本发明属生物技术领域， 涉及一种精氨酸 -酮戊二酸盐的制备技术。 背景技术

L-精氨酸 -α-酮戊二酸盐， 英文名称为 L-Arginine-alpha-Ketoglutarate， 简称 AAKG, 白色或淡黄色晶体， 易溶于水、 HC1和 NaOH溶液， 微溶于 乙醇， 不溶于丙酮、 乙醚等。

L-精氨酸 -α-酮戊二酸盐是目前国际市场上销量日益增� �的一种氨基酸 盐类保健品，作为功能性营养强化剂和护肝药 物，主要用于体格增强补剂， 促进肌肉的快速增长和恢复， 促进肝细胞对营养和能量的吸收， 维护肝功 能正常等作用。其主要生理机制在于 AAKG物能够在短期内促进一氧化氮 的水平， 促进和扩张肌肉运动， 进而促进肌肉的快速增长和恢复， 增强力 量和精力。

AAKG有 1 : 1和 2: 1 (L-精氨酸： α-酮戊二酸）两种配比的盐， 即单 精氨酸酮戊二酸盐 （MAAKG)和双精氨酸酮戊二酸盐 （DAAKG), 两种 AAKG理化性质接近， 但功能和应用领域上也有一定差异。 MAAKG主要 作用是增加血液的一氧化氮水平，剌激血管舒 张，促进训练后的肌肉生长， 作为保健品运动强壮剂在美国市场上很受青睐 （http://www.mims.com/)。

DAAKG是一种拥有多种生理作用的有机酸盐， 对肝硬化病人给予高剂量 的 DAAKG, 其肝脏脱毒功能得到增强， 血浆氨、 血清酚浓度得到显著降 低， 其氧化分解作用得到增强。 这种作用在治疗氨中毒或用于强化肝脏解 毒功能的动物模型试验中也得到证明，治疗组 的存活率相对于控制组较高， 而且较少出现昏迷。法国瑞法兰药厂的 DAAKG护肝药物 Euligen (商品名 优力康）， 已在药理分析、毒理学鉴定、动物肝组织再生 、动物体内解毒等 的实验基础上， 进行了一系列的临床研究， 证明了 DAAKG在肝脏疾病及 其并发症， 酒精中毒及其并发症等方面有显著疗效。

早在 1977年就有研究报道， 给予肝硬化病人高剂量的精氨酸 α-酮戊二 酸， 能增强他们的肝脏解毒能力 （Muting et al. Munch Med Wochenschr， 1977)。 目前， 关于 AAKG的临床应用和代谢机制的研究不断深入。 美国 专利 USP 2005/0085498 A1介绍， 动物实验表明， 补充 AAKG可以增长骨 骼肌中精氨酸和谷氨酰胺的水平， 同时起到剌激免疫系统功能的作用。 一 项针对儿童补充 AAKG ( 15g/d) 的研究还显示， AAKG能够提升合成生 长素的水平、 促进包括胰岛素样生长因子 (IGF1)、 谷氨酰胺及谷氨酸盐等 氨基酸代谢作用， 补充 5个月后在增长速率提高显著。 同样， AAKG能够 促进术后病人的生长素和胰岛素的分泌， 其中间代谢产物谷氨酰胺和脯氨 酸也可以促进创伤复愈。在一项针对 AAKG抗分解代谢的研究中，具有高 分解代谢和代谢增进的 14名多发性创伤病人参与了实验，受试组每天� ��予 AAKG 20g, 显示出在蛋白质转化、 胰岛素、 生长素以及谷氨酰胺、 脯氨 酸、 精氨酸等自由氨基酸的血液水平方面同样得到 显著的最高。 另外针对 健康男性的研究表明， 每天给予 10g的 AAKG剂量， 其胰岛素水平升高 20〜30%， 而单独补充精氨酸或 α-酮戊二酸的研究组别中未观察到这种升 高。 体外细胞培养表明， AAKG能够显著诱导人成纤维细胞的增长， 这种 细胞与肌纤维细胞相似， 其作用有显著的量效关系， 而相应的精氨酸或 α- 酮戊二酸没有这种特性 (USP 2005/ 0085498 Al)。

此外， AAKG在水溶液中， 可解离形成精氨酸和 α-酮戊二酸， 因而也 可以作为 α-酮戊二酸或者精氨酸的供体， 在某种情况下， 作为精氨酸或 α- 酮戊二酸的替代品进行应用。 精氨酸是人体内不可缺乏的条件性必需氨基 酸和合成蛋白质、 肌酸的重要原料， 是生物体尿素循环的重要中间代谢产 物， 也是一氧化氮的前导物。 而 α-酮戊二酸对蛋白质的代谢有着很强的调 控作用， 并是推动三羧酸循环的重要物质和产能载体。 （美国专利 USP 7645742; USP 6905707； USP 7, 645， 742)

在 AAKG的生产上， 主要有三种方式： 一是直接混合法， 即按照摩尔 比分称取 L-精氨酸、 α-酮戊二酸， 以 1 : 1或者 2: 1进行混合。 这种产品 是精氨酸和酮戊二酸的简单混合， 二者之间没有盐键结合， 产品质量受原 料的品质、 混合的均匀度影响较大， 一般药品或食品生产不采用该法； 二 是溶解-冻干法， 分别配制一定浓度的 L-精氨酸、 α-酮戊二酸溶液， 按照一 定的摩尔比进行混合， 再将溶液进行冷冻干燥成为 AAKG， 该法中两种物 质形成稳定的有机酸盐，但冻干过程能耗大， 一般只适合于 AAKG注射剂 生产； 中国专利 200710063477.4， 200710063478.9, 200710063479.3均 涉及了上述两种方法。 三是结晶法， 是在溶液混合后， 对溶液进行浓缩或 加入有机溶剂， 降低 AAKG的溶解度， 析出 AAKG结晶， 经洗涤干燥后 获得 AAKG产品， 该法制备的产品纯度高， 产品质量能够保证， 但过程复 杂， 成本也偏高 （CN 101591271A：)。

上述三种方法制备 AAKG所需的 L-精氨酸和 α-酮戊二酸， 都必须达到 原料药的指标要求， 尤其是前两种方法， 制备过程不能够去除原料带入的 杂质， 因而对产品的质控提出较高的要求。 而结晶方法的生产过程， 成为 制备 AAKG的优选方法。

CN101591271A描述了 L-精氨酸 α-酮戊二酸盐结晶制备方法， 采用市 购 L-精氨酸和 α-酮戊二酸原料配制溶液混合结晶制备，众所 周知目前市场 销售的 L-精氨酸是从毛发（一般为猪毛、 人发）酸水解提取分离而得， （X- 酮戊二酸是石油基原料化学合成产品。 这两种原料来源都存在有生物安全 的疑虑。 L-精氨酸和 α-酮戊二酸， 又如 CN101011372A所描述的， 由市售 化学合成品、 毛发提取物原料来源的 α-酮戊二酸-精氨酸盐制剂作为原料 药， 但药物原料不一定适宜于保健食品。

发明内容

本发明的目的在于为克服上述 AAKG产品及其制备工艺的缺点， 提供 了一种从发酵来源的 L-精氨酸、 α-酮戊二酸原料制备 AAKG的方法，并且 是直接用发酵液中的 L-精氨酸与发酵液中的 α-酮戊二酸作为制备 AAKG 的原料， 而不是用其提取精制的结晶制品。

本发明，所需原料 L-精氨酸和 α-酮戊二酸是以植物来源的淀粉葡萄糖 为碳源， 用非转基因的野生型微生物进行代谢发酵而得 到的发酵产物， 简 称发酵液，将发酵液中的 α-酮戊二酸与发酵液中的 L-精氨酸按一定比例混 合、 螯合成盐， 利用通用的化工分离技术单元和设备， 直接结晶制备 L- 精氨酸 -α-酮戊二酸盐，制备的工艺包括发酵液预处� �、螯合、浓縮、结晶、 溶解脱色、 重结晶和晶体干燥等技术单元， L-精氨酸发酵液预处理， 去除 菌体和大分子杂质， 加入同步进行净化处理的一定量的 α-酮戊二酸发酵滤 液进行混合， 即螯合， 经真空蒸发浓縮， 再采用降温结晶方式获得 L-精氨 酸 α-酮戊二酸盐的粗品， 粗品经溶解脱色， 并进行有机溶剂重结晶， 最终 经干燥获得高纯度的 L-精氨酸 α-酮戊二酸盐。

本发明， 所述的发酵液预处理技术单元， 是将 L-精氨酸发酵液， 或 α- 酮戊二酸发酵液分别按照公知的方法进行絮凝 、 过滤或离心， 除去菌体和 较大固体粒子， 获得澄清滤液的过程。 所述的絮凝操作是采用硫酸铝、 CaCl ₂ 、聚丙烯酰胺、 壳聚糖等絮凝剂或其他无机铝盐、 铁盐、钙盐、 高分 子絮凝剂。 所述过滤操作， 是采用板框过滤、 真空过滤或带式过滤等设备 进行过滤， 尤其适合规模化制备工艺； 所述的离心操作是采用离心分离设 备进行固液分离， 尤其适合小试制备过程。

本发明， 所述的螯合技术单元， 是根据滤液中 L-精氨酸的含量， 加入 一定量的 α-酮戊二酸发酵液， 或 α-酮戊二酸溶液进行反应的过程。 α-酮戊 二酸的加入摩尔含量， 是体系中 L-精氨酸摩尔量的 0.3〜1.5倍。

本发明， 所述的浓縮技术单元， 是对含有 L-精氨酸、 α-酮戊二酸的溶 液进行浓缩的过程， 使 AAKG达到过饱和状态。 优选的浓縮设备是真空 浓縮、 二效浓缩或多效浓縮装备， 溶液浓缩到 L-精氨酸原溶液体积的 15%〜50%。

本发明，所述的结晶技术单元， 是将浓缩液放置在温度 -5°C〜15'C下进 行结晶， 或使用结晶锅， 通过冷却液进行溶液冷却， 结晶过程控制在 4〜 50 ho 结束后采用过滤或离心收集晶体。

本发明， 所述的溶解脱色技术单元， 是将上述晶体重新溶解在 2〜5倍 重量份的去离子水中， 搅拌使其充分溶解后， 加入颗粒活性碳进行脱色。 活性碳加入量相当于 AAKG晶体质量的 0.5%〜3.0%， 搅拌并将溶液加热 至 40〜90°C， 并维持 20〜60分钟， 再通过板框过滤， 收集 AAKG滤液。

本发明， 所述的重结晶技术单元， 是在上述 AAKG滤液中， 缓慢加入 溶液体积的 1〜4倍的亲水性有机溶剂，室温或冰箱静置 8〜50 h进行重结 晶，采用过滤收集晶体，并以少量的冷的新鲜 溶剂洗涤 2〜3次。所述的亲 水性有机溶剂， 包括乙醇、 甲醇、 丙酮、 异丙醇、 甘油、 乙腈等， 其中优 选的溶剂为乙醇或丙酮。

本发明，所述的晶体干燥技术单元， 是采用真空干燥、热风循环烘箱或 气流干燥等设备进行晶体干燥， 其干燥温度 50° (：〜 150°C。 本发明， 所述发酵液预处理、 螯合、 浓缩、 结晶、 溶解脱色、 重结晶、 晶体干燥等技术单元， 可适当进行增加、 减少、 调整或组合。

本发明制备 AAKG的原料 L-精氨酸、 α-酮戊二酸，都是发酵来源产品， 以植物来源的淀粉葡萄糖为碳源， 用非转基因微生物 （自行筛选改良的野 生菌， CN 03112896.3; CN 200310106298.6)进行代谢发酵， 得到的发酵 产物 L-精氨酸或 α-酮戊二酸纯度高、质量稳定。更重要的是， 非毛发来源 氨基酸、非石油基原料化学合成来源的 α-酮戊二酸制备的 AAKG, 用于保 健食品等， 不存在有生物安全和食品安全的疑虑。

本发明直接用发酵液中的 L-精氨酸与发酵液中 α-酮戊二酸作为 AAKG 的原料 L-精氨酸、 α-酮戊二酸， 而不是用其结晶制品。 这可以避免与发酵 法精制精氨酸或 α-酮戊二酸的后提取有较多的重复操作。从发 酵液中提取 L-精氨酸或 α-酮戊二酸一般都需要采用絮凝、 过滤、 树脂吸附、 洗脱、 浓 縮、结晶、干燥等步骤进行制备。本发明直接 用发酵液按一定比例混合（螯 合）、 浓縮结晶制备， 能够对 L-精氨酸或 a-酮戊二酸的生产过程、 AAKG 的制备过程进行衔接和改进， 能够有缩短生产环节、 降低生产成本、 提高 质控水平等良好效果。

本发明提供的直接从发酵液制备 AAKG结晶的方法，与现有技术相比， 还具有如下显著的优点： （1 )直接从 L-精氨酸发酵液和 a-酮戊二酸发酵液 进行制备，将 AAKG的生产有机整合到发酵产物的后提取过程� � 因而整体 流程縮短， 生产成本显著降低； （2)去除了发酵精氨酸和发酵 a-酮戊二酸 制备过程中的精制步骤， 减少了能耗物耗和废水生成量； （3 ) 工艺具有较 大的灵活性，通过参数的适当调整，可实现两 种或多种配比的 AAKG生产； (4)产品质量易于控制， 采用低温结晶、有机溶剂重结晶工艺， 并利用活 性碳进行脱色， 能够有效保证 AAKG的纯度。

附图说明

图 1 为实施例 L-精氨酸 a-酮戊二酸盐 HPLC 分析图谱， 色谱柱 Waters Atantis dCl 8, 流动相 20 mmol/L NaH ₂ P0 ₄ -Na ₂ HP0 ₄ ， pH 2.7, 柱温 30"C , UV 210 nm 。

具体实施方式

本发明提供了一种以植物来源的淀粉葡萄糖为 碳源，用非转基因菌株进 行微生物代谢发酵 （分别参考专利 CN 03112896.3 方法和专利 CN 200310106298.6方法）， 得到含 L-精氨酸或含 α-酮戊二酸的代谢产物的发 酵液，并从其发酵液中直接制备 L-精氨酸 -α-酮戊二酸盐结晶的工艺，主要 由发酵液预处理、 螯合、 浓缩、 结晶、 溶解脱色、 重结晶、 晶体干燥等技 术单元构成。 现从技术优化、 提高产品质量、 降低技术成本角度， 对发明 内容提出的技术参数进行说明。

发酵液预处理单元目的是去除除去菌体和较大 固体粒子，通过添加絮凝 剂， 能够进一步降低发酵液中大分子物质的含量， CaCl ₂ 絮凝一般可以达 到良好的絮凝效果。 在规模化制备工艺中， 过滤操作可以选择板框过滤、 真空过滤或带式过滤等设备， 在小试工艺中， 可以采用离心机进行固液分 离。

酸化之前，应分别测定两种发酵滤液中 L-精氨酸和 α-酮戊二酸的含量， 通常情况下，发酵液中 L-精氨酸含量在 4%〜6% (质量体积百分比，后同）， α-酮戊二酸含量在 3%~4%。应根据制备目标产物进行优化， 制备 MAAKG 时， 加入的 α-酮戊二酸摩尔量， 应为 L-精氨酸的摩尔量的 0.8〜1.5， 优化 的范围在 0.95〜1.05。 制备 DAAKG时， 加入的 α-酮戊二酸摩尔量， 应为 L-精氨酸的摩尔量的 0.2〜0.8， 优化的范围在 0.35〜0.55。

对含有 L-精氨酸、 α-酮戊二酸的混合溶液进行浓缩， 使 AAKG达到过 饱和状态， 理想的浓縮设备应该选择真空浓缩方式， 多效真空浓缩装置更 适合较大规模的制备过程， 小试制备适宜采用薄膜浓缩或旋转蒸发仪。 以 混合之前的 L-精氨酸和 α-酮戊二酸原溶液体积为标准，应浓缩到该体 积的 15%〜50%， 适宜的浓缩体积是 20%〜25%， 浓縮量较大， 结晶回收率较 高， 但纯度较低； 浓缩量较小， 则晶体析出量较少， 结晶操作时间需要适 度延长， 但析出的晶体纯度一般较高。

此外，螯合操作还可以调整到浓縮操作后进行 ,但应避免在浓缩完成后， 因加入 α-酮戊二酸溶液而使体系体积变多。

结晶的适宜温度在 -5° (〜 15°C， 优选温度为 5°C〜10°C。 在大生产中采 用结晶锅操作， 通过冷却液进行体系降温时， 应控制降温速率， 优选的降 温速率在 2°C〜5°C/h。 结晶时间控制在 4〜50 h， 优选的时间是 20〜30h。

晶体重新溶解在 2〜5倍质量体积的去离子水中， 优选为 3倍体积水； 加入颗粒活性碳的量，应根据晶体纯度适度调 整，优选的加入量为 0.5%〜 1.5%, 适宜的脱色温度 60°C〜90°C， 维持 30〜60min较为适宜， 再通过板 框过滤，收集滤液，在小批量生产中，可以选 择离心或真空抽滤获得 AAKG 重结晶采用有机溶剂体系进行，优选的溶剂为 乙醇或丙酮，优选的加入 体积为 2倍， 重结晶时间 8〜30 h， 晶体析出后， 过滤获得晶体， 并以少 量的冷的新鲜溶剂洗涤 2〜3次， 一般为 50%以上的乙醇或丙酮， 洗涤溶 剂应先行预冷至结晶温度 （5 〜 10°C )， 以降低对 AAKG的溶解度。

重结晶操作也可以不使用有机溶剂，直接在水 相中进行重结晶，也可以 使 AAKG的纯度适当提高， 可以根据产品的质量指标要求确定。采用水相 进行重结晶， 晶体溶解使用 2倍质量体积水， 可适度加热提高溶解速度。

一般采用真空干燥进行晶体干燥，温度 60°C〜90°C，优选为 70°C~75°C， 大规模生产可以采用其气流干燥设备。

本发明内容未对母液处理和溶剂回收进行规定 ，具体实施阶段可采用本 领域通用的或改进的措施， 以提高产率， 减少排放。

为进一步阐述本发明的工艺思想， 现通过具体实施案例予以说明。 【实施案例一】单精氨酸酮戊二酸 MAAKG的制备

在 5 L精氨酸发酵液中加入 CaCl ₂ 粉末 25g，搅拌使之充分溶解，静置 2 h， 再通过大容量离心机 （8000 r/min, 10 min) 分批离心， 收集滤液得 4.6 L。 经测定其中 L-精氨酸含量为 45.0 g/L， 计算出溶液中共含有 L-精氨 酸 1.19 mol。 按类似的方法将 α-酮戊二酸发酵滤清液进行预处理， 并计算 mol量 _β

按照 mol比 L-精氨酸： α-酮戊二酸 =1 : 1计算， 搅拌情况下， 缓慢添加 α-酮戊二酸发酵滤清液到 L-精氨酸发酵滤清液中， 使之完全混合。 采用旋 转蒸发仪进行混合液浓缩， 水浴温度 65°C， 获得浓縮液 1200 mL， 为混合 前 L-精氨酸和 α-酮戊二酸发酵滤清液的 26.1%。放入 5Ό冰柜， 静置 20h， 溶液中有大量晶体析出。

通过真空抽滤，收集粗品结晶物 272.3 g (干重），计算回收率为 71.5%， 通过 HPLC测定， 粗品纯度为 92.0% (不含结晶水， 下同）， L-精氨酸： α- 酮戊二酸摩尔比为 1 : 1.11。 取粗品 270 g溶解在 500mL去离子水中 （粗品质量体积的 2.5倍水）， 按照粗品质量的 0.5%加入粉末活性炭（100目：)，搅拌脱色，并� ��温至 70°C 保持 40 min。 然后真空抽滤， 去除活性炭。

待滤液冷却至室温后， 缓慢加入 3倍体积的乙醇， 室内放置 50 h进行 重结晶。 真空抽滤收集晶体， 并以 85% (体积百分比） 乙醇 10〜15 mL淋 洗结晶 3次， 继续抽干 20 mir！〜 30 min。 转移结晶物至表面皿， 置入真空 干燥箱， 70°C干燥 48 h。

干燥后重结晶产品质量 239.6g， HPLC测定的产品纯度为 99.2%， 其中 L-精氨酸： α-酮戊二酸摩尔比为 1 : 1.06。 重结晶收率达到 88.0%， AAKG 总收率为 62.9%。

【实施案例二】 双精氨酸酮戊二酸 DAAKG的制备

在 5 L精氨酸发酵液中加入 1.0%壳聚糖盐酸 （1.0%) 溶液 25mL， 搅 拌并静置 1.0 h， 真空抽滤， 收集滤液得 4.2 L。 经测定其中 L-精氨酸含量 为 52.0 g/L， 计算出溶液中共含有 L-精氨酸 1.25 moL α-酮戊二酸发酵按 同样方法获取发酵滤液。

取含 91.6 g a-酮戊二酸的发酵滤液（按照 L-精氨酸： α-酮戊二酸 =1 : 0.5 摩尔比添加）， 搅拌情况下， 缓慢加入到 L-精氨酸发酵液中， 使之完全混 合。采用旋转蒸发仪进行混合液浓缩，水浴温 度 65 °C ,获得浓缩液 1680 mL， 相对于混合前 L-精氨酸和 α-酮戊二酸发酵滤清液的 40 %。 放入 0°C冰箱， 静置 48h， 溶液中有晶体析出。

真空抽滤收集粗品结晶物， 折合干重为 190.3 g (干重）， 计算回收率为 61.4%, 通过 HPLC测定， 粗品纯度为 88.6%， L-精氨酸： α-酮戊二酸摩 尔比为 1.92： 1。

取粗品 185 g溶解在 370 mL去离子水中 （粗品质量体积的 2.0倍水）， 按照粗品质量的 0.5%加入粉末活性炭（ 100目），搅拌脱色，并升温至 70°C 保持 40 min。 然后真空抽滤， 去除活性炭， 滤液 350 mL。

待滤液冷却至室温后，缓慢加入 1400 mL丙酮（滤液体积的 4倍）， 0°C 冰箱下放置 8 h， 待结晶析出后， 真空抽滤收集晶体， 并以 0°C冷丙酮 10〜 15 mL淋洗结晶 3次， 继续抽干 20 min〜30 min。 转移结晶物至表面皿， 置入真空干燥箱， 70°C干燥 24 h为 DAAKG产品。 重结晶产品质量 165.1g， HPLC测定的产品纯度为 98.7%,其中 L-精氨 酸： α-酮戊二酸摩尔比为 1.99: 1。 重结晶收率达到 86.7%， AAKG总收 率为 53.3%。

【实施案例 三】 中试规模下的 AAKG制备技术

L-精氨酸发酵液 5 Μ ³ ， 精氨酸含量为 48 g/L。 加入 CaCl ₂ 粉末 25 kg， 搅拌使之充分溶解， 静置 2 h， 采用板框过滤设备 （过滤面积约 25.0 m ² ) 进行过滤， 并对滤渣进行洗涤。 收集澄清滤液 4350 L。

用于与精氨酸成盐反应的 α-酮戊二酸也采用发酵液， 其预处理过程与 L-精氨酸相似， 澄清滤液中 α-酮戊二酸含量为 39.2 g/L。

以生产 MAAKG为例， 按照 L-精氨酸： α-酮戊二酸 =1 : 1摩尔比添加， 将 α-酮戊二酸发酵滤清液加入到 L-精氨酸滤清液中， 搅拌均匀， 混合发酵 液共 8.82 Μ ³ 。

采用二效真空浓缩设备， 浓缩至 1500 L， 浓缩液量为原 L-精氨酸滤液 和 α-酮戊二酸滤液混合液体积的 34.5%。

使用结晶锅对上述浓缩液进行结晶，通入冷却 水，当滤液温度冷至 30°C 时， 控制冷却速率， 以每小时 2°C速率缓慢降温至 5°C， 结晶锅搅拌速率 10〜15 r/min， 养晶时间 10 h。采用板框过滤， 分离粗晶体。粗晶体折合干 重 342.7Kg， 粗品纯度为 88.6%， 其回收率为 79.1%。

粗品复溶于 600 L去离子水中， 加入粉末活性炭 （100目） 1500 g， 搅 拌并升温至 70°C脱色 60 min， 板框过滤去除活性炭， 滤液装入结晶罐， 通 冷凝水冷却至室温， 缓慢加入 1800 L 96% (v/v) 乙醇。 通冷却水降温至 15°C , 静置 12 h待结晶析出。 真空抽滤， 并以 96% (v/v) 乙醇洗涤结晶， 真空下抽干， 结晶物于 50°C干燥。 获得重结晶 AAKG 222.4 kg。

上述工艺为 MAAKG的制备工艺， 产品总收率约为 57.3%， 产品纯度 >99.0%。 若母液经处理回用， 实际收率在 70%以上。

【实施案例 四】 α-酮戊二酸加入量对结晶产品纯度和产率的影 响

为研究 a-酮戊二酸加入量对结晶产品纯度和产率的影� ��， 分别取 100 mL L-精氨酸滤液， 加入不同量的 α-酮戊二酸， 按 "实施案例一"中浓缩 和结晶方法操作， 通过 HPLC测定， 各批次 MAAKG纯度及产率如下。

表 1 α-酮戊二酸加入比例对结晶产率和纯度的影响 L-精氨酸量 （Arg) α-酮戊二酸量 （KG) MAAKG产率 MAAKG纯度 /mol /mol /% /%

0.025 0.020 0.8 55.1 92.7

0.025 0.025 1.0 71.5 92.0

0.025 0.030 1.2 67.5 91.0

0.025 0.035 1.4 60.0 89.0

0.025 0.040 1.6 57.7 87.0 a-酮戊二酸添加比例可以在一定范围内调整， 但对于 MAAKG而言， 采用 1 : 1的定量添加是最优的方案。

【实施案例 五】结晶温度、 降温速率对产物收率和纯度的影响

降温速率对结晶产率和产品纯度有一定影响。 按照 "实施案例 四"中 的溶液体系（Arg: KG=1 : 1 )， 每组均预冷至 30°C， 再采用不同的降温速 率和结晶温度， 考察 MAAKG结晶收率和产品纯度。 结果见下表。

晶温度和降温速率对产率和纯度的影响

【实施案例 六】 AAKG的 HPLC测定

称取待测品 MAAKG 0.100 g, 溶解在 lOO mL蒸馏水中， 为待测试样。 采用 HPLC进行分析，色谱柱使用 Waters Atantis dC18,流动相为 20 mmol/L NaH ₂ P0 ₄ -Na ₂ HP0 ₄ ， pH 2.7, 柱温设定 30°C， 使用紫外检测器， 检测波长 210 nm。 进样体积 10μ 。

MAAKG在水溶液中解离为 L-精氨酸和 α-酮戊二酸两种单独的化合物， 因而在 HPLC 图谱中呈现为两个峰（参见附图）。 采用上述色谱条件能够 较好地获得这两个组分峰， 其保留时间分别为 3.35 min、 5.79 min。 采用 L-精氨酸、 α-酮戊二酸的标准品， 确定这两个峰分别为 L-精氨酸、 α-酮戊 二酸。 样品的含量可以根据标准品进行计算， 同时也可以计算出 MAAKG 中 L-精氨酸、 α-酮戊二酸的组成的摩尔比。