[0001] 本发明属于细胞生物学技术领域， 尤其涉及一种人母乳干细胞的制备方法及其 应用。

背景技术

[0002] 干细胞是指那些具有自我复制和多向分化能力 的细胞， 它们可以不断地自我更 新， 并在特定条件下分化成为一种或多种构成人体 组织或器官的细胞。 利用干 细胞移植受损组织， 可使组织恢复再生能力， 修复其功能， 干细胞替代疗法为 治疗各种疾病和组织损伤带来了巨大的希望。 干细胞存在于胚胎、 成熟机体组 织、 血液中， 近年来研究发现， 人母乳中也含有干细胞成分， 母乳干细胞表现 出类似人胚胎干细胞的多向分化潜能， 可表达多种多能性基因， 如 OCT4、 SOX 2、 NANOG等， 这些基因对于维持细胞未分化状态和多能性有 着非常重要的作 用。 人母乳干细胞具有很多天然优势： 可通过无创方式获取， 哺乳期女性均可 提供， 来源丰富。 因此， 人母乳干细胞可作为细胞替代疗法稳定且丰富 的来源

[0003] 目前关于人母乳干细胞制备方法的文献资料较 少， 尚未有公知的获得认可的标 准化制备方法。 根据目前的文献报道， 人母乳干细胞的培养多采用添加 10%-20 <¾胎牛血清的 DMEM或 RPMI培养基， 在此基础上， 有些研究学者添加了胰岛素 、 表皮生长因子等物质， 有些研究学者添加了饲养层细胞。 然而， 胰岛素、 表 皮生长因子等物质对于维持人母乳干细胞的未 分化状态没有起到非常好的效果 ， 饲养层细胞培养较前者而言可以稍好地维持人 母乳干细胞的未分化状态， 但 是实验步骤较为繁琐且需要花费较多的吋间。 因此， 急需寻找一种操作简便且 能较好地维持人母乳干细胞未分化状态的制备 方法。

技术问题

[0004] 在此处键入技术问题描述段落。

问题的解决方案 技术解决方案

[0005] 针对以上技术问题， 本发明公幵了一种人母乳干细胞的制备方法及 其应用， 操 作简便， 无需采用饲养层细胞共培养。

[0006] 对此， 本发明采用的技术方案为：

[0007] 一种人母乳干细胞的制备方法， 其包括以下步骤：

[0008] 步骤 S1 : 采集母乳；

[0009] 步骤 S2: 分离人母乳细胞， 得到纯化后的母乳细胞悬液；

[0010] 步骤 S3: 将纯化后的母乳细胞悬液转移到包被体积百分 比为 0.01-0.05%的明胶 的培养板中， 置于 CO ₂ 培养箱中培养， 每天换液 1次， 第 6天分离单个细胞克隆并 接种到新的培养板中， 促进克隆形成； 优选的， 所述培养板为市售的超低粘附 培养板；

[0011] 步骤 S4: 当细胞融合至 80% (细胞融合数量的百分数） 以上吋， 添加胰蛋白酶 ， 胰蛋白酶覆盖细胞表面即可， 37°C消化 5min， 用 2倍体积含 10% (体积百分比 ) 胎牛血清的 DMEM/F12培养基终止消化， lOOOrpm离心 10min， 收集细胞沉淀 ， 用 PBS缓冲液洗涤 1次， lOOOrpm离心 10min， 用新鲜的细胞培养液重悬细胞， 按 1:3传代。

[0012] 作为本发明的进一步改进， 步骤 S4中， 所述细胞培养液的成分为： 含 10% (体 积百分比， 下同） KOSR (knockout serum replacement, 血清替代物） 、 10 -20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、 10-20 ng/mL表皮细胞生长因子、 100-300 U/mL白血病抑制因子、 含有 0.1-0.5 mol/mL视黄醇的 DMEM/F12培养基。

[0013] 作为本发明的进一步改进， 所述细胞培养液的成分为： 含 10%KOSR、 12-15ng/ mL碱性成纤维细胞生长因子、 12-18 ng/mL表皮细胞生长因子、 150-250 U/mL白 血病抑制因子、 含有 0.2-0.4 mol/mL视黄醇的 DMEM/F12培养基。

[0014] 作为本发明的进一步改进， 所述细胞培养液的成分为： 含 10%KOSR、 10ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子、 20 ng/mL表皮细胞生长因子、 100 U/mL白血病抑制 因子、 含有 0.5 mol/mL视黄醇的 DMEM/F12培养基。

[0015] 作为本发明的进一步改进， 步骤 S1中， 在采集母乳之前， 检测供者 ABO/Rh血 型、 HLA分型及梅毒、 HIV、 HBV、 HCV， 然后在无菌条件下采集供者的母乳 5- 200mL。

[0016] 作为本发明的进一步改进， 步骤 S2中， 所述分离人母乳细胞包括： 将母乳和等 体积的 PBS缓冲液混合， 4°C下 1500-2000rpm下进行离心分离， 吸除脂肪层和脱 脂母乳成分。

[0017] 作为本发明的进一步改进， 余下的细胞沉淀用 PBS缓冲液洗涤 3次， 每次 1000-2 OOOrpm离心 5-15min， 用新鲜培养液重悬细胞沉淀， 得到纯化后的母乳细胞悬液 。 其中， 所述新鲜培养液为新鲜配置的培养液， 可以为本领域常用的培养液。 所述新鲜培养液可以为含 10% (体积百分比） 胎牛血清的 DMEM培养基。

[0018] 作为本发明的进一步改进， 所述将母乳和等体积的 PBS缓冲液混合， 4°C下于 20 OOrpm下进行离心分离 20min， 吸除脂肪层和脱脂母乳成分。

[0019] 作为本发明的进一步改进， 余下的细胞沉淀用 PBS缓冲液洗涤 3次， 每次 1500rp m离心 10min， 用新鲜培养液重悬细胞沉淀， 得到纯化后的母乳细胞悬液。 其中 ， 所述新鲜培养液为新鲜配置的培养液， 可以为本领域常用的培养液。 所述新 鲜培养液可以为含 10% (体积百分比） 胎牛血清的 DMEM培养基。

[0020] 作为本发明的进一步改进， 将纯化后的母乳细胞悬液转移到包被 0.01-0.05%明 胶培养板前， 所述明胶培养板提前包被 lh， 并用细胞培养前用 PBS洗涤至少 2次

[0021] 作为本发明的进一步改进， 所述明胶培养板的包被明胶的体积百分比为 0.01%

[0022] 本发明还公幵了一种人母乳干细胞的应用， 所述人母乳干细胞采用如上任意一 项所述的人母乳干细胞的制备方法制备得到， 其应用于细胞替代治疗， 促进人 体组织修复中。

[0023] 与现有技术相比， 本发明的有益效果为：

[0024] 采用本发明的技术方案， 操作简便， 无需采用饲养层细胞共培养， 而且可以更 好的维持人母乳干细胞未分化状态， 且获得的人母乳干细胞数量更多。

发明的有益效果

有益效果

[0025] 在此处键入有益效果描述段落。 对附图的简要说明

附图说明

[0026] 图 1是本发明实施例 1培养第 20天的人母乳干细胞经流式细胞术鉴定的结果� ��

实施该发明的最佳实施例

本发明的最佳实施方式

[0027] 在此处键入本发明的最佳实施方式描述段落。

本发明的实施方式

[0028] 下面结合附图对本发明的较优的实施例作进一 步的详细说明。 应当理解， 以下 所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于限定本发明。

[0029] 实施例 1

[0030] 一种人母乳干细胞的制备方法， 其特征在于， 其包括以下步骤：

[0031] 1.采集母乳

[0032] 人母乳的采集： 采集母乳之前， 检测供者 ABO/Rh血型、 HLA分型及梅毒、 HI V、 HBV、 HCV， 然后在无菌条件下采集供者的母乳 5-200mL， 立即送往实验室 进行人母乳干细胞的制备。

[0033] 2.分离人母乳细胞

[0034] 将母乳和等体积的 PBS缓冲液混合， 4°C下 2000rpm离心 20min， 吸除脂肪层和 脱脂母乳成分， 余下的细胞沉淀用 PBS缓冲液洗涤 3次， 每次 1500rpm离心 lOmin ， 用新鲜的培养液重悬细胞沉淀， 收获纯化后的母乳细胞悬液。

[0035] 3.培养人母乳干细胞

[0036] 将纯化后的母乳细胞悬液转移到包被 0.01%明胶的培养板中， 所述包被 0.01%明 胶的培养板提前包被 lh， 细胞培养前用 PBS洗涤 2次； 然后置于 CO ₂ 培养箱中培 养， 每天换液 1次， 第 6天分离单个细胞克隆并接种到新的超低粘附� �养板中， 促进克隆形成。 当细胞融合至 80%以上吋， 添加适量 0.25%胰蛋白酶， 胰蛋白酶 覆盖细胞表面即可， 37°C消化 5min， 用 2倍体积含 10%胎牛血清的 DMEM/F12培 养基终止消化， lOOOrpm离心 10min， 收集细胞沉淀， 用 PBS缓冲液洗涤 1次， 100 Orpm离心 10min， 用新鲜细胞培养液重悬细胞， 按 1:3传代。

[0037] 所述细胞培养液为含 10%KOSR、 10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、 20 ng/mL表皮细胞生长因子 （EGF) 、 100U/mL白血病抑制因子 (LIF)、 0.5 mol/mL 视黄醇的 DMEM/F12培养基。

[0038] 经流式细胞术鉴定培养第 20天的人母乳干细胞， 如图 1所示， 结果显示 S0X2、

NANOG、 0CT4呈高表达， 阳性比例分别为 72<¾、 70%、 53%。 说明采用本专利 方法培养的人母乳干细胞纯度高。

[0039] 实施例 2

[0040] 在实施例 1的基础上， 所述培养人母乳干细胞的步骤有所不同， 具体如下： [0041] 将纯化后的母乳细胞悬液转移到包被 0.01%明胶的培养板中， 所述包被 0.01%明 胶的培养板提前包被 lh， 细胞培养前用 PBS洗涤 2次， 然后置于 CO ₂ 培养箱中培 养， 每天换液 1次， 第 6天分离单个细胞克隆并接种到新的超低粘附� �养板中， 促进克隆形成。 当细胞融合至 80%以上吋， 添加适量 0.25%胰蛋白酶， 胰蛋白酶 覆盖细胞表面即可， 37°C消化 5min， 用 2倍体积含 10%胎牛血清的 DMEM/F12培 养基终止消化， lOOOrpm离心 10min， 收集细胞沉淀， 用 PBS缓冲液洗涤 1次， 100 Orpm离心 10min， 用新鲜细胞培养液重悬细胞， 按 1:3传代。

[0042] 所述细胞培养液为含 10%KOSR、 20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、 10 ng/mL表皮细胞生长因子 （EGF) 、 300

U/mL白血病抑制因子 (LIF)、 Ο.ΙμιηοΙ/mL视黄醇的 DMEM/F12培养基。

[0043] 经流式细胞术鉴定培养第 20天的人母乳干细胞， 结果显示 S0X2、 NANOG、 O CT4呈高表达， 阳性比例分别为 65%、 66%、 42%。 说明采用本专利方法培养的 人母乳干细胞纯度高。

[0044] 对比例 1

[0045] 本例与实施例的不同在于， 所述培养人母乳干细胞的步骤有所不同， 其采用常 规方法， 具体如下：

[0046] 将纯化后的母乳细胞悬液以 5x10 ⁴ /cm ² 的细胞密度转移到铺有鼠胚胎成纤维细 胞 (MEFs， 接种密度 5x10 4/cm 2)的培养皿中， 置于 CO ₂ 培养箱中培养， 隔天半量 换液 1次， 1周后每天换液 1次， 当细胞融合至 80%以上吋， 添加适量 0.25%胰蛋白 酶， 胰蛋白酶覆盖细胞表面即可， 37°C消化 5min， 用 2倍体积含 10%胎牛血清的 DMEM/F12培养基终止消化， lOOOrpm离心 10min， 收集细胞沉淀， 用 PBS缓冲液 洗涤 1次， lOOOrpm离心 10min， 用新鲜细胞培养液重悬细胞， 按 1:3传代。

[0047] 所述细胞培养液为含 10%自体血浆或胎牛血清、 20ng/mL碱性成纤维细胞生长 因子 (bFGF)、 10ng/mL表皮细胞生长因子 （EGF) 、 5 g/mL胰岛素 RPMI1640培 养基。

[0048] 经流式细胞术鉴定培养第 20天的人母乳干细胞， 结果显示 SOX2、 NANOG、 O CT4阳性比例分别为 55%、 62%. 40%。 与实施例 1和实施例 2对比可见， 采用实 施例 1和实施例 2的方法得到的人母乳干细胞人母乳干细胞的� �度更高， 可以更 好的维持人母乳干细胞未分化状态。

[0049] 实施例 3

[0050] 对实施例 1和对比实施例进行人母乳干细胞增殖活性测� �， 具体过程如下：

[0051] 将实施例 1和对比例 1的人母乳干细胞在培养第 20天吋， 在倒置显微镜下取 6个 视野 (200x)， 计数未分化细胞数量， 实施例 1的方法制备的人母乳干细胞数量为 9 .17+0.75 , 采用对比例 1的方法制备的人母乳干细胞数量为 4.17±0.75， 所以， 实 施例 1制备的人母乳干细胞数量明显高于常规方法� �备的母乳干细胞。

[0052] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明 所作的进一步详细说明， 不能认 定本发明的具体实施只局限于这些说明。 对于本发明所属技术领域的普通技术 人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干简单推演或替换， 都应当视为属于本发明的保护范围。

工业实用性

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序列表自由内容

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