大肠杆菌表达系统目前是应用最广泛的蛋白表 达系统之一， 其具有成 本低廉、 生产率高、 操作简单等优点。 该系统主要有表达载体、 表达宿主 菌、 表达条件等组成。 目前， 越来越多的研究人员关注于融合表达载体的 应用， 研究成功的融合表达载体主要有： GST (谷光甘肽 -S-转移酶） 系统、 半乳糖苷酶系统、 麦芽糖结合蛋白 (MBP) 系统、 蛋白 A系统、 纯化标签融 合系统等。

家 ombyx or )多角体蛋白（Polyhedrin, Polh)基因共有 738个核苷 酸， 编码由 245个氨基酸组成的大小为 29 kD的多肽。 它是多角体的主要 结构成份； 多角体蛋白构成的蛋白质晶体对包埋在其中的 病毒体具有保护 作用，它使病毒体在自然环境中保持稳定和侵 染能力。多角体蛋白基因; 是一个超表达极晚期基因。 在病毒感染的晚期， 当其它病毒基因和宿主基 因关闭后， 此基因能持续高水平表达， 在受感染细胞内产生的多角体蛋白 的量可达细胞蛋白质总量的 25 % -50 %。 近 20年来， 人们都致力于研究多 角体蛋白基因的高效表达机制， 并且利用它的这种特性使许多外源基因得 到了高效表达， 尤其是一些难以表达的蛋白例如膜蛋白。 家蚕核型多角体 病毒的多角体蛋白具有它独特的性质， 在大肠杆菌中表达的多角体蛋白在 中性 pH条件下以包涵体的形式存在，只有在碱性条� �� (pH 10.8及以上)下可 溶， 并且这种多角体蛋白具有与天然多角体蛋白晶 体相同的性质。 因此， 可将目的蛋白基因与其融合表达， 一方面能提高目的蛋白的表达量， 另一 方面，通过简单的 pH梯度洗脱和差速离心的方法就可以获得较纯� ��融合蛋 白， 再经过特异性蛋白酶酶切消化， 回收得到较纯的目的蛋白。 张耀洲等 在纯化标签融合系统上进行改造， 将具有高效表达的能力多角体蛋白作为 一种标签， 将不表达或者难表达的蛋白基因融合上去， 从而使其表达或者 提高其表达量。 同时， 利用多角体的溶解特性， 通过简单的 pH调节和差速 离心的方法得到比较纯的融合蛋白， 之后进行蛋白酶切得到纯的目的蛋白。 但是， 蛋白酶的最佳作用 pH范围在 7.0-8.5, 而多角体蛋白只有在 ρΗΙΟ.8 时才会溶解， 所以在这一条件下进行酶切时， 蛋白酶丧失活性或者无法达 到最大活性， 所得到的目的蛋白的量也受到限制。 发明内容

有鉴于此， 本发明的目的在于提供一种多角体基因前 120bp 片段及其 应用。 本发明通过在常用载体的基础上， 插入该多角体蛋白基因前 120bp 片段， 后面可继续克隆上外源基因， 用于融合表达； 表达出来的融合蛋白， 可用调节 PH值的方法等进行快速纯化该目的蛋白，还能� ��低 pH值 (pH7.6) 下溶解， 所溶解的 pH值符合一般蛋白酶反应需要的条件。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种多角体基因前 120bp片段，其碱基序列如 SEQ ID NO:l 所示。

本发明还提供上述多角体基因前 120bp 片段在表达融合蛋白及降低其 溶解性中的应用。

本发明还提供上述多角体基因前 120bp 片段与蛋白酶酶切位点连接而 成的重组基因， 其碱基序列如 SEQ ID NO:2所示。

进一步地， 其中所述蛋白酶为凝血酶。 本发明还提供一种含上述多角体基因前 120bp片段的重组载体。

进一步地， 其中所述重组载体由多角体基因前 120bp 片段与转移载体 构建而成。

进一步地， 其中所述转移载体为 pET22b、 pET28a、 pET28b、 pET28c、 pET32a、 pcDNA3或 pFastBac™。

进一步地， 其中所述转移载体为 pET28a。

本发明进一步提供一种含上述多角体基因前 120bp片段的基因工程菌。 进一步地， 其中所述基因工程菌为大肠杆菌。

本发明主要是在常用的表达载体中利用多角体 基因前 120bp 片段 (polhl20)和外源基因 EGFP进行融合表达， 同时与全长多角体融合方式比 对。 本发明中的融合方式在具有全长多角体性质的 同时， 还降低了溶解融 合蛋白所需溶液的 pH值， 使融合蛋白在中性缓冲液中即可溶解， 并适用于 蛋白酶等酶切反应的进行。 附图说明

图 1是本发明构建的重组表达载体的质粒图；

图 2是本发明多角体基因前 120bp片段的 PCR产物电泳图； 其中， M: 核酸分子量标准； 1 : 目的基因 PCR产物；

图 3是本发明的重组表达载体鉴定图； 其中， M:核酸分子量标准； 1 : 基因 PCR产物； 2: 重组质粒 EcoR I和 Xho l的酶切产物； 图 4是本发明的融合蛋白表达图； M: 蛋白分子量标准； l : co/ BL21 pET2Sa-polhl20-EGFP未诱导； 2: E. coli BL21 pET2Sa-polhl20-EGFP诱导； 3 : E.coli BL21 pET2Sa-polh-EGFP诱导； 4: E.coli BL21 pET28a- -EGFP诱 导；

图 5是本发明的融合蛋白溶解性分析图； 其中， 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13是溶液 pH为 8.0、 8.4、 9.2、 9.6、 10.、 10.4、 10.8时的上清; 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14是溶液 pH为 8.0、 8.4、 9.2、 9.6、 10.、 10.4、 10.8时的沉淀; 图 6是本发明使用 Gly回调 pH值至 7.6时的电泳图； 其中， M:蛋白分 子量标准； 1 :ρΗ7.6时的上清蛋白样品； 2: pH7.6时的沉淀中蛋白样品； 图 7是本发明的凝血酶酶切效果图；其中，Μ:蛋� �分子量标准； 1 :ρΗ7.6 时的上清原样； 2: ρΗ7.6时凝血酶酶切后的样品。 具体实施方式

应该指出， 以下具体说明都是事例性的， 皆在对本发明提供进一步说 明， 除非另有说明， 本文中使用的所有科学和技术术语具有与本发 明所属 技术领域人员通常理解的相同含义。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明 。 以下实施例中使用的 生物材料如家蚕核型多角体病毒、 载体 pET-28a、 质粒 pGEX^T-l- GFA 质粒 pET28a-jw/ z和 E.coli TGI、 E.coli BL21 ( DE3 )均购自特菲 (天津） 生物医药科技有限公司； 所使用的反应试剂如无特殊说明， 均为 Fermentas 公司产品。

实施例 1 : 构建重组载体 pET28a-jro/W

1)以质粒 pET28a-jw/ z为模板扩增多角体基因前 120bp片段， 引物设计 如下：

上游引物 F1 :

5'-CGG(¾:rCCATGGCCAATTATTCATAC-3' (斜体表示 B imH I酶切位 点）

下游引物 R1 :

5'- GGCGA47 CCTCGTTCCTCGTGGTTCTATGTTCGACTAGGTGC-3' (斜体表示 coR I酶切位点,下划线部分为凝血酶酶切位点）。

2) PCR反应参数设计为， 94°C预变性 5min， 94°C变性 30s, 59°C退火 30s, 72°C复性延伸 lmin, 30个循环， 72°C延伸 10min。 在 ΙΟΟμΙ^的离心管中， 加入下列组分:

双蒸水 33 μL

lOxTaq Buffer I 5

2 mM dNTPs 5 μ

Fl(10 μΜ) 1.5

l(10 μΜ) 1.5

质粒 pET28a- w//z 2.5

Taq DNA polymerase 1.5

Total 50 μL

各组分混匀后， 放入 PCR仪中， 按上述反应参数设计 30个循环。 待反 应结束后， 电泳鉴定扩增片段， 同时切胶回收目的片段。

3)上述步骤 2)得到的 PCR产物经 BamYL I和 EcoR I双酶切后的基因片 段克隆至经 B纖 H I和 EcoR I双酶切的载体 ET28a中， 使 PCR扩增的基 因连接到载体 pET28a上， 构建成重组载体 pET28a-jw/ z 0, 经酶切分析鉴 定基因序列完全正确。

实例 2: 融合表达 (绿色荧光蛋白）

1)以质粒 为模板， 以下列引物进行扩增 EGFP基因 片段。

F2 : 5'- GCC|GAATTC TGGTGAGCAAGGGCGAGGA -3' (方框内为 coR I酶切位点）

R2: 5'-CCG|CTCGA(jTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3' (方框内为 Xho

I酶切位点）

PCR反应参数设计为， 94°C预变性 5min, 94°C变性 45s, 56 °C退火 30s, 72 °C复性延伸 lmin, 30个循环， 72 °C延伸 10min。 PCR反应体系为：

双蒸水 33 μL

lOxTaq Buffer I 5 2 mM dNTPs 5 μL

F2(10 μΜ) 1.5

R2(10 μΜ) 1.5

pEGX-4T-l-EG 2.5 μ

Taq DNA polymerase 1.5

Total 50 μL

各组分混匀后， 放入 PCR仪中， 按上述反应参数设计 30个循环。 待反 应结束后， 电泳鉴定扩增片段 (见图 2), 同时切胶回收目的片段。

2)上述步骤 1)得到的 PCR产物经 coR I和 ¾。 I双酶切后的基因片段 克隆至经 EcoR I和 ½ I双酶切的上述重组载体 pET2Sa-polhl20中，使 PCR 扩增的基因连接到重组载体 pKT28a-/? _O hJ20 上， 构建成重组表达载体 pET28a-jw/W20- 见图 1) , 经酶切分析鉴定连接完全正确（见图 3)。

3)将步骤 2)构建好的重组表达载体转化 BL21(DE3)感受态细胞， 涂布 平板并挑取长出来的单菌落， 即得到重组的基因工程菌 E.coli BL21 pKT28∑L-pcMl 20-EGFP。

4)将 E.coli BL21 pET2Sa-polhl20-EGFP转接到 LB培养基中， 37°C摇 床培养至 OD值在 0.4-0.6, 加入终浓度为 lmmol/L的 IPTG, 诱导继续培养 4小时后， 离心收集菌体。 同时， 用常用载体 pET28a构建的工程菌 co/ BL21 pETlSa-EGFP, co/ BL21 pET28a-jro/ z- 作对照。 将部分离心 收集到的菌体进行全菌 SDS-PAGE电泳，结果如图 4所示，重组工程菌 E.coli BL21 pET2Sa-polhl20-EGFP在约 36kDa处有一明显的蛋白条带， 与理论上 该载体上表达出的融合蛋白 Polhl20-EGFP 大小相符合。 且与两种对照相 比， 本发明中的载体表达出的外源蛋白量不亚于对 照组的量。

实例 3 : 融合蛋白 Polhl20-EGFP的溶解性分析

1) 将离心收集的菌体进行超声破碎后， 收集超声后的沉淀， 用 pH 8.0 的甘氨酸-氢氧化钠 （Gly-NaOH ) 缓冲液 20亳升重悬， 4°C下搅拌 30 min, 12,000 rpm离心 lO min,取上清，作为 H 8.0的上清; 收集的沉淀用 H 8.4 的缓冲液 20亳升重悬， 在 4°C下搅拌 30 min, 取此重悬液作为 pH 8.0的沉 淀组分， 12,000 rpm离心 10 min, 取上清作为 pH 8.4的上清； 同样， 向上 一步的沉淀加入 20亳升的 pH 8.8的甘氨酸-氢氧化钠（Gly-NaOH )缓冲液， 4°C搅拌混匀 30 min, 重悬液作为 pH 8.4的沉淀组分， 12,000 rpm离心 10 min, 取上清作为 pH 8.8的上清； 以此类推， 得到不同 pH条件下的融合蛋 白 Polhl20-EGFP 的上清和沉淀组分。 取等量不同组分的样品， 进行 SDS-PAGE电泳分析 (见图 5) ,检测融合蛋白 PO/ZL^O- GFT ⁵ 随 pH的溶解性 变化。 缓冲液配方见表 1。

表 1 不同 pH缓冲液的配方

图 5的电泳结果显示， 在 PH为 10.8时融合蛋白有大部分溶解在上清 液中， 还有少部分在沉淀中， 这与对照组中的 PoM20Q-EGFP的溶解 PH 值基本一致。

2)取上述 PoM20-EGFP蛋 PH为 10.8时的上清，向其中边搅拌边滴 加 0.2 M的 Gly, 同时随时检测溶液的 PH值。 同时， 用 Polhl20-EGFP蛋 白 PH为 10.8的上清作为对照同时进行实验。 发现 Polhl20-EGFP蛋 \ 液回调直到 PH为 7.6时仍然未出现浑浊现象， 12000rpm离心 lOmin, 只看 到离心管底部有少许沉淀； 而 Polhl20-EGFP蛋^ H PH为 10.8时即 可发现溶液出现浑浊现象， 12000rpm离心 lOmin, 看到离心管底部有大量 沉淀； 分别取上清和沉淀与蛋白上样缓冲液（ Loading Buffer )等比例 (体积 比）混合后， 100°C煮 10分钟， 5000rpm, 离心 5分钟， 进行电泳检测。 图 6 中显示，在回调至 pH为 7.6时，上清中的目的蛋白多于沉淀中的目的蛋 白， 这足以达到降低溶解 pH值的要求，这一 pH值可以算是中性的缓冲液的 pH。

实例 4: 凝血酶酶切目的蛋白 EGFP

将实例 3中回调至 pH7.6的融合蛋白溶液， 用 BCA蛋白定量试剂盒检 测样品蛋白浓度后， 按照 Novagen公司 THROMBIN产品说明将融合蛋白 在 1.5mL离心管中进行酶切反应。 反应体系如下：

混匀后， 21 °C反应 2h后， 取样电泳。 结果显示 (见图 7), 经过酶切后 的蛋白大小和理论上的 大小基本一致， 且融合蛋白的条带很淡， 可 以说是凝血酶基本上能将融合蛋白中的 EGFP酶切下来。

综上所述， 以上实施例仅为本发明的优选实施例， 在各个实施例可以 证明本发明可以和全长多角体基因融合外源基 因一样， 具有全长多角体基 因融合外源基因的高效表达性质，同时所需溶 解融合蛋白的 pH值明显比全 长多角体融合的方式低很多， 处于中性， 可适用于蛋白酶切且酶切效率很 高。 此外， 对于本发明中的技术来说， 在不脱离本发明的核心技术特征的 前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些润饰和改进也应属于本发明的 专利保护范围。