(一)技术领域： 本发明涉及中药技术领域， 具体涉及一种用于风湿骨痛的三七药酒 的制备工艺。

(二)背景技术： 常见的风湿骨病包括骨性关节炎、风湿性关节 炎、类风湿性关节炎、 肩周炎、 颈椎病、 腰椎病、 痛风、 强直说性脊柱炎、 股骨头坏死、 运动型损伤 （跌打新老 伤）、 静脉曲张、 无名肿痛、 偏瘫、 滑膜炎、 腱鞘炎、 肋膜炎、 网球肘等。 据世界卫生 组织近年的调查统计报告显示， 全球患不同程度风湿骨病的患者达全球人口的 40%， 高 书

达 25亿人以上， 由于类风湿、 痛风导致瘫痪的， 全世界占发病人口的 1.08%。 初步的 流行病学调查显示， 我国骨性关节炎总的发病率约 15%， 其中 40岁以下人群总发病率 为 2〜3%； 40-60岁人群总发病率为 25〜30%， 60岁以上人群发病率者高达 65%以上（西 方国家发病率更高）。 单这一个病症， 以中老年为主的全国不同程度患者即达 2亿人以 上。 目前风湿骨痛病的治疗方法， 包括中医药辩证疗法、 止痛西药治疗 （西乐葆、 乐松 等）、 物理治疗、 推拿针灸治疗、 封闭疗法、 手术治疗等， 但西乐葆等西药多数为缓解 疼痛， 治标不治本， 长期用药副作用大， 手术等风险大， 费用高， 而且复发风险较大。 中医学将风湿病归为 "痹证"， 其病因主要由于身体虚弱， 又感受风寒、 湿邪， 气血运 行不畅所致。 中药药效作用温和而持久， 毒副作用较少， 患者接受长程治疗的耐受性较 好； 复方中药通过多途径、 多环节、 多靶点的特点， 能够发挥整合调节作用， 可以针对 风湿病的多个病理环节进行整体治疗； 可以改善患者的一般状况， 增强体质， 延缓病情 发展， 预防和改善骨质破坏。 中国古籍记载大量用于风湿骨痛中药， 如 《伤寒论》记载 风湿相抟， 骨节疼烦， 掣痛不得屈伸， 近之则痛剧， 汗出短气， 小便不利， 恶风不欲去 衣， 或身微肿者， 甘草附子汤主之。 《金匮要略》 记载治诸肢节疼痛， 身体 ¾羸， 脚肿 如脱， 头眩短气， 温温欲吐， 桂枝芍药知母汤主之。 目前市场上在销售的风湿骨病用药 如鸿茅药酒、 虎力散、 盘龙七、 三七药酒等销售额都高达数亿元。

三七药酒为云南特色民族药， 具有舒筋活络， 散瘀镇痛， 祛风除湿， 强筋壮骨功效， 用于跌打损伤， 风湿骨痛， 四肢麻木。 其质量标准收载于卫生部部颁标准， 其处方包括 三七、 莪术、 全蝎、 土鳖虫、 补骨脂、 淫羊藿、 四块瓦、 叶下花、 当归、 牛膝、 五加皮、 制川乌、 苏木、 大血藤、 川芎、 血竭、 红花、 乳香 （醋制）、 没药 （醋制）、 延胡索 （醋 制）、 香附 （醋制） 21味药材； 也记载了制法如下： 以上二十一味， 三七、 全蝎、 土鳖 虫、 血竭粉碎成粗粉， 其余补骨脂等十七味粉碎成最粗粉， 与三七等四味药粉混合， 照 流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法 （通则 0189)， 用 50度以上白酒作溶剂， 密闭浸泡 15 天后， 缓缓渗漉， 收集渗漉液 8400ml， 静置， 滤过， 即得。 三七药酒组方中含有全蝎、 土鳖虫、 四块瓦、 叶下花、 制川乌等有毒药材， 其质量标准仅对三七药酒的鉴别， 并未 进行疗效指标等的控制， 这些药材通常是通过一定量的毒性成分发挥舒 筋活络， 散瘀镇 痛， 祛风除湿， 强筋壮骨功效， 正如我们熟知的以毒攻毒的秋水仙碱治疗类风 湿性关节 炎； 严格的含量控制是保证药品安全有效的重要措 施， 活性成分含量不足可能导致临床 无效， 含量过高可能导致临床上的肝、 肾、 心脏、 神经系统损伤， 如此简单的工艺和质 量控制标准可能为临床应用埋下安全隐患； 另一方面， 在生产销售使用中发现， 其可能 还存在沉淀、 口感不佳等诸多问题。 因此， 对于三七药酒这类复杂组方的中成药生产工 艺研究是目前的研究热点， 也是亟待解决的问题。

虽然已有相关的工艺研究报道， 但这些研究大多为单方提取或者多方简单的浸 泡、 渗漉提取， 大多仅考虑三七等活性成分的提取， 未涉及多种毒性药材的含量控制问题。 如《三七渗漉提取工艺的研究》 （谭朝阳等， 中国中医药信息杂志， 2010.17 (4): 51-52) 考察了渗漉法中乙醇浓度、 乙醇用量以及渗漉速度等对三七提取的影响， 结果显示， 最 佳渗漉提取工作： 12倍药材 50%乙醇， 渗漉速度 l-3ml/ (min ' kg), 三七总皂苷和三七 总氨基酸含量分别可达 7.801%和 1.771%。 但该文献采用的乙醇用量达到 12倍药材量， 药材浸出浓度较低， 需要进一步回收乙醇； 其渗漉速度缓慢， 影响生产效率， 不适合大 生产；且其仅考察单味药材三七，对于复方制 剂中多味药材的提取及含量控制并未涉及。 而 CN104623607A公开了一种治疗风湿病的中药组合物 ， 它包含下列重量份的物质：三 七 50-90 份、 乳香 30-60 份、 没药 30-60 份、 马钱子 10-20 份、 炮山甲 20-30 份、 当 归 20-60 份、 川芎 20-60 份、 川乌 20-60 份、 草乌 20-60 份、 土鳖虫 30-90 份、 白芷 30-90 份、红花 30-90 份、木通 15-30份、蜈蚣 30-50 份、全蝎 10-15 份、川断 30-90 份、 乌梢蛇 60-90 份、地龙 30-60 份、青风藤 30-60 份、海风藤 30-60 份、络石藤 30-60 份 和干姜 60-90 份， 其制备方法为， 加入 4000 毫升无水乙醇， 在室温封闭的条件下浸渍 7 天， 过滤， 滤液即得。 该专利说明书实施例公开了采用无水乙醇浸渍 ， 过滤， 滤液即 得； 其临床给药方法为酒剂纱布蘸取涂抹。 该专利重点在于中药组合物的组方， 其制备 方法为常规工艺， 并未对如川乌、 土鳖虫、 全蝎等毒性药材成分、 君药三七等提取影响 因素进行分析， 可能存在活性成分、 毒性成分含量不稳定等问题， 不适合内服。 (三)发明内容：本发明的目的在于提供一种治� ��风湿骨痛的内服三七药酒制备工艺， 其工艺主要由酶解、 凝胶柱过滤、 浸泡、 渗漉、 澄清步骤组成， 具有经济环保优势， 且 制得药品临床安全、 有效、 质量可控。

三七药酒组方及其重量比为三七 50份、 莪术 40份、 全蝎 10份、 土鳖虫 30份、 补 骨脂 50份、 淫羊藿 50份、 四块瓦 60份、 叶下花 80份、 当归 60份、 牛膝 50份、 五加 皮 60份、 制川乌 20份、 苏木 40份、 大血藤 60份、 川芎 30份、 血竭 10份、 红花 20 份、 乳香 (醋制）30份、 没药 (醋制）30份、 延胡索 (醋制 )40份、 香附 (醋制）40份。

其中， 三七为君药， 活血化瘀而消肿定痛， 为治瘀血诸证之佳品， 为伤科之要药。 入肝经血分， 有止血不留瘀， 化瘀不伤正。

臣药行气活血， 散瘀镇痛： 莪术味辛性烈， 专攻气中之血， 主破积消坚， 去积聚癖 块， 土鳖虫活血散瘀， 通经止痛。 当归-川芎相须为用： 当归甘温质润以补血调经， 辛 行温通能活血止痛； 川芎辛散温通， 既能活血化瘀， 又能行气止痛， 为 "血中之气药"。 苏木味辛能散， 咸入血分， 能活血散瘀、 消肿止痛。 血竭入血分而散瘀止痛， 为伤科及 其他瘀滞痛证要药。 没药与乳香相须为用， 治疗跌打损伤瘀滞疼痛。 香附 "乃气病之总 司， 女科之主帅也"， 辛行苦泄， 善于梳理肝气， 调经止痛， 为妇科调经之要药。 延胡 索辛散温通， 为活血、 行气止痛之良药， 前人谓其能 "行血中之气滞， 气中血滞， 故能 专治一身上下诸痛"。 诸药合用为臣， 共奏行气活血， 散瘀镇痛之功。

祛风除湿， 舒筋活络： 全蝎主入肝经， 性善走窜， 既平息肝风， 又搜风通络， 有良 好的息风止痉之效， 为治痉挛抽搐之要药。 制川乌辛热升散苦燥， "疏利迅速， 开通关 腠， 驱逐寒湿"， 善于祛风除湿、 温经散寒， 有明显的止痛作用， 为治风寒痹症之佳品。 五加皮辛能散风， 苦能燥湿， 温能祛寒， 且兼补益之功， 为强壮性祛风湿药， 尤宜于老 人及久病体虚者。 诸药合用为臣， 共奏祛风除湿， 舒筋活络之功。

补肾壮阳， 强筋壮骨： 补骨脂， 能暖水脏 （肾脏）， 阴中生阳， 壮火益土之要药也。 淫羊藿辛温散寒， 长于补肾壮阳， 入肝肾强筋骨， 又能祛风胜湿。 诸药合用为臣， 共奏 补肾壮阳， 强筋壮骨之功。

佐药： 大血藤活血通经， 祛风除湿。 四块瓦祛风、 除湿、 活血、 散瘀。 叶下花行气 活血、 续筋接骨、 除湿止痛。

使药： 牛膝善引气血下注， 是以用药欲其下行者， 恒以之为引经。活血散瘀力较强， 又能补益肝肾， 强筋健骨， 兼能祛风除湿。 可谓一药专使而身具四功。 全方以酒制药， 酒性升提， 与牛膝共司载诸药升降出入气血职责。

全方共计 21 味药， 辛散温通， 行中有止， 润燥相合， 升降有度， 攻补兼施。 散瘀 镇痛而不伤血， 祛风散湿而不伤阴， 舒筋活络而不伐正， 强筋壮骨而不敛邪， 诸药组合， 殊功至善。

本发明提供三七药酒的制备工艺具体步骤如下 ：

( 1 )、 将处方量的全蝎、 土鳖虫粉碎成粗粉， 加入 0.8〜2倍体积量的 30〜50度白 酒， 再加入 0.08〜0.12%上述两味处方量药材的菠萝蛋白酶， 水浴温度 50〜60°C， 浸润 酶解 3〜5h， 然后上 Superdex peptide柱， 用 1.0〜2.0倍体积量的 30〜50度白酒洗脱， 弃去洗脱液， 用 2.0〜4.0倍体积量的 30〜50度白酒洗脱， 收集洗脱液， 备用；

(2)、 将处方量的制川乌、 四块瓦、 叶下花、 香附、 川芎粉碎成粗粉， 投料于渗漉 装置中， 加入步骤 （1 ) 制备的洗脱液， 加入 50〜60度白酒 1〜2倍体积， 常温密封浸 泡 12〜36小时，然后将其余处方量药材粉粹成粗� �，投料于上述渗漉装置中，加入 50〜 60度白酒 3〜7倍量， 密封浸泡 10〜20天， 并保证包材遮光；

(3 )、 调整渗漉 3〜5ml/ (min - kg), 并不断加入 50〜60度白酒， 收集渗漉液（每 个处方 8400ml)， 静置， 采用 200目澄清板过滤， 收集过滤液即得。

其中， 步骤 （1 ) 作为溶剂的白酒为 1.5倍体积量的 40度白酒； 作为洗脱溶剂的白 酒为 3.0倍体积的 40度白酒；

步骤 （1 ) 菠萝蛋白酶的添加量为 0.10%;

本发明提供了一种用于风湿骨病的内服三七药 酒新的制备工艺，制成的药酒棕红透 亮， 可以长时间在常温下放置保存而不产生沉淀， 且对风湿骨痛疗效显著， 具体有益效 果如下：

( 1 )、 全蝎和土鳖虫都是两种有毒动物药材， 目前这两个药材用于风湿骨病的报道 较为罕见，本发明采用 1.5倍 40度白酒浸泡全蝎和土鳖虫，利用土鳖中含有� ��纤溶活性 酶和 0.10%菠萝蛋白酶分解全蝎中的 BmK- β IM、 BmP09、 NTX、 CTX等长链蝎毒蛋白， 降低了这些成分对机体的肌肉抑制等作用； 另一方面， 该过程采用 1.5 倍体积量的 40 度白酒浸泡药材， 其显著降低了浸泡溶剂的用量， 有利于后续直接渗漉制成酒， 减少了 溶剂回收过程， 降低了生产成本； (2)、 将菠萝蛋白酶酶解液上 Superdex peptide柱， 通过上柱去除未分解的长链蝎 毒蛋白等大分子以及杂质， 然后用 3.0倍 40度白酒洗脱， 其可以有效富集分子量低于 6.5KDa的成分； 将制川乌、 四块瓦、 叶下花、 香附、 川芎药材用步骤 （1 ) 制备的洗脱 液密封浸泡， 本发明人在长期的试验研究过程中发现， 上述五个药材浸泡过程中能降低 制川乌、 四块瓦、 叶下花的毒性， 尤其是通过配伍减毒作用， 可以显著降低制川乌中的 乌头碱含量， 检测结果显示， 采用上述工艺制备的三七药酒未检出乌头碱成 份。 大鼠长 期毒性试验显示， 该工艺制备的三七药酒在 1.0g/kg/天的高剂量下无不良反应， 大鼠连 续灌胃给药 6个月安全、 无毒副作用。

(3 )、 本发明提供的制备工艺制得的三七药酒中各主 要药效成分如三七皂苷、 淫羊 藿苷、 补骨脂素及异补骨脂素等含量稳定， 质量可控， 其各成分转移率达到 90〜98%； 动物实验显示，其对小鼠 DNCB诱导的迟发性超敏反应具有显著的抑制作� �，可以显著 减轻大鼠纽扣肉芽肿、 足趾肿胀情况。

本发明提供了一种安全、 有效、 质量可控的三七药酒制备工艺， 整个制备过程仅采 用不同浓度的白酒作为溶剂， 而且其用量少， 不需要回收， 工艺经济环保， 未引入其他 溶剂； 且所制得的三七药酒的主要药效成分明确， 含量稳定， 其安全、无明显毒副作用， 适合长期用药。

(四）具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明， 下述实施例是说明性的， 不是限定性的， 不 能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

实施例 1 :

( 1 )、 将全蝎 10g、 土鳖虫 30g粉碎成粗粉， 加入 1.5倍体积量的 40度白酒， 再加 入 0.10%上述两味处方量药材的菠萝蛋白酶， 水浴温度 55 °C， 浸润酶解 4h， 然后上 Superdex peptide柱， 用 1.5倍体积量的 40度白酒洗脱， 弃去洗脱液， 用 3.0倍体积量的 40度白酒洗脱， 收集洗脱液， 备用；

(2)、 将制川乌 20g、 四块瓦 60g、 叶下花 80g、 香附 40g、 川芎 30g粉碎成粗粉， 投料于渗漉装置中， 加入 （1 ) 制备的洗脱液， 加入 55度白酒 1.5倍量， 常温密封浸泡 24小时， 然后将三七 50g、 莪术 40g、 补骨脂 50g、 淫羊藿 50g、 当归 60g、 苏木 40g、 大血藤 60g、 血竭 10g、 红花 20g、 乳香（醋制） 30g、 没药（醋制） 30g、 延胡索（醋制） 40g、 牛膝 50g、 五加皮 60g粉粹成粗粉， 投料于上述渗漉装置中， 加入 55度白酒 5倍 量， 密封浸泡 15天， 并保证包材遮光；

(3)、 调整渗漉 3〜5ml/ (min - kg), 并不断加入 55度白酒， 收集渗漉液 8400ml， 静置 (0〜4°C)， 采用 200目澄清板过滤， 收集过滤液即得。 实施例 2:

(1)、 将全蝎 10g、 土鳖虫 30g粉碎成粗粉， 加入 0.8倍体积量的 30度白酒， 再加 入 0.08%上述两味处方量药材的菠萝蛋白酶， 水浴温度 50 V， 浸润酶解 5h， 然后上 Superdex peptide柱， 用 2.0倍体积量的 30度白酒洗脱， 弃去洗脱液， 用 4.0倍体积量的 30度白酒洗脱， 收集洗脱液， 备用；

(2)、 将制川乌 20g、 四块瓦 60g、 叶下花 80g、 香附 40g、 川芎 30g粉碎成粗粉， 投料于渗漉装置中， 加入（1)制备的洗脱液， 加入 60度白酒 1倍量， 常温密封浸泡 12 小时， 然后将三七 50g、 莪术 40g、 补骨脂 50g、 淫羊藿 50g、 当归 60g、 苏木 40g、 大 血藤 60g、 血竭 10g、 红花 20g、 乳香 （醋制） 30g、 没药 （醋制） 30g、 延胡索 （醋制） 40g、 牛膝 50g、 五加皮 60g粉粹成粗粉， 投料于上述渗漉装置中， 加入 50度白酒 7倍 量， 密封浸泡 20天， 并保证包材遮光；

(3)、调整渗漉 3〜5ml/ (min *kg)， 并不断加入 60度白酒， 收集渗漉液，静置 (0〜 4V), 采用 200目澄清板过滤， 收集过滤液即得。 实施例 3:

(1)、 将全蝎 10g、 土鳖虫 30g粉碎成粗粉， 加入 1.5倍体积量的 50度白酒， 再加 入 0.12%上述两味处方量药材的菠萝蛋白酶， 水浴温度 60°C， 浸润酶解 3h， 然后上 Superdex peptide柱， 用 1.0倍体积量的 50度白酒洗脱， 弃去洗脱液， 用 2.0倍体积量的 50度白酒洗脱， 收集洗脱液， 备用；

(2)、 将制川乌 20g、 四块瓦 60g、 叶下花 80g、 香附 40g、 川芎 30g粉碎成粗粉， 投料于渗漉装置中， 加入（1)制备的洗脱液， 加入 50度白酒 2倍量， 常温密封浸泡 36 小时， 然后将三七 50g、 莪术 40g、 补骨脂 50g、 淫羊藿 50g、 当归 60g、 苏木 40g、 大 血藤 60g、 血竭 10g、 红花 20g、 乳香 （醋制） 30g、 没药 （醋制） 30g、 延胡索 （醋制） 40g、 牛膝 50g、 五加皮 60g粉粹成粗粉， 投料于上述渗漉装置中， 加入 50度白酒 3倍 量， 密封浸泡 10天， 并保证包材遮光；

(3)、调整渗漉 3〜5ml/ (min *kg)， 并不断加入 50度白酒， 收集渗漉液，静置 (0〜 4°C)， 采用 200目澄清板过滤， 收集过滤液即得。 实施例 4: 含量检测方法

三七皂苷含量测定方法

人参皂苷 Rgl照高效液相色谱法 （中国药典 2015年版通则 0512) 测定。

色谱条件与系统适应性试验以十八垸基硅垸键 合硅胶为填充剂； 以乙腈为流动相 A， 水为流动相 B; 按下表中的规定进行梯度洗脱； 流速每分钟为 1.5ml; 检测波长为 203nm, 柱温 25 °C。 理论板数按人参皂苷 Rgl峰计算应不低于 6000。

时间 （分钟） 流动相 A (%) 流动相 B (%)

0 20 80

20 20 80

45 46 54

55 55 45

60 55 45

61 90 10

70 90 10

对照品溶液的制备取人参皂苷 Rgl对照品适量， 精密称定， 加 50%乙醇制成每 lml 含 0.3mg的溶液， 即得。

供试品溶液的制备精密量取本品 10ml， 加在 D900大孔阴离子脱色树脂层析柱 ( d=1.2~1.5cm, V=20cm ³ ), 加 50%乙醇 60ml洗脱， 收集洗脱液， 减压浓缩至干， 残 渣加水 15ml， 加二氯甲垸振摇提取 2次， 每次 15ml， 弃去二氯甲垸液， 水液减压浓缩 至干， 加 50%乙醇溶解并转移至 10ml量瓶中， 加 50%乙醇至刻度， 摇匀， 滤过， 取续 滤液， 即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液 各 10μ1， 注入液相色谱仪， 测定， 即 得。

测得实施例 1 制备的三七药酒每 lml 含三七以人参皂苷 Rgl ( C ₄₂ H ₇₂ 0 ₁₄ ) 计为 0.20mg。

淫羊藿苷含量测定方法

淫羊藿苷照高效液相色谱法 （中国药典 2015年版通则 0512) 测定。 色谱条件与系统适应性试验以十八垸基硅垸键 合硅胶为填充剂； 以乙腈为流动相 A， 水为流动相 B ; 按下表中的规定进行梯度洗脱； 流速每分钟为 1.0ml ; 检测波长为 270nm, 柱温 25 °C。 理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于 1500。

时间 （分钟） 流动相 A (%) 流动相 B (%)

0 30 70

30 30 70

35 90 10

45 90 10

对照品溶液的制备取淫羊藿苷对照品适量， 精密称定， 加 50%乙醇制成每 lml含 O. lmg的溶液， 即得。

供试品溶液的制备精密量取本品 10ml， 加在 D900大孔阴离子脱色树脂层析柱 ( d=1.2~1.5cm, V=20cm ³ ) , 加 50%乙醇 60ml洗脱， 收集洗脱液， 减压浓缩至干， 残 渣加乙酸乙酯 25ml， 超声提取 30分钟， 滤过， 残渣加乙酸乙酯 25ml， 继续超声 30分 钟， 合并提取液， 浓缩至干， 残渣加 50%乙醇溶解并转移至 10ml量瓶中， 稀释至刻度， 摇匀， 滤过， 取续滤液， 即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液 各 10μ1， 注人液相色谱仪， 测定， 即 得。

测得实施例 1制备的三七药酒每 lml含淫羊藿以淫羊藿苷（C ₃₃ H _4Q 0 ₁₅ ) 32.22计为

补骨脂素、 异补骨脂素的含量测定方法

补骨脂素、 异补骨脂素照高效液相色谱法 （中国药典 2015年版通则 0512 ) 测定。 色谱条件与系统适应性试验以十八垸基硅垸键 合硅胶为填充剂； 以甲醇为流动相

A， 水为流动相 B ; 按下表中的规定进行梯度洗脱； 流速每分钟为 1.0ml ; 检测波长为

245nm, 柱温 25 °C。 理论板数按补骨脂素峰计算应不低于 2000。

时间 （分钟） 流动相 A (%) 流动相 B (%)

0 50 50

30 50 50

35 90 10

45 90 10

对照品溶液的制备取补骨脂素、 异补骨脂素对照品适量， 精密称定， 加甲醇制成每 lml各含 20 μ _§ 的溶液， 即得。 供试品溶液的制备精密量取本品 10ml， 加在 D900大孔阴离子脱色树脂层析柱 (d=1.2~1.5cm, V=20cm ³ ), 加 50%乙醇 60ml洗脱， 收集洗脱液， 减压浓缩至干， 残 渣加二氯甲垸 25ml， 超声提取 30分钟， 滤过， 残渣加二氯甲垸 25ml， 继续超声 30分 钟， 合并提取液， 浓缩至干， 加 50%乙醇溶解并转移至 10ml量瓶中， 加 50%乙醇至刻 度， 摇匀， 滤过， 取续滤液， 即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液 各 10μ1， 注人液相色谱仪， 测定， 即 得。

测得实施例 1制备的三七药酒每 lml含补骨脂以补骨脂素 （C _u H ₆ 0 ₃ ) 和异补骨脂 素 （C _u ¾0 ₃ ) 计为 60.54 y g。

SDS-PAGE长链蝎毒蛋白的检査

样品处理及加样： 精密取全蝎、 土鳖虫提取液适量， 冻干， 再取适量标准分子蛋白 质， 加 5X SDS-PAGE加样缓冲液稀释 5倍， 混匀， 煮沸 2-5min， 取出冷却， 将样品加 5X SDS-PAGE加样缓冲液转移至 Eppendorf管中混合， 盖上盖子， 在 100°C沸水浴中加 热 2-5min， 离心 （15000xg) 15min。 用微量注射器取蛋白 Marker、 样品溶液各 5 μ 1缓 慢加至样品孔底部。

电泳：将电机插头于是当的电极相接，置入冷 柜中，将电压调至 200V, 电流 10mA， 待样品进入分离凝胶后， 将电压调至 300V, 电流调至 30mA， 当溴甲酚蓝染料的前沿迁 移至距凝胶的底部 lcm时， 停止电泳。 从电泳槽中取出凝胶玻璃板， 轻轻撬开， 除去弄 塑胶， 用去离子水清洗凝胶， 取出胶上的电极缓冲液。

染色和脱色： 戴上手套将凝胶移入一个盛有少量考马斯亮蓝 的大培养皿中， 盖上盖 子， 在摇床上慢振荡染色（频率： 40~60Hz， 时间 2-3h)， 弃去染液， 将凝胶在水中漂洗 数次， 加入脱色液， 过夜脱色。

结果显示， 实施例 1制备的三七药酒样品分子量小于 6.5kDa。 双酯型乌头碱含量测定方法

双酯型乌头碱照高效液相色谱法 （中国药典 2015年版通则 0512) 测定。 色谱条件与系统适应性试验以十八垸基硅垸键 合硅胶为填充剂； 以乙腈-四氢呋喃 (25: 15 )为流动相 A， 0.1mol/L醋酸铵（每 1000ml加冰醋酸 0.5ml)为流动相 B; 按下 表中的规定进行梯度洗脱； 流速每分钟为 1.0ml; 检测波长为 225nm， 柱温 25°C。 理论 板数按乌头碱峰计算应不低于 2000。

时间 （分钟） 流动相 A (%) 流动相 B (%)

0 15 85

48 26 74

49 35 65

58 35 65

65 15 85

对照品溶液的制备取乌头碱对照品适量， 精密称定， 加流动相 A-流动相 B ( 15:85 ) 制成每 1ml含 50mg的溶液， 即得。

供试品溶液的制备精密量取本品 50~100ml，加在 D900大孔阴离子脱色树脂层析柱 (d=1.2~1.5cm, V=20cm ³ ), 加 50%乙醇 60ml洗脱， 收集洗脱液， 减压浓缩至干， 残 渣精密加流动相 A-流动相 B ( 15:85 ) 2ml, 摇匀， 滤过， 取续滤液， 即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液 各 10μ1， 注人液相色谱仪， 测定， 即 得。

结果显示实施例 1制备的三七药酒未检出乌头碱 （C ₃₄ H _47N O _u )。 实施例 5: 风湿骨病动物实验

实验材料：

KM小鼠 18~22g，

SD大鼠， 体重 180〜220g，

本发明所用三七药酒为实施例 1所制备 （人参皂苷 Rgl含量 0.20mg/ml， 淫羊藿苷 含量 32.22 g/ml， 补骨脂素及异补骨脂素含量 60.54 μ g/ml， 未检出乌头碱， 蝎毒多肽 分子量小于 6.5kDa);

阳性药为云南希陶绿色药业股份有限公司提供 的三七药酒（根据实施例 4检测， 人 参皂苷 Rgl 含量 0.15mg/ml， 淫羊藿苷含量 30.61 μ g/ml， 补骨脂素及异补骨脂素含量 62.76 g/ml, 乌头碱含量为 1.25 μ g/ml， 蝎毒多肽分子量小于 20.1kDa)。

给药前， 将本品置 40~50°C减压浓缩至相应的浓度。

( 1 ) 小鼠溶血素实验 取 KM小鼠 50只， 雌雄各半， 体重 18〜22g， 随机分为 5组， 即正常对照组， 阳 性药组， 三七药酒低、 中、 高剂量组， 每组 10只。 各给药组小鼠分别灌胃灌胃给予相 应药物， 正常对照组灌胃给予等浓度白酒， 灌胃容积均为 10ml/kg， 每日一次， 共 10d。 给药第 3天， 对每只小鼠用 20%绵羊红细胞 （SRBC) 腹腔注射 0.2ml致敏， 末次灌胃 给药后 24h， 从小鼠眼眶取血 0.5ml， 常规分离血清。 于 96孔微量血凝板上将血清做倍 比稀释， 每孔 50 μ 1， 再于每孔加入 50 ll%SRBC， 混匀， 至 37°C烘箱中 3h， 观察红 细胞凝集程度， 计算各组小鼠血清抗体积数。

再取 KM小鼠 60只， 操作同上， 在致敏后的第 4天和第 6天每只小鼠腹腔注射环 磷酰胺 （CTX) 30mg/kg (正常对照组小鼠除外）。 计算各组小鼠的血清抗体积数。

抗体积数= ( SL+2S2+3 S3+…… +nS _n )， 式中 1,2,3， ……， n代表倍比稀释的指数， S 表示凝集程度的级别， 抗体积数越大表示血清中抗体水平越高。

0级为红细胞全部下沉， 集中在孔底形成圆点状， 四周液体清晰；

I级为红细胞大部分下沉在孔底成圆点状， 四周有少量聚集的红细胞；

II级为凝集的红细胞在孔底形成薄层， 中心可以明显见到 1个疏松的红点；

III级为凝集的红细胞均匀地铺散在孔底形成 一薄层， 中心隐约可见 1个小红点；

IV级为凝集的红细胞均匀地铺散在孔底形成� ��薄层， 凝块有时呈卷折状。

表 1三七药酒对小鼠血清溶血素的影响 （X± s， n=10)

mi 剂量 （g/kg ) 抗体积数

正常小鼠 免疫低下小鼠 正常对照组 - 126.5 ±34.4 38.5 ±24.0 阳性药组 0.31 87.5 ±29.1 ^A 65.3 ±26.7·* 三七药酒低剂量组 0.16 93.9 ±31.8 50.9 ±24.1

中剂量组 0.31 75.0 ±27.4 ^A 66.0 ±23 高剂量组 0.62 66.5 ± 18.5 ^A 67.4 ±20.5 ^J 注： 与正常对照组相比， P<0.05， A <0.01 o

对于免疫正常的小鼠， 各剂量三七药酒均可降低小鼠血清抗体积数， 其中中、 高 剂量组小鼠血清抗体积数显著低于正常对照组 （^<0.05或^<0.01 )， 其表现出来一定 体液免疫抑制作用。 但是， 当预先腹腔注射 CTX导致小鼠免疫功能低下时， 各剂量组 的三七药酒又具有一定的升高血清溶血素作用 ， 其中中、 高剂量组小鼠血清抗体显著高 于正常对照组 （P<0.01 )， 表明其对免疫低下小鼠具有一定的体液免疫增 强作用。 ( 2 ) 小鼠迟发性超敏 （DTH) 反应试验

取 KM小鼠 50只， 体重 18〜22g， 雌雄各半， 随机分为 5组， 即模型组， 阳性药 组， 三七药酒低、 中、 高剂量组， 每组 10只。 各组分别用 7%的二硝基氯苯 （DNCB ) 丙酮溶液 0.02ml/只背部皮下注射致敏。各组分别按 20ml/kg每日灌胃给相应受试药物 1 次， 连续 10天。末次灌胃给药后 30min， 小鼠右耳涂以 1%DNCB麻油溶液 0.3ml激发。 24h后处死动物， 剪下左右两耳， 用打孔器 （直径 9mm ) 分别在同一部位取下元二片， 电子天平称重， 计算小鼠耳廓肿胀度 （小鼠右耳廓重与左耳廓重的差值）， 并计算肿胀 百分率 （肿胀度 /左耳重）。 再取 KM小鼠 50只， 操作同上， 在致敏期间并不给药， 仅 在激发后 lh和 13h灌胃给药 2次， 计算小鼠耳廓肿胀度， 并计算肿胀百分率。

表 2三七药酒对小鼠迟发性超敏反应的影响 （X± s， n=10 )

剂量 （g/kg ) 抗体积数

激发前给药 激发后给药

模型组 3.07±1.64 3.31±1.80

阳性药组 0.31 0.96±0.7 2.66 ±3.90'

三七药酒低剂 0.16 1.28±1.33' 3.04±1.6 ^A

组

中剂量组 0.31 0.86±0.62 ^A 1.9±2.7 ^{A B}

高剂量组 0.62 0.61±0.52 ^A 1.3±2.2 ^{A B}

注： 与模型组相比， AP<0.05， A <0.01 ; 与阳性药组相比， 口尸<0.05， ΜΡ<

0.01

致敏后给药，三七药酒对 DNCB诱导的迟发性超敏反应具有显著的抑制作� �，与模 型组相比具有统计学意义 （^<0.05或^<0.01 )， 在激发后给药， 三七药酒各剂量组能 够在一定程度上对抗由 DNCB诱导的迟发性超敏反应。

( 3 ) 大鼠纽扣肉芽肿试验

取雄性 SD大鼠 50只， 体重 180〜220g， 随机分为 5组， 即模型组， 阳性药组， 三 七药酒低、 中、 高剂量组， 每组 10只， 以 4%戊巴比妥 （40mg/kg) 麻醉， 仰卧位固定 大鼠， 腹部去毛， 用碘酒和酒精消毒后， 腹部正中切开， 向两侧腹股沟处， 缝合切口。 切口常规消毒， 整个手术过程注意无菌操作。 除模型组外， 其余各组大鼠分别灌胃给予 受试药物， 每日 1次， 共 10天。 于末次给药后 24h， 处死大鼠， 取出肉芽组织， 称取肉 芽组织的湿重； 然后将肉芽组织放入 80°C烘箱中烘 24h， 取出， 称取肉芽组织干重。 比 较各组间差异， 并计算抑制率。

抑制率 （％) = (对照组肉芽干重 -给药组肉芽干重） /对照组肉芽干重 * 100% 三七药酒中、 高剂量组均可降低肉芽组织干重， 与模型组相比具有统计学意义

<0.05或 P<0.01 )。 表 3三七药酒对纽扣肉芽肿的影响 （X± s n=10 )

组别 齐 11量 （g/kg: 干重 （mg ) 干重抑制率

(%)

模型组 - 252.7±30.5 - 阳性药组 0.20 181.4 ±26.0 ^Δ 28.2

三七药酒低剂量组 0.10 182.4 ±25.3 ^Δ 27.8 中剂量组 0.20 176.0 ±25.0 ^Δ 30.3

高齐 11量组 0.40 165.5 ±27.0 ^Δ 34.5

注： 与模型组相比， ΑΡ<0.05， Α <0.01

( 4 ) 足趾肿胀试验

取雄性 SD大鼠 50只， 体重 180 220g， 随机分为 5组， 即模型组、 阳性药组、 三 七药酒低、 中、 高剂量组， 每组 10只。 除模型组外， 其余各组大鼠分别灌胃给予相应 受试药物， 每日 1次， 共 5天。 末次给药 lh后， 将大鼠后肢拉直， 用 26号针头自足趾 中部皮下向上注入一部分致炎剂（0.1%角叉菜� � 0.1ml ) , 然后调转针头项下注射完， 分 别于注射致炎剂前及注射后 1 2 4 6h时用测厚仪测定大鼠足趾的厚度， 比较各组间 的差异。

三七药酒对角叉菜胶诱发的大鼠足趾肿胀具有 较强的抑制作用。

表 4三七药酒对足趾肿胀的影响 （mm X± s n=10 )

.别 剂量 注射前 注射后

(g/kg) lh 2h 4h 6h 8h

；型组 - 5.12±0.31 5.54±0.14 5.91 0.20 6.40 0.24 6.46 0.22 6.51 0.12 性药组 0.20 5.13±0.29 5.53 0.37 5.52±0.30 ^A 5.98±0.21 ^A 6.02±0.19 ^A 6.12±0.20 ^A

.七药酒低剂量 0.10 5.12±0.23 5.54±0.26 5.80±0.35 ^A 6.07±0.22 ^A 6.27±0.21 ^A 6.26±0.20 ^A 剂量组 0.20 5.13±0.26 5.47±0.18" 5.51±0.30 ^A 5.55 0.19" 5.82±0.17" 5.94±0.21"

-剂量组 0.40 5.11 0.26 5.38 0.22" 5.50±0.20 ^AD 5.48 0.16" 5.53 0.17" 5.64 0.16 ^AB 注： 与模型组相比， AP<0.05 AP<0.01 ; 与阳性药组相比， DP<0.05， 國<0.01 实施例 6: 长期毒性

实验材料： SD大鼠 80~100g， 本发明所用三七药酒为实施例 1所制备， 人参皂苷 Rgl含量 0.20mg/ml， 淫羊藿苷含量 32.22 μ g/ml， 补骨脂素及异补骨脂素含量 60.54 μ g/ml, 未检出乌头碱， 蝎毒多肽分子量小于 6.5kDa。 阳性药 （为云南希陶绿色药业股份 有限公司提供的三七药酒， 根据实施例 4检测结果， 人参皂苷 Rgl含量 0.15mg/ml， 淫 羊藿苷含量 30.61 g/ml， 补骨脂素及异补骨脂素含量 62.76 μ g/ml， 乌头碱含量为 1.25 g/ml, 蝎毒多肽分子量小于 20.1kDa。

给药前， 将本品至 40~50°C减压浓缩至相应的浓度。

取大鼠 150只， 随即分为 5组， 每组大鼠 30只， 雌雄各半， 空白对照组灌胃给等 浓度白酒 10ml/kg/天，三七药酒低、中、高剂量组分别灌� ��给予按生药量计算含药 0. lg/kg/ 天， 0.6g/kg/天， l.Og/kg/天。 每天观察期行为表现， 粪便性状及其他症状体征。 每周测 体重一次， 根据体重变化调整药量。

给药 3个月、 6个月及停药 4周后，每次、每批大鼠麻醉（戊巴比妥钠 80~100mg/kg) 10只，雌雄各半，腹部主动脉取血，放血致死� ��进行血常规检查，包括红细胞计数（RBC)、 白细胞计数（WBC)、 血小板计数（PLT)、 血红蛋白 （Hgb)， 血生化检查， 包括碱性磷 酸酶（ALP)、天冬氨酸氨基转移酶（AST)、丙氨� ��氨基转移酶（ALT)、尿素氮（BUN) 和肌酐 （Cr)， 解剖取出心、 肝、 脾、 肺、 肾， 并进行病理学检查。

三七药酒各剂量组给药大鼠 3个月、 6个月及恢复期后， 各组生命体征及血液学、 主要脏器和足趾均无病理改变， 说明三七药酒各剂量均不影响大鼠骨髓造血功 能， 对肝 肾功能均无损害。 未发现明显毒性靶器官。 本实验表明， 三七药酒在 l.Og/kg/天的高剂 量下无不良反应， 大鼠连续服用 6个月安全， 可以为临床试验提供参考依据。 给药 3个月后 SD大鼠血液生化指标结果

生化学指标 对照组 小剂量组 中剂量组 高剂量组

AST 雄 176.8±22.9 183.4±25.0 176.6±25.5 145.0±26.9

(IUL) 雌 162.1±23.4 168.8±23.2 164.5 ±26.6 137.9±26.2

ALT 雄 51.4±11.5 50.6±10.3 49.9±10.6 46.4±14.3

(IUL) 雌 40.8±7.7 43.0±10.9 38.6±14.3 35.8±13.0

ALP 雄 147.2±16.9 142.1±14.6 152.5±15.9 161.6 + 11.9

(IUL) 雌 136.6±15.7 135.3±16.5 142.0±13.6 151.7 + 17.9 TP 雄 58.7±8.9 59.2±6.9 57.3±4.1 60.9±2.3

(gL) 雌 60.0±5.9 58.3±7.9 58.5±2.9 64.0±3.8

ALB 雄 34.1±9.1 33.1±4.8 33.2±7.6 35.9±8.4

(gL) 雌 36.1±7.1 35.3±4.3 35.9±8.9 36.9±9.1

BUN 雄 4.91±6.56 5.76±14.90 5.63 ±8.88 ^Δ 5.64±13.43

(mmol/L)

雌 5.91±14.35 5.89±15.90 5.94 + 11.78 5.91±13.09

Glu 雄 5.26±0.40 5.27±0.49 5.29±0.26 5.28±0.42

(mmol/L) 雌 5.59±0.62 5.66±0.98 0.64±0.81 5.66 + 1.29

Cr 雄 50.2±3.1 49.8±2.9 49.1±2.3 50.2±1.8

( molL ) 雌 50.2±3.9 50.3 ±2.4 50.0±3.6 49.9±4.5

Tc 雄 1.50±0.47 1.50±1.19 1.49±0.81 1.50 + 1.02

(mmol/L) 雌 1.51±0.99 1.50±0.73 1.49±0.62 1.49±0.67 注： 与对照组相比， △Ρ<0.05， ΑΡ<0.01. 表 6 给药 6个月后 SD大鼠血液生化指标结果

生化学指标 对照组 小剂量组 中剂量组 高剂量组

AST 雄 182.1 ±24.2 198.2±22.3 179.2±20.6 156.1 ±20.0

(IUL) 雌 163.2±18.8 182.6±19.5 162.4±22.4 150.3 ±22.6

ALT 雄 51.2±10.3 49.3 ±10.4 47.3±13.3 45.4±13.0

(IUL) 雌 39.6±9.6 40.3 ±12.9 38.7±16.9 32.4±11.2

ALP 雄 149.1±16.5 138.2±17.4 156.7±14.6 167.2±10.8

(IUL) 雌 139.4±16.3 127.4±8.9 148.0±15.0 161.8±18.5 ^Δ

TP 雄 58.5±4.6 60.9±7.6 58.9±6.1 59.0±5.9

(gL) 雌 59.6±7.5 59.0±5.8 59.5±6.7 60.4±10.5

ALB 雄 36.5±6.9 38.1±6.4 33.5±11.6 35.1±7.3

(gL) 雌 34.2±7.3 37.5±3.8 35.2±9.5 ^Α 36.5±10.9

BUN 雄 5.53±11.83 5.34±17.68 5.92±4.98 5.61±11.74

(mtnol/L) 雌 5.73 ±19.75 5.18±14.90 5.24±5.19 5.92±12.67

Glu 雄 5.28±0.37 5.28±0.54 5.27±0.44 5.29±0.30

(mtnol/L) 雌 5.65±1.08 5.63±1.43 5.60±0.77 5.66 + 1.02

Cr 雄 49.8±3.0 48.7±2.1 49.9±3.4 49.9±3.0

( molL ) 雌 49.4±4.0 50.8±2.9 51.1±1.5 50.1±2.7

Tc 雄 1.50±0.28 1.50±0.78 1.49±0.73 1.49±0.48 ^Δ

(mtnol/L)

雌 1.50±0.79 1.50±0.60 1.51±0.34 1.49±0.94 注： 与对照组相比， △Ρ<0.05， ΑΡ<0.01. 恢复期后 SD大鼠血液生化指标结果

生化学指标 对照组 小剂量组 中剂量组 高剂量组

AST 雄 176.2±17.3 173.1±19.3 176.0±16.9 180.9±19.5

(IUL) 雌 164.4±18.5 162.7±21.6 168.1±15.7 161.7 + 22.2

ALT 雄 50.0±11.7 50.5±11.8 51.5±13.4 49.2±37.6

(IUL) 雌 39.9±9.3 40.5±15.0 40.4±15.2 37.6±16.8

ALP 雄 147.8±14.8 143.5±18.6 145.2±16.0 146.3±15.8

(IUL) 雌 132.4±15.8 135.6±16.9 132.1±17.8 133.1±12.5

TP 雄 63.4±3.2 58.3±8.1 58.3 ±6.0 59.4±8.6

(gL) 雌 59.1 ±10.2 59.8±8.4 59.6±7.7 59.5±3.1

ALB 雄 34.3±5.0 35.1±9.2 35.0±5.5 36.9±7.1

(gL) 雌 32.2±2.5 36.4±9.0 32.9±1.1 36.8±9.3

BUN 雄 5.89±5.42 5.37±15.91 5.98±8.42 5.71±12.49

(mmol/L) 雌 6.01±11.45 5.73±16.28 5.73±12.19 5.39±9.81

Glu 雄 5.27±0.27 5.27±0.22 5.28±0.58 5.28±0.53

(mmol/L) 雌 5.63 ±0.76 5.65±1.60 5.66±1.19 5.63±1.01

Cr 雄 50.6±3.2 50.6±3.0 49.5±2.3 50.2±2.6

( molL ) 雌 50.2±2.7 49.6±3.6 48.9±2.9 49.7±3.4

Tc 雄 1.50±0.59 1.50±0.63 4.50±0.84 1.51±0.41

(mmol/L) 雌 1.50±0.78 ±1.49±0.67 1.49±0.88 1.50±0.86 注： 与对照组相比， ΔΡ<0.05， ΑΡ<0.01.