本发明属于生物产品和生物技术应用领域，具 体涉及将外源物质转入宿主细胞 的方法。

背景技术

在生物技术领域，基因横向转移，是指生物将 遗传物质水平传递给其他细胞而 非垂直传递给其子代的过程，是目前研究外源 基因功能的重要手段，特别是在微生 物水平 (如病毒、 细菌、 真菌、 植物细胞、 动物细胞等)非常常见， 一种细菌往往通 过从其他细菌获得部分遗传物质从而获得新的 性状，例如目前大量使用抗生素之后 导致编码可分解抗生素的基因在不同细菌之间 横向扩散， 从而形成耐药菌。而在实 验室中，则往往利用这种遗传物质可在不同个 体之间进行传播和扩散的性质研究外 源 DNA以及其他生物活性物质的功能。 然而， 包括细菌、 真菌（如酵母） 、 植物细 胞、 动物细胞等在内的细胞通常具有细胞膜， 严格限制外源物质的进入， 因此， 如 何将这些细胞通过一定的技术处理将其改变为 能够接受外源物质的状态即感受态， 是生物工程和生物技术领域的一个重要研究内 容。

目前常用的可促进将外源物质转化宿主细胞的 方法主要有：利用二价金属离子

(如钙离子） 在一定温度条件 （如 42'C ) 下， 会使宿主细胞由于热刺激而导致细 胞膜通透性变大，从而易于摄入外源物质（如 DNA) (梅运军，陈向东，谢志雄等. Ca~

( 2 + ) 对诱导大肠杆菌摄取外源 DNA 的影响. 武汉大学学报： 理学 版， 2012， 58 (4) : 354-358. )，或者采用高压电场促使宿主细胞膜瞬间穿� �等方法 (张 洋， 王志强， 刘斌等. DH10B 菌株高效电转化条件探究. 生物工程学 报， 2007， 23 (2) : 347-351. ) 。 但这些方法均存在操作复杂、 对细胞损伤大、 操作成 本高、 转化效率低等缺点。 如何建立一种快速高效的将外源物质转化（转 入）宿主 细胞的方法是目前生物工程和生物技术领域研 究的重点问题之一。

发明内容

基于以上问题，本发明目的在于提供一种快速 高效的感受态宿主细胞的制备方 法， 以及一种将外源物质转入宿主细胞的方法。

本发明所提供的感受态宿主细胞的制备方法， 包括以下步骤-

1 ) 纯化、 复苏及预处理宿主细胞；

2 ) 真空冷冻干燥技术处理宿主细胞， 得到感受态宿主细胞。

本发明所提供的将外源物质转入宿主细胞的方 法， 进一步包括以下步骤： 3) 制备待转入的外源物质的水溶液；

4) 对步骤 2 ) 得到的感受态宿主细胞进行快速复水而将外源 物质转入宿主细 胞， 并用条件培养基筛选已转化有外源物质的宿主 细胞， 得到外源物质转化菌。

在上述方法中，所述步骤 1 )中的宿主细胞可为任意一种原核或真核宿主� �胞， 如细菌细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞 等。由于细菌（最常用的是大肠杆菌) 和酵母具有遗传背景清楚、 目标基因表达水平高、 表达系统成熟完善、 易于培养、 成本低等优点， 本发明实施例中使用了大肠杆菌和酵母。

所述纯化宿主细胞是指将原宿主细胞在固体培 养基表面划线培养， 得到单克 隆； 复苏宿主细胞是指将纯化的宿主细胞重新培养 一定时间，使其从静止状态重新 进入到生长状态；预处理宿主细胞是指将复苏 的宿主细胞扩大培养至相应浓度。具 体而言， 所述步骤 1 ) 纯化、 复苏及预处理宿主细胞的过程如下-

( 1 ) 纯化宿主细胞： 用接种环挑取原始宿主细胞， 分区划线接种于适用于培 养宿主细胞的固体培养基（LB固体培养基（适� ��大肠杆菌）配方：胰蛋白胨 10g/L， 酵母膏 5 _g /L， NaCl 10g/L, 琼脂粉 15g/L; YPD固体培养基 （适合酵母） 配方： 酵 母膏 10g/L， 蛋白胨 20g/L， 葡萄糖 20g/L, 琼脂粉 20g/L) , 在适宜条件下 （大肠 杆菌 37'C， 12〜16h; 酵母培养 30'C， 48h) 培养， 得到宿主细胞单克隆；

( 2 ) 复苏宿主细胞： 挑取宿主细胞单克隆接种到 5mL适用于宿主细胞的液体 培养基 (LB培养基 (适合大肠杆菌)配方:胰蛋白胨 10 _g /L，酵母膏 5g/L，NaCl 10g/L _; YPD培养基 （适合酵母） 配方： 酵母膏 10g/L， 蛋白胨 20g/L， 葡萄糖 20g/L) 中， 在适宜温度下（大肠杆菌 37'C _; 酵母培养 30'C ) 220rpm复苏过夜（12~ 16小时）；

(3 ) 预处理宿主细胞： 将经复苏的宿主细胞按照体积比 1 : 100的比例接种到 lOOmL新鲜的液体培养基 （LB培养基 （适合大肠杆菌）配方： 胰蛋白胨 10g/L, 酵 母膏 5g/L， NaCl 10g/L; YPD培养基（适合酵母）配方：酵母膏 10g/L，蛋白胨 20g/L， 葡萄糖 20g/L) 中， 在适宜温度下 （大肠杆菌 37'C _; 酵母培养 30Ό ) 220rpm摇菌 至 0D,:0. 6〜1. 0； 吸取 500μ 1菌液分装至 1. 5mL EP管中， _80'C冰箱预冷冻 12〜 24小时以上。

在上述方法中， 所述步骤 2) 中真空冷冻千燥宿主细胞的方法为： 采用市场上 任何一台真空冷冻干燥仪或自行加工的真空冷 冻干燥仪， 将步骤 1 )处理后的宿主 细胞用真空冷冻干燥仪预冷 30〜120分钟， 待温度达到- 54'C并稳定在该温度后， 真空冷冻干燥宿主细胞 12〜24小时或以上。

在上述方法中，所述步骤 3 )中所用的外源物质包括核酸（脱氧核糖核酸 (DNA)、 核糖核酸 ( NA) ) 、 蛋白质、 寡肽、 氨基酸等生物活性物质。 所述外源物质水溶液使用 ddH ₂ 0。 外源物质的用量可根据具体的研究目的可变 化 （例如质粒 DNA的用量不低于 O. Olng: 对于其他待转化的外源物质， 本领域技 术人员可根据参照已公开文献确定外源物质的 用量），配制好的外源物质水溶液在 37°C保温 30〜60分钟。

在上述方法中， 所述步骤 4) 中对感受态宿主细胞进行快速复水的方法为： 将 步骤 2 ) 的感受态宿主细胞迅速加入步骤 3 ) 配制并保温处理的含有外源物质的水 溶液， 轻轻混匀后于 37'C保温 30分钟， 置于适宜温度下（大肠杆菌 37Ό ; 酵母培 养 30°C ) 恒温箱中 220rpm振荡培养 45〜60分钟； 含有外源物质的水溶液的用量 与冷冻干燥前的宿主细胞等体积。

步骤 4 )中筛选用的条件培养基为： LB固体培养基（适合大肠杆菌）， 配方为： 胰蛋白胨 10g/L, 酵母膏 5g/L， NaCl 10g/L, 琼脂粉 15g/L, 终浓度 100- 200 μ g/mL 的适于外源物质的抗生素： YPD固体培养基（适合酵母）， 配方为： 酵母膏 10g/L， 蛋白胨 20g/L， 葡萄糖 20g/L， 琼脂粉 20g/L， 终浓度 100-200 μ g/mL的适于外源物 质的抗生素。抗生素的选择与外源物质种类有 关，本领域技术人员可根据外源物质 参照已公开文献确定。

步骤 4 ) 中筛选感受态宿主细胞的过程为： 将复水的感受态宿主细胞菌液接种 或涂布到所述的条件培养基， 适宜温度下 （大肠杆菌 37'C ; 酵母培养 30'C ) 恒温 培养 12〜16小时后长出单克隆， 即得到已转化有外源物质的宿主细胞即外源物 质 转化菌。

上述方法中制备得到的感受态宿主细胞和外源 物质转化菌也属于本发明内容。 且所述感受态宿主细胞可以在 O-4'C温度下仍保持生物活性， 便于保存和运输， 而 目前本领域的感受态细胞只能在千冰 (-70'C)条件下运输。

本发明利用真空冷冻干燥技术制备感受态宿主 细胞，且可快速高效将外源物质 向该感受态宿主细胞转化（转入），其核心在 于采用真空冷冻干燥技术和复水技术。 本发明首先在真空状态下对宿主细胞进行冷冻 干燥处理获得感受态宿主细胞，然后 将拟转化的外源物质的水溶液加入到感受态宿 主细胞进行复水，将复水后的宿主细 胞置于恒温培养箱中培养后，转移到含有抗性 压力的条件培养基中进行筛选，并可 通过生化指标检测确证转化是否成功。利用本 发明不仅可实现外源核酸快速转化宿 主细胞， 而且可实现外源蛋白质、氨基酸、糖类等生物 活性物质及其它物质快速转 化宿主细胞， 而且该方法具有操作简单、 损伤性小、 成本低等优点。通过本发明的 实施，不仅可以简便快速获得成批量的感受态 宿主细胞（即经冷冻干燥的宿主细胞， 处于容易接受外源 DNA以及其他外源物质进入的状态） ， 可用于后续生物学功能 的研究，还可为外源物质的跨膜转运提供重要 的技术研究手段，进而为外源物质的 功能研究提供关键技术，可显著节约研究成本 ， 因此本发明具有十分广泛的应用前 、。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说 明。

附图说明

图 1为本发明利用真空冷冻干燥技术快速高效地� �外源物质转化宿主细胞的 方法的流程图

图 2A为原核表达载体 pET28b-Tat在 37'C条件下复水转化结果

图 2B为原核表达载体 _P ET28b-Tat在 42'C条件下复水转化结果

图 3为 pET28b-Tat-EGFP在 37'C条件下复水转化后细菌生长曲线检测结果 图 4A为 _P ET28b-Tat-EGFP诱导表达 2小时 SDS-PAGE和免疫印迹技术检测结果 图 4B为 pET28b-Tat- EGFP诱导表达 6小时 SDS-PAGE和免疫印迹技术检测结果 图 5为质粒 _P UC19在 37'C条件下复水转化大肠杆菌 DH5 α感受态结果 图 6为质粒 pUC19在 37°C条件下复水转化毕赤酵母 GS115感受态结果

具体实施方式

鉴于现有的钙离子和高电压等进行基因横向转 移的方法均存在操作复杂、对细 胞损伤大、操作成本高、转化效率低等缺点， 本发明努力探究以得到一种快速高效 的将外源物质转化宿主细胞的方法。

本发明利用真空冷冻干燥技术来实现外源物质 向宿主细胞的转化。

真空冷冻干燥技术是利用升华的原理在真空低 温条件下实现生物组织中固态 水直接升华成气体蒸发的过程， 该过程不仅可以保持生物样品的完整性，而且 可以 保持生物样品的活性（Kang MS, Jang H, Kim MC, Kim MJ, Joh SJ， Kwon JH, Kwon YK: Development of a stabilizer for lyophilization of an attenuated duck viral hepatitis vaccine. Poult Sci 2010, 89(6) :1167-1170; Chen C, Han D， Cai C, Tang X: An overview of liposome lyophilization and its future potential. Control Release 2010, 142 (3) :299- 311. )。 目前， 冷冻干燥技术 已广泛应用于食品工业， 生物学和药学等多个领域中食品、 生物细胞、组织器官及 药物等的干燥和长期保存（Liu JH, Zhou J, Wang DM, Ouyang XL, Xing YC, Lu FQ: [Experimental study on lyophilization of platelets]. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi 2007， 15 (5) : 1098- 1101 ; Matejtschuk P: Lyophilization of proteins. Methods Mol Biol 2007, 368:59-72; Taniwaki L， Mendonca R, Cunha-Junior AS, Faraco Ah, Ribeiro JA, Scott IU, Jorge R: Effect of lyophilization on the in vitro biological activity of bevacizumab. Eye (Lond) 2010)。利用冷冻干燥技术不仅可实现原核生物� ��胞的冷冻干燥及复水复活 (Renoux G: [Lyophilization of Brucella strains. ]. Ann Inst Pasteur (Paris) 1962, 103:290-292),而且可实现真核生物细胞的冷冻干� �及复水复活，如酵母细胞和小 鼠精子细胞等 (Guibert L， Brechot P: [Lyophilization of yeasts; first part. ]. Ann Inst Pasteur (Paris) 1955， 88(6) :750-768; Atkin L， Moses W， Gray PP: The preservation of yeast cultures by lyophilization. J Bacteriol 1949, 57(6) :575-578; Leirner AA, Tattini V, Jr. , Pitombo RN: Prospects in lyophilization of bovine pericardium. Artif Organs 2009, 33(3) :221-229) ₀ 研究人员通过研究发现采用冷冻干燥技术可实 现小鼠脏器组织的室温长期保藏，其 中核酸和蛋白质不随储存时间的延长而降解， 组织冷冻干燥后变得膨松而复水后能 保持结构完整性（Yonghong Wu， Min Wu, Yanchun Zhang, Weiguang Li, Yan Gao, Zhihui Li, Zhaoyan Wang, Gert Lubec, Chenggang Zhang. Lyophilization is suitable for storage and shipment of fresh tissue samples without altering RNA and protein levels stored at room temperature. Amino Acids. 2012, 43(3) :1383-1388)。

真空冷冻干燥技术不仅能保持生物样品的完整 性和活性， 发明人在研究中还 发现： 通过对细菌细胞（例如大肠杆菌）进行冷冻干 燥处理后， 细胞膜将出现一定 数量的孔洞。 此时若将拟转化的外源物质 （例如脱氧核糖核酸 (DNA)、 核糖核酸 (RNA)、 蛋白质、 生物活性物质及其它物质） 的水溶液加入到经真空冷冻干燥处理 后的细菌细胞后，外源物质就能够随着水分一 起快速进入细菌细胞，从而实现了将 外源物质转入细胞的目的。在此基础上， 发明人提出以下机理： 采用冷冻干燥技术 可实现大肠杆菌细胞的冷冻干燥并复水复活； 冷冻干燥后的大肠杆菌变得膨松，膜 孔松散，而复水后膜孔迅速关闭；冷冻干燥后 的大肠杆菌在复水过程中随着膜孔的 关闭可将外源物质快速转化宿主细胞，随后可 通过条件培养基筛选可获得转化有外 源物质的宿主菌。

以下通过实施例进一步阐释。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规 方法， 具体步骤可参见- 《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 （Sambrook, J. , Russell, David W.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 3 ^rd edition, 2001， NY, Cold Spring Harbor ) 。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅 是提供一种实验获取的途径以 达到具体公开的目的， 不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实 上， 本发明所 用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反 法律和道德伦理能够获取的生物材料 都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施 ，给出了详细的实施方式和具体 的操作过程， 实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保 护范围并不限于下述的 实施例。 指标检测 、

本实施例中外源物质以质粒 pET28b- Tat-EGFP 为例， 宿主细胞以大肠杆菌 BL21 (DE3)为例。 参考如图 1所示， 进行以下操作将外源物质转入宿主细胞：

1 ) 纯化、 复苏及预处理大肠杆菌宿主细胞

( 1 )纯化宿主细胞： 用 LB固体培养基（配方：胰蛋白胨 10g/L， 酵母膏 5g/L， NaCl 10g/L,琼脂粉 15g/L)在 37°C下划线培养纯化大肠杆菌宿主细胞 BL21 (DE3)， 得到大肠杆菌宿主细胞单克隆；

( 2 ) 复苏宿主细胞： 挑取大肠杆菌宿主细胞单克隆接种到 5mL LB液体培养 基 (配方: 胰蛋白胨 10g/L， 酵母膏 5g/L， NaCl 10g/L) 中， 37。C、 220rpm复苏 过夜 （12 16小时） ；

( 3) 预处理宿主细胞： 将经复苏的大肠杆菌宿主细胞按照体积比 1 : 100的比 例接种到 lOOmL新鲜的 LB液体培养基（配方与步骤（2)相同） 中， 37'C、 220rpm 摇菌 2〜3小时至 0D ₆ 。。=0. 6〜1. 0， 吸取 50CmL菌液分装至 1. 5mL EP管中， -80Ό冰 箱预冷冻 12〜24小时以上。

2) 真空冷冻干燥大肠杆菌宿主细胞

将真空冷冻干燥仪 (购自北京松源华兴科技发展有限公司）预冷� �温度达到 -54 °C并稳定后， 将步骤 1 ) 预处理后的大肠杆菌宿主细胞从 -80Γ低温冰箱取出并迅 速置于真空冷冻干燥仪中， 安装好盖子后关闭进气阀并打开真空泵， 设置 -54Ό低 温条件， 真空冷冻干燥宿主细胞 12〜24小时或以上， 待干燥后关闭真空泵并取出 经冷冻干燥技术处理的大肠杆菌， 该方法制备的大肠杆菌即为 "感受态大肠杆菌 BL2KDE3) " (具备了接受外源物质转化的能力） ， 可立即使用或 -20Ό保存备用， 或者也可以在 0-4°C条件下保存和运输。

以下考证得到的 "感受态大肠杆菌 BL21 (DE3) "是否具备接受转入外源物质的 能力。 将外源物质转化宿主细胞时， 继续以下步骤：

3) 制备拟转化外源物质的水溶液 首先采用紫外分光光度计测定预转化质粒 pET28b-Tat™EGFP (构建方法： 1.通 过常规 PCR方法扩增出 EGFP的 cDNA片段; 2.限制性内切酶分别酶切目的基因 EGFP、 载体 pET28b-Tat,琼脂糖凝胶电泳回收后使用 T4 DNA连接酶连接。参考文献 (Wu Y， Ren C, Gao Y, Hou B, Chen T, Zhang C. A novel method for promoting heterologous protein expression in Escherichia coli by fusion with the HIV- 1 TAT core domain. Amino Acids. 2010 Aug : 39 (3) : 811- 20)或中国专利文献 201010119397. 8《利用 TAT核心肽段促进外源蛋白可溶性表达的方法及 其专用表达 载体》 的构建过程） 的浓度， 并用 dd 0将其稀释到 lng/ μ ΐ , 分别将 5 μ 1、 10 1、 25 μ 1、 50 μ 1、 100 μ 1质粒 pET28b-Tat-EGFP加入至 500 μ 1 ddH ₂ 0中混匀制成 不同浓度的水溶液， 在 37°C恒温水浴锅中孵育 30〜60分钟。

4) 对上述步骤 2) 得到的经过真空冷冻干燥处理的大肠杆菌宿主 细胞 （ "感 受态大肠杆菌 BL2 DE3) " )进行快速复水， 用条件培养基筛选获得已转化有外源 物质的大肠杆菌宿主细胞：

( 1 )快速复水： 将步骤 2 )得到的 "感受态大肠杆菌 BL21 (DE3) "迅速加入经 37°C保温处理的步骤 3)制备的含有质粒 pET28b-Tat_EGFP的水溶液， 该水溶液与 冷冻干燥前的宿主细胞等体积 （500 μ 1 ) ， 轻轻混匀后于 37Ό (或 42°C )保温 30 分钟， 置于 37°C恒温箱中 220rpm振荡培养 45〜60分钟；

(2) 筛选： 取经过冷冻干燥后复水处理 （以步骤 3) 所列不同质粒浓度的水 溶液） 的大肠杆菌宿主细胞菌液 100 μ 1， 分别涂布到条件培养基即含有卡那霉素 的 LB固体培养基 (配方：胰蛋白胨 10g/L，酵母膏 5g/L， NaCl 10g/L,琼脂粉 15g/L， 终浓度 200 μ g/mL的抗生素卡那霉素）中， 在 37'C下恒温培养 12〜16小时， 挑选 生长出来的单克隆， 得到已转化有外源物质的大肠杆菌宿主细胞， 即 "Tat-EGFP 转化菌" 。

实验过程中通过观察单克隆数量判断感受态大 肠杆菌 BL2KDE3)被外源物质 _P ET28b-Tat-EGFP转化的能力， 结果发现在保温 37'C和 42°C不同的温度条件下， 质粒 pET28b Tat-EGFP对于感受态大肠杆菌 BL21 (DE3)的转化量随着质粒浓度的增 加而增加， 但二者之间没有明显差异， 参见图 2A ( 37'C条件下） 和图 2B (42°C条 件下） 所示， 因此后续直接采用 37°C条件对外源物质进行复水转化。

对 Tat-EGFP转化菌的验证继续以下操作：

5)对己转化有外源物质的大肠杆菌宿主细胞 Tat-EGFP转化菌进行生化指标检

( 1 ) 对 Tat-EGFP转化菌进行生长曲线的动态监测 将上述 300 μ l"Tat-EGFP转化菌"按照体积比 1： 10的比例采用含有卡那霉素 (Kana ⁺ , 终浓度 200 μ g/mL)的 LB液体培养基稀释并接种到微生物生长曲线监� ��微 孔板 (350 μ 1/孔）， 实时动态监测微生物的生长状态。

监测结果如图 3所示。图 3第一列为正常菌，没有使用 pET28b-Tat- EGFP质粒 进行转化， 因此在条件培养基筛选时没有任何克隆生长出 来；第二列到第四列均为 三组平行重复对照， 均为含有 pET28b-Tat-EGFP的质粒的 "Tat-EGFP转化菌" ， 全部生长出了单克隆， 说明本发明的感受态细胞制备方法是成功的。 可见： 己转化 有外源物质的大肠杆菌 （ "Tat EGFP转化菌" ） 可在 Kana抗性的培养基中生长， 且其生长曲线良好；对于生长在固体培养基表 面的菌落观察表明， 已转化有外源物 质的大肠杆菌菌落形态正常。因此表明步骤 2 )得到的 "感受态大肠杆菌 BL21 (DE3) " (真空冷冻干燥获得的大肠杆菌宿主细胞）遗� �性状没有发生改变，可以作为外源 物质转化使用的宿主细胞。

( 2 ) 对已转化有外源物质的大肠杆菌的外源蛋白表 达检测

为进一步确认已转化有外源物质的大肠杆菌中 外源蛋白是否可以按照预期设 想正常表达， 本步检测是将 "Tat-EGFP 转化菌"接种到 5raL 含有 Kana (终浓度 200 ₈ /11^)的1^液体培养基并复苏过夜（12〜16小� ��）； 次日，按照体积比 1 : 100 的比例接种到 150mL含有 Kana (终浓度 200 μ g/mL)的 LB液体培养基， 37'C、220rpm 摇菌至 0D _M 。=0. 6-1. 0; 然后加入诱导剂 IPTG (终浓度 ImM)并于 30' (：、 220rpm诱导 表达 6个小时， 分别于 0小时、 2小时、 4小时和 6小时取样， 制备蛋白样品， 采 用 15% SDS-PAGE和免疫印迹技术检测外源蛋白 （TAT-EGFP) 表达情况。

2小时和 6小时检测结果见图 4A、 图 4B， 从中可以看出， 由外源质粒编码的 TAT-EGFP蛋白 （如图中箭头所示） 获得表达， 表明 "感受态大肠杆菌 BL21 (DE3) " 可以正常表达含有 TAT-EGFP基因的外源质粒 pET28b-Tat-EGFP所编码的 TAT-EGFP 蛋白。 可见不仅外源物质 （此检测中 TAT-EGFP蛋白的编码基因） 向真空冷冻千燥 制备的大肠杆菌感受态宿主细胞的转入，而且 这些外源物质转入后也获得了理想的 表达 （此检测中以 TAT-EGFP蛋白为例） ， 说明本发明所制备的感受态宿主细胞可 以作为基因表达的宿主细胞。

实施例 2、 利用真空冷冻干燥技术制备 DH5 α感受态细胞并快速转化 pUC19 如图 5所示， 外源物质以质粒 PUC19 (购自 THERMO FISHER, 0. 5 g/ 1 ) 为 例，宿主细胞以大肠杆菌 DH5 a为例。以下步骤与实施例 1相同，除特殊指明之处， 基本相同的表述可相互参照。

1 ) 纯化、 复苏及预处理大肠杆菌宿主细胞 ( 1 )纯化宿主细胞： 用 LB固体培养基（配方：胰蛋白胨 10g/L， 酵母膏 5g/L， NaCl 10g/L, 琼脂粉 15g/L)在 37'C下划线培养纯化大肠杆菌宿主细胞（DH5 a ) , 得到大肠杆菌宿主细胞 DH5 α单克隆；

(2) 复苏宿主细胞： 挑取 DH5 _a 单克隆接种到 5mL LB液体培养基 （配方： 胰 蛋白胨 10g/L， 酵母膏 5g/L， NaCl 10g/L) 中， 37。C、 220rpm复苏过夜 ( 12-16 小时） ；

( 3)预处理宿主细胞：将经复苏的 DH5 a菌液按照 1 : 100的比例接种到 lOOmL 新鲜的 LB液体培养基中， 37。 (：、 220rpm摇菌 3〜4小时至 ODeo。=0. 6〜1. 0， 分装入 50ml离心管， 放置冰上冷却 lOmin, 4000rpm 4'C离心 10分钟。 每 50ml菌液收集 的菌体重悬于 2ml冻干保护剂中， 冻干保护剂配方如下： 按重量含明胶 1%， 甘露 醇 7%， 其余为水。 按 200 μ 1每管分装到 1. 5mlEP管中， -80°C冰箱预冷冻 12〜24 小时以上。

2) 真空冷冻干燥大肠杆菌宿主细胞

将真空冷冻干燥仪 (购自北京松源华兴科技发展有限公司）预冷� �温度达到 -54 °C并稳定后， 将大肠杆菌宿主细胞从 -80'C低温冰箱取出迅速置于真空冷冻干燥仪 中， 安装好盖子后关闭进气阀并打开真空泵， 设置 -54'C低温条件， 真空冷冻干燥 宿主细胞 12〜24小时或以上， 待干燥后关闭真空泵并取出经冷冻干燥技术处 理的 大肠杆菌， 该方法制备的大肠杆菌即为 "感受态大肠杆菌 DH5 a " ， 具备了接受外 源物质转化的能力， 可立即使用或 -20°C保存备用， 或者也可以在 0-4 °C条件下保 存和运输。

3 ) 制备拟转化外源物质的水溶液

将预转化质粒 PUC19 (购自 THERMO FISHER, 0, 5 μ g/ μ 1 ) 加入至 500 1 LB 液体培养基 （配方： 胰蛋白胨 10g/L， 酵母膏 5g/L， NaCl 10g/L) 中混勾制成浓度 为 2pg/ w 1的溶液， 在 37°C恒温水浴锅中保温 30〜60分钟。

4 ) 对感受态大肠杆菌 DH5 a进行快速复水， 用条件培养基筛选获得已转化有 外源物质的大肠杆菌宿主细胞：

( 1 ) 对经真空冷冻干燥的大肠杆菌宿主细胞进行快 速复水： 将感受态大肠杆 菌 DH5 a迅速加入经 37°C保温处理的含有质粒 pUC19的 LB液体培养基， 轻轻混匀 后置于 37Ό恒温箱中 220rpm振荡培养 45~60分钟；

(2 ) 用条件培养基压力筛选获得已转化有外源物质 的大肠杆菌宿主细胞： 取 经过冷冻千燥后复水处理的感受态细胞 DH5 a菌液 100 μ 1,涂布到条件培养基即含 有氨苄青霉素的 LB固体培养基 (配方：胰蛋白胨 10g/L，酵母膏 5g/L， NaCl 10g/L, 琼脂粉 15g/L，终浓度 100μ g/mL的抗生素氨苄青霉素）中，在 37'C下恒温培养 12〜 16小时后长出单克隆， 得到已转化有外源物质的宿主细胞， 即 " pUC19转化菌" ， 参见图 5显示， 表明质粒 pUC19成功转入到 "感受态大肠杆菌 DH5 α " 中。

实施例 3、利用真空冷冻干燥技术制备毕赤酵母 GS115感受态细胞并快速转化 PUC19

外源物质以质粒 PUC19 (购自 THERMO FISHER, 0.5μ _ε /μ 1) 为例， 宿主细胞 以毕赤酵母 GS115为例。 以下步骤与实施例 1和实施例 2相同， 除特殊指明之处， 基本相同的表述可相互参照。

1) 纯化、 复苏及预处理大肠杆菌宿主细胞

(1)纯化宿主细胞： 用 YPD固体培养基（配方：酵母膏 10g/L， 蛋白胨 20g/L， 葡萄糖 20g/L， 琼脂粉 20g/L) 在 30Ό下划线培养纯化毕赤酵母 GS115两天， 得到 酵母细胞单克隆；

(2) 复苏宿主细胞： 挑取 GS115单克隆接种到 5mL YPD液体培养基 （配方： 酵母膏 10g/L， 蛋白胨 20g/L， 葡萄糖 20g/L) 中， 30。C、 220rpm复苏过夜 (12-16 小时） ；

(3) 预处理宿主细胞： 将经复苏的 GS115菌液按照体积比 1:100的比例接种 到 lOOmL新鲜的 YPD液体培养基中， 30'C、 220rpm摇菌 24〜28小时至 ODe^O.8〜 1.0， 吸取 50(^L菌液分装至 1.5mL EP管中， - 80°C冰箱预冷冻 12〜24小时以上。

2) 真空冷冻干燥毕赤酵母 GS115宿主细胞

将真空冷冻干燥仪 (购自北京松源华兴科技发展有限公司）预冷� �温度达到- 54 'C并稳定后， 将大肠杆菌宿主细胞从 -80Ό低温冰箱取出迅速置于真空冷冻干燥仪 中， 安装好盖子后关闭进气阀并打开真空泵， 设置 -54°C低温条件， 真空冷冻干燥 宿主细胞 12〜24小时或以上， 待干燥后关闭真空泵并取出经冷冻干燥技术处 理的 毕赤酵母 GS115, 该方法制备的毕赤酵母 GS115即为 "感受态酵母" ， 具备了接受 外源物质转化的能力， 可立即使用或 -20'C保存备用， 或者也可以在 0- 4°C条件下 保存和运输。

3) 制备拟转化外源物质的水溶液

将预转化质粒 UC19 (购自 THERMO FISHER, .5n g/n 1)加入至 500 μ 1 dd¾0 中混勾制成浓度为 lng/μ 1的水溶液， 在 37'C恒温水浴锅中保温 30〜60分钟。

4)对经过真空冷冻干燥处理的毕赤酵母 GS115感受态细胞（ "感受态酵母"） 进行快速复水， 用条件培养基筛选获得己转化有外源物质的酵 母宿主细胞：

(1) 对经真空冷冻干燥的酵母宿主细胞进行快速复 水： 将酵母宿主细胞迅速 加入经 37'C保温处理的含有质粒 pUC19的（与冷冻干燥前的宿主细胞等体积)水溶 液，轻轻混匀后于 37°C保温 30分钟，然后置于 30'C恒温箱中 220rpm振荡培养 1〜 4小时；

( 2 ) 用条件培养基筛选获得已转化有外源物质的酵 母宿主细胞： 取经过冷冻 干燥后复水处理的酵母宿主细胞菌液 100 μ 1， 分别涂布到条件培养基即含有氨苄 青霉素的 YPD固体培养基 （配方为： 酵母膏 10g/L， 蛋白胨 20g/L， 葡萄糖 20g/L， 琼脂粉 20g/L，终浓度 100 μ g/mL的抗生素氨苄青霉素）中，在 30Ό下恒温培养 2〜 3天后长出单克隆， 得到已转化有外源物质的宿主细胞， 即 " _P UC19酵母转化菌"。 参见图 6显示， 表明质粒 pUC19成功转入"感受态酵母"中， 制备得到了酵母感受 态细胞并实现外源物质 PUC19的转入。

工业应用性

本发明利用真空冷冻干燥技术制备感受态宿主 细胞，且可快速高效将核酸、蛋 白质、 氨基酸、 糖类等外源物质转入该感受态宿主细胞， 方法具有操作简单、损伤 性小、成本低等优点。通过本发明的实施， 不仅可以简便快速获得成批量的感受态 宿主细胞， 以用于后续生物学功能的研究，还可为外源物 质的跨膜转运提供重要的 技术手段， 本发明有工业应用前景。