Keimungsverhalten

Die vorliegende Erfindung betrifft transgene Kartoffelpflan¬ zen, die Zellen mit einer im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen verringerten Aktivität der cytosolischen Stärkephosphorylase enthalten. Die Knollen derartiger Kartoffelpflanzen zeigen im Vergleich zu Knollen von Wildtyp-Pflanzen ein verändertes Keimungsverhalten, das zur Bildung einer erhöhten Anzahl von Sproßenden und folglich zu einer erhöhten Anzahl von Stolo- nen und Knollen führt . Weiterhin weisen solche Pflanzen einen erhöhten Ertrag auf .

Der Ertrag beim landwirtschaftlichen Anbau von Kartoffeln wird in erster Linie bestimmt durch die Anzahl der Spro߬ enden, die pro angelegter Knolle gebildet werden. Normaler¬ weise bildet eine, auskeimende Kartoffelknolle lediglich ein, zeitweise 2 bis 3, Sproßenden, wobei aufgrund der Apikaido¬ minanz dieser Sproßenden das Wachstum weiterer potentiell vorhandener Seitensprosse unterdrückt wird. Ausgehend von den Sproßenden werden während des weiteren Wachstums der Kartoffelpflanzen Stolone gebildet, an denen später die Knollen gebildet werden. Da der Ernteertrag mit der Anzahl der durch die entwickelten Sproße gebildeten Stolone korre- liert, besteht ein Bestreben, die Keimung von Kartoffel- pflanzen derart zu manipulieren, daß eine möglichst große Anzahl von "Augen" auskeimen und sich zu Sproßenden ent¬ wickeln. Eine Methode besteht darin, den zuerst gebildeten Sproß einer Knolle, der aufgrund seiner Apikaidominanz das Wachstum weiterer Sproßenden unterdrückt, abzubrechen. Dies führt zum Wachstum weiterer Sproßenden. Eine weitere Methode besteht in dem Vorkeimen der zum Auslegen bestimmten Kartof-

fein unter regulierten Bedingungen in speziellen Behältern (siehe z.B. Bouman, Kartoffelbau 47 (1996) , 18-21; van de Waart, Kartoffelbau 44 (1993) , 18-20) . Derartige Methoden sind jedoch sehr kostenintensiv, da sie neben den speziellen Behältern auch Lagerräume erfordern, in den sowohl die Licht- als auch die Temperaturbedingungen reguliert werden können. Im Zusammenhang mit der Unterdrückung der Knollen¬ keimung wurde bereits in der DE-Al 42 13 444 eine gentechni¬ sche Manipulation von Kartoffelpflanzen dahingehend vorge¬ schlagen, daß am Stärkemetabolismus beteiligte Enzyme inhi¬ biert werden. Entsprechende Ansätze für eine verstärkte Sproßbildung der Kartoffelknollen sind bisher jedoch nicht bekannt. Es besteht somit ein Bedarf an Kartoffelpflanzen bzw. Verfahren, bei denen sich die obenbeschriebenen ar- beits- bzw. kostenintensiven Schritte erübrigen und die zu einer erhöhten Sproßanzahl und somit erhöhtem Knollenertrag führen.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Kartoffelpflanzen zur Verfügung zu stellen, deren Knollen bei Keimung eine hohe Anzahl von Sproßenden bilden.

Diese Aufgabe wird durch die in den Patentansprüchen be¬ zeichneten Ausführungsformen gelöst.

Somit betrifft die Erfindung transgene Kartoffelpflanzen, die Zellen mit einer im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen, d.h. entsprechenden nicht-transformierten Pflanzen, um mindestens 60 % verringerten Aktivität der cytosolischen Stärkephospho¬ rylase enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Aktivität der cytosolischen Stärkephosphorylase um min¬ destens 80 % und besonders bevorzugt um mindestens 95 % ver¬ ringert im Vergleich zu Wildtyp-Kartoffelpflanzen.

Unter dem Begriff "cytosolische Stärkephosphorylase" wird die im Cytoplasma von Pflanzenzellen lokalisierte Isoform der Stärkephosphorylase (EC 2.4.1.1) verstanden, die auch

als Isoform H oder I bekannt ist. Von der zweiten, der pla- stidären Isoform unterscheidet sich diese dadurch, daß sie beispielsweise eine wesentlich höhere Affinität für hochver¬ zweigte Glucane zeigt (Shimomura et al . , J. Biochem. (Tokyo) 91 (1982) , 703-717; Yang und Steup, Plant Physiol . 94, 960- 969) und eine geringe Affinität zu Oligoglucanen. Das Enzym katalysiert die reversible Phosphorolyse von α-1, 4-Glucanen. Die Aktivität der Stärkephosphorylase läßt sich beispiels¬ weise bestimmen wie beschrieben in Parvin und Smith (Anal. Biochem. 27 (1969) , 65-72) , Conrads et al . (Biochim. Biophys. Acta 882 (1986) , 452-463) , Steup und Latzko (Planta 145 (1979) , 69-75) , Steup (In. Methods in Plant Biochemistry 3; Academic Press Limited (1990) , 103-128) oder Sonnewald et al. (Plant Mol. Biol . 27 (1995) , 567-576) .

Erfindungsgemäß ist die Aktivität der cytosolischen Stärke¬ phosphorylase vorzugsweise in allen bzw. in fast allen Zel¬ len der Pflanze verringert. Zumindestens jedoch in den Knol¬ len und den sich aus diesen entwickelnden Sproßenden.

Es wurde überraschend gefunden, daß Knollen von Kartoffel¬ pflanzen, die eine derart verringerte Aktivität der cytoso¬ lischen Stärkephosphorylase aufweisen, im Vergleich zu Knol¬ len von Wildtyp-Pflanzen ein drastisch verändertes Keimungs¬ verhalten zeigen. Unter Keimung wird hierbei das Auswachsen von Sproßenden aus Knollen verstanden.

Das veränderte Keimungsverhalten zeigt sich darin, daß der¬ artige Knollen

(a) zum einen im Durchschnitt pro Knolle mehr Sprosse aus¬ bilden; und/oder

(b) im Durchschnitt pro Knolle mehr Augen (d.h. die an den Knollen vorhandenen Sproßknospen) auskeimen und zur Bil¬ dung von Sprossen führen; und/oder

(c) im Durchschnitt pro auskeimendem Knollenauge mehr Sproßenden gebildet werden, insbesondere, wenn die Kei¬ mung nach Lagerung für 5 Monate bei 20°C im Dunkeln er¬ folgt.

Wie bereits oben erläutert, bilden Knollen von Wildtyp- Pflanzen beim normalen Auskeimen in der Regel 1, maximal 2 bis 3, Sproßenden. Zur Erhöhung der Anzahl der Sproßenden ist entweder die Eliminierung des Apikaisprosses oder eine Vorkeimung unter speziellen Bedingungen notwendig. Hingegen zeigen Knollen der erfindungsgemäßen Kartoffelpflanzen, die Zellen mit einer verringerten cytosolischen Stärkephos¬ phorylase enthalten, bei Keimung, insbesondere nach Lagerung bei 20°C im Dunkeln, eine drastisch erhöhte Anzahl von Sproßenden. Dies führt zur Ausbildung von mehr Stolonen und folglich zu mehr Knollen pro Pflanze. Insgesamt steigt damit der Knollenertrag pro Pflanze. Dies betrifft sowohl die An¬ zahl der Knollen pro Pflanze, als auch das Gesamtfrischge- wicht von Knollen pro Pflanze.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist bei den erfindungs- gemäßen Kartoffelpflanzen die durchschnittliche Anzahl der Sprosse, die pro Knolle gebildet werden, wenn die Keimung nach einer Lagerung von 5 Monaten bei 20°C im Dunkeln er¬ folgt, mindestens verdoppelt im Vergleich zu Wildtyp-Pflan¬ zen, d.h. entsprechenden nicht-transformierten Pflanzen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist bei den Knollen der erfindungsgemäßen Kartoffelpflanzen die Anzahl der Sproßenden, die pro auskeimendem Auge gebildet werden, wenn die Keimung nach einer Lagerung von 5 Monaten bei 20°C im Dunkeln erfolgt, mindestens verdoppelt im Vergleich zu Knollen von Wildtyp-Pflanzen, d.h. entsprechenden nicht- transformierten Pflanzen.

Neben dem veränderten Keimungsverhalten weisen die erfin¬ dungsgemäßen Pflanzen auch einen gesteigerten Ertrag hin¬ sichtlich der Knollenanzahl sowie des Knollengewichtes auf. Dabei ist die Anzahl der Knollen pro Pflanze vorzugsweise um mindestens 20 %, bevorzugt um mindestens 50 % und besonders bevorzugt um mindestens 100 % höher als in entsprechenden

nicht-transformierten Pflanzen unter gleichen Wachstumsbe- dingungen.

Ferner ist das Knollenfrischgewicht aller Knollen pro Pflanze vorzugsweise um mindestens 10 %, vorzugsweise um mindestens 15 % und besonders bevorzugt um mindestens 20 % höher als bei entsprechenden nicht-transformierten Pflanzen unter gleichen Wachstumsbedingungen.

Die Verringerung der Aktivität der cytosolischen Stärkephos¬ phorylase in den Zellen der erfindungsgemäßen Kartoffel- pflanzen läßt sich prinzipiell durch verschiedene, dem Fach¬ mann bekannte Methoden erreichen.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verringe¬ rung der Aktivität der cytosolischen Stärkephosphorylase durch die Inhibierung der Expression endogener Gene, die dieses Enzym codieren. Bevorzugt sind hierbei molekularbio¬ logische Techniken, die auf einem antisense-, Ribozym- oder einem Cosuppressionseffekt beruhen. Bei einem antisense- Effekt wird eine entsprechende RNA in antisense-Orientierung exprimiert . Diese hat vorzugsweise eine Länge von mindestens 30 Nucleotiden, bevorzugt von mindestens 50 Nucleotiden und besonders bevorzugt von mindestens 100 Nucleotiden. Die ex- primierte antisense-RNA sollte eine hohe Homologie zu den endogen in der Pflanze exprimierten Transkripten, die cyto- solische Stärkephosphorylase codieren, haben. Die Homologie beträgt vorzugsweise mindestens 90 %, bevorzugt mindestens 95 % und besonders bevorzugt mindestens 99 %. Bei einem Ri- bozym-Effekt wird eine RNA exprimiert, die spezifisch Transkripte cytosolischer Stärkephosphorylase spalten kann. Die Expression von Ribozymen zur Verringerung der Aktivität von bestimmten Enzymen in Zellen ist dem Fachmann ebenfalls bekannt und ist beispielsweise beschrieben in EP-Bl 0 321 201. Die Expression von Ribozymen in pflanzlichen Zel¬ len wurde z.B. beschrieben in Feyter et al . (Mol. Gen. Genet. 250 (1996) , 329-338) . Der Cosuppressions-Effekt be¬ ruht auf der Expression einer sense-RNA, die die Expression

von endogener Stärkephosphorylase-mRNA unterdrückt. Die Ausführung dieser Techniken sind dem Fachmann bekannt. Das Verfahren der Cosuppression ist beispielsweise beschrieben in Jorgensen (Trends Biotechnol. 8 (1990), 340-344) , Niebel et al. (Curr. Top. Microbiol . Immuno1. 197 (1995) , 91-103) , Flavell et al . (Curr. Top Microbiol. Immuno1. 197 (1995) , 43-46) , Palaqui und Vaucheret (Plant. Mol. Biol . 29 (1995) , 149-159) , Vaucheret et al. (Mol. Gen. Genet . 248 (1995) , 311-317) , de Borne et al . (Mol. Gen. Genet. 243 (1994) , 613- 621) und anderen Quellen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorlie¬ genden Erfindung wird die Verringerung der Aktivität einer cytosolischen Stärkephosphorylase in den Zellen dadurch er¬ reicht, daß man transgene Kartoffelpflanzen erzeugt, die stabil ins Genom integriert ein rekombinantes DNA-Molekül enthalten, das folgende Elemente umfaßt:

(a) einen Promotor, der die Transkription zumindest in Zel¬ len der Knollen von Kartoffelpflanzen ermöglicht; und

(b) eine in antisense-Orientierung mit diesem Promotor ver¬ knüpfte DNA-Sequenz, deren Transkripte ganz oder teil¬ weise komplementär sind zu Transkripten eines endogen in Kartoffelpflanzenzellen vorliegenden Gens, das cytosoli- sche Stärkephosphorylase codiert .

Promotoren, die die Expression in pflanzlichen Zellen ge¬ währleisten sind in großem Umfang beschrieben. Für eine Ex¬ pression in den Knollen der Kartoffelpflanzen bietet sich beispielsweise der Promotor des Patatingens B33 aus Kartof¬ fel an (Rocha-Sosa et al . , EMBO J.8 (1989) , 23-29) . Für eine konstitutive Expression eignet sich z.B. der 35S-Promotor des CaMV (Franck et al . , Cell 21 (1980) , 285-292) . DNA-Sequenzen, die eine cytosolische Stärkephosphorylase aus Kartoffel codieren sind bereits beschrieben (siehe z.B. Mori et al . , J. Biol. Chem. 266 (1991) , 18446-18453) . Mit Hilfe dieser DNA-Sequenzen ist es dem Fachmann möglich mittels gängiger Verfahren weitere Sequenzen zu isolieren, die cyto-

solische Stärkephosphorylase aus Kartoffel codieren, falls dies erforderlich ist .

Neben den obengenannten Möglichkeiten kann die Verringerung der Aktivität der cytosolischen Stärkephosphorylase auch durch Inaktivierung der endogen vorhandenen Gene, die dieses Enzym codieren, erreicht werden. Techniken hierfür sind bei¬ spielsweise Transposonmutagenese oder gene-tagging. Alternativ besteht auch die Möglichkeit, in den Zellen Anti¬ körper zu exprimieren, die spezifisch cytosolische Stärke¬ phosphorylase erkennen.

Verfahren zur Herstellung transgener Kartoffelpflanzen sind in der Literatur beschrieben, siehe z.B. (Rocha-Sosa (loc.cit.) . Bevorzugt wird die Transformation mittels Agro- bakterien angewandt .

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Vermehrungsmate¬ rial der erfindungsgemäßen Kartoffelpflanzen, insbesondere Samen und besonders bevorzugt Kartoffelknollen. Diese ent¬ halten Zellen mit einer im Vergleich zu Knollen von Wildtyp- Pflanzen verringerten Aktivität der cytosolischen Stärke¬ phosphorylase und ein wie oben beschriebenes verändertes Keimungsverhalten auf.

Schließlich betrifft die Erfindung auch die Verwendung von Nucleinsäuremolekülen, die eine cytosolische Stärkephospho¬ rylase codieren oder Teile davon zur Herstellung von trans- genen Kartoffelpflanzen mit einer verringerten Aktivität der cytosolischen Stärkephosphorylase, insbesondere um minde¬ stens 60 % im Vergleich zu entsprechenden nicht-transfor¬ mierten Pflanzen, vorzugsweise um mindestens 80 % und beson¬ ders bevorzugt um mindestens 95 % und einem verändertem Kei¬ mungsverhalten.

Beschreibung der Figuren.

Figur 1 zeigt schematisch das Plasmid pBin-Anti-STPI ^Kτrι . cSTP 1,7: ca. 1,7 kb langes DNA-Fragment, das einen Teil der codierenden Region für cytosolische Stärkephosphorylase aus Kartoffel umfaßt und in antisense-Orientierung mit dem 35S-Promotor ver¬ knüpft ist.

Figur 2 zeigt zwei Polyacrylamidgele zum Nachweis der Ak¬ tivität der cytosolischen Stärkephosphorylase in Blatt- (A) und Knollengewebe (B) transgener Kartof¬ felpflanzen, die mit dem Plasmid pBin-Anti-STPI ^Kτn transformiert sind. Proteinrohextrakte von Blatt- und Knollengewebe wurden in einem nicht-denaturie¬ renden Polyacrylamidgel (diskontinuierliches System; 12 % bzw. 4 % (Gew. /Vol.) Acrylamid) auf¬ getrennt. Das Trenngel enthielt 2,4 % (Gew. /Vol.) Glykogen. Es wurden ca. 20 μg Protein pro Spur aufgetragen. Die Elektrophorese wurde für 4 h bei 100 Volt durchgeführt. Die Wanderungsrichtung ist von oben (Kathode) nach unten (Anode) . Für die Ak¬ tivitätsfärbung wurden die Gele in 20 mM Glucose- l-Phosphat/100 mM Citrat, pH 6,0 bei Raumtempera¬ tur über Nacht inkubiert . Proteinbanden mit stär¬ kesynthetisierender Aktivität werden als blaue Banden sichtbar. Die cytosolische Stärkephospho¬ rylase (STPI) wird durch das immobilisierte Poly- saccharid stark in seiner Mobilität gehemmt . Die plastidäre Stärkephosphorylase (STPII) ist dagegen in ihrer Wanderungsgeschwindigkeit nicht so stark beeinträchtigt .

Figur 3 zeigt im Vergleich das Keimungsverhalten von Knol¬ len von Wildtyp-Pflanzen (S. tuberosum L. cv Desiree; rechts) im Vergleich zu Knollen der

transformierten Linie cSTP 9 (links) nach einer Lagerung von 5 Monaten bei 20°C im Dunkeln.

Figur 4 zeigt im Vergleich das Keimungsverhalten von Knol¬ len von Wildtyp-Pflanzen (Mitte) im Vergleich zu Knollen der transformierten Linien cSTP 6 (links) und cSTP 7 (rechts) nach einer Lagerung von 10 Mo¬ naten bei 20°C im Dunkeln.

Figur 5 zeigt eine statistische Übersicht über die Anzahl der im Durchschnitt pro Knolle bzw. pro 25 Knollen gebildeten Sproßenden bei Knollen von Wildtyp- Pflanzen (cDesi) bzw. den transformierten Linien (cSTP-6, -7, -9, -14, -15, -16 und -18) nach einer Lagerung von 5 Monaten bei 20°C im Dunkeln.

Figur 6 zeigt eine statistische Übersicht über die durch¬ schnittliche Anzahl der pro "Auge" gebildeten Sproßenden bei Knollen von Wildtyp-Pflanzen (cDesi) und Knollen von transformierten Linien (cSTP-6, -7, -9, -14, -15, -16 und -18) .

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

In den Beispielen werden unter anderem folgende Materialien und Techniken verwendet .

1. Bakterienstämme

Für Clonierungen wurde der E.coli-Stamm DH5α (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, USA) verwendet.

Die Transformation der Plasmide in die Kartoffelpflanzen wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes C58C1 pGV2260 durchgeführt (Deblaere et al . , Nucl . Acids Res. 13 (1985) , 4777-4788) .

2. Transformation von Agrobacterium tumefaciens

Der Transfer der DNA erfolgte durch direkte Transforma¬ tion nach der Methode von Höfgen & Willmitzer (Nucleic Acids Res . 16 (1988) , 9877) . Die Plasmid-DNA transfor¬ mierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim, & Doly (Nucleic Acids Res. 7 (1979) , 1513- 1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert.

3. Transformation von Kartoffeln

Zehn kleine mit dem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur (Solanum tuberosum L.cv. Desiree) wurden in 10 ml MS-Medium (Murashige & Skoog, Physiol . Plant 15 (1962) , 473-497) mit 2 % Saccharose gelegt, welches 50 μl einer unter Selektion gewachsenen Agrobac¬ terium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 3-5 minütigem, leichtem Schütteln erfolgte eine weitere In¬ kubation für 2 Tage im Dunkeln. Daraufhin wurden die Blätter zur Kallusinduktion auf MS-Medium mit 1,6 % Glu¬ cose, 5 mg/1 Naphthylessigsäure, 0,2 mg/1 Benzylaminopu- rin, 250 mg/1 Claforan, 50 mg/1 Kanamycin und 0,80 % Bacto Agar gelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurden die Blätter zur Sproßinduktion auf MS-Medium mit 1,6 % Glucose, 1,4 mg/1 Zeatinribose, 20 mg/1 Naphthylessigsäure, 20 mg/1 Giberellinsäure, 250 mg/1 Claforan, 50 mg/1 Kanamycin und 0,80 % Bacto Agar gelegt .

4. Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten

Die radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit Hilfe eines DNA-Randon Primer Labelling Kits der Firma Boehringer (Deutschland) nach den Angaben des Herstel¬ lers durchgeführt.

5. Northern Blot-Analyse

RNA wurde nach Standardprotokollen aus Blattgewebe oder Knollengewebe von Pflanzen isoliert. 50 μg der RNA wur¬ den auf einem Agarosegel aufgetrennt (1,5 % Agarose, 1 x MEN-Puffer, 16,6 % Formaldehyd) . Das Gel wurde nach dem Gellauf kurz in Wasser gewaschen. Die RNA wurde mit 20 x SSC mittels Kapillarblot auf eine Nylonmembran vom Typ Hybond N (Amersham, UK) transferiert. Die Membran wurde anschließend bei 80°C unter Vakuum für zwei Stunden ge¬ backen.

Die Membran wurde in NSEB-Puffer für 2 h bei 68°C prähy¬ bridisiert und anschließend in NSEB-Puffer über Nacht bei 6B°C in Gegenwart der radioaktiv markierten Probe hybridisiert .

6. Pflanzenhaltung

Kartoffenpflanzen werden im Gewächshaus unter folgenden Bedingungen gehalten:

Lichtperiode 16 h bei 25000 Lux und 22°C

Dunkelberiode 8 h bei 15°C

Luftfeuchte 60 %

Die Pflanzen werden in einzelnen Töpfen (200 cm ² , 15 cm tief) gehalten und täglich gewässert. Die Knollen werden 4 Monate nach dem Transfer der Gewebekulturpflanzen in das Gewächshaus geerntet. Für biochemische Analysen wer¬ den Knollen mit einem Frischgewicht von 8-16 g verwen¬ det . Das Frischgewicht wird unmittelbar nach dem Ernten bestimmt. Die gernteten Knollen werden gewaschen und in Kisten bei 20°C für 5 bis 10 Monate im Dunkeln gelagert.

Beispiele

Beispiel 1

Konstruktion des Plasmids pBin-Anti-STPI ^Km

Zur Herstellung eines antisense-Konstruktes, das eine anti¬ sense-RNA codiert zu Transkripten, die cytosolische Stärke¬ phosphorylase aus Kartoffel codieren, wurde ein Teil der co¬ dierenden Region der in Mori et al . (loc. cit . ) beschriebe¬ nen cDNA mittels PCR aus einer λZAP cDNA-Bibliothek aus Knollengewebe amplifiziert .

Ein 1,7 kb Asp718/Smal-Fragment wurde mit glatten Enden in die Smal-Schnittstelle des binären Pflanzentransformations¬ vektors pBIN19 (Bevan, Nucl . Acids Res. 12 (1984) , 8711- 8721) insertiert. Dieser enthält den 35S-Promotor des CaMV und das Polyadenylierungssignal des Octopinsynthase-Gens. Durch Restriktionsverdau wurde sichergestellt, daß die co¬ dierende Region in antisense-Orientierung zum Promotor ange¬ ordnet ist.

Das resultierende Konstrukt wurde als pBin-Anti-STPI Km be¬ zeichnet (siehe Figur 1) .

Beispiel 2

Herstellung transgener Kartoffelpflanzen mit einer verrin¬ gerten Aktivität der cytosolischen Stärkephosphorylase

Der Vektor pBin-Anti-STP ^Km wurde mittels direkter Transfor¬ mation in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm C58C1: pGV2260 eingeführt (Höfgen und Willmitzer, Nucl. Acid Res. 16

(1988) , 9877) . Die Transformation und Regeneration transge¬ ner Kartoffelpflanzen erfolgte wie in Rocha-Sosa et al .

(EMBO J. 8 (1989) , 23-29) beschrieben. Es wurden mehrere un¬ abhängig voneinander erzeugte transgene Linien hinsichtlich ihrer Eigenschaften getestet, insbesondere die Linien mit den Bezeichnungen cSTPI-6, -7, -9, -14, -15, -16 und -18.

Beispiel 3

Analyse transgener Kartoffelpflanzen mit einer verringerten Aktivität der cytosolischen Stärkephosphorylase

(a) Northern-Blot-Analyse

Von verschiedenen unabhängigen Linien der gemäß Beispiel 2 hergestellten transgenen Kartoffelpflanzen wurde Ge- samt-RNA aus Blatt- bzw. Knollenmaterial isoliert und mittels Northern-Blot-Analyse hinsichtlich der Expres¬ sion von mRNA analysiert, die cytosolische Stärkephos¬ phorylase codiert. Im Vergleich zu Proben von Wildtyp- Pflanzen (Solanum tuberosum L. cv. Desiree) , die ein starkes Signal bei der Hybridisierung, mit einer für cy¬ tosolische Stärkephosphorylase spezifischen Probe zeig¬ ten, konnten in fast allen der untersuchten transfor¬ mierten Pflanzen keine bis fast keine Transkripte für cytosolische Stärkephosphorylase nachgewiesen werden.

(b) Nachweis der Aktivität der cytosolischen Stärkephospho¬ rylase

Der Nachweis der Aktivität der cytosolischen Stärkephos¬ phorylase in Geweben der transformierten Kartoffelpflan¬ zen wurde nach der Methode von Steup (In: Methods in Plant Biochemistry 3, Academic Press Limited (1990) , 103-128) durchgeführt. Hierzu wurden zunächst Protein¬ rohextrakte aus den zu untersuchenden Geweben gewonnen, indem gefrorenes Gewebe in Extraktionspuffer (100 mM HEPES-NaOH, pH 7,5; 1 mM EDTA, 10 % (Vol. /Vol.) Glyce- rin; 5 mM DTT, 200 mg Na ₂ S0 ₃ ; 150 mg Na ₂ S ₂ 0 ₅ ) homogeni¬ siert. Nach Zentrifugation wurde der klare Überstand in einem Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die Elektrophorese wurde durchgeführt wie in Steup und Latzko (Planta 145 (1979) , 69-759) beschrieben. Hierbei wurde ein nicht-de-

naturierendes diskontinuierliches System verwendet (12 % bzw. 4 % (Gew. /Vol.) Acrylamid) . Das Trenngel enthielt 2,4 % (Gew. /Vol.) Glycogen. Zum Nachweis der Aktivität der cytosolischen Stärkephosphorylase wurde das Gel nach dem Gellauf in einer Lösung von 20 mM Glucose-1-Phos- phat/100 mM Citrat; pH 6,0 über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde das Gel in lugolscher Lö¬ sung für 5 min inkubiert. Entfärbung erfolgte durch ex¬ tensives Waschen mit Wasser über einen längeren Zeit¬ raum. Blaufärbung zeigt die Anwesenheit stärkesyntheti¬ sierender Enzymaktivitäten an. Die Aktivität der cytoso¬ lischen Stärkephosphorylase kann beispielsweise an¬ schließend durch densitometrische Analyse der entspre¬ chenden Proteinbanden bestimmt werden.

Figur 2 zeigt ein Polyacrylamidgel in dem sieben unab¬ hängige gemäß Beispiel 2 hergestellte transgene Kartof¬ fellinien hinsichtlich ihrer Aktivität an cytosolischer Stärkephosphorylase getestet wurden.

(c) Untersuchung des Keimungsverhaltens von Knollen der er¬ zeugten transgenen Kartoffelpflanzen

Zur Untersuchung des Einflusses der Verringerung der Ak¬ tivität der cytosolischen Stärkephosphorylase auf das Keimungsverhalten wurden Knollen der Pflanzen bei 20°C gelagert und das Keimungsverhalten der Knollen nach ver¬ schiedenen Zeiträumen untersucht.

Figur 3 zeigt im Vergleich Knollen von Solanum tuberosum L. cv. Desiree (Wildtyp) , sowie Knollen der mit dem Plasmid pBin-Anti-STPI ^Km transformierten Linie cSTPI-9, die jeweils 5 Monate bei 20°C gelagert worden waren. Figur 4 zeigt im Vergleich Wildtyp-Knollen und Knollen von zwei anderen transformierten Linien (cSTPI-6 und cSTPI-7) , die für 10 Monate bei 20°C gelagert worden sind.

Aus den beiden Figuren wird deutlich, daß die Knollen der transformierten Linien, die eine verringerte Aktivi¬ tät der cytosolischen Stärkephosphorylase aufweisen, ein drastisch verändertes Keimungsverhalten aufweisen. Die Knollen der transformierten Linien bilden zum einen wesentlich mehr Sproßenden pro Knolle und auch mehr Sproßenden pro auskeinemdem Auge aus. Ferner keimen bei den Knollen der transformierten Pflanzen mit verringer¬ ter Aktivität der cytosolischen Stärkephosphorylase in der Regel mehr Augen aus. Eine statistische Auswertung _lt -- ist in den Figuren 5 und 6 dargestellt.

Die aus den Knollen der transformierten Pflanzen wach¬ senden Kartoffelpflanzen zeigen ferner einen erhöhten Ertrag (in Knollenfrischgewicht/Pflanze) . Dies ist in der folgenden Tabelle dargestellt am Beispiel der trans¬ formierten Linien cStP6, cSTP7, cSTP9, CSTP14 , CSTP15, CSTP16 und cSTP18.

Tabelle I

Pflanze Anzahl der Knollen Knollenfrischcrewicht (q)

Wildtyp 5,6 ± 1,5 69,0 + 9,0

CSTP6 13,5 + 2,7 95, 0 + 12, 0

CSTP7 10,8 + 1,9 90,5 + 8,6

CSTP9 10, 0 1,4 92,5 + 9,1

CSTP14 9,6 + 3,5 93,8 + 12,4

CSTP15 12,8 + 5, 0 94, 5 ± 8,8

CSTP16 8,8 + 0,8 92,5 + 5,6

CSTP18 11,3 + 1,3 82,5 ± 8,3

Die Daten wurden von unabhängigen Pflanzen erhalten, die von individuel ¬ len Saatgutknollen propagiert worden waren . Knollen mit 10 -40 g Frisch¬ gewicht von nicht seneszenten Pflanzen wurden geerntet . Die Werte sind Mittelwerte von unabhängigen Pflanzen (n = 4- 8 ) mit Angabe der Standard¬ abweichung .

Aus der Tabelle geht hervor , daß Pf lanzen mit einer ver¬ ringerten Aktivität der cytosolischen Stärkephospho¬ rylase zum einen mehr Knollen pro Pf lanze ausbilden als

Wildtyp-Pflanzen und darüber hinaus das Knollenfrischge¬ wicht pro Pflanze wesentlich höher ist als bei Wildtyp- Pflanzen.

Die transformierten Kartoffelpflanzen unterscheiden sich hinsichtlich der in den Knollen gebildeten Stärke nicht von Wildtyp-Pflanzen.