Domaine technique de l'invention

L'invention concerne le domaine de la radiobiologie médicale, et plus particulièrement le domaine des méthodes de laboratoire radiobiologiques. L'invention concerne une nouvelle méthode prédictive de la radiosensibilité cellulaire, tissulaire et clinique, qui se base sur la détermination et le recoupement de plusieurs paramètres et critères cellulaires et enzymatiques. Etat de la technique

Environ 1 à 15% des patients traités par radiothérapie pour un cancer montrent une réaction tissulaire (tel qu'une dermite ou une rectite) qui peut mettre en jeu le bon déroulement du traitement dans la mesure où elle peut conduire le médecin à décider l'arrêt du traitement radiothérapeutique avant la fin du protocole prévu. Par ailleurs, cette réaction tissulaire est un indicateur d'une sensibilité particulièrement élevée du patient au rayonnement ionisant. Ainsi, le traitement radiothérapeutique, même interrompu au moment de l'apparition des premiers signes tissulaires visibles, peut augmenter la morbidité voire la mortalité post-traitement des patients, non seulement parce que le cancer qu'il était censé traiter n'a pas pu être éradiqué complètement dû à l'arrêt prématuré du traitement, mais encore à cause de l'endommagement collatéral des tissus sain induit par le rayonnement lui-même.

On sait également que la question de la sensibilité des tissus au rayonnement ionisant est inséparable de celles des mécanismes de réparation des dommages de l'ADN. En effet, au niveau cellulaire, le rayonnement ionisant peut casser certains types de liaisons chimiques en générant des radicaux libres (en particulier par peroxydation) et d'autres espèces réactives à l'origine des dommages de l'ADN. L'endommagement de l'ADN par des agressions endogènes ou exogènes (telles que les radiations ionisantes et les radicaux libres), peut aboutir à différents types de dommages de l'ADN en fonction notamment de l'énergie déposée : les dommages de bases, les cassures simple-brin et les cassures double-brin (CDB). Les CDB non réparées sont associées à la mort cellulaire, la toxicité et plus spécifiquement la radiosensibilité. Les CDB mal réparées sont associées à l'instabilité génomique, aux phénomènes mutagènes et à la prédisposition au cancer. L'organisme dispose de systèmes de réparation spécifiques à chaque type de dommage de l'ADN. En ce qui concerne les CDB, les mammifères possèdent deux principaux modes de réparation : la réparation par suture (ligation des brins) et la réparation par recombinaison (insertion d'un brin homologue ou non-homologue). On sait que la sensibilité des tissus au rayonnement ionisant est très variable d'un organe à l'autre et d'un individu à l'autre ; l'idée d'une « radiosensibilité intrinsèque » a été conceptualisée par Fertil et Malaise en 1981. Ainsi, les diverses études sur les effets thérapeutiques et les effets secondaires de la radiothérapie ont montré qu'il existe des individus qui jouissent d'une radiorésistance particulièrement élevée, et des individus qui montrent au contraire une radiosensibilité qui peut aller d'un effet secondaire reconnu cliniquement mais sans conséquence jusqu'à un effet létal. Même en dehors de certains rares cas de radiosensibilité extrême, dont l'origine génétique semble avérée, on pense que la radiosensibilité découle d'une manière générale d'une prédisposition génétique : elle est donc propre à un individu. Il serait donc désirable de disposer d'une méthode d'essai prédictive pour pouvoir déterminer la dose maximale cumulée qu'un patient donné peut recevoir sans risque. Cette question se pose en premier lieu en radiothérapie dans un contexte de fortes doses ionisantes. Toutefois, cette question est également susceptible de se poser pour toute autre exposition à de fortes doses ionisantes, équivalentes à celles utilisées en radiothérapie.

On sait que deux protéines de la famille des kinases, appelées couramment ATM et ATR, sont impliquées dans la détection, la réparation et la signalisation des CDB ; leur action nécessite au moins la présence d'une protéine connue sous la désignation BRCA1 et d'une cascade de phosphorylations ordonnée des différents substrats d'ATM (voir l'article de N. Foray et al., « A subset of ATM- and ATR-dependent phosphorylation events requires the BRCA1 protein », paru dans The EMBO Journal vol. 22(1 1 ), p. 2860-2871 (2003)). L'essai a été entrepris d'utiliser l'enzyme ATM dans un modèle explicatif de la radiosensibilité cellulaire (voir Joubert et al., "DNA double-strand break repair defects in syndromes associated with acute radination response ; At least two différent assays to predict intrinsic radiosensitivity ?", paru dans Int. J. Radiât. Biol., vol. 84(2), p. 107-125 (2008)), et cela a permis d'identifier trois types de radiosensibilité : les cellules radiorésistantes (radiosensibilité dite de Groupe I), les cellules modérément radiosensibles (radiosensibilité dite de Groupe II), et les cellules extrêmement radiosensibles (radiosensibilité dite de Groupe III). Cependant, aucun modèle prédictif n'a été proposé sur cette base, notamment aucune relation n'a été établie entre les données cliniques (grade de sévérité tissulaire) et les données radiobiologiques. De même, la présentation de N. Foray, « Les réparatoses : nouveaux concepts sur la prédiction de la radiosensibilité », effectuée lors des « Rencontres Nucléaire & Santé » du 25 janvier 2008 (XP55131242) évoque le rôle des différents marqueurs pH2AX et MRE1 1 et leurs évolutions au cours du temps pour décrire le nombre de cassures double-brin radioinduites. Cette présentation ne fait pas non plus mention des grades de sévérité tissulaires qui quantifient et répertorient le niveau de radiosensibilité observé au niveau clinique. .

De nombreux documents décrivent les conditions dans lesquelles ΓΑΤΜ peut contribuer à la détection et la réparation de l'endommagement de l'ADN. La demande de brevet WO 2004/013634 (KUDOS Pharmaceuticals Ltd) décrit l'identification d'une composante de voie de signalisation de dommage ATM-dépendant de l'ADN qui interagit avec d'autres facteurs de réponse aux dommages de l'ADN, y compris le complexe MRE1 1/Rad51/NBS1. La demande de brevet US 2007/0072210 (Ouchi et Aglipay) propose une méthode de criblage d'agents thérapeutiques potentiels qui favorisent une réponse aux dommages de l'ADN, dans laquelle on mélange une protéine appelée BAAT1 (qui est associée à une prédisposition au cancer du sein liée au gène BRCA1 ), une protéine ATM et le composé candidat ; si la phosphorylation de l'ATM est augmentée par rapport à un mélange témoin ne comportant pas le composé candidat, ce dernier est identifié comme un potentiel principe actif favorisant la réparation de l'ADN. La demande de brevet EP 2 466 310 A1 (Helmholtz Zentrum Munchen) décrit la réparation de ruptures de l'ADN de type double brin en présence de la forme phosphorylée de l'histone H2AX (appelée gamma-H2AX ou g-H2AX). La demande WO 00/47760 et le brevet US 7,279,290 (St. Jude's Children's Research Hospital) décrivent le rôle de la fonction kinase de l'ATM dans la réparation de l'ADN.

Ces derniers documents décrivent donc des voies de réparation mais n'offrent aucune corrélation pour établir un lien avec la clinique.

Le brevet EP 1 616 01 1 B1 (International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology) propose une méthode pour le diagnostic d'un défaut génétique dans la réparation de l'ADN basée sur trois étapes : la culture de cellules isolées d'un échantillon à tester, l'incubation de ces cellules avec un polypeptide chimérique, la caractérisation de la réponse cellulaire. Ladite réponse cellulaire est le taux d'expression d'un marqueur biochimique consistant en protéines intracellulaires de type p53, ATM, Chk1 , Chk2, BRCA1 , BRCA2, Nbs1 , MRE1 1 , Rad50, Rad51 et des histones. Toutefois, l'expression radioinduite peut ne pas être prédictive de la fonctionnalité de ces protéines (certains syndromes présentent un taux d'expression normale alors que la protéine est mutée) : ces procédures ne sont pas des tests fonctionnels.

Les demandes de brevet WO 01/90408, WO 2004/059004 et WO 2006/136686 (Commissariat à l'Energie Atomique) décrivent d'autres méthodes pour constater l'endommagement de l'ADN suite à une irradiation ionisante. Le premier document concerne la mise en évidence d'activités d'incision des lésions de l'ADN, il ne permet pas la quantification des activités enzymatiques d'excision et de resynthèse de l'ADN ni de la réparation des CDB. Les deux autres documents décrivent l'évaluation quantitative des capacités d'un milieu biologique à réparer son ADN à l'aide d'ADN double-brin circulaire superenroulé (selon le troisième document : immobilisé dans un film d'hydrogel de polyacrylamide poreux). Ces procédés ne concernent pas directement les CDB dans leur environnement physiologique in situ et aucune corrélation n'existe pour valider leur application en clinique.

KR20030033519 propose de déduire la sensibilité au rayonnement de l'activité de la catalyse ou de la superoxyde dismutase, KR20030033518 utilise la glutathione peroxydase ou la glucose 6-phosphate dehydrogenase. De telles méthodes ne détectent pas des marqueurs directement reliés à l'endommagement ou à la réparation de l'ADN.

La demande de brevet US 201 1/312514 (Dana Farber Cancer Institute) propose d'utiliser la détection des foci FANCD2 comme marqueur. La demande de brevet US 2007/0264648 (National Institute of Radiological Sciences) propose l'utilisation des oligomères de l'ADN pour la prédiction de l'apparition d'effets secondaires lors des radiothérapies. Toutefois, certaines radiosensibilités peuvent être observées alors que le taux de foci FANCD2 est normal. Les demandes de brevet US 2008/234946 et US 2012/041908 (University of South Florida et al.) décrivent une méthode pour la prédiction de la radiosensibilité de cellules cancéreuses, et non pas de cellules saines ; elle est en plus basée sur des données génomiques et non des tests fonctionnels.

La demande de brevet WO2014/154854 (Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier) décrit une méthode pour la prédiction de la radiosensibilité d'un sujet via l'utilisation d'au moins un biomarqueur de radiosensibilité. Cette méthode ne détecte pas des marqueurs directement reliés à l'endommagement ou à la réparation de l'ADN ; elle est en plus basée sur des données protéomiques.De plus, cette demande de brevet ne décrit pas de relation quantitative entre les données radiobiologiques et la sévérité des réactions tissulaires.

La demande de brevet WO 2013/187973 (University of California) décrit des systèmes et des méthodes de détermination de la radiosensibilité de cellules et/ou d'un sujet au regard d'une population contrôle. Plus particulièrement cette méthode inclut l'irradiation d'un échantillon biologique, la détection et la quantification de foci radioinduits au sein de cellules erythrocytes, lymphocytes ou de cellules primaires, résultant d'un prélèvement sanguin via l'utilisation d'un ou plusieurs marqueurs de détection parmi un ensemble de marqueurs dont l'anti-pH2AX, l'anti-MRE1 1 et l'anti-ATM. La quantification des foci radioinduits à différents temps d'observation post-irradiation inférieurs à 2 h permet de déterminer leur cinétique de réparation qui est corrélée de manière empirique à la radiosensibilité du sujet. Toutefois, l'analyse des focis dans des cellules de type lymphocyte est très difficile du fait de leur petit noyau. De plus, cette méthode ne permet cependant pas au praticien de prendre des décisions quant au traitement du patient.

Le brevet US 8,269,163 (New York University School of Médecine) décrit un grand nombre de protéines susceptibles d'être utilisées comme marqueurs pour apprécier de manière simple et rapide l'importance de l'exposition accidentelle au rayonnement ionisant qu'une personne a subie, en vue de trier les patients et de les orienter vers un traitement d'urgence approprié. Ce dernier brevet concerne la dosimétrie biologique (détermination de la dose accidentelle) alors que la détection de la radiosensibilité s'effectue à partir d'une dose connue. La demande de brevet WO 2010/88650 (University of Texas) décrit des méthodes et compositions pour identifier les cellules cancéreuses qui sont soit sensibles soit résistantes à un traitement de radiothérapie particulier ; elles n'est donc pas applicable à tout traitement radiothérapeutique. La demande de brevet WO 2010/136942 (Philips) décrit une méthode globale pour surveiller un patient lors d'une radiothérapie à l'aide de biomarqueurs. Le procédé comprend l'obtention d'au moins un descripteur dérivé d'une image extrait d'une modalité d'image, dans lequel le descripteur appartient à un tissu d'intérêt pour lequel est prévue une radiothérapie ou à un tissu dans le voisinage de ce volume cible. Le procédé comprend en outre la sélection d'au moins un marqueur biologique spécifique d'une maladie apte à détecter ou quantifier des effets secondaires de la radiothérapie dans la zone des tissus d'intérêt. En outre, le procédé comprend la récupération d'au moins une valeur de mesure in vitro du biomarqueur spécifique de la maladie sélectionnée. En outre, le procédé comprend le traitement du au moins descripteur de la au moins une valeur de biomarqueur in vitro au moyen d'une technique de corrélation, résultant en un signal de sortie indicatif de la radiotoxicité dans la région du tissu d'intérêt. Toutefois, l'enseignement de ce brevet ne tient compte que de la toxicité dépendant du tissu et non de l'individu et est principalement basée sur l'analyse d'images. La demande de brevet WO 2010/109357 décrit un procédé et un appareil pour la planification de protocole de radiothérapie adaptative basée sur l'optimisation de la probabilité de complication des tissus normaux et la probabilité de contrôle tumoral selon des marqueurs spécifiques à chaque patient. Les valeurs des marqueurs associées à des tissus normaux comprennent des valeurs de tests in vitro, les signatures par spectrométrie de masse des protéines, des données de l'anamnèse et les antécédents du patient. Les valeurs d'essai in vitro peuvent être d'origine cellulaire, protéomique et génétique tel que, mais sans s'y limiter, divers comptages de cellules, HB, CRP, PSA, TNF-alpha, ferritine, transferrine, LDH, IL-6, l'hepcidine, créatinine, glucose, HbAlc, et la longueur des télomères. Les marqueurs de l'anamnèse et des antécédents du patient incluent la chirurgie abdominale antérieure, les médicaments hormonaux ou de anticoagulants, le diabète, l'âge, et les mesures liées à la croissance tumorale. Les biomarqueurs non liés à la radiotoxicité sont également envisagés, tels que les biomarqueurs associés à diverses formes d'ablation ou agents chimiothérapeutiques. Toutetois, la radiosensibilité individuelle n'y est pas prise en compte.

Malgré ce vaste état de la technique, la demanderesse constate que les brevets décrits ci-dessus ne décrivent pas une méthode de quantification de la radiosensibilité individuelle permettant d'évaluer le risque de réactions tissulaires post-radiothérapie, qui puisse être employé pour tout patient et tout type de rayonnement ionisant susceptible d'induire des CDB, et qui soit prédictif. Le problème de founir une méthode prédictive de la radiosensibilité individuelle reste donc sans solution opérationnelle. La présente invention vise à proposer une nouvelle méthode prédictive de la radiosensibilité tissulaire et clinique.

Objets de l'invention

Les inventeurs ont constaté, et la méthode selon l'invention part de ce constat, que les cassures double-brin (CDB) de l'ADN sont les dommages radioinduits les plus prédictifs de la radiosensibilité quand ils sont non-réparés d'une part, et de l'instabilité génomique quand ils sont mal réparés d'autre part. Les inventeurs ont découvert que les CDB sont prises en charge par le mode majoritaire de réparation dit de suture, et/ou par le mode minoritaire de réparation fautive dit recombinaison MRE1 1 -dépendante. L'équilibre entre ces deux modes de réparation est contrôlé par la protéine ATM. Le marqueur pH2AX indique un site CDB reconnu par le mode de réparation par suture. Le marqueur MRE1 1 indique un site de CDB qui a été pris en charge par la réparation fautive MRE1 1 - dépendante. Le marqueur pATM renseigne sur l'activation de la voie de suture par phosphorylation de H2AX et l'inhibition de la voie MRE1 1 -dépendante. Les inventeurs ont par ailleurs observé un transfert des formes cytoplasmiques de la protéine ATM dans le noyau cellulaire à la suite d'un stress de type oxydatif, et notamment à la suite d'un stress lié à un rayonnement ionisant induisant des CDB. Pour constater l'endommagement d'un ADN par une aggression exogène, il faut tenir compte, d'une part, de l'état spontané de l'ADN, et, d'autre part, de son état radioinduit. Par ailleurs, après irradiation, il faut tenir compte de la réparation de l'ADN, dont la cinétique dépend du mécanisme de réparation et donc du type d'endommagement radioinduit. On sait par ailleurs que l'efficacité et la rapidité de la réparation de l'ADN varie d'un individu à l'autre, et qu'il existe en outre des conditions génétiques particulières qui conduisent à une radiosensibilité exceptionnelle.

Selon l'invention le problème est résolu par une méthode basée sur : 1 ) une amplification de cellules non transformées, notamment de cellules issues de biopsies de peau ; 2) un modèle mécanistique valable pour les cellules humaines quiescentes ; 3) des tests fonctionnels de la reconnaissance, de la réparation et de la signalisation des CDB valables quelle que soit la modalité thérapeutique. Un premier objet de l'invention est un procédé pour prédire la radiosensibilité cellulaire d'un échantillon cellulaire envers un rayonnement ionisant, ledit échantillon cellulaire ayant été obtenu à partir de cellules prélevées sur un patient dans une zone non irradiée ou peu irradiée, dans lequel procédé :

(i) on amplifie lesdites cellules prélevées, ces cellules amplifiées constituant « l'échantillon cellulaire » ;

(ii) on détermine sur ledit échantillon cellulaire le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX aux temps d'observation t (ce nombre moyen étant appelé N _pH 2Ax(t)), lesdits temps d'observation t étant le temps t=0 min (appelé tO, état non irradié) et le temps d'observation t4 (et de préférence en plus les temps t1 , t2 et t3) après irradiation avec une dose absorbée D;

(iii) on détermine la dose totale à ne pas dépasser (DTNPD), exprimée en Gray (Gy), en utilisant au moins le paramètre N _pH 2Ax(t4),

(iv) on détermine sur ledit échantillon cellulaire le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec au moins deux des marqueurs pH2AX, pATM et MRE1 1 aux temps d'observation t (ces nombres moyens étant appelé respectivement N _pH 2Ax(t),

NpATM(t), N _M REn(t)), lesdits temps d'observation t étant le temps t=0 min (appelé tO, état non irradié) et au moins un temps d'observation sélectionné parmi t = t1 , t2, t3 et t4 après irradiation avec une dose absorbée D;

(v) on détermine le groupe de radiosensibilité de l'échantillon, en utilisant au moins les nombres moyens N _pH2 Ax(t), N _pAT M(t) et N _MR Ei i(t) ;

et dans lequel procédé

• t4 est une valeur fixe qui représente le temps pour lequel le taux de cassures ADN atteint sa valeur résiduelle, et qui est avantageusement choisie entre 6 fois t3 et 8 fois t3, mais doit être dans ce cas être au moins de 12 heures, et de préférence comprise entre 12h et 48h, et qui est encore plus préférentiellement d'environ 24 heures ;

• t3 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 25% des CDB sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 3 fois t2 et 5 fois t2, mais doit dans ce cas être au moins de 2,5 heures et au plus de 6 heures, et est de préférence comprise entre 3 heures et 5 heures, et est encore plus préférentiellement environ 4 heures ;

· t2 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 50% des CDB sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 5 fois t1 et 7 fois t1 , mais qui doit dans ce cas être au moins de 35 minutes et au plus de 90 minutes, et est de préférence compris entre 45 minutes et 75 minutes, et est encore plus préférentiellement environ 60 minutes ;

• t1 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel le nombre de CDB reconnues atteint son maximum dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 5 minutes et 15 minutes après l'arrêt de l'irradiation, de préférence entre 7,5 minutes et 12,5 minutes, et encore plus préférentiellement à environ 10 minutes.

Dans un mode de réalisation avantageux on utilise également le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX aux temps d'observation t1 , t2 et t3 pour vérifier la forme de la courbe cinétique de réconnaissance et de réparation des CDB.

La dose totale à ne pas dépasser (DTNPD), exprimée en Gray (Gy), est un paramètre important pour le radiothérapeute, qui permet de prédire quelle dose maximale un patient donné peut absorber sans subir une réaction potentiellement létale ; ce paramètre permet également d'écarter de la radiothérapie les patients qui présentent une radiosensibilité particulièrement forte.

La DTNPD est idéalement exprimée en équivalent peau : les expériences étant effectuées sur des fibroblastes cutanés, elle ne peut être extrapolée quantitativement directement sur d'autres tissus. Les prédictions concernent donc essentiellement la réponse radioinduite d'une peau ou un tissu biologiquement équivalent (ex :fibroblastes du poumon). Toutefois, les extrapolations à d'autres tissus comme l'endothélium, les astrocytes ou les épithéliums peuvent s'effectuer qualitativement dans l'attente de la définition plus précises de facteurs correctifs spécifiques à chaque tissu. Selon l'invention, on peut déterminer la DTNPD selon la formule

DTNPD = 60/N _pH 2Ax(t4) si N _pH 2Ax(tO) < 3, ou selon la formule DTNPD = 60/[N _pH2 Ax(t4) + N _pH2 Ax(tO)] si N _pH 2Ax(tO) > 3,

Dans une variante du procédé selon l'invention on détermine sur ledit échantillon cellulaire également le nombre moyen de micronoyaux observés aux temps t pour 100 cellules [en %] (ce nombre moyen étant appelé N _M N(t)), les temps t étant au moins tO (non irradié) et t4 après irradiation avec une dose absorbée D, on utilise le paramètre N _M N(t4) dans la détermination de la DTNPD. Toutefois, l'incertitude statistique de la mesure expérimentales des micronoyaux étant plus grande que celle du nombre de foci nucléaires observés par immunofluorescence, on favorisera toujours les valeurs prédictives issues de la mesure des foci plutôt que de celle des micronoyaux. Ainsi, à titre indicatif, on peut déterminer la DTNPD en fonction de selon la formule

DTNPD = 60/[0.4 x N _MN (t4)], si N _pH2 Ax(tO) < 3, ou selon la formule DTNPD = 60/[2 + (0.4 x N _MN (t4))]

L'utilisation de l'une ou l'autre variante du procédé selon l'invention conduit à l'obtention d'un chiffre décimal. La valeur de la DTNPD finale, obtenue après utilisation de l'une ou l'autre des formules est un chiffre ou un nombre entier correspondant à l'arrondi arithmétique de la valeur obtenue par calcul. La DTNPD déterminée selon l'invention correspond à ce chiffre ou à ce nombre entier.

Dans une variante du procédé selon l'invention, et de manière avantageuse le groupe de radiosensibilité du patient est déterminée avant celle de la DTNPD, et ce, afin d'attribuer au patient une valeur correcte de DTNPD pour les patients appartenant au groupe de radiosensibilité de type II (radiosensibilité modérée).

Le groupe de radiosensibilité de l'échantillon a été déterminée via les formules précédemment décrites, de la manière suivante :

(a) on considère que l'échantillon est radiorésistant si N _pH 2Ax(t4) < 2 et N _P ATM(Î1 ) > N _P ATM(t2) et N _P ATM(t1 ) > 30 et A < 10 et B < 5 et C < 2 ; sachant que :

C = N _pH 2Ax(tO) + N _MN (t0) ;

B = % de gros noyaux (supérieurs à 150 μηι ² ) à tO ;

A = NMREU (tO) + Nbre de petit foci pH2AX/cellule à tO ; (b) on considère que l'échantillon est très radiosensible si (N _pH 2Ax(t4) > 8 ou N _M N(t4) > 24) ;

(c) on considère que l'échantillon présente une radiosensibilité modérée pour toutes les autres conditions.

Pour certains patients, la réparation de l'ADN peut être perturbée par une production incessante de cassures simple-brin de l'ADN (CSB) spontanées dû au phénomène d'hyperrecombinaison qui est généralement observé chez les patients prédisposés aux cancers. La surproduction spontanée de CSB peut avoir deux effets qui ne non pas contradictoires : à l'état spontané et par marquage pH2AX, des foci nucléaires plus petits que les foci pH2AX habituellement observés peuvent apparaître ; ils sont le reflet de la présence d'un grand nombre de CDB (phénomène de « petits focis »). De même, une surproduction de CSB peut conduire à une décondensation de la chromatine ce qui augmente la taille du noyau des cellules (taille généralement supérieur à 150 μηη ² , corresdpondant au phénomène des « gros noyaux »). Ces deux phénomènes sont le reflèt d'une grande instabilité génomique.

La DTNPD est ensuite déterminée pour les patients de groupe de radiosensibilité II via les deux variantes présentées précédemment, à savoir selon la formule

DTNPD = 60/N _pH 2Ax(t4) si N _pH2 Ax(tO) < 3, ou selon la formule DTNPD = 60/[N _pH2 Ax(t4) + N _pH2 Ax(t0)] si N _pH2 Ax(t0) > 3, ou selon une deuxième variante, on peut déterminer la DTNPD en fonction de selon la formule

DTNPD = 60/[0.4 x N _MN (t4)], si N _pH2A x(t0) < 3, ou selon la formule DTNPD = 60/[2 + (0.4 x N _MN (t4))]

si N _pH2A x(tO) > 3.

L'utilisation de l'une ou l'autre variante du procédé selon l'invention conduit à l'obtention d'un chiffre décimal. La valeur de la DTNPD finale, obtenue après utilisation de l'une ou l'autre des formules est un chiffre ou un nombre entier correspondant à l'arrondi arithmétique de la valeur obtenue par calcul. La DTNPD déterminée selon l'invention correspond à ce chiffre ou à ce nombre entier. Le procédé selon l'invention utilise au moins un échantillon de tissu sain, de préférence des fibroblastes. Ces derniers sont de préférence prélevés sur le tissu conjonctif du patient. Ce prélèvement peut être effectué par biopsie. Ainsi, dans un mode de réalisation avantageux lesdites cellules prélevées sont des cellules fibroblastiques issues d'une biopsie de peau d'un patient (prélevées typiquement selon une méthode connue sous le nom « punch dermatologique »). L'échantillon de tissu est cultivé dans un milieu de culture approprié. La première étape du procédé selon l'invention qui suit le prélèvement des cellules (à savoir dans le mode de réalisation préféré via l'établissement de la biopsie en lignée fibroblastique) consiste à caractériser l'état spontané de l'ADN (état à tO), c'est-à-dire sans irrradiation. Cette étape peut comporter notamment l'examen de la taille des noyaux, la présence de micronoyaux, des éventuels corps apoptotiques spontanés et de cellules multilésées : on observe les cellules sous un microscope à fluorescence. En utilisant le colorant DAPI (4'6'-diamidino-2-phénylindole, n° CAS 28718-90-3 pour le dihydrochlorure) on détermine le taux de micronoyaux pour 100 cellules, qui est un indicateur de l'instabilité génomique. On détermine également les corps apoptotiques. On détermine également la population de noyaux anormalement gros, dont la présence indique la décondensation de la chromatine.

Ledit rayonnement ionisant est défini par sa dose absorbée (paramètre appelé D et exprimé en Gray). Dans le cadre de la présente invention la dose absorbée D est comprise entre 0,5 Gy et 4 Gy, de préférence comprise entre 1 Gy et 3 Gy, de préférence entre 1 ,7 Gy et 2,3 Gy, et est encore plus préférentiellement de 2 Gy. Ces zones correspondent typiquement à une séance individuelle de traitement radiothérapeutique, le nombre de séances dépendant de la localisation, du type et du stade d'avancement de la tumeur. II est essentiel pour la méthode selon l'invention que toutes les valeurs de temps t1 , t2, t3 et t4 soient définies en début d'une série d'essais (i.e. au moins pour un patient donné, et de préférence pour une pluralité de patients afin de calibrer la méthode par rapport à un ensemble d'observations statistiquement significatifs) et soient les mêmes pour toutes les déterminations de tous les paramètres qui se réfèrent à ces intervalles de temps.

Dans le procédé selon l'invention, t1 est avantageusement compris entre 8 minutes et 12 minutes, et/ou t2 est avantageusement compris entre 50 minutes et 70 minutes, et/ou t3 est avantageusement compris entre 3,5 heures et 4,5 heures, et/ou t4 est avantageusement compris entre 22 heures et 26 heures ; de préférence toutes ses quatre conditions sont remplies. Dans une variante du procédé qui est particulièrement intéressante et facile à standardiser, t1 est 10 minutes, t2 est 60 minutes, t3 est 4 heures, t4 est 24 heures, et D est 2 Gy. La détermination de N _pH 2Ax(t) fait avantageusement intervenir un test d'immunofluorescence.

Les cellules témoins issues de patients radiorésistants peuvent être prélevées sur des patients sélectionnés à partir d'un examen clinique comme patients n'ayant pas montré de réactions tissulaires significatives pendant ou à la suite d'un traitement radiothérapeutique. Elles peuvent également être sélectionnées en tant que cellules montrant un taux de survie clonogénique in vitro supérieur à 55% après une irradiation avec une dose absorbée de 2 Gy. Nous décrivons ici un mode de réalisation typique.

On observe les cellules avec le marqueur pH2AX. On peut ajouter l'observations avec les marqueurs pATM et/ou MRE1 1 aux temps d'observation t (ces nombres moyens étant appelés respectivement N _pA TM(t) et N _M REn(t)) et au moins un temps d'observation sélectionné parmi t=t1 , t2 , t3 et t4 après irradiation avec une dose absorbée D. Dans un mode de réalisation on détermine le nombre de foci avec le marqueur pH2AX et la présence de cellules multilésées. On note la localisation de la protéine pATM et celle de la protéine MRE1 1 (nucléaire ou cytoplasmique). Cette première étape permet d'identifier une éventuelle instabilité génomique à l'état spontanée.

La seconde étape du procédé selon l'invention comprend l'irradiation avec la dose absorbée D voulue (par exemple 2 Gy) et l'évaluation de la réponse cellulaire au rayonnement ionisant. a) Dans un premier mode de réalisation, on étudie la réparation des CDB radioinduites par suture, qui est le mode majoritaire de leur réparation. On détermine le nombre de foci pH2AX par cellule à t4 et optionnellement aussi à t1 , t2 et possiblement aussi à t3 ; la détermination à t3 permet de consolider la définition de l'allure des cinétiques de t1 à t4. Dans un mode de réalisation avantageux, après la durée t4 on détermine également le taux de micronoyaux pour en déduire le taux de micronoyaux radioinduits. Cela permet d'estimer la radiosensibilité selon l'importance des CDB non réparées. b) Dans un deuxième mode de réalisation on approfondit l'étude de la réponse cellulaire au rayonnement ionisant à travers la mesure de la fonctionnalité de l'activité kinase ATM- dépendante. On sait que dans les cellules radiorésistantes témoin, les formes phosphorylées de la protéine ATM (pATM) sont cytoplasmiques à l'état spontané. La demanderesse a découvert qu'à l'état irradié, elles ont tendance à devenir nucléaires. Une fois passées dans le noyau, les formes pATM activent les mécanismes de réparation par suture et inhibent la voie de réparation fautive dépendante de MRE1 1.

A titre d'exemple, si après l'irradiation (par exemple avec une dose absorbée de 2 Gy) les formes pATM montent une localisation cytoplasmique, on en conclut que les formes pATM ne passent pas ou ne peuvent pas passer normalement du cytoplasme au noyau.

Cela peut être causé par une mutation d'ATM ou de tout autre partenaire protéine d'ATM qui l'aiderait à passer dans le noyau après irradiation : en tout cas, cela indique une radiosensibilité significative.

Cette détermination optionnelle de la localisation de la protéine pATM est effectuée au moins à t1 et t2, et optionnellement aussi à t3 et t4.

c) dans un troisième mode de réalisation pouvant être combiné avec les précédents, on approfondit l'étude de la réponse cellulaire au rayonnement ionisant à travers la voie MRE1 1 -dépendante. En plus de la voie majeure de réparation par suture dont la capacité est quantifiable par immunofluorescence pH2AX, la demanderesse a identifié une autre voie de réparation, alternative à la suture et qui est susceptible de la remplacer en cas de déficience : c'est la réparation par recombinaison MRE1 1 dépendante. Sa capacité est quantifiable par l'étude cinétique de l'immunofluorescence des foci MRE1 1 . Cette mesure est effectuée au moins à t1 , t2 et t3, et optionnellement aussi à t4. Selon les constatations de la demanderesse, dans les lignées témoins radiorésistantes, MRE1 1 est cytoplasmique et le nombre de foci MRE1 1 est très faible jusqu'à 4 heures après une dose 2 Gy (typiquement 7 ± 2 foci MRE1 1 ) ; le marquage devient cytoplasmique environ 24 heures après l'irradiation. Dans une dernière étape on procède à l'évaluation des résultats en calculant les scores afin de prédire l'état d'endommagement radioinduit et/ou la radiosensibilité du patient, et en particulier la DTNPD qui lui est propre.

Description des figures

Les figures 1 (a),(b) et (c) montrent respectivement l'évolution du nombre de foci des micronoyaux (a), des marqueurs pH2AX (b) et pATM (c) issus de cellules non irradiées en fonction du grade de sévérité selon la classification CTCAE. Les micronoyaux, les foci pH2AX et pATM issus de cellules non irradiées ne sont pas prédictives de la radiosensibilité.

Deux échelles différentes de gravité de réactions tissulaires co-existent : la classification CTCAE et la classification RTOC.

La classification dite CTCAE (Common Terminology Criteria for Adverse Events, appelée en français « Critères d'évaluation de la morbidité selon la classification du National Cancer Institute»), éditée en 2006 par le National Cancer Institute des Etats Unis d'Amérique, est une terminologie descriptive des événements indésirables (en particulier des effets secondaires) en thérapie du cancer.

Un événement indésirable correspond à tout signe défavorable et involontaire, symptôme ou maladie temporellement associé à l'utilisation d'un traitement médical ou d'une procédure qui peut ou non être considéré comme lié au traitement ou à la procédure médicale. Un événement indésirable est une représentation unique d'un événement spécifique utilisé pour la documentation médicale et lors d'analyses scientifiques.

La CTCAE fournie une brève définition de chaque événement indésirable pour clarifier le sens de l'événement indésirable. Cette échelle, valable pour d'autres stress génotoxique (ex : blessures causées par le feu) est particulièrement utilisée en radiothérapie.

Le grade se réfère à la sévérité de l'événement indésirable. La CTCAE affiche 5 grades de sévérité (de 1 à 5) présentant des descriptions cliniques uniques de sévérité pour chaque événement indésirable et décrits dans le tableau 1 ci-après. Chaque grade de sévérité est défini par des réactions tissulaires précises.

Tableau 1 : dernière version de l'échelle CTCAE éditée par le National Cancer Institute des Etats Unis d'Amérique le 14 juin 2010

A ces 5 grades, est ajouté un grade 0 correspondant à une absence d'effet tissulaire. La classification historique dite RTOG, proposée par le Radiation Therapy Oncology Group (RTOC) en 1984 couvre pratiquement tous les types de toxicités tardives de la radiothérapie.

Toutefois, la classification RTOG n'est pas applicable pour certains types de cancer sachant que la classification CTCAE, elle, est employée pour tout type de cancer.

Les figures 2 (a) et 2 (b) présentent l'évolution du nombre de micronoyaux 24 h après irradiation en fonction des grades de sévérité CTCAE (figure 2 (a)) ou RTOG (figures 2

(b) ). Les micronoyaux sont marqués avec le marqueur fluorescent DAPI puis quantifiés par l'analyse du signal de fluorescence. Le groupe de radiosensibilité (I, II, III) est indiqué en caractères romains sur la figure 2.

Le nombre de micronoyaux observé 24 h après irradiation permet uniquement de prédire les radiosensibilités de groupe III. Les figures 3 (a), (b) et (c) montrent l'évolution du nombre de foci pH2AX 24 h après irradiation en fonction des grades de sévérité CTCAE (figure 3 (b)) ou RTOG (figure 3

(c) ). La figure 3 (a) présente les cinétiques du nombre moyen de foci obtenus avec le marqueur pH2AX au cours du temps.

Le nombre de foci pH2AX obtenu 24 h après irradiation en fonction des grades de sévérité CTCAE ou RTOG (2 échelles différentes de gravité de réactions tissulaires) permettent de prédire uniquement les radiosensibilités de groupe I, Il ou III mais pas les grades de sévérité.

La figure 4 (A) représente le nombre moyen de foci obtenus avec le marqueur pH2AX 10 minutes après une irradiation avec 2 Gy pour toutes les lignées cellulaires d'une collection d'échantillons de patients (fibroblastes de peau), la ligne pointillée indiquant l'incidence de CDB normale qui est de 40 CDB par Gy par cellule.

La figure 4 (A) montre que toutes les cellules issues de patients ayant une radiosensibilité de groupe II sont caractérisées par moins de foci pH2AX (de cassures double-brin de l'ADN (CDB)) qu'attendus après 2Gy. Ceci s'explique par le fait que les CDB sont insuffisamment reconnues.

La figure 4 (B) représente l'expression des pATM dans le cytoplasme et le noyau à différents temps (0 minute, 10 minutes et 1 h) suite à une irradiation de 2 Gy. Les données d'immunofluorescence correspondantes sont présentées pour des cellules non irradiées et pour des cellules irradiées avec 2 Gy à 10 minutes post-irradiation.

Les données présentées dans la figure 4 (B), relatives aux nombres de foci pATM suggèrent un « transit cyto-nucléaire » de ΓΑΤΜ. La figure 4 (C) présente les cinétiques du nombre moyen de foci obtenus avec le marqueur pATM au cours du temps à partir de cellules de la collection. Par commodité, les barres d'erreur relatives aux mesures effectuées à 10 min, 1 h, 4 h et 24 h ont été omises. Pour les figures 4 (A) et 4 (C), chaque point représente la moyenne de trois répétitions indépendantes et les barres d'erreur représentent l'écart-type pour chaque catégorie.

La figure 5 montre l'évolution du nombre de foci pATM en fonction des grades de sévérité CTCAE après 10 minutes (figure 5 (A)) et 1 h suite à une irradiation de 2 Gy (figure 5 (B)). La figure 5 (C) représente le maximum du nombre de foci pATM entre les 2 valeurs obtenues à 10 minutes et 24 h après une irradiation de 2 Gy en fonction des grades de sévérité CTCAE, et précédemment présentées en figure 5(A) et 5 (B) respectivement. La figure 5 (B) présente un grade 0, c'est-à- dire une absence d'effet tissulaire.

La figure 5 (C) montre pour une centaine de patients le lien existant entre ces paramètres radiobiologiques et les grades de sévérité selon la classification CTCAE. La figure 5 (C) représente ainsi la validation clinique de la corrélation existante entre les grades de sévérité CTCAE et le maximum du nombre de foci pATM entre les 2 valeurs obtenues 10 minutes et 1 h après irradiation de 2 Gy.

Les groupes de radiosensibilité (I, II, Nia et lllb) sont indiqués en caractères romains sur la figure 5. Pour les figures 5 (A), 5 (B) et 5 (C), chaque point représente la moyenne de trois répétitions indépendantes, et ce, pour chaque catégorie.

Le nombre de foci pATM maximal entre (2 Gy + 10 min) ou (2 Gy + 1 h ) permet de prédire tous les groupes ainsi que le grade de sévérité de la réaction. La figure 6 (A) représente le nombre maximum de foci obtenus avec le marqueur pATM en fonction du nombre de foci pH2AX, précédemment représenté en figures 3 (B) et 5 (C) respectivement.

La figure 6 (B) reprend les données présentées en figure 6 (A) et montre des zones de confiance bien définies représentant les différents groupes de radiosensibilité humaine (Groupe I, Groupe II et Groupe III). La radiosensibilité est déterminée par la reconnaissance et la réparation des cassures double-brin.

La figure 6 (C) présente l'incidence des groupes pour chaque type de groupes. En considérant que la probabilité d'appartenance à un groupe donné est proportionnelle à l'inverse des zones de confiance correspondants, la fréquence normalisée de chaque groupe est représentée sur la figure 6 (C) par des barres. La ligne en pointillé correspond à la gaussienne produisant le meilleur ajustement des données (r = 0,9). Description de l'invention

A. Définitions générales

Les termes « endommagement radioinduit », « radioinduit », « radiosensibilité, « radiorésistance », « radiotoxicité », « radiothérapie » se réfèrent tous à un rayonnement ionisant, notamment à un rayonnement de type particules, tel que constitué par des particules de type alpha (a) ou béta (β), ou encore à un rayonnement électromagnétique à haute énergie, notamment de type gamma (γ) ou X.

Le terme transit cyto-nucléaire d'ATM décrit la translocation qu'effectue la protéine ATM en passant du cytoplasme au noyau, notamment après irradiation.

B. Description détaillée

Nous décrivons ici un mode de réalisation avec plusieurs variantes qui convient pour un patient humain.

1 . Préparation de l'essai

Avant tout prélèvement de cellules et avant toute manipulation des cellules prelévées, les opérateurs respectifs (appartenant par exemple à un laboratoire d'analyses cytologiques) sont informés (typiquement par le médecin) du statut d'infection éventuelle du patient par HIV ou hépatite C pour que les opérateurs puissent prendre les mesures appropriées de sécurité biologique accrue lors du prélèvement, de la manipulation et de la gestion de la culture cellulaire.

Puis, l'opérateur prélève au patient un échantllon cellulaire. De préférence il lui prélève par biopsie un échantillon de peau ; ce prélèvement peut se faire avantageusement selon une méthode connue sous le nom « punch dermatologique ». L'échantillon cellulaire est placé dans du milieu DMEM+20% sérum de veau fetal stérile. L'échantillon est transféré sans délai dans un laboratoire spécialisé, sachant que l'échantillon ne doit pas rester plus de 38 h à la température ambiante.

Dès réception, l'échantillon cellulaire (typiquement la biopsie) est établie sous la forme d'une lignée cellulaire amplifiable sans agent de transformation virale ou chimique suivant une procédure ancillaire et bien connue des laboratoires de culture, comme le souligne la publication d'EIkin M. et al. « The radiobiology of cultured mammalian cells », Gordon and Breach (1967). Dès que le nombre de cellules est suffisant (1 semaine - 3 semaines), les premières expériences sont réalisées en utilisant le procédé selon l'invention. Les cellules sont ensemencées sur lamelles de verre dans des boîtes de Pétri. Une partie de ces lamelles sont irradiées sur un irradiateur médical suivant une dosimétrie certifiée avec une dose absorbée D (par exemple 2 Gy). Une autre partie n'est pas irradié ; elle repésente l'état spontané (dose absorbée 0 Gy).

L'irradiation peut être effectuée par exemple avec un accélérateur médical qui délivre des photons de 6 MV avec un débit de dose absorbée de 3 Gy min ^"1 . Après l'irradiation et pour subir les temps de réparation mentionnés ci-dessous, les cellules restent dans l'incubateur de culture à 37°C.

Pour les cellules irradiées, on acquiert des caractéristiques correpondant à l'état radio- induit après plusieurs temps de réparation (temps de réparation post-irradiation). On acquiert de préférence au moins deux et encore plus préférentiellement au moins trois points, à savoir : t1 , t2, t3 et t4. Lesdites caractéristiques sont représentées par les foci correspondant au marqueur pH2AX.

Les cellules sur lamelles de verre sont ensuite fixées, lysées et hybridées. La procédure suivante, connue en tant que telle (voir la publication citée de Bodgi et al.), peut être utilisée : les cellules ont été fixées dans 3% paraformaldéhyde et 2% sucrose pendant 15 minutes à température ambiante et perméabilisées dans 20 mM solution tampon HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1 -pipérazine éthane sulfonique) à pH 7,4, 50 mM NaCI, 3 mM MgCI ₂ , 300 mM sucrose, 0,5% Triton X-100 (un surfactant non-ionique de formule i-Oct- C ₆ H4-(OCH2CH ₂ )xOH avec x= 9-10, CAS N° 9002-93-1 , fourni par Sigma Aldrich) pendant 3 minutes. Puis les lamelles de couverture ont été lavées dans du tampon phosphate salin (connu sous le sigle PBS) avant coloration immunologique. L'incubation a eu lieu pendant 40 min à 37°C dans du PBS additioné de 2% d'albumine de sérum bovin (connu sous le sigle BSA ou fraction V, fourni par Sigma Aldrich) et a été suivie par un lavage au PBS. Les anticorps primaires anti-pH2AX ont été utilisés à une concentration de 1 :800, les autres anticorps primaires à 1 :100. Les incubations avec des anticorps secondaires FITC anti-souri ou TRITC anti-lapin (1 :100, fournis par Sigma Aldrich) ont été effectuées à 37°C dans du BSA à 2% pendant 20 minutes. On a traité des lamelles de verre avec du Vectashield™ contenant du DAPI (4,6-Diamidino-2-phénylindole) pour marquer le noyau. La coloration avec du DAPI pemet aussi, de manière indirecte, la détermination du nombre de cellules en phase Gi (noyaux avec coloration DAPI homogène), en phase S (noyaux avec de nombreux foci pH2AX), en phase G ₂ (noyaux avec coloration DAPI hétérogène) et métaphases (chromosomes visibles).

L'acquisition des résultats est effectuée à partir de ces lamelles sur microscope à immunofluorescence (modèle Olympus par exemple). La lecture peut être directe (typiquement par comptage des foci sur au moins 50 cellules en G ₀ /Gi pour chaque point) ou par logiciel d'analyse d'image dédié, ou encore sur un microscope automatisé ; de préférence les méthodes par logiciel ou microscope automatisé sont calibrées avec des déterminations manuelles.

Afin d'obtenir des résultats d'une fiabilité statistique suffisante pour servir comme base d'un diagnostic, au moins 3 séries d'expériences (irradiation) indépendantes sont effectuées et la moyenne de chacun des nombres de foci pour les temps définis est calculée.

2. Détermination des paramètres biologiques et cliniques

2.1 Généralités et marqueurs utilisés

L'invention est basée entre autres sur l'utilisation de données acquises pour le marqueur pH2AX sur des cellules non-irradiées (état spontané) et irradiées (état radioinduit). La méthode est basée sur l'étude cinétique du marquage par ce marqueur en fonction de la durée de réparation : on marque les échantillons après un laps de temps déterminé à compter de l'arrêt de l'irradiation, et on étudie leur immunofluorescence. On peut mesurer les courbes cinétiques complètes, par exemple représentées par 5 points se situant avantageusement à tO, t1 (de préférence 10 minutes), t2 (de préférence 1 h), t3 (de préférence 4h) et t4 (de préférence 24h), sachant que tO correspond à l'état avant irradiation (état spontané). Il est avantageux d'y associer les données acquises avec deux autres marqueur, à savoir pATM et MRE1 1.

Mais la demanderesse s'est rendu compte que certains points (correspondant à certains temps de réparation) sont plus importants que d'autres, et que certains points ne sont pas prédictifs. Grâce à la sélection judicieuse des paramètres déterminés à des temps donnés, on peut ainsi diminiuer le nombre de mesures et donc diminuer le coût global du diagnostic, sans diminuer le pouvoir prédictif de la méthode. C'est cette méthode simplifiée qui constitue la base de la méthode prédictive selon l'invention.

Les moyennes de chaque point et chaque dose avec chaque marqueurs sont calculées avec les erreurs écart-types de la moyenne (SEM) vu que l'échantillonnage est n=3 (pas d'écart-type gaussien de type standard error SE).

(i) pH2AX désigne les formes phosphorylées en sérine 439 du variant X de l'histone H2AX qui marque, selon les constatations de la demanderesse, le nombre de cassures double-brin de l'ADN (CDB) qui sont reconnues par le mode de réparation majoritaire et fidèle, la suture. Le marqueur pH2AX est essentiellement nucléaire sous forme uniquement de foci nucléaire et seuls le nombre et la taille des foci seront analysés. (ii) pATM désigne les formes phosphorylées en sérine 1981 de la protéine kinase ATM. Selon les constatations de la demanderesse, ATM passe du cytoplasme au noyau après irradiation en conditions normales (statut radiorésistant). Les formes pATM se concentrent principalement dans le cytoplasme puis marquent des sites de CDB. Le marqueur pATM se distingue par une localisation qui peut être cytoplasmique homogène (pas de foci cytoplasmique) sans foci nucléaire, uniquement nucléaire sous forme uniquement de foci nucléaires (pas de localisation nucléaire homogène), soit cytoplasmique et foci nucléaire.

(iii) MRE1 1 est une endonucléase qui casse l'ADN. Selon les constatations de la demanderesse, MRE1 1 marque les CDB mal réparées quand le processus de réparation est finalisé. Le marqueur MRE1 1 peut être soit cytoplasmique sans foci, soit cytoplasmique et nucléaire sans foci, soit cytoplasmique et nucléaire avec foci.

La contrecoloration au DAPI (un marqueur d'ADN connu de l'homme du métier) permet de localiser le noyau pour situer la localisation cytoplasmique ou nucléaire (cette répartition étant modifiée pour MRE1 1 et pATM sous l'influence de la radiation ionisante), pour quantifier les micronoyaux, les corps apoptotiques et la taille des noyaux qui sont des marqueurs cellulaires complémentaires aux données sur les foci.

2.2 Paramètres biologiques

On définit et détermine comme indiqué :

- N _P H2Ax(t), NpATM(t), N _M REn(t) les nombres moyens de foci nucléaires obtenus avec les marqueurs pH2AX, pATM, et MRE1 1 aux temps d'observations tO (non irradié) ou t1 , t2, t3, t4 après irradiation (dose absorbée: 2 Gy), sachant que la détermination du paramètre N _pH 2Ax(t) est obligatoire dans le cadre de la méthode selon l'invention, alors que celle des autres paramètres N _pA TM(t) et N _M REn(t) est facultative mais avantageuse ;

- le nombre de micronoyaux observés spontanément (à t = tO, i.e. sans irradiation) ou à t = t4 après irradiation avec une dose absorbée de 2 Gy pour 100 cellules (en %).

2.3 Evaluation prédictive

Elle vise la prédiction de paramètres cliniques ou radiothérapiques à partir des données biologiques mesurées. Il s'agit d'une analyse quantitative directement issue de la valeur mathématique des scores ou de formules mathématiques reliant les scores ; l'analyse concerne la dose totale à ne pas dépasser pour éviter une réaction potentiellement létale (critère appelé DTNPD) applicable à un patient qui va subir ou qui est en train de subir une radiothérapie : La dose totale à ne pas dépasser (DTNPD), exprimée en Gray (Gy), est un paramètre important pour le radiothérapeute, qui permet de prédire quelle dose maximale un patient donné peut absorber sans subir une réaction potentiellement létale ; ce paramètre permet également d'écarter de la radiothérapie les patients qui présentent une radiosensibilité particulièrement forte.

Selon l'invention, on peut déterminer la DTNPD selon la formule

DTNPD = 60/N _pH 2Ax(t4) si N _pH2 Ax(tO) < 3,

ou selon la formule

DTNPD = 60/[N _pH 2Ax(t4) + N _pH2 Ax(tO)] si N _pH2 Ax(tO) > 3,

Dans une variante du procédé selon l'invention on détermine sur ledit échantillon cellulaire également le nombre moyen de micronoyaux observés aux temps t pour 100 cellules [en %] (ce nombre moyen étant appelé N _M N(t)), les temps t étant au moins tO (non irradié) et t4 après irradiation avec une dose absorbée D, on utilise le paramètre N _M N(t4) dans la détermination de la DTNPD. Toutefois, l'incertitude statistique de la mesure expérimentales des micronoyaux étant plus grande que celle du nombre de foci nucléaires observés par immunofluorescence, on préfère utiliser les valeurs prédictives issues de la mesure des foci plutôt que de celle des micronoyaux.

On détermine alors la DTNPD selon la formule

DTNPD = 60/[0.4 x N _MN (t4)] si N _pH2 Ax(t0) < 3, ou selon la formule

DTNPD = 60/[2 + (0.4 x N _MN (t4))]

Sur la base de cette analyse quantitative un diagnostic plus qualitatif peut ensuite être effectué ; il sera influencé par l'analyse quantitative mais tiendra compte d'éventuels éléments cliniques portés à la connaissance du praticien. La corrélation existante entre la DTNPD et le nombre de foci pH2AX et le nombre de micronoyaux obtenus après 24 h d'irradiation sous 2 Gy, en fonction du nombre de foci pH2AX à l'état spontané a été validée par l'ensemble des données rétrospectives collectées sur des patients irradiés hyper-radiosensibles mutés dans le gène ATM qui ont succombé à 1 ou 2 sessions de radiothérapie dans les années 1970. Les cas de décès post-irradiation (grade de sévérité 5 selon la classification CTCAE) ont été décrits dans la littérature depuis les années 1970 jusqu'à nos jours et correspondent systématiquement, soit à des cas d'ataxie telangiectasique, soit au cas d'un patient atteint par une mutation de la ligase 4 (voir l'article de A. Joubert et al, « DNA double-strand break repair defects in syndromes associated with acute radiation response : At least two différent assays to predict intrinsic radiosensitivity ? », paru dans International Journal of Radiation Biology, vol. 84(2), p107-125 (2008)). Sur la base de ces données rétrospectives et connaissant la dose totale cumulée lors de ces sessions de radiothérapie, le parallèle avec le nombre de CDB non réparées correspondant a pu être fait. En effet, le nombre de cassures double-brin non réparées a été mesuré chez un grand nombre de lignées ataxiques et du cas unique de mutation de LIG4 (lignée cellulaire 180BR). Ces lignées montrent systématiquement un taux de cassures non réparées dépassant le seuil de létalité après une dose. Les valeurs des lignées cellulaires de patients AT et 180BR présentées dans le tableau 2 contiennent les preuves de la détermination du seuil à partir duquel le nombre de cassures non réparées est létal pour le patient. Pour ces cas particuliers, le grade CTCAE correspondant est 5 (=décès). La DTNPD peut ainsi être défini comme étant la dose cumulée totale permettant d'atteindre ce fameux nombre de CDB non réparées. Dans une autre variante du procédé selon l'invention, on détermnie de prime abord le groupe de radiosensibilité sur ledit échantillon cellulaire.

La définition des groupes de radiosensibilité (GROUPE) aide le médecin à déterminer à partir des scores selon l'invention et du tableau clinique du patient des analogies avec des syndromes génétiques connus. Ces groupes ont été définis dans la publication de Joubert et al qui a déjà été citée.

Selon l'invention, on considère que :

si Np _A TM(t1 ) > Np _A TM(t2) et

si Np _A TM(t1 ) > 30 et

si A < 10 et

si B < 5 et

si C < 2

sachant que :

C = N _pH 2Ax(tO) + N _MN (t0) ;

B = % de gros noyaux (supérieurs à 150 μηι ² ) à tO ;

A = N _M REI I (tO) + nombre de petit foci pH2AX/cellule à tO ;

alors le groupe de radiosensibilité (critère GROUPE) est considéré comme « Groupe I » : ces cellules sont radiorésistantes.

Si (N _pH 2Ax(t4) > 8 ou N _MN (t4) > 24) alors on considère que le groupe de radiosensibilité (critère GROUPE) est considéré comme « Groupe III » : ces cellules sont très radiosensibles.

• Pour toutes les autres conditions, on considère que le critère GROUPE est « Groupe II » : ces cellules montrent une radiosensibilité modérée.

Après avoir déterminer le groupe de radiosensibilité d'un patient, on détermine ensuite la DTNPD selon l'une ou l'autre des variantes présentées précédemment.

En pratique, ces formules sont particulièrement adaptées à la détermination de la DTNPD de patients appartenant au groupe de radiosensibilité de type II (radiosensibilité modérée), les patients radiorésistants (groupe I) pouvant subir le traitement standard et les patients hyper-radiosensibles ne devant être irradiés sous aucun prétexte.

L'invention est illustrée ci-dessous par des exemples qui cependant ne limitent aucunement l'invention. Ces exemples portent sur l'analyse de lignées cellulaires de patients permettant la détermination de la dose totale à ne pas dépasser.

Exemples

1 . Préparation de l'essai

Un échantillon cellulaire de peau d'un patient a été prélevé par biopsie via la méthode de « punch dermatologique » connue de l'homme du métier. L'échantillon cellulaire a ensuite été placé dans du milieu DMEM+20% sérum de veau fetal stérile. L'échantillon cellulaire a ensuite été transféré sans délai dans un laboratoire spécialisé, afin que l'échantillon ne reste pas plus de 38 h à la température ambiante.

Dès réception, l'échantillon cellulaire issu de la biopsie a été établi sous la forme d'une lignée cellulaire amplifiable suivant une procédurebien connue des laboratoires de culture et de l'homme du métier : en utilisant notamment la dispersion trypsique les cellules sont à nouveau diluée dans du milieu renouvelé et ainsi de suite jusqu'à obtention du nombre de cellules souhaité. Après obtention d'un nombre de cellules suffisant, (généralement au bout d'une à 3 semaines), les premières expériences ont été réalisées en utilisant le procédé selon l'invention. Les cellules ont été ensemencées sur lamelles de verre dans des boîtes de Pétri. Une partie de ces lamelles ont été irradiées sur un irradiateur médical suivant une dosimétrie certifiée avec une dose absorbée D (2 Gy). Une autre partie n'a pas été irradiée, cette partie représentant l'état spontané (dose absorbée 0 Gy).

Les cellules sur lamelles de verre ont ensuite été fixées, lysées et hybridées. Les cellules ont été fixées dans 3% paraformaldéhyde et 2% sucrose pendant 15 minutes à température ambiante et perméabilisées dans 20 mM solution tampon HEPES (acide 4- (2-hydroxyéthyl)-1 -pipérazine éthane sulfonique) à pH 7,4, 50 mM NaCI, 3 mM MgCI2, 300 mM sucrose, 0,5% Triton X-100 (un surfactant non-ionique de formule t-Oct-C6H4- (OCH2CH2)xOH avec x= 9-10, CAS N° 9002-93-1 , fourni par Sigma Aldrich) pendant 3 minutes. Puis les lamelles de couverture ont été lavées dans du tampon phosphate salin (connu sous le sigle PBS) avant coloration immunologique. L'incubation a eu lieu pendant 40 min à 37°C dans du PBS additionné de 2% d'albumine de sérum bovin (connu sous le sigle BSA ou fraction V, fourni par Sigma Aldrich) et a été suivie par un lavage au PBS. Les anticorps primaires anti-pH2AX ont été utilisés à une concentration de 1 :800, les autres anticorps primaires à 1 : 100. Les incubations avec des anticorps secondaires FITC anti-souri ou TRITC anti-lapin (1 :100, fournis par Sigma Aldrich) ont été effectuées à 37°C dans du BSA à 2% pendant 20 minutes.

Les lamelles de verre ont ensuite été traitées avec du Vectashield™ contenant du DAPI (4,6-Diamidino-2-phénylindole) pour marquer le noyau. La coloration avec du DAPI a permis de manière indirecte, la détermination du nombre de cellules en phase de quiescence G0/G1 (noyaux avec coloration DAPI homogène), en phase de synthèse S (noyaux avec de nombreux foci pH2AX), en phase de quiescence G2 (noyaux avec coloration DAPI hétérogène) et en phase de mitose M (chromosomes visibles). La contrecoloration au DAPI a permis notamment de localiser le noyau pour situer sa localisation cytoplasmique ou nucléaire, et a permis ainsi de quantifier les micronoyaux présents.

L'acquisition des résultats a été effectuée à partir de ces lamelles sur microscope à immunofluorescence (modèle Olympus). La lecture a été réalisée de manière directe par comptage des foci obtenus avec les différents marqueurs pH2AX, MRE1 1 et pATM sur au moins 50 cellules en G0/G1 pour chaque point et par logiciel d'analyse d'image dédié (imageJ).

2. détermination du nombre de foci pH2AX, MRE1 1 et pATM à l'état spontané et après 10 min (t1 ), 1 h (t2), 4h (t3) et 24h (t4)) de réparation post-irradiation avec une dose absorbée de 2Gy, du nombre de micronovaux N _m (t) observés à l'état spontané et après 24h de temps de réparation après irradiation avec une dose absorbée de 2 Gy pour 100 cellules (en %), du nombre de petit foci pH2AX par cellule à à l'état spontané et du pourcentage de gros noyaux (supérieurs à 150 um ² ) à t0.

Pour les cellules non-irradiées (état spontané, i.e. à tO), on a acquis le nombre moyen de foci pH2AX à l'état spontané, le nombre de petit foci pH2AX par cellule à l'état spontané, le pourcentage de gros noyaux (supérieurs à 150 μηι ² ) à tO et le nombre de micronoyaux observés spontanément via l'analyse de l'immunofluorescence de ces cellules.

Pour les cellules ayant subi l'irradiation, l'irradiation a été effectuée avec un accélérateur médical qui délivre des photons de 6 MV avec un débit de dose absorbée de 3 Gy min ^"1 . Après irradiation avec une dose absorbée de 2 Gy, les cellules ont été conservées dans l'incubateur de culture à 37°C. Pour les cellules irradiées (état radioinduit), les échantillons ont été marqués après un laps de temps déterminé, à savoir : 10 min (t1 ), 1 h (t2), 4h (t3) et 24h (t4) à compter de l'arrêt de l'irradiation, et on a acquis le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec les marqueurs pH2AX, MRE1 1 et pATM à ces différents temps de réparation post-irradiation (10 min (t1 ), 1 h (t2), 4h (t3) et 24h (t4)). Le nombre de micronoyaux N _M N(t) observés après 24h de temps de réparation après irradiation avec une dose absorbée de 2 Gy pour 100 cellules (en %) a aussi été déterminé via l'analyse de l'immunofluorescence de ces échantillons.

Afin d'obtenir des résultats d'une fiabilité statistique suffisante pour servir comme base d'un diagnostic, 3 séries d'irradiations indépendantes ont été effectuées. La moyenne et les erreurs écart-types de la moyenne (SEM) de chacun des nombres de foci à l'état spontané (tO), après 10 min (t1 ), 1 h (t2), 4h (t3) et 24h (t4)) de réparation post-irradiation ont été calculées et dont une partie des mesures est présentée dans le tableau ci-après (cf. tableau 2), et ce, pour différents échantillons cellulaires de peau de patients.

Tableau 2 :

Détermination de la radiosensibilité d'un patient et de la DTNPD en fonction du nombre de foci pH2AX, pATM et MRE1 1 à l'état spontané (tO) et/ou après 10 min (t1 ), 1 h (t2), 4h (t3) et 24h (t4)) de réparation post-irradiation sous 2Gy, du nombre de micronoyaux N _M N(t) observés à l'état spontané et après 24h de temps de réparation après irradiation (t4) avec une dose absorbée de 2 Gy pour 100 cellules (en %), du nombre de petit foci pH2AX par cellule à l'état spontané et du pourcentage de gros noyaux (supérieurs à 150 μηι ² ) à tO et ce, pour différents échantillons cellulaires de peau de patients ( ^* ce patient est radioresistant et peut par conséquent subir un protocole standard de radiothérapie, i.e. recevoir 70 Gy pour le traitement d'un cancer de la prostate, 40 Gy pour le traitement d'un cancer du sein)

2.3 Evaluation prédictive de la dose totale à ne pas dépasser

Ainsi, pour différents échantillons cellulaires de peau de patients (cf. tableau 2), la dose totale à ne pas dépasser par un patient qui va subir ou qui est en train de subir une radiothérapie afin d'éviter une réaction potentiellement létale (critère appelé DTNPD) a été déterminée.

La dose totale à ne pas dépasser (DTNPD), exprimée en Gray (Gy), a été déterminée par les formules suivantes :

DTNPD = 60/N _pH 2Ax(t4) si N _pH2 Ax(tO) < 3,

ou

DTNPD = 60/[N _pH 2Ax(t4) + N _pH2 Ax(tO)] si N _pH2 Ax(tO) > 3,

Selon une autre variante de l'invention, la dose totale à ne pas dépasser (DTNPD), exprimée en Gray (Gy), a aussi été déterminée par les formules suivantes tenant compte du nombre moyen de micronoyaux observés aux temps t pour 100 cellules [en %] :

DTNPD = 60/[0.4 x N _MN (t4)] si N _pH2 Ax(tO) < 3, ou selon la formule

DTNPD = 60/[2 + (0.4 x N _MN (t4))] si N _pH2 Ax(tO) > 3. Les temps tO et t4 correspondent respectivement à l'état spontané, i.e, non irradié et au temps t4 après irradiation avec une dose absorbée D.

Les valeurs quantitatives de la dose totale à ne pas dépasser (DTNPD), exprimée en Gray (Gy) sont indiquées dans le tableau 2.

Les grades de sévérité de 2 à 4 concernent des réactions tissulaires (ex : dermites, rectites, etc). Le grade de sévérité 1 concerne des effets secondaires supportables qui sont souvent confondus, suivant les praticiens avec le grade 0 (absence d'effet).