 30 mg m-Amino- phenylboronsäure gelöst εind, werden mit den aktivierten Partikeln für 6 h bei 30°C inkubiert. Danach wird mehrfach mit Wasser nachgewaschen. Die Boronsäure gekoppelten Magnetpartikel werden zur Bestimmung des glykierten Hämoglobins im Blut nach den bekannten Verfahren eingesetzt.

Beispiel 27

30 mg Magnetpartikel entsprechend Beispiel 14 werden mit 2 ml Wasεer, in dem 50 mg Cibacron Blau F3G-A gelöεt sind, versetzt und für 30 Min. auf 60°C erhitzt. Danach wird 1 ml 25% NaCl-Löεung zugesetzt und eine weitere h auf 75°C erhitzt. Nach Zugabe von 1 ml 10%iger Na-Carbonat-Lösung, wird noch 2 h bei 70°C erhitzt. Eε folgt mehrstündiges Waschen mit Wasser. Die gewonnene Matrix wird für die Auftrennung von Alkohol Dehydrogenase nach den bekannten Verfahren verwendet.