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Title:
PORTABLE DEVICE, METHOD FOR READING AUTHENTICATION LABELS AND USES THEREOF
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2017/191575
Kind Code:
A1
Abstract:
The present disclosure relates to a portable device for detecting deoxyribonucleic acid in a sample. The present device comprises the following components: a rod and a disposable part located at one end of the device. The disposable part, a membrane lid, is in turn coupled to a microtube, for example. The membrane lid of the portable DNA-detecting device/indicator brush in turn comprises three distinct components: a zone for clipping the lid to the microtube, a zone for absorbing the reaction solution and the DNA sample, and a zone for clipping to the brush body. The device further comprises a reaction indicator. The present disclosure also relates to a method for specifically detecting molecular labels containing deoxyribonucleic acid molecules used for labelling, tracking and verifying the authenticity of various materials, in particular biological and non-biological materials and liquid media.

Inventors:
MARCIAL GOMES NEWTON CARLOS (PT)
JESUS OLIVEIRA VANESSA (PT)
RISO DAS COSTA COELHO FRANCISCO JOSÉ (PT)
LOPES DOS SANTOS ANTÓNIO ROGÉRIO (PT)
Application Number:
IB2017/052570
Publication Date:
November 09, 2017
Filing Date:
May 03, 2017
Export Citation:
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Assignee:
UNIV AVEIRO (PT)
International Classes:
C12Q1/68
Domestic Patent References:
WO2011150115A22011-12-01
WO2015026254A12015-02-26
Foreign References:
US20050150423A12005-07-14
US6179501B12001-01-30
US20140356874A12014-12-04
US7115301B22006-10-03
US8415164B22013-04-09
US20140099643A12014-04-10
US7972820B22011-07-05
EP1609874B12008-11-05
US20140295415A12014-10-02
US5645801A1997-07-08
US5837466A1998-11-17
US6468751B12002-10-22
Other References:
ANONYMOUS: "Ink eradicator: historical overview - Pelikan", 21 November 2014 (2014-11-21), XP055399277, Retrieved from the Internet [retrieved on 20170817]
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BELLE DUMÉ: "A Portable DNA Detector - MIT Technology Review", 24 September 2008 (2008-09-24), XP055399250, Retrieved from the Internet [retrieved on 20170817]
BERNHARD WEIGL ET AL: "Towards non- and minimally instrumented, microfluidics-based diagnostic devices", LAB ON A CHIP, vol. 8, no. 12, 1 January 2008 (2008-01-01), pages 1999, XP055094261, ISSN: 1473-0197, DOI: 10.1039/b811314a
Attorney, Agent or Firm:
TEIXEIRA DE CARVALHO, Anabela (PT)
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Claims:
R E I V I N D I C A Ç Ã O

1. Dispositivo portátil para deteção de um ácido desoxirribonucleico de uma amostra, que compreende:

uma haste com uma primeira extremidade e uma segunda extremidade; em que a primeira extremidade da haste é apta para ser manuseada por um utilizador e a segunda extremidade da haste compreende um elemento destacável;

em que o referido elemento destacável compreende

um elemento de clipagem que compreende duas posições, em que a primeira posição acopla o elemento de clipagem à segunda extremidade da referida haste e a segunda posição do elemento de clipagem acopla uma membrana porosa de policarbonato para suporte da amostra e de uma solução de amplificação enzimática isotérmica.

2. Dispositivo de acordo com a reivindicação anterior em que a membrana porosa de policarbonato compreende uma porosidade entre 0,05-8 μιη, de preferência 0,2-8 μιη, ainda de mais preferência 1-5 μιη.

3. Dispositivo de acordo com as reivindicações anteriores em que a membrana porosa de policarbonato compreende um revestimento.

4. Dispositivo de acordo com a reivindicação anterior em que o referido revestimento é um revestimento de polivinilpirrolidona.

5. Dispositivo de acordo com as reivindicações 3-4 em que o revestimento de polivinilpirrolidona compreende uma espessura entre 0,5-1,5 μιη, de preferência 1 μιη.

6. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que o dispositivo compreende um segundo elemento destacável apto para ser acoplado à segunda extremidade do dispositivo e envolver o elemento de clipagem.

7. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que o segundo elemento destacável é um microtubo.

8. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que os elementos destacáveis são descartáveis.

9. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a membrana porosa de policarbonato é descartável.

10. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que o dispositivo compreende ainda um indicador de reação, em particular um indicador colorimétrico de reação.

11. Dispositivo de acordo com a reivindicação anterior em que o indicador de reação está compreendido na solução de amplificação enzimática isotérmica.

12. Dispositivo de acordo com as reivindicações 10-11 em que o indicador de reação é um corante da família das cianinas.

13. Dispositivo de acordo com as reivindicações 10-12 em que o corante de reação é o azul de hidroxinaftol.

14. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a amostra é selecionada da seguinte lista: superfície de embalagens, produtos farmacêuticos e/ou produtos alimentares.

15. Kit que compreende o dispositivo descrito em qualquer uma das reivindicações anteriores.

Description:
D E S C R I Ç Ã O

DISPOSITIVO PORTÁTIL, MÉTODO PARA LEITURA DE ETIQUETAS DE AUTENTICAÇÃO E

SEUS USOS

Domínio técnico

[0001] A presente divulgação refere-se a um dispositivo portátil e a um método para deteção específica de etiquetas moleculares contendo moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN) utilizadas na marcação, rastreabilidade e autenticidade de diversos materiais, em particular materiais biológicos, não biológicos e meios líquidos. A presente divulgação insere-se assim, no domínio das tecnologias para rastreabilidade e autenticação, com aplicação em qualquer tipo de atividade em que seja necessário a identificação de materiais marcados com ADN.

Antecedentes

[0002] A entrada de produtos falsificados nas cadeias de abastecimento está a ganhar proporções nunca antes registadas, com consequências alarmantes nas receitas de empresas e na saúde e segurança de consumidores em todo o mundo. Existe, assim, uma necessidade crescente de tecnologias inovadoras que permitam combater a contrafação e proteger a população contra produtos contrafeitos e adulterados. Atualmente estão amplamente implementados vários sistemas de autenticação de produtos e certificação de sua origem. Os mais comuns recorrem à utilização de etiquetas adesivas com ou sem códigos de barras e etiquetas eletrónicas com identificação por radio-frequência (RFID). No entanto as várias técnicas de contrafação têm experimentado uma rápida evolução tornando desta forma vulneráveis os métodos tradicionais de autenticação. Em resposta a esse fenómeno, a utilização de ADN na autenticação de materiais diversos constitui uma alternativa inovadora e revolucionária aos métodos tradicionais. O ADN é considerado o "padrão-ouro" de testes forenses, e é uma ferramenta fundamental para a justiça criminal. O ADN é um polímero formado por nucleotídeos. Cada nucleotídeo é constituído por três componentes: um grupo fosfato, um açúcar e uma base azotada. Existem quatro tipos de nucleotídeos diferentes no ADN (adenina, guanina, citosina e timina), em que a informação codificada nos genomas de organismos vivos determina a sua ordem. A diversidade de organismos no nosso planeta é uma prova por si só da enorme capacidade do ADN de codificar informação. De fato, a capacidade codificadora e a estabilidade das moléculas de ADN faz com que estas possam ser utilizadas como forma de identificação e autenticação de matérias-primas ou industriais.

[0003] O documento de patente WO 2015026254 Al descreve um método de criação de uma etiqueta molecular de ADN que parte de fragmentos de ADN natural e não necessita de sequenciação para a sua leitura. Por sua vez, o documento de patente US7115301 descreve vários métodos de encapsulamento de ADN numa variedade de meios, que além de protegerem e estabilizarem a molécula de ADN face à fatores externos (temperatura, UV), permitem que as moléculas sejam incorporadas numa variedade de materiais e objetos. O documento de patente US8415164 B2 descreve a incorporação de um marcador de ADN, previamente ligado a um "up-converting phos- phor" , em várias tintas. O documento US 20140099643 Al descreve uma formulação que permite a recuperação dos marcadores de ADN mantendo a integridade do material marcado.

[0004] No entanto, a falta de um sistema de deteção expedito, simples e seguro de materiais marcados por ADN constitui o principal obstáculo para a popularização das tecnologias de autenticação por ADN. Atualmente, muitas destas técnicas de amplificação de ADN, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), necessitam de material laboratorial específico e dispendioso para a amplificação e de métodos elaborados e complexos para visualização dos produtos amplificados, como o uso de agentes fluorescentes intercalantes de ADN (como por exemplo brometo de etídio ou SYBR Green) adicionados em gel de agarose antes ou depois da eletroforese.

[0005] Outras técnicas têm vindo a ser desenvolvidas para a deteção de sequências de ácidos nucleicos amplificadas, tais como, adição de fluoróforos aos "primers" ou iniciadores para posterior deteção do produto amplificado por polarização fluorescente.

[0006] Também o uso de reações de hibridização de ADN-ADN através de sondas que consistem em sequências de ADN de fita simples específicas tem vindo a ser amplamente difundidas com o desenvolvimento de suportes de fácil uso. Contudo, para deteção das sequências de ADN alvo, as sondas são marcadas com radioisótopos, enzimas ou moléculas quimioluminiscentes o que leva à necessidade de equipamentos dispendiosos para a deteção do resultado. Outra grande desvantagem do uso de sondas é a baixa sensibilidade da técnica e a reduzida eficácia em concentrações baixas de ADN alvo.

[0007] Geralmente no contexto de diagnóstico a utilização de micropipetas não é problemática, uma vez que os técnicos de saúde possuem, em regra, experiência na manipulação destes instrumentos. No contexto da autenticação, a utilização deste instrumento por um profissional não habilitado pode constituir uma barreira à deteção da etiqueta molecular. O documento de patente US 7972820 B2 divulga a utilização de uma técnica de amplificação isotérmica de ácidos nucleicos em que os iniciadores e o ácido nucleico alvo são imobilizados num suporte, contudo para execução dessa tecnologia é necessário o uso de kits e equipamento de laboratório e metodologias complexas. A patente EP 1609874 BI, descreve um chip para pesquisa e identificação de patógenos, que utiliza sondas de oligonucleótidos específicas ligadas a um suporte sólido. Neste exemplo, a utilização de sondas para a hibridização torna o processo mais moroso e complexo. O documento de patente US 20140295415 Al descreve vários dispositivos portáteis de baixo custo baseados em membranas que podem ser utilizados para detetar ácidos nucleicos. No entanto todos eles requerem a manipulação da amostra de ADN com recurso a uma pipeta.

[0008] Estes documentos ilustram o problema técnico a resolver pela presente divulgação.

Descrição geral

[0009] Recentemente a utilização de ADN para marcação de produtos tem vindo a ser utilizada por várias empresas. O ADN é incorporado em objetos ou materiais diversos e, caso seja necessário verificar a autenticidade ou proveniência dos objetos ou matérias, é recolhida uma amostra do ADN do material marcado que é em seguida analisada em laboratório. O fato da análise ter que ser feita em laboratório torna mais difícil o acesso ao código e inibe possíveis tentativas de falsificação do mesmo. No entanto, em algumas áreas de atividade, a verificação da autenticidade de objetos necessita de ser feita na hora, não sendo possível o envio e análise do ADN em laboratório. A presente divulgação procura suprimir essa falha, descrevendo um método simples que permite uma análise rápida da amostra marcada e no local.

[0010] A presente divulgação refere-se a um dispositivo e a um método para deteção de ADNs utilizados na marcação de objetos ou materiais diversos, sendo denominados de etiquetas de ADN. Uma amostra de ADN obtida de um objeto ou material marcado é eluída em tampão e analisada por um dispositivo apropriado denominado por pincel indicador.

[0011] O referido dispositivo compreende vários elementos, entre os quais uma haste, em particular uma haste na forma de pincel, que pode compreender um código de cor responsável por indicar a presença do ADN alvo; um ou mais microtubos e ainda uma tampa ligada a uma membrana absorvente denominada tampa-membrana.

[0012] A utilização do dispositivo compreende o encaixe da tampa-membrana numa das extremidades da haste, seguido da imersão da membrana absorvente numa solução de amplificação enzimática isotérmica por loop (LAMP) e adição da amostra de ADN na membrana. A tampa-membrana é então encaixada novamente sobre o microtubo original com a membrana absorvente voltada para dentro do tubo. O conjunto microtubo tampa-membrana é então incubado num termobloco durante 30-60 min a ~60 °C. A deteção do ADN alvo é feita a partir da avaliação colorimétrica da membrana através da comparação de reações controlo.

[0013] A amostra referida na presente divulgação pode ser qualquer material artificialmente marcado com um ADN, em particular com um ADN alvo.

[0014] A presente divulgação insere-se, assim, no domínio das tecnologias para rastreabilidade e autenticação, com aplicação em qualquer tipo de atividade em que seja necessária a identificação de etiquetas moleculares de ADN ou deteção de materiais marcados com ADN. A presente divulgação também tem aplicação na área de diagnóstico molecular e deteção especifica de ADN de diferentes espécies de microrganismos.

[0015] A técnica de amplificação enzimática isotérmica de ácidos nucleicos mediada por loop (LAMP) é uma técnica de amplificação realizada a uma temperatura constante e sem necessidade de recurso a um termociclador. Esta técnica é distinta da tecnologia de reação em cadeia da polimerase (PCR), uma vez que com a tecnologia de PCR a reação é levada a cabo com uma série alternada de passos de temperatura ou ciclos e é necessário a utilização de um termociclador.

[0016] Com a técnica de amplificação enzimática isotérmica de ácidos nucleicos mediada por loop (LAMP) a sequência alvo é amplificada a uma temperatura constante de 60 - 65 °C, utilizando dois ou três conjuntos de iniciadores/primers/oligonucleotideos e uma polimerase com atividade de deslocamento (liberação de um ADN de fita única) elevada em adição a uma atividade de replicação. Tipicamente, 4 iniciadores diferentes são utilizados para identificar regiões distintas no gene-alvo, o que aumenta significativamente a especificidade dessa técnica. Um par adicional de iniciadores "loop" pode acelerar ainda mais a reação. Devido à natureza específica da ação destes iniciadores, a quantidade de ADN produzida em LAMP é consideravelmente mais elevada do que a amplificação baseada em PCR.

[0017] A deteção do produto de amplificação pode ser determinada por meio de fotometria de turvação causada por um aumento da quantidade de precipitado de pirofosfato de magnésio numa solução, como um subproduto da amplificação. Isto permite fácil visualização pelo olho nu, especialmente para os volumes de reação maiores, ou através da deteção simples de abordagens para volumes menores. A reação pode ser seguida em tempo real, quer por medição da turbidez, quer por fluorescência utilizando corantes intercalantes na cadeia de ADN. As moléculas de corante intercaladas diretamente na cadeia de ADN podem ser correlacionadas com o número de cópias inicialmente presentes, pelo que a técnica de amplificação enzimática isotérmica de ácidos nucleicos pode ser uma técnica qualitativa e/ou quantitativa.

[0018] A presente divulgação compreende um dispositivo e um método que permite detetar, no local, sequências de ADN específicas de etiquetas moleculares usadas na autenticação de materiais diversos. A deteção das etiquetas de ADN é feita através da técnica de amplificação enzimática isotérmica LAMP, em pequenos volumes de reagente, por exemplo entre 4-6 μΙ de volume e sem a necessidade de equipamentos sofisticados de biologia molecular. [0019] Numa forma de realização, a reação ocorre sobre uma membrana absorvente e porosa de policarbonato, de preferência uma membrana de policarbonato com uma porosidade compreendida entre 0,05-8 μιη, de preferência 0,2-8 μιη, ainda mais de preferência 1-5 μιη. Para melhores resultados, a referida membrana pode ainda compreender um revestimento de polivinilpirrolidona (PVP).

[0020] Numa forma de realização, o resultado da análise consiste na avaliação colorimétrica através da comparação com reações controle com e sem moléculas de ADN alvo.

[0021] A presente divulgação irá permitir a rápida autenticação de materiais marcados com ADN em locais remotos com pouca infraestrutura laboratorial, pontos de produção e áreas de controlo de mercadorias diversas, em particular pontos de fiscalização alfandegária e/ou ação fiscal móvel através de um dispositivo, kit, que pode compreender reagentes adequados para a realização da técnica de amplificação enzimática isotérmica de ácidos nucleicos mediada por loop (LAMP) e um método para utilização do referido dispositivo.

[0022] O recurso a técnicas de amplificação de ADN utilizando enzimas isotérmicas, tal como a técnica de amplificação enzimática isotérmica mediada por loop (LAMP), tem sido amplamente difundida como uma alternativa prática e relativamente fácil de executar na deteção de marcadores genéticos, em particular moléculas de ADN. Uma das grandes vantagens do LAMP é a possibilidade de monitorização rápida, por exemplo cerca de 1 hora, e em tempo real dos produtos obtidos, em particular os produtos que resultam da amplificação de fragmentos da molécula de ADN alvo através de um marcador colorimétrico e sem recurso a instrumentos de laboratório caros e cuja utilização requer experiência. Essa tecnologia requer apenas um banho de água ou banho seco, em particular um termobloco e micropipetas para manuseio das soluções de reação. Possui ainda a vantagem de ser uma tecnologia de elevada especificidade e sensibilidade. Contudo, em geral, apesar da sua simplicidade, a tecnologia LAMP tem vindo a ser utilizada sobretudo na deteção de agentes patogénicos e diagnóstico de doenças, em ambiente académico ou em ambiente hospitalar. Sendo ainda muito dependente de micropipetas automáticas e materiais para biologia molecular livres de contaminação e condições assépticas para manipulação dos reagentes (LAMP mix de reação). Além disso os reagentes para a reação de LAMP são significativamente mais caros do que os reagentes convencionais usados para amplificação por PCR. Alternativamente, com o desenvolvimento da tecnologia microfluídica, é possível a simplificação da utilização dessa tecnologia e diminuição dos custos devido à necessidade de quantidades mínimas de reagentes para amplificação enzimática de amostras de ADN. Contudo muitas destas técnicas usam sondas ou fluoróforos que necessitam posteriormente de equipamento de laboratório para leitura de resultados. Mesmo os já desenvolvidos para técnicas de amplificação de ADN utilizando enzimas isotérmicas necessitam de micropipetas, equipamentos específicos, consumíveis de biologia molecular para manipulação da amostra, em particular pontas, reagentes para extração e purificação de ADN.

[0023] As soluções atualmente existentes requerem que o operador possua alguma experiência ou treino na manipulação de pipetas e/ou outro material sofisticado. Geralmente no contexto de diagnóstico a utilização de micropipetas não é problemática, uma vez que os técnicos de saúde possuem, em regra, experiência na manipulação destes instrumentos. No contexto da autenticação, a utilização deste instrumento por um profissional não habilitado pode constituir uma barreira à deteção da etiqueta molecular.

[0024] Recentemente a utilização de ADN para marcação de produtos, objetos e/ou materiais diversos tem vindo a ser utilizada por várias empresas. O ADN é incorporado em produtos, objetos e/ou materiais diversos e caso seja necessário verificar a autenticidade ou proveniência dos objetos ou matérias é recolhida uma amostra do ADN do material marcado que é em seguida analisada em laboratório. O fato da análise ter que ser feita em laboratório torna mais difícil o acesso ao código e inibe possíveis tentativas de falsificação do mesmo. No entanto, em algumas áreas de atividade, a verificação da autenticidade de objetos necessita de ser feita na hora, não sendo possível o envio e análise do ADN em laboratório. A presente divulgação procura suprimir essa falha, descrevendo um método simples que permite uma análise rápida da amostra e no local.

[0025] As áreas de atividade em que a presente divulgação pode ser utilizada são, por exemplo, as seguintes áreas: indústria alimentar, embalagens e farmacêutica. [0026] Na presente divulgação uma zaragatoa pode ser utilizada para recolher uma amostra, em particular uma amostra de ADN de um material marcado, em particular da superfície do material marcado. Inicialmente uma extremidade da referida zaragatoa pode ser imersa num tampão de extração, em particular um tampão de extração que compreende Tris-HCI e EDTA (TE) pH8. A zaragatoa humedecida com tampão é então usada para obtenção de um esfregaço do material marcado e em seguida o ADN removido é dissolvido em tampão TE, pré-aquecido em termobloco, em particular a 60°C e colocado durante 5 min a 60 °C. Durante o período de incubação, inicia-se a preparação do dipositivo de deteção de moléculas de ADN alvo denominado na presente divulgação como pincel indicador. O dispositivo compreende uma haste na forma de pincel contendo um código de cor indicador da presença do ADN alvo e um sistema contendo microtubo e tampa-membrana.

[0027] Numa forma de realização, a utilização do dispositivo inicia-se com o encaixe de uma das extremidades da haste sobre a face externa da tampa-membrana acoplada ao microtubo. Com auxílio da haste a tampa-membrana é removida e a membrana da sua face interna é então imersa na solução contendo reagentes para amplificação enzimática isotérmica do ADN (LAMP). Cerca de 4 - 6 μΙ da solução de reação de LAMP é transferida para a membrana absorvente. A reação de LAMP na presente divulgação contem iniciadores específicos para o ADN a ser detetado, em particular ADN usado na marcação do material examinado e um indicador colorimétrico, em particular azul de hidroxinaftol ou outros corantes da família das cianinas e suas combinações para deteção do fragmento de ADN amplificado.

[0028] Numa forma de realização, a deteção de ADN inicia-se com a transferência de cerca de 1 μΙ da amostra contendo >50 fg de ADN alvo em TE, em particular 50-500 fg/μΙ com auxílio de uma alça de inoculação de 1 μΙ, sobre a membrana absorvente já impregnada com a solução de reação de LAMP, tal como descrito na etapa anterior. Em seguida a membrana é incubada dentro do microtubo original através da acoplagem da tampa-membrana sobre o tubo.

[0029] Numa forma de realização, o conjunto microtubo-tampa-membrana é transferido para um termobloco durante 30-60 min a ~60 °C. Após a incubação a presença da etiqueta molecular ou molécula alvo de ADN é determinada através da avaliação colorimétrica da membrana absorvente através da comparação dos resultados contendo reações controle com e sem ADN alvo.

[0030] A presente divulgação insere-se no domínio das tecnologias para rastreabilidade e autenticação de materiais diversos.

[0031] A presença da etiqueta molecular ou molécula alvo de ADN é determinada através da avaliação colorimétrica de comparação dos resultados contendo reações controle com e sem ADN alvo.

[0032] A presente divulgação pode ser utilizada em várias áreas, por exemplo, indústria alimentar, embalagens e farmacêutica.

[0033] A presente divulgação diz respeito a um dispositivo portátil para deteção de um ácido desoxirribonucleico de uma amostra que compreende: uma haste com uma primeira extremidade e uma segunda extremidade;

em que a primeira extremidade da haste é apta para ser manuseada por um utilizador e a segunda extremidade da haste compreende um elemento destacável;

em que o referido elemento destacável compreende

um elemento de clipagem que compreende duas posições em que a primeira posição é apta para acoplar o elemento de clipagem à segunda extremidade da referida haste e a segunda posição do elemento de clipagem é apta para acoplar uma membrana porosa de policarbonato para suporte da amostra e de uma solução de amplificação enzimática isotérmica.

[0034] Numa forma de realização, e para obter melhores resultados, a porosidade da membrana de policarbonato pode variar entre 0,05-8 μιη, de preferência 0,2-8 μιη, ainda de mais preferência 1-5 μιη.

[0035] Numa forma de realização, e para obter melhores resultados, a membrana da presente divulgação pode compreender um revestimento, em particular pode compreender um revestimento de polivinilpirrolidona (PVP) em que o referido revestimento atua como agente humectante.

[0036] Numa forma de realização, o revestimento de polivinilpirrolidona pode compreender uma espessura entre 0,5-1,5 μιη; de preferência aproximadamente 1 μιη. [0037] Numa forma de realização, foram testadas as seguintes membranas sem sucesso, nomeadamente uma membrana de nitrato de celulose, em particular uma membrana de nitrato de celulose com 0,45 μιη; uma membrana de fibra de vidro em particular uma membrana de fibra de vidro com 0,3 μιη de porosidade e uma membrana de vidro com 0,7 μιη de porosidade; uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF), em particular uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) com 0,22 μιη; e uma membrana de filtro de celulose.

[0038] Numa forma de realização, a referida membrana de policarbonato, com ou sem o revestimento de polivinilpirrolidona (PVP), pode estar apta a suportar a solução de reação e o ADN da amostra e a mediar a amplificação do referido ácido nucleico, sendo que este efeito se deve à sinergia entre o material da membrana e a porosidade da mesma.

[0039] Numa forma de realização, a amplificação do ácido nucleico é feita por amplificação enzimática isotérmica mediada por loop.

[0040] Numa forma de realização, o dispositivo pode compreender um segundo elemento destacável apto para ser acoplado à segunda extremidade do dispositivo e envolver o elemento de clipagem, sendo que o referido segundo elemento destacável é um microtubo.

[0041] Numa forma de realização, os elementos destacáveis podem ser descartáveis.

[0042] Numa forma de realização, a membrana porosa de policarbonato pode ser descartável.

[0043] Numa forma de realização, o dispositivo pode compreender ainda um indicador de reação, em particular o indicador colorimétrico azul de hidroxinaftol e outros corantes da família das cianinas.

[0044] Numa forma de realização, a amostra pode ser selecionada da seguinte lista: superfície de embalagens; produtos farmacêuticos e/ou produtos alimentares.

[0045] A presente divulgação também diz respeito a um kit que compreende o dispositivo descrito anteriormente. [0046] Ao longo da descrição e reivindicações a palavra "compreende" e variações da palavra não têm intenção de excluir outras características técnicas, outros componentes, ou passos. Objetos adicionais, vantagens e características da divulgação irão tornar-se evidentes para os peritos na técnica após o exame da descrição ou podem ser aprendidos pela prática da divulgação. Os seguintes exemplos e figuras são fornecidos como forma de ilustrar, e não têm a intenção de serem limitativos da presente divulgação. Além disso, a presente divulgação abrange todas as possíveis combinações de formas de realização particulares ou preferenciais aqui descritas.

Breve descrição das figuras

[0047] Para uma mais fácil compreensão da presente divulgação juntam-se em anexo as figuras, as quais representam realizações preferenciais que, contudo, não pretendem limitar o objeto da presente divulgação.

[0048] Fig. 1: Desenho esquemático do dispositivo portátil de leitura de etiquetas de ADN agora divulgado.

[0049] Fig. 2A: Primeira fase do método de deteção da molécula de ADN alvo em materiais marcados.

[0050] Fig. 2B: Segunda fase do método de deteção da molécula de ADN alvo em materiais marcados.

Descrição Detalhada

[0051] A fig. 1 representa uma forma de realização, em particular representa um dispositivo portátil apto para deteção de ADN, em particular mas não restrito a ADN não codificante, utilizado para marcar diversos materiais.

[0052] O dispositivo portátil para deteção de um ADN/pincel indicador (1) compreende os seguintes elementos: uma haste e uma peça descartável (2) localizada numa das extremidades do referido dispositivo. A referida peça destacável (2) é denominada tampa-membrana e é por sua vez acoplada a um microtubo, em particular um microtubo de 0,2 ml (2a). A tampa-membrana do dispositivo portátil para deteção de um ADN/pincel indicador compreende, por sua vez, três elementos distintos, uma zona de clipagem da tampa ao microtubo (2b), uma zona de absorção da solução de reação e amostra de ADN (2c) e uma zona de clipagem ao corpo do pincel (2d). A tampa é fixa à ponta do pincel por clipagem e tem uma geometria standard tipo microtubos para biologia molecular, de modo a que a sua utilização seja universal em equipamentos laboratoriais como um termobloco.

[0053] Numa forma de realização, o dispositivo pode ainda compreender um indicador de reação (3). O corpo do dispositivo portátil para deteção de um ADN/pincel indicador (1) pode assim compreender um código de cor impresso que indica se o resultado da análise é positivo ou negativo, sendo que numa forma de realização o resultado da análise é positivo para a cor azul e negativo para a cor roxa. As referidas cores devem aparecer na membrana absorvente na ponta do pincel indicador após a reação de amplificação enzimática isotérmica por loop LAMP/reação LAMP (3).

[0054] Numa forma de realização, a fig. 2a representa a primeira fase do método de deteção da molécula de ADN alvo em materiais marcados.

[0055] Numa forma de realização, a fig. 2b representa a segunda fase do método de deteção da molécula de ADN alvo em materiais marcados.

[0056] Numa forma de realização, a presente divulgação compreende uma reação mix para amplificação enzimática isotérmica mediada por loop (LAMP). A referida reação LAMP é mediada por 4 diferentes iniciadores, utilizados para identificar regiões, em particular sequências distintas do ADN alvo, sendo o ADN alvo, num dos exemplos da presente divulgação, fragmentos do gene hsp65 do microrganismo Mycobacterium ma- rinum. O ADN alvo é então amplificado a uma temperatura constante de ~60 °C durante 30-60 minutos, no máximo 1 hora, dependendo da quantidade de ADN alvo na amostra a ser analisada, sem a necessidade de realizar ciclos térmicos tradicionalmente usados na PCR. Devido à natureza específica da ação destes iniciadores, a quantidade de ADN produzido em LAMP é consideravelmente mais elevada do que a amplificação convencional por PCR.

[0057] Numa forma de realização, o meio de reação de amplificação pode compreender 20 mM Tris-HCI; 10 mM KCI; 10 mM (NH 4 ) 2 S0 4 ; 8 mM MgS0 4 ; 0,1% (v/v) Tween 20; 0,8 M betaína e 1,4 mM de mistura de dNTP; 0,2 μΜ iniciador exterior F3 e B3; 1,6 μΜ iniciador interior FIP e BIP e 8U Bst ADN polimerase ou outras polimerases com função similar.

[0058] Numa forma de realização, a deteção da amplificação do ADN alvo é feita através de um indicador colorimétrico, em particular o indicador colorimétrico azul de hidroxinaftol (3 mM). No final do tempo de incubação se ficar azul significa que foi detetado o ADN alvo. Se tiver cor roxa significa que não foi detetado ADN alvo.

[0059] A presente divulgação compreende um dispositivo portátil para deteção de um ADN contendo uma haste na forma de um cabo de pincel (Fig. 1), denominado na presente divulgação como pincel indicador. O referido pincel é capaz de alojar em uma das extremidades uma peça destacável denominada na presente divulgação como tampa-membrana [Fig. 1 (2 b, c, d)] que é por sua vez ligada a um microtubo de 0,2 ml [Fig. 1 (2a)].

[0060] Numa forma de realização, o conjunto microtubo-tampa-membrana é fixo à ponta do pincel por clipagem. O tubo tem uma geometria standard tipo microtubo de 0,2 ml tipicamente usado em biologia molecular para a reação em cadeia da polimerase (PCR). Isso permite que a sua utilização seja universal em equipamentos laboratoriais para biologia molecular.

[0061] Numa forma de realização, a peça destacável tampa-membrana compreende uma tampa de microtubo com duas faces funcionais [Fig. 1 (2b, 2c e 2d)]. Sendo que uma face serve de fixação ao microtubo [Fig. 1 (2b)] e estende-se dentro do perímetro externo da abertura do tubo. Simultaneamente essa mesma face da tampa-membrana serve para fixar a tira de membrana absorvente de policarbonato a partir do centro da face interna da tampa para dentro do microtubo [Fig. 1 (2c)]. A outra face da tampa- membrana estende-se dentro do perímetro de abertura do tubo em direção oposta ao microtubo [Fig. 1 (2d)] e tem a função de conectar a tampa-membrana a uma das extremidades da haste do pincel indicador (Fig. 1), permitindo assim a utilização deste para remoção da tampa-membrana do microtubo e manipulação da membrana absorvente durante a análise da amostra (Fig. 2A e 2B). A respetiva membrana é capaz de imobilizar em seus poros pequenos volumes da solução de reação para amplificação isotérmica do ADN. A tampa-membrana também tem a função de selar a membrana dentro do microtubo antes e durante a reação de LAMP (Fig. 1.2 conjunto microtubo tampa-membrana). O corpo do pincel tem um código de cor impresso que indica se o resultado da análise é positiva ou negativa. Positivo para a cor azul e negativo para a cor roxa, que deverá aparecer na membrana absorvente na ponta do pincel indicador após a reação de LAMP (Fig. 1.3).

[0062] Numa forma de realização, o método de deteção da molécula de ADN alvo em materiais marcados é caracterizado por uma metodologia de deteção de etiquetas de ADN que pode compreender 6 etapas (Fig. 2A e 2B).

[0063] Numa forma de realização, uma zaragatoa pode ser utilizada para remoção e recolha de ADN da superfície do material marcado com a etiqueta de ADN. Uma extremidade da zaragatoa é imersa em tampão de extração, em particular um tampão de extração que compreende Tris-HCI 10 mM, EDTA 1 mM a pH8, em particular num volume de 250 μΙ e em seguida a zaragatoa humedecida com tampão pode ser usada para obter esfregaços do material marcado com ADN.

[0064] Numa forma de realização, o ADN removido e aderido à zaragatoa pode ser imerso num tampão de extração, em particular um tampão de extração que compreende Tris-HCI 10 mM, EDTA 1 mM a pH8, sendo que o referido tampão se encontra a uma temperatura de 60 °C durante 5 minutos, com um intervalo para homogeneização da amostra. Durante esse período de incubação, pode preparar-se o pincel indicador para análise da amostra de ADN.

[0065] Numa forma de realização, a preparação do pincel indicador para análise pode compreender várias etapas, nomeadamente: i) acoplar o pincel indicador ao conjunto microtubo-tampa-membrana, ii) desconectar a tampa-membrana do microtubo, iii) com auxílio do pincel indicador, transferir para a membrana absorvente a solução de LAMP através da imersão da mesma na solução de reação, sendo que a solução de reação pode compreender 20 mM Tris-HCI, lOmM KCI, lOmM (NH 4 ) 2 S0 4 , 8 mM MgS0 4 , 0,1% (v/v) Tween 20, 0,8M betaína e 1,4 mM de mistura de dNTP, 0,2 μΜ iniciador exterior F3 e B3, 1,6 μΜ iniciador interior FIP e BIP, 8U Bst ADN polimerase e 3 mM azul de hidroxinaftol. [0066] Numa forma de realização, uma alíquota, em particular ~1 μΙ de uma amostra de ADN pode ser transferida com auxílio de uma alça de inoculação de 1 μΙ sobre a membrana absorvente saturada com a solução de reação de LAMP na etapa anterior.

[0067] Numa forma de realização, o conjunto tampa-membrana pode ser recolocado dentro do microtubo original através da acoplagem da tampa-membrana sobre o referido tubo.

[0068] Numa forma de realização, o conjunto microtubo-tampa-membrana pode ser incubado num termobloco durante 30-60 min a ~60 °C. O tempo e a temperatura de incubação a ser usada podem variar de acordo com a quantidade de moléculas de ADN alvo e os iniciadores usados em cada protocolo de reação, respetivamente. Após a incubação, a presença da etiqueta molecular ou molécula alvo de ADN pode ser determinada através da avaliação colorimétrica da membrana absorvente através da comparação dos resultados contendo reações controle com e sem ADN alvo.

[0069] As vantagens técnicas da presente divulgação em relação a soluções já existentes, nomeadamente em relação aos documentos de patente US5645801, US5837466 e US6468751 BI, podem ser resumidas nos seguintes pontos:

(i) o dispositivo de deteção da presente divulgação tem um baixo custo de produção;

(ii) a membrana absorvente necessita de poucos microlitros, em particular ~ 5 μΙ para análise de uma amostra, reduzindo os custos quando comparado aos gastos de uma reação de LAMP convencional que necessita de 25 μΙ-500 μΙ.

(iii) o processo não envolve reagentes tóxicos;

(iv) tempo de deteção relativamente baixo e que pode variar entre 30 minutos a 1 hora;

(v) a operação do dispositivo não envolve instrumentos ou equipamentos complexos e a interpretação dos resultados é evidente, podendo ser

interpretados a "olho nú".

(vi) dispositivo de fácil uso, não sendo necessário pessoal especializado para seu manuseamento. [0070] De seguida, são descritos alguns exemplos da presente divulgação.

[0071] Numa forma de realização, a marcação com ADN e utilização do dispositivo portátil descrito na presente divulgação podem ser efetuadas como se passa a descrever. Para a produção e incorporação do marcador de ADN alvo, o ADN genómico de Mycobacterium marinum ATCC 927 comercial foi utilizado como ADN alvo. O gene hsp65 foi escolhido como alvo para a amplificação, uma vez que é usualmente utilizado para identificação específica do Mycobacterium marinum ATCC 927. A alta especificidade do sistema desenvolvido nessa divulgação permite a produção e leitura de etiquetas de autenticação contendo fragmentos desse gene com baixo risco de contaminação cruzada (falso positivo). Isso deve-se ao fato de o ADN da bactéria Mycobacterium marinum apenas apresentar níveis detetáveis via LAMP somente em ambientes aquáticos ou em animais. Portanto, seria muito pouco provável que ocorresse uma contaminação cruzada de materiais de origem industrial e afectasse o processo de leitura de etiquetas de autenticação contendo fragmentos do gene hsp65 de Mycobacterium marinum. Desta forma, foram desenhados oligonucleotidos iniciadores para a técnica LAMP que permitam amplificar especificamente fragmentos do gene hsp65 da espécie Mycobacterium marinum. A sequência de ADN alvo do gene hsp65 foi amplificada por LAMP utilizando os iniciadores descritos a seguir:

Seq ID No:l: F3: 5 ' -GGACCCGTACGAGAAGATC-3 ' - iniciador exterior ou "forward outer primer"

Seq ID No:2: 5 ' -CTCCTTGGTCTGACCTCT-3 ' - iniciador exterior ou "backward outer primer" B3

Seq ID No:3: 5 ' -CGTCGTCGTGCCGTCATGAGCTGGTCAAGGAAGTT-3 ' - iniciador interior ou "forward inner primer" FIP

Seq ID No:4: 5 ' -TCTGCGCAACGTTGCGTCGACTGCCTTCTCGATG-3 ' - iniciador interior ou "backward inner primer" BIP:

[0072] Numa forma de realização, os iniciadores Seq ID No:l, Seq ID No:2, Seq ID No:3 e Seq ID No:4 compreendem 19 bases, 18 bases, 35 bases e 34 bases, respetivamente. Todos os iniciadores referidos no exemplo mencionado foram sintetizados por IBA - Life Sciences. [0073] Numa forma de realização, uma a mostra de controlo negativo em que o ADN genómico foi substituído com água foi processada de forma idêntica e em paralelo como controlo negativo.

[0074] Numa forma de realização, o ácido nucleico alvo produzido através da técnica LAMP descrita acima foi adicionado numa concentração final de 50 ng/ml a tinta de base solvente. Dez microlitros de tinta foram adicionados a uma placa de PVC. Depois de seca, foi recolhida uma amostra da placa.

[0075] Numa forma de realização, a leitura do marcador de ADN pode ser rea lizada da seguinte forma :

• num 1^ passo: com uma zaragatoa previamente humedecida com 250 μΙ do tampão de extração, em particular Tris-HCI 10 mM, EDTA 1 mM pH8 é recolhido o ADN (fragmentos do gene hsp65) de uma placa de PVC;

• num 2^ passo: a zaragatoa com o ADN é então imersa no tampão de extração a 60 °C durante 5 minutos, com um intervalo para homogeneização da amostra. Durante esse período de incubação, prepara-se o pincel indicador para análise da amostra de ADN;

• num 35 passo: o pincel indicador é acoplado ao conjunto microtubo-tampa- membrana, seguidamente desconecta-se a tampa-membrana do microtubo. A membrana absorvente ligada a tampa é mergulhada na solução de reação de LAMP.

[0076] Numa forma de realização, a preparação da reação LAMP pode ser realizada num volume de reação final de 25 μί que compreende uma concentração final de tampão 2x, em particular 20 mM Tris-HCI; 10 mM KCI, 10 mM (NH 4 )2S0 4 ; 8 mM MgS0 4 ; 0,1% (v/v) Tween 20; 0,8 M betaína e 1,4 mM de mistura de dNTP; 0,2 μΜ iniciador exterior F3 e B3; 1,6 μΜ iniciador interior FI P e BIP e 8U Bst ADN polimerase:

• num 45 passo: com uma haste de inoculação descartável, transferir uma alíquota, em particular ~1 μΙ da amostra de ADN e colocar sobre a membrana absorvente saturada com a solução de reação de LAMP na etapa anterior; • num 5^ passo: acoplar o conjunto tampa-membrana para dentro do microtubo original;

• num 6^ passo: incubar o conjunto microtubo-tampa-membrana num termobloco durante 60 min a 64 °C. Após a incubação a presença da etiqueta molecular ou molécula alvo de ADN é determinada através da avaliação colorimétrica da membrana absorvente por comparação dos resultados contendo reações controle com e sem ADN alvo.

[0077] Numa forma de realização, a deteção do ácido nucleico pode ser feita usando o corante azul de hidroxinaftol entre outros corantes da família das cianinas.

[0078] Numa forma de realização, foi adicionado inicialmente à mistura da reação LAMP 1 μΙ de corante azul de hidroxinaftol, em particular 3 mM. No final do tempo de incubação, em particular ao fim de 60 minutos, se a mistura adquirir a cor azul significa que o foi detetado o ácido nucleico alvo, se no final tiver cor roxa significa que não foi detetado ácido nucleico alvo.

[0079] A presente divulgação não é, naturalmente, de modo algum restrita às realizações descritas neste documento e uma pessoa com conhecimentos médios da área poderá prever muitas possibilidades de modificação da mesma sem se afastar da ideia geral, tal como definido nas reivindicações anexas.

[0080] As realizações preferenciais acima descritas são obviamente combináveis entre si. As seguintes reivindicações definem adicionalmente realizações preferenciais.

LISTA DE SEQUÊNCIAS

Iniciador exterior ou "forward outer primer" F3: 5 ' -GGACCCGTACGAGAAGATC-3 ' [Seq ID No:l]

Iniciador exterior ou "backward outer primer" B3: 5 ' -CTCCTTGGTCTGACCTCT-3 ' [Seq ID No:2]

Iniciador interior ou "forward inner primer" FIP: 5 ' - CGTCGTCGTGCCGTCATGAGCTGGTCAAGGAAGTT-3 ' [Seq ID No:3]

Iniciador interior ou "backward inner primer" BIP: 5 ' - TCTGCGCAACGTTGCGTCGACTGCCTTCTCGATG-3 ' [Seq ID No:4]