Die Erfindung bezieht sich auf eine neuartige Zubereitung zur Anwendung bei der therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, insbesondere zur Modulation neurochemischer Prozesse und von Verhalten, wobei in einer Ausgestatlung die Zubereitung mindestens ein DISCl -Fragment in Kombination mit einer immunstimulierenden Substanz aufweist.

Dem DISCl Protein wird aufgrund von genetischen Untersuchungen (Chubb et.al. 2008 "Molecular Psychiatry" 13:36), sowie revers genetischen Untersuchungen an Tiermodellen (Shen et al., 2008, J. Neuroscience 48:10893) eine zentrale Rolle in der Steuerung der Verhaltenskontrolle und mentalen Homöostase zugeschrieben. Unter anderem hatten Tiere, die eine Dysfunktionalität von DISCl modellierten auch Lern- oder Gedächtnisstörungen, sowie Störungen des Sensory gating oder Depressions-ähnliche Symptome (Übersicht bei Shen et al., 2008, J. Neuroscience 48:10893).

DISCl ist ein Protein, dessen Funktion noch nicht abschließend bekannt ist. Es spielt eine Rolle in der neuronalen Entwicklung sowohl bei der Proliferation der neuronalen Vorläuferzellen als auch bei der neuronalen Differenzierung, der neuronalen Migration und der Ausbildung eines funktionalen Dopaminstoffwechsels (Niwa et al., 2010, Neu- ron 65:480). DISCl ist ein Protein, das zytosolisch exprimiert wird und keine typischen Signalsequenzen besitzt, die einen Export in das endoplasmatische Retikulum ermöglichen. Insofern ist nach dem Stand der Wissenschaft nicht zu erwarten, dass es in biolo- gisch-funktionell relevanten Mengen extrazellulär vorhanden ist und sich als z.B. außerhalb der Zelle auftretendes Target verwenden lässt.

Aus der US 2005/0210536 ist bekannt neurologische Störungen an Tiermodellen zu untersuchen, wobei ein Gen-Konstrukt enthaltend das DISCl-Gen ins Hirn der Tiere injiziert wird.

Aus der WO 02/058637 ist bekannt, DISCl als Marker bei klinischen Studien zur Ermittlung der Wirksamkeit von Medikamenten für DISC-korrelierte Erkrankungen einzusetzen.

Die WO 2009/154697 beschreibt ein Verfahren zur Behandlung von neurologischen Störungen, bei dem ein DISCl -Aktivator verabreicht wird. Es kann sich bei dem Aktivator z.B. um DISCl handeln. Allerdings wird in der WO 2009/154697 nicht zwischen monomerem und multimerem DISC unterschieden, die beide unterschiedlich aktivieren, z.T. mit antagonistischen Effekten. Ausserdem wird nicht auf immunogene Effekte, insbesondere von multimerem DISCl eingegangen.

In der Veröffentlichung von Leliveld et.al. - Biochemistry 2009, 48, 7746-7755 - wird die Untersuchung unterschiedlicher DISCl -Fragmente beschrieben. Die DISCl - Fragmente sind in der Veröffentlichung mit Nummern bezeichnet, die die Position der jeweils ersten und letzten Aminosäure des Fragments in der Sequenz des DISCl - Proteins angeben. Diese Bezeichnung von DISCl -Fragmenten wird auch in der vorliegenden Anmeldung verwendet.

In der angesprochenen Veröffentlichung wurde gezeigt, dass ein C-terminales Fragment von DISCl auch in vivo im Zytosol auftritt. In derselben Veröffentlichung wird angenommen, dass noch weitere C-terminale DISCl -Fragmente in vivo vorliegen und eine bislang noch nicht bekannte Rolle bei der Modulation DISCl -abhängiger intrazellulärer Funktionen spielen können. Aber auch aus dieser Veröffentlichung ergibt sich, dass DISC1 -Fragmente im Zytosol und nicht in sekretierter Form vorliegen.

Aufgabe der Erfindung ist, neue Anwendungen für DISC1 oder DISC1 -Fragmente zu schaffen.

Gelöst wird die Aufgabe gemäß Anspruch 1.

Erfindungsgemäss ist vorgesehen, eine DISC1 und/oder mindestens ein DISC1- Fragment enthaltende Zubereitung als Therapeutikum zur Behandlung bzw. Modulation neurochemischer Prozesse im menschlichen oder tierischen Körper oder zur Beeinflussung der Proliferation bzw. Migration von Zellen einzusetzen.

Bevorzugt wird ein multimeres DISC1 -Fragment eingesetzt.

Es wurde überraschend herausgefunden, dass die exogene, subkutane Verabreichung einer Zubereitung, die ein DISC1 -Fragment enthielt, eine Modulation des Verhaltens bei Ratten in Offenfeld-Tests (Open-Field-Tests) und die Inokulation einer Zubereitung, die ein DISCl-Fragement enthielt, ins Hirn einen lindernden Effekt auf das Angstverhalten von Ratten im Hellfeld/Dunkelfeldpräferenztest bewirkte. Diese Effekte waren nicht zu erwarten, da das DISC1 Protein nach dem Stand der Forschung als zytosolisches Protein nicht extrazellulär vorkommen sollte und somit einer direkten Modulation unzugänglich sein sollte. Der Effekt war jedoch DISC1 -abhängig, da in einer DISC1 -freien Kontrolle keine von der gänzlich unbehandelten Kontrolle unterschiedlichen Ergebnisse erzielt wurden (siehe Figur 1, Beispiel la; Figur 4B, Beispiel lb)

Bei Open-Field-Tests handelt es sich um Tierexperimente, in denen Testtiere in oben offene, zumeist helle Behälter mit in der Regel einer Grundfläche von 1 Meter x 1 Meter gesetzt werden. Während des Experiments werden die Bedingungen (Beleuchtung, Temperatur etc.) konstant gehalten. Nachdem eine Ratte bzw. ein Testtier in den Behälter gesetzt wird, werden über eine bestimmte Zeitdauer die Ortsänderungen des Tieres beobachtet und quantifiziert. Den Tests liegt zugrunde, dass Tiere den Aufenthalt auf einer ihnen unbekannten, hell erleuchteten Freifläche möglichst vermeiden wollen. Werden sie dennoch in eine derartige Umgebung gebracht, zeigen sie ein Bewegungsverhalten, das durch Ängstlichkeit, Fluchtbereitschaft und Neugier diktiert wird.

In eine ähnliche Richtung geht der Hellfeld/Dunkelfeldpräferenztest, bei dem Ratten in ein Hellfeld (61 x 38 x 32 cm) gesetzt werden, das mit einem benachbarten Dunkelfeld verbunden ist. Während z.B. 5 Minuten wird die Zeit gemessen, die die Ratte jeweils im Hellfeld oder im Dunkelfeld verbringt.

In einigen Experimenten wurde eine Zubereitung eingesetzt, die aus dem Ratten- DISC1 -Fragment 598-785 und der immunstimulierenden Substanz ABM-ZK besteht (Linaris, Deutschland); ABM-ZK besteht aus 0,5 mg Trehalose Dimycolate (TDM), 0,5 mg Monophosphoryl Lipide A (MPL), 0,5 mg Cell Wall Skeleton (CWS), 2 % Öl (Squalene) und einer nicht näher angegebenen Menge Tween 80.

Es ist davon auszugehen, dass neben dem eingesetzten DISCl -Fragment auch andere DISCl -Fragmente, z.B. DISCl 765-854, 598-854, DISCl 1-854, oder andere als die in der oben zitierten Veröffentlichung angesprochenen Fragmente einen ähnlichen Effekt haben. Denkbar ist ein Einsatz als Einzelprotein bzw. -peptid oder auch als Fusionsprotein.

In einem ersten Experiment konnte gezeigt werden, dass nach Verabreichung des DISCl -Fragmentes an gesunden Ratten diese in Open-Field Tests eine geringere Loko- motion zeigten als eine nicht-behandelte Kontrollgruppe. Daraus lässt sich ableiten, dass das Fragment auf solche Ratten einen beruhigenden Einfluss hat (Figur 1).

Im Gegensatz dazu zeigten Ratten, die vorher durch chronische Verabreichung von D- Amphetamin einer Amphetamin-Sensitivierung unterzogen wurden, nach Verabreichung des DISCl -Fragmentes eine deutliche Lokomotionssteigerung gegenüber einer Amphetamin-sensitivierten Kontrollgruppe, der kein DISCl -Fragment verabreicht wurde (Figur 2). Amphetamin-Sensitivierungen werden in Tierversuchen eingesetzt, um Störungen des neurochemischen Gleichgewichtes hervorzurufen, die denen bei neuropsychiatrischen Erkrankungen mit schizophrenietypischen Symptomen entsprechen.

In der Regel führt eine Amphetamin-Sensitivierung bei z.B. Ratten in Open-field expe- rimenten dazu, dass diese eine gegenüber nicht sensitivierten Ratten gesteigerte Loko- motion zeigen. Die Tatsache, dass nach Gabe von DISCl -Fragmenten eine weitere Lo- komotionssteigerung zu beobachten war, lässt darauf schließen, dass durch das DISCl - Fragment eine Modulation der gestörten neurochemischen Prozesse erfolgt ist, speziell des Dopaminstoffwechsels, von dem bekannt ist, dass er sich bei einer Amphetaminsensitivierung ändert (Featherstone et al. 2007, Progress in Neuropsychopharmacology & Biological Psychiatry 31 : 1556).

In einem weiteren Experiment (Hellfeld/Dunkelfeldpräferenztest) konnte gezeigt werden, das durch Inokulation des DISCl -Fragments (598-785) ins Hirn ein anxiolytischer Effekt bei Ratten erreicht werden konnte.

Die Experimente deuten darauf hin, dass die Verabreichung von DISCl -Fragmenten immunogene und/oder psychotrope Effekte auslösen kann, die beide z.B. eine Modulation des Angstverhaltens bewirken.

In vom Anmelder durchgeführten Experimenten konnte weiterhin (mittels Elisa) gezeigt werden, dass mit einer Zubereitung aus dem Ratten-DISCl -Fragment 598-785 und der immunstimulierenden Substanz ABM-ZK immunisierte Ratten sämtlich Antikörper gegen DISC gebildet hatten.

In der Regel lassen sich die Verhältnisse von Ratten auf Menschen übertragen, so dass es ohne Weiteres denkbar ist, z.B. aus DISCl -Fragmenten hergestellte Medikamente als Beruhigungsmittel oder bei zur Therapie von neuropsychiatrischen Erkrankungen, insbesondere solchen Erkrankungen, die mit einer Störung des DISCl -Stoffwechsels oder des Dopaminstoffwechsels korreliert sind, einzusetzen. Im Sinne einer DISCl -abhängigen Regulation des Dopaminstoffwechsels, die von der erfindungsgemässen Zubereitung moduliert wird, ist beispielsweise ein Einsatz denkbar bei Schizophrenie, (rekurrente) Depression, bipolarer Störung, Autismus, Suchterkrankungen, Morbus Huntington, Tourette Syndrom, Aufmerksamkeits-Defizit- Hyperaktivitäts-Syndrom, Restless-legs Syndrom, sowie indirekt Synukleinopathien wie Demenz mit Lewykörperchen oder die Parkinson Erkrankung; bei der Parkinson Erkrankung auch z.B. als adjuvante Therapie beim "Dopamine Dysregulation Syndrom". Aufgrund der existierenden Gedächtnisstörungen bei Tiermodellen mit DISCl Mutationen ist die erfindungsgemässe Zubereitung auch bei transienen oder chronischen Gedächtnisstörungen wie des "Mild Cognitive Impairment" (MCI), oder Krankheiten wie der Alzheimer Erkrankung anwendbar.

Ausserdem könnte die erfindungsgemässe Zubereitung zur Behandlung von Nebenwirkungen bestimmter Medikamente oder Substanzen, die den Dopaminstoffwechsel beeiflussen, verwendet werden, indem diese günstig beeinflusst werden, inklusive akute Vergiftungen.

Weiterhin kann die erfindungsgemässe Zubereitung zur Behandlung von chronischen Schmerzzuständen verwendet werden, bei denen der Dopaminstoffwechsel eine Rolle spielt, inklusive aber nicht begrenzt auf Chronic Fatigue Syndrome, Fibromyalgie, "Burning mouth Syndrome".

Dopamin spielt auch bei kognitiven Eigenarten oder Störungen eine Rolle wie der Anhedonie, Störungen der sozialen Interaktion oder insgesamt der "incentive Salience" und die erfindungsgemässe Zubereitung kann daher auch als Kognitions- Verstärker bei nicht-kranken Individuen eingesetzt werden.

Ausserdem ist die erfindungsgemässe Zubereitung zur Behandlung folgender nicht- hirnspezifischer Erkrankungen denkbar, bei denen der periphere Dopaminstoffwechsel eine Rolle spielt wie zum Beispiel kardiovaskuläre Erkrankungen, Arrhythmien, Blut- hochdruck, Übergewicht, Diabetes, Immunregulation, Laktationsstörungen, Ammenorrhoe, Libidoverlust und sexuelle Funktionsstörungen.

Die erfindungsgemässe Zubereitung kann auch die Proliferation und Migration von Zellen beeinflussen, da dies eine Kernfunktion von DISC1 ist. Insofern ist auch an eine Anwendung bei Krebserkrankungen möglich oder eine Anwendung zur Eindämmung der Proliferation von Immunzellen, z.B. bei Autoimmunerkrankungen wie der Multiplen Sklerose.

Die genannten vielfältigen Einflüsse der erfindungsgemässen Zubereitung auf DISO - abhängige Funktionen wie neurochemische Prozesse, Zellproliferation und Migration, lassen erwarten, dass die erfindungsgemässe Zubereitung einen insgesamt lebensverlängernden Einfluss hat, so dass die erfindungsgemässe Zubereitung auch allgemein zur Regeneration eingesetzt werden kann.

Die überraschende Feststellung, dass DISC1 oder DISC1 Fragmente in sekretierter Form vorliegen, lässt vermuten, dass DISC1 als Signalmolekül, ggf. ausgelöst durch unter bestimmte Umständen wie zellulärem Stress, agieren kann und durch noch unbekannte Transportmechanismen unabhängig vom endoplasmatischen Retikulum in den Extrazellularraum abgegeben werden kann und dort dann an spezifische Moleküle oder Rezeptoren bindet. Diese molekularen Mechanismen waren nach dem bisherigen Stand der Wissenschaft nicht zu erwarten, da eine Sekretion von DISC1 oder DISC1 Fragmenten unbekannt war und als unmöglich erachtet wurde, weil DISC1 als ein zytosolisches, dem Zytoskelett assoziiertes Molekül klassifiziert wurde. Insofern begründet die erfindungsgemässe Zubereitung eine neue Lehre.

Die erfindungsgemässe Zubereitung kann zur subcutanen, intramuskulären, intravenösen, intracerebralen, intranasalen oder intraperitonealen Verabreichung formuliert sein. Ausgehend von den weiter unten angegebenen Beispielen, die die subcutane und intracerebrale Verabreichung beschreiben, stellt es für den Fachmann kein Problem dar, auch für die weiteren angegebenen Verabreichungsmöglichkeiten geeignete Formulierungen bereitzustellen. Im Folgenden soll die Erfindung anhand von Beispielen und Figuren näher erläutert werden:

Figur 1 zeigt in einem Balkendiagramm das Lokomotionsverhalten von gesunden

Ratten in einem Open-Field Test, in dem nicht-behandelte Ratten (nur Adjuvant) mit Ratten, denen das DISC 1 -Fragment (zusammen mit Adjuvant) injiziert wurde, verglichen wurden.

Figur 2 zeigt ähnlich wie Fig. 1 den Effekt der (subkutanen) Immunisierung von

DISC 1(598-785) auf das basale Verhalten von Ratten im Offenfeld.

Figur 3 zeigt das unter ähnlichen Bedingungen wie in Figur 1 ermittelte Lokomotionsverhalten von Amphetamin-sensitivierten Ratten.

Figur 4 zeigt ein(e)

A) Fluoreszenzmikroskopie eines Hirnschnitts des Nucleus accumbens einer Ratte, die mit Dylight-markiertem (rot), rekombinantem DISC1 598-785 stereotaktisch inokuliert wurde,

B) Diagramm der Resultate des Hell-Dunkelpräferenztests zwei Wochen nach bilateraler Inokulation von DyLight-markiertem rekombinantem DISC 1(598-785) oder Kontrolle (sham) in den Nucleus accumbens einer Wildtyp Ratte, und

C) Diagramm der Resultate eines Offenfeld (Openfield) Versuchs nach einer einzelnen, intraperitonealen Amphetamininjektion zwei Wochen nach bilateraler Inokulation von DyLight-markiertem rekombinantem DISC 1(598-785) oder Kontrolle (sham) in den Nucleus accumbens einer Wildtyp Ratte.

Figur 5 zeigt Diagramme A und B, die den Effekt von DISC 1 -Immunisierung auf das Verhalten im Hellfeld / Dunkelfeldpräferenztest zeigen (schwarze Balken, Dunkelfeld; weisse Balken, Hellfeld). Figur 6 zeigt einen Western blot von Zellysaten und dem dazugehörenden Überstand, die DISC 1 expremieren und volle Länge DISC1 oder ein DISC1 Fragment in den Überstand sekretieren

Beispiel 1: Untersuchung von Ratten in einem Open-Field Experiment a) Einfluss von DISC1 auf das Lokomotionsverhalten bei gesunden Ratten

Bei diesem Experiment wurde das Verhalten einer Gruppe nicht-behandelter Ratten im Vergleich zu einer anderen Gruppe Ratten untersucht, denen ein D IS Cl -Fragment verabreicht wurde.

Die Verabreichung erfolgte mittels Injektion (subkutan) einer Lösung, die 150 μg des Ratten-DISCl -Fragmentes 598 bis 785 enthielt und in 150 xL Adjuvant ABM-ZK (Linaris, Deutschland; bestehend aus 0,5 mg Trehalose Dimycolate (TDM), 0,5 mg Monophosphoryl Lipide A (MPL), 0,5 mg Cell Wall Skeleton (CWS), 2 % Öl (Squalene) und einer nicht näher angegebenen Menge Tween 80) aufgenommen wurde.

Es erfolgten insgesamt vier Injektionen der gleichen Menge im Abstand von jeweils drei Wochen.

Das Einsetzen der Ratten in die Open-Field Umgebung erfolgte 14 Tage nach der letzten Injektion. Die Ratten wurden über einen Zeitraum von 20 Minuten beobachtet und ihre Bewegung gemessen, indem entweder die gesamte zurückgelegte Distanz gemessen wurde (Beispiel 1) oder das Open-field in neun Teile (Sektoren) unterteilt wurde und die Anzahl der Übertritte von einem Sektor in einen anliegenden gezählt wurde (Beispiel 2). Die beiden Messmethoden sind gleichwertig und erlauben dieselben Aussagen. Pro Gruppe wurden 10 Ratten untersucht.

Die Ergebnisse des Experimentes sind in Fig. 1 zusammengefasst. Das Verhalten nicht-behandelter Ratten (nur Adjuvant) ist in dem linken Balken dargestellt. Der rechte Balken zeigt das Lokomotionsverhalten der Ratten, denen das DISC1- Fragment (zusammen mit dem Adjuvant) injiziert wurde.

Man erkennt, dass die behandelten Ratten eine deutlich geringere Bewegungsneigung zeigen als die nicht-behandelten. Da neuigkeit-induzierte Lokomotion mit dem Dopa- min-System in Verbindung gebracht werden kann, lässt dieser Befund Unterschiede im Dopamin-System der beiden Behandlungsgruppen vermuten

Daraus lässt sich ableiten, dass die periphere Einbringung von DISC1 in den Körper der Ratte einen deutlichen Effekt auf das Verhalten im Sinne einer Verminderung der Bewegung hat. b) Einfluss der (subkutanen) Immunisierung von DISCl(598-785) zusammen mit Adjuvant (ABM-ZK, Linaris, wie beschrieben) auf das basale Verhalten älterer Ratten im Offenfeld

Es wurde wie im Beispiel la der Effekt der (subkutanen) Immunisierung von DISC 1(598-785) zusammen mit Adjuvant (ABM-ZK, Linaris, wie beschrieben), oder nur mit Adjuvant als Kontrolle oder nur Applikation von PBS als weiterer Kontrolle, auf das basale Verhalten im Offenfeld untersucht. Die experimentellen Bedingungen der Offenfeldmessung waren wie in Beispiel la, allerdings waren die immunisierten Ratten diemal ca. ein Jahr alt und es wurde die Zeit bestimmt, die die Ratten sich im Zentrum des Offenfelds nach 15 Minuten aufhalten.

Die Ergebnisse zeigt Fig.2, wobei die Resultate für DISC 1 -immunisierte Ratten (n= 10 pro Gruppe) als schwarzer, die für Kontroll-immunisierte Ratten (nur Adjuvans) als grauer und die für PBS-immunisierten Ratten als weisser Balken wiedergegeben sind. Die Resultate wurden statistisch ausgewertet und als signifikant bewertet (Univariate ANOVA F(2, 13)=3.931 ; p=0.05. Post hoc LSD für 15 min bin: DISC vs. pbs: p=0.041 , DISC vs. adjuvant: p=0.030). Konsistent mit den Ergebnissen des Beispiel la, halten sich die DISC1 -immunisierten Ratten signifikant seltener im Zentrum auf, was wiederum einen Verhaltenseffekt der DISC1 Immunisierung demonstriert. c) Einfluss von DISC1 auf das Lokomotions verhalten Amphetamin- sensitivierter Ratten

Die Durchfuhrung des Experimentes erfolgte im Wesentlichen wie unter a) beschrieben. Der einzige Unterschied war, dass die Ratten zusätzlich vor Durchführung des Experimentes mit Amphetamin sensitiviert wurden. Die Sensitivierung erfolgte 2 Wochen vor dem Einsetzen in die Open-Field Behälter durch intraperitoneale (i.p.) Gabe von 2 mg/kg/Ratte D-Amphetamin täglich für fünf Tage (gelöst in Saline; 1 ml/kg Injektionsvolumen). Nach einem behandlungsfreien Intervall von 2 Wochen wurde dann 24 h nach einer einmaligen Injektion von 0,5 mg/kg/Ratte D-Amphetamin die Open-Field Testung durchgeführt.

Die Ergebnisse sind in dem in Fig. 3 dargestellten Balkendiagramm wiedergegeben. Hier erkennt man, dass die Amphetamin-sensitivierten Ratten ohne DISC1 -Behandlung eine deutlich geringere Bewegungsneigung zeigten als die Ratten, denen DISC1 verabreicht wurde. In einer genaueren Analyse wurde die "Center time" der einzelnen Gruppen bestimmt, d.h. die Zeit die die Ratten in der Mitte der Open Field Box verbringen, und die ein Mass für Angst-induzierte Effekte ist. Diese war für alle Gruppen identisch, so dass ausgeschlossen werden konnte, dass es sich bei der erhöhten Lokomotion nach Immunisierung mit DISC1 (598-785) um eine Angst-induzierte Lokomotion handelt.

Dabei zeigt sich auch, dass das wiederholte Einbringen der erfindungsgemässen Zubereitung keine toxische Wirkung hatte, da über den gesamten Beobachtungszeitraum (ca. 10 Monate) keine Nebenwirkungen in Form neurologischer Symptome, Verhaltenssymptome, Störungen des Grooming- Verhaltens, Gewichtsverlust oder ähnliches beobachtet wurde. Die Anwendung ist somit als sicher zu bezeichnen.

Aus diesen Ergebnissen lässt sich ableiten, dass DISC1 eine Modulation der durch die Amphetamin-Sensitivierung gestörten neurochemischen Prozesse bewirkt. Es ist davon ausgehen, dass sich eine solche Modulation bei der Behandlung DISCl -assoziierter Erkrankungen ausnutzen lässt. Insbesondere bei zum Beispiel Depressionen, die mit einer deutlich abnehmenden Neigung zu Aktivitäten beziehungsweise Bewegungen einhergehen, lässt sich ein positiver Effekt postulieren.

Beispiel 2: Einfluss von exogener DISCl Applikation auf das Angstverhalten bei gesunden Ratten

Wistar Ratten wurde stereotaktisch ca. 5 μg rekombinantes DISCl (598-785) Protein in den Nukleus accumbens (stereotaktische Koordinaten im Kopf-Rahmen (AP: 1.2 mm; ML: ± 0.8 mm; DV: -5.2 mm) inokuliert. Zwei Wochen nach Inokulation wurden der Hellfeld / Dunkelfeldpräferenztest und der Offenfeldversuch zur Messung des Angstinduzierten Verhaltens untersucht. Beim Hellfeld / Dunkelfeldpräferenztest wird die Ratte in ein Hellfeld (61 x 38 x 32 cm) gesetzt, das mit einem benachbarten Dunkelfeld verbunden ist. Während 5 Minuten wird die Zeit gemessen, die die Ratte jeweils im Hellfeld oder im Dunkelfeld verbringt.

Weiterhin wurde im Offenfeldversuch nach einmaliger intrperitonealer Gabe von 0.5 mg / kg Körpergewicht Amphetamin, die Sensitivität auf Amphetamin untersucht. Jeder Untersuchungszeitraum betrug 15 Minuten. Die horizontale Bewegung wird automatisch mit dem TruScan Lichtschrankenmesssystem gemessen (Coulbourn Instruments, Allentown, USA).

Die Ergebnisse sind in den weiter unten kommentierten Fig 4B+C wiedergegeben.

Fig. 4A zeigt eine Fluoreszenzmikroskopie eines Hirnschnitts des Nucleus accumbens einer Ratte, die mit Dylight-markiertem (rot), rekombinantem DISCl 598-785 stereotaktisch inokuliert wurde. Gegenfärbung mit anti-NeuN Antikörper, einem Neuronspezifischen Markerprotein. Das Bild zeigt, dass rekombinantes DISCl Protein ins Zytosol von Neuronen aufgenommen wurde. Balken 20 μι ^η ,

Fig.4 B zeigt ein Diagramm der Resultate des Hell-Dunkelpräferenztests zwei Wochen nach bilateraler Inokulation von DyLight-markiertem rekombinantem DISCl (598-785) oder Kontrolle (sham) in den Nucleus accumbens einer Wildtyp Ratte. Das Diagramm zeigt, dass die Inokulation mit DISCl (598-785) einen anxiolytischen Effekt hat, weil die Aufenthaltspräferenz zum Hellfeld hin verändert wird. F(l , 17)=4.671 ; * p=0.045.(ANOVA).

Fig. 4C zeigt Diagramm der Resultate eines Offenfeld (Openfield) Versuchs nach einer einzelnen, intraperitonealen Amphetamininjektion zwei Wochen nach bilateraler Inokulation von DyLight-markiertem rekombinantem DISCl (598-785) oder Kontrolle (sham) in den Nucleus accumbens einer Wildtyp Ratte. Die Inokulation mit multimerem rekombinantem DISCl führte zu einer erhöhten Amphetaminsensitivität da in diesen Ratten im Vergleich zur Kontrolle eine Hyperaktivität beobachtet wurde. Y-Achse: relative Lokomotion inbezug auf den Ausgangswert vor Amphetamingabe in %. F(l, 17) = 4.5; * p = 0.049 (ANOVA).

Beispiel 3: Untersuchung von mit DISCl /598-785 behandelten Ratten im

Hellfeld / Dunkelfeldpräferenztest

Nach erfolgter Immunisierung mit DISCl /598-785, oder den Kontrollen (nur Adjuvant oder PBS -Phosphatgepufferte Kochsalzlösung-) wurden die Ratten in mit dem Hellfeld / Dunkelfeldpräferenztest zur Messung des Angst-induzierten Verhaltens untersucht. Beim Hellfeld / Dunkelfeldpräferenztest wird die Ratte in ein Hellfeld (61 x 38 x 32 cm) gesetzt, das mit einem benachbarten Dunkelfeld verbunden ist. Während 5 Minuten wird die Zeit gemessen, die die Ratte jeweils im Hellfeld oder im Dunkelfeld verbringt.

Fig. 5 zeigt Diagramme, die den Effekt von DISCl -Immunisierung auf das Verhalten im Hellfeld / Dunkelfeldpräferenztest zeigen (schwarze Balken, Dunkelfeld; weisse Balken, Hellfeld).

A. Es ist zu sehen, dass die DISCl Immunisierung zu einem Wechsel in der relativen Präferenz von Aufenthalt und Aufenthaltsdauer vom Dunkelfeld zum Hellfeld bewirkt.

B. Dieser Effekt (aus A.) wird verdeutlicht wenn aus demselben Experiment die Aufenthaltsdauer im Hellfeld durch die im Dunkelfeld geteilt wird. Beispiel 4: Untersuchungen, die die Sekretion von DISCl zeigen

Eine humane Neuroblastomzelllinie (SHSY-5Y) wurde mit dem volle länge humanes DISCl-Gen (1-854) oder einem C-terminalen humanen DISCl -Fragment, fusioniert an das "greenfluorescent protein" (GFP), dergestalt retroviral transfiziert, dass eine Expression durch Zugabe von Tetryzyklin 1 μg/ml ("tet-on") in das Zellkulturmedium ausgelöst werden kann (retrovirales induzierbares Transfektionssystem pTRE-TIGHT von Clontech/Invitrogen, USA); die Tetrezyklin-induzierte Expression hat gegenübber anderen transienten Expressionssystemen den Vorteil, dass die Zellen durch die Transfektion nicht sterben und so zytosolische Bestandteile bedingt duch Zelltod in den Zellkultur- überstand übergehen. Die Zellen wurden dann für zwei Tage in Serum-freiem Medium mit 1 μ§/ηι1 Tetrazyklin induziert und der gesamte Zellkulturmedium-Überstand wurde schliesslich nach zwei Tagen zunächst abzentrifugiert um ggf. vorhandene tote Zellen abzusondern, mit 7g Ammoniumsulfat/ 10 ml Überstand gefällt und auf einem SDS- PAGE Gel aufgetrennt und im Western blot mit Standardmethoden und dem Antikörper 14F2 gegen humanes DISCl Protein dargestellt. Als Kontrolle wurden auch die Zellysate mit untersucht.

Figur 6 zeigt einen Western blot von Überständen (Spuren 1-4) oder Zelllysaten (Spuren 5-8). Die jeweils geradzahligen Spuren 2, 4, 6 und 8 zeigen Tetrazyklin-induzierte, die nicht-geradzahligen Spuren 1 , 3, 5, 7 nicht induzierte humane SHSY-5Y Zellen. Die Spuren 2 und 6 zeigen volle Läge humanes DISCl protein oder humanes DISCl (598- 854) Fragment (Spuren 4 und 8), C-terminal fusioniert an green-fluorescent protein (GFP).

Es ist zu sehen, dass grosse Mengen DISCl Immunreaktivität im Überstand zu finden sind (vergleiche korrespondierende Spuren "induziert" DISCl volle Länge (VL) oder GFP DISCl (598-854) vs. "nicht induziert"). Da während der schonenden Induktion mit Tetrazyklin keine toten Zellen beobachtet wurden, und die Menge an Immunreaktivität auch nicht durch wenige tote Zellen erklärbar ist, wird gefolgert, dass DISCl überraschenderweise aus den Zellen sekretiert wird.