La présente invention concerne un procédé perfectionné pour l'obtention de liposomes unilamellaires de diamètres élevés et leur application pharmacologigue pour l'encapsulage d'un principe actif en vue de son administratio extemporanée.

Au cours de ces dernières années, de nombreu études ont montré que les liposomes peuvent être utilisés pou l'encapsulage et le transfert d'une substance active dans les cellules. A cet effet, des vésicules de phosphdlipide ont principalement été préparées par des techniques physiques comme les ultra sons, la technique dite de "French press" ou des techniques chimiques, en utilisant des solvants organiques ou des détergents, suivies de l'élimination de ces derniers.

Or les liposomes obtenus à l'heure actuelle présentent, soit des structures, s ^' oit des dimensions ne permettant pas toujours, soit d'encapsuler certaines macro¬ molécules présentant un certain encombrement, soit d'encap¬ suler une quantité relativement importante de substance active, les quantités encapsulées jusqu'à présent restant limitées à certaines valeurs.

Les demandeurs se sont par conséquent fixé comme objectif de trouver un procédé de préparation de gros liposomes unilamellaires, d'une part capables d'encapsuler des macromolécules de dimensions importantes (protéines ou acides nucléiques), et d'autre part, capables d'encapsuler des quantités d'une substance active plus importantes qu'il n'était possible jusqu'à présent. Par ailleurs, ce procédé devrait être suffisamment modéré et plus spécialement devrait éviter le contact avec un solvant organique dénaturant les protéines ou des énergies élevées telles que- 1'émission d'ultra-sons ou l'application de pressions susceptibles de

briser les molécules d'acides nucléiques. La technique faisant appel* à un détergent semble être la meilleure façon de préserver la structure et l'activité de ces macromolécules. L'élimination du détergent par dialyse ou par la technique de filtration sur gel fournit des liposomes unilamellaires. Le volume interne de ces liposomes varie avec la nature du détergent, le rapport molaire du détergent aux phospholipides, la composition en lipides des vésicules et la vitesse de dialyse. La dimension des vésicules s'est avéré être différente en taille mais du même ordre de grandeur, que ce soit après dialyse ou après filtration sur gel. Toutefois, la rareté et/ou le coût de la molécule à encapsuler (anti¬ corps, enzymes, gènes purifiés ou porteurs de ARN) nécessite un taux d'encapsulation très élevé et exclut les techniques exigeant de grande quantités de substance à encapsuler comme celle de l'élimination du détergent par filtration sur gel.

Le procédé selon la présente invention est fondé sur la technique de 1'élimination du détergent par dialyse et en constitue un perfectionnement. En effet, un des principaux inconvénients que l'on rencontre lors de la forma¬ tion de liposomes par la technique mettant en oeuvre des détergents réside dans le fait que l'élimination du détergent n'est jamais totale ; il reste une quantité très souvent non négligeable de détergent, même après une dialyse poussée.

C'est ainsi qu'avec les détergents habituellement utilisés, en particulier le cholate ou le desoxycholate de sodium et le "Triton X 100", la quantité résiduelle peut aller de quelques % à 10 %. Or, les demandeurs ont trouvé de façon imprévisible que si l'on utilise comme détergent pour la solubilisation de lipides, en vue de la formation d'un liposome, un détergent neutre présentant une concentration critique micellaire élevée, sous certaines conditions de dialyse, son élimination rapide et quasiment totale peut

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être obtenue, permettant ainsi de réaliser des liposomes encapsulant un principe actif tel qu'un médicament pratique¬ ment exempt de détergent.

Par ailleurs, on obtient des liposomes 5 unilamellaires de diamètre élevé pouvant aller de 200 à 1 000 nm et donc capables d'encapsuler, soit de grosses molécules en quantités appropriées, soit des quantités importantes de molécules moins encombrantes palliant ainsi les inconvénients inhérents aux liposomes connus. ° En vue de l'application particulière en tant que véhicule de médicament pratiquement exempt de détergent, les demandeurs ont constaté que, comme détergent répondant à la définition ci-dessus convenant selon l'inven¬ tion, on peut citer 1 'octylglucoside qui présente en outre la propriété d'être compatible avec une grande quantité des substances actives que l'on viendrait à encapsuler.

Suivant une autre caractéristique de l'inve tion, on utilise de préférence un rapport détergent : lipides de 10 : 1 à 12 : 1. Suivant encore une autre caractéristique, l'élimination du détergent est effectuée au moyen de polymère de synthèse, avantageusement sous forme de billes, choisis de préférence parmi les polymères de synthèse à pouvoir adsorbant élevé du type styrène-divinylbenzène, disposés dans le milieu de dilution.

Suivant enfin une autre caractéristique, l'élimination du détergent est d'autant plus totale et rapide que le rapport détergent/billes (μmole/mg) est faible.

L'invention couvre également le procédé ci-dessus, appliqué à l'encapsulage d'une substance active, caractérisé par le fait que l'on ajoute aux lipides désirés, solubilisés dans le détergent conforme à l'invention, la substance à encapsuler et que l'on élimine ledit détergent au moyen desdits polymères de synthèse à grand pouvoir adsorbant.

Elle couvre également la préparation extem- poranée d'un médicament, consistant à prélever le volume désiré d'un mélange de la solution mixte de lipides, de détergent et de la substance à encapsuler, à procéder à 1'élimination du détergent avantageusement après contact direct avec les billes, puis à injecter au patient le liposome exempt de détergent.

Suivant un mode de réalisation avantageux, au moment de l'emploi, on opère au moyen d'une seringue de prélèvement chargée de l'agent adsorbant le détergent et munie à sa base d'un filtre ou tamis approprié.

D'autres avantages et les caractéristiques de 1*invention ressortiront plus clairement de la description qui va suivre. Comme indiqué précédemment, l'une des princi pales difficultés rencontrées lors de la formation des liposo par la technique faisant appel à un détergent solubilisant réside dans le fait qu'une quantité résiduelle non négligeable de déterge subsiste dans le liposome obtenu même après avoir eu recours, pour l'élimination dudit détergent, à une opération de dialys poussée (quelques pour cent dans le cas du cholate ou du desoxycholate et environ ^' 10 % dans le cas du Triton X-100). Or, si l'onchoisit par exemple de l'octylglucoside comme détergent, on constate qu'il peut être éliminé presque complètement (quantité résiduelle inférieure à 0,05 %) et rapidement. On attribue ce résultat inattendu et imprévisible et c'est ce qui constitue le fondement de l'invention et en fait son intérêt, au fait que ce détergent présente une concentration micellaire très élevée qui facilite son rejet rapide de complexes micellaires mixtes. On a constaté aussi de façon assez générale qu'un rapport molaire d'un tel détergent : lipide compris entre 10 : 1 et 12 : 1 convenait pour obtenir une solution limpide de lipide. On notera que la présence de cholestérol ne modifie pas le degré de solubi- lisation de mélanges de lipides.

Pour ce qui est de l'élimination de ce détergent, on a utilisé la dialyse et un polymère adsorbant de haute porosité avantageusement sous forme de billes, ce polymère étant choisi de préférence parmi ceux formés de styrène-divinylbenzène du type "A berlite X AD-2", commercia¬ lisées par la Société BIO RAD sous le nom de "Bio Beads SM2".

Des essais effectués avec ce type de billes mais avec, comme détergent, outre 1'octylglucoside, le "TRITON X-100" et le desoxycholate de sodium, montrent que l'adsorption du détergent et donc de 1'octylglucoside était fonction du rapport détergent/billes. De plus, comparativemen à l'adsorption correspondante du TRITON X-100, on note que 1*octylglucoside se fixe plus rapidement sur ces billes que le TRITON X-100. Par ailleurs, on observe qu'il existe un rapport détergent/billes optimum au-delà duquel l'élimination du détergent n'est plus améliorée. Ce rapport optimum est de "0,11"pour l'octylglucoside (1 μmole de détergent/9 mg de billes) et il correspond à un rejet total du détergent du milieu, alors que ce même rapport optimum est de "0,05" dans le cas du TRITON X-100 (1 μmole détergent/20 mg de billes) avec une quantité résiduelle de 0,25 % de détergent, quantité que l'on ne peut pas réduire en ajoutant une quantité supplé¬ mentaire de billes (29 mg de billes/μmole de détergent) . Ceci confirme ce que tout homme de l'art sait de la difficult qu'il y a à éliminer le TRITON X-100 de tels milieux. Toutefo ceci montre le net perfectionnement apporté lorsque l'on procède avec les moyens de l'invention.

Une autre série d'essais a permis aussi d'apprécier la capacité de liaison desdites billes avec les phospholipides au cours d'une préparation typique de liposomes en utilisant le contact direct entre des micelles mixtes détergent-phospholipide et des billes telles que définies ci-dessus, et de comparer aussi les effets du TRITON X-100 et de 1Octylglucoside sur ce phénomène. A cet effet, on a solubilisé une quantité identique de lipides

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(rapport molaire PC/PS de 1 :1 - PC désignant la phosphatidyl- choline et PS la phosphatidylserine) au moyen de ces déter¬ gents avec un rapport molaire détergent/phospholipides de 8 puis on a mélangé des échantillons de ces milieux avec 5 lesdites billes et on a déterminé par voie d'analyse cinétiqu les concentrations des solutions. Dans ces conditions, on peut obtenir des liposomes dans un très court laps de temps. Toutefois, on constate qu'une importante quantité de lipides semble se fixer aux billes dans les deux cas. En fait, il ne 0 s'agit que d'une dilution due au volume de liquide emprisonné par les billes. Donc il n'y a pas de perte de lipide par fixation.

En tout état de cause, on constate qu'au delà d'un certain seuil de concentration en billes, cette élimination totale 5 et rapide de ce détergent est obtenue quelle que soit la quantité de billes utilisée. Cette élimination est cependant d'autant plus rapide que le rapport détergent/billes (μmole/mg) est faible. Par ailleurs, la quantité de lipide présente dans le mélange (telle qu'elle peut être déterminée 0 à l'aide de C-PC) semble décroître lorsqu'augmente la quantité de billes dans le milieu (dilution des lipides par le volume interne des billes) .

Ces résultats mettent de toute façon bien en lumière l'aptitude des billes en cause à adsorber de 5 nombreux composés différents, que leurs molécules soient neutres ou chargées. Cette aptitude des billes de polystyrène n'avait pas été signalée jusqu'à présent. Toutefois, cette technique impliquant un contact direct avec les billes peut ne pas convenir pour l'encapsulage de certaines ° macromolécules.

Or de tels milieux et de telles billes peuvent avantageusement être utilisés pour un tel encapsulage et ce, conformément à l'invention, en procédant par la technique de dialyse. 5 C'est ainsi par exemple, qu'au cours d'une série d'essais, on a procédé à l'hydratation de 20-30 μmoles

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de lipides séchés, soit au moyen de 0,125 ml d'une solution tamponnée d'anticorps fluorescent (1,25 mg de protéine), soi au moyen d'une solution de tARN (400 μg/ml) puis à leur solubilisation au moyen d'octylglucoside en utilisant un rapport molaire détergent/lipide de 10:1, dans un volume final de 0,675 ml. On a procédé à la dialyse contre 100 ml de solution tampon contenant des quantités différentes de billes (0,04 à 0,1 μmόle de détergent/mg de billes). On a alors comparé les résultats obtenus par cette technique avec ceux obtenus par dialyse classique en changeant quatre fois un volume de 1 000 ml de solution tampon.

Pour un rapport de détergent/billes inférieur à 0,1, toutes les molécules de détergent sont adsorbées en moins d'une heure par contact direct entre le détergent et les billes. On obtient les mêmes résultats

24 heures plus tard lorsqu'on ajoute les billes au milieu de dialyse. On constate qu'un tel rapport inférieur à 0,1 accélère l'élimination du détergent. L'essai comparatif montre ainsi que cette technique donne une élimination de détergent plus rapide avec 100 ml seulement de solution tampo .

On a vérifié aussi que cette dialyse utilisant ces billes ne modifie pas la concentration en lipides. Par ailleurs, on a mesuré, par microscopie électronique, les diamètres des vésicules obtenues. On constate que les liposomes en question présentent une répartition dimensionnelle très homogène.

L'exemple ci-après illustre un type de liposome que l'on peut obtenir en mettant en oeuvre l'inventi

Exemple :

1/ Préparation du mélange lipide-octylglucoside :

On mélange dans différentes proportions les lipides (stockés à - 30° C dans un mélange 2 : 1 (v/v) de chloroforme et de méthanol) et on ajoute si on le désir pour les besoins de l'expérimentation, une quantité

appropriée de phosphatidylcholine /C J comme élément traceur. On évapore le solvant en soumettant le mélange (concentration finale 10-30 mM) à un courant d'azote puis sous vide pendant une heure. On ajoute ensuite la substance à encapsuler avec une solution tampon (L)

/"10 mM Hepes (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-piperazineéthane- sulfonique) (pH = 7,4) / 1 mM EGTA / 150 mM NaCl/ et après agitation au Vortex, les lipides sont hydratés 30 minutes à une température supérieure à la température de transitio la plus élevée des constituants du mélange. On ajoute alors le détergent (octylglucoside) avec, si nécessaire, une quantité appropriée du même détergent radioactif comme traceur pour les besoins de l'expérimentation. La suspension des liposomes multilamellaires se transforme en une solution limpide. Un tel mélange, scellé sous vide dans une ampoule, devrait pouvoir se conserver plusieurs mois. / Elimination du détergent et formation des liposomes : unilamellaires encapsulant la substance active :

On prélève le volume désiré de la solution mixte ci-dessus (lipide + substance active + détergen et on le dialyse contre 100 ml de tampon contenant une quantité de billes telles que définies précédem- ment et dans le rapport optimum. On agite quelques heures : il se forme des liposomes unilamellaires contenant, encapsulée en leur sein, la substance active ajoutée. Ces liposomes sont alors prêts à 1'emploi.

Le tableau ci-dessous illustre quelques caractéristiques de types de liposomes obtenus conformément à 1'invention avec élimination par dialyse.

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* Le volume total encapsulé a été calculé sur la base d'une surface tot •2 de 75 A par molécule de phospholipide, par l'équation :

% d'encapsulaticn = 37 x M x d x 10 2 où M ≈ concentration des phospholipides (mol/litre) et d = diamètre (μm)

Comme on peut le voir à l'examen de ce tableau, le diamètre des liposomes varie dans une large mesure avec la composition des lipides. Les liposomes PC-PS ont un diamètre de 200 nm, alors que l'addition de cholestér donne des vésicules présentant un diamètre de 1.000 nm. Cet effet du cholestérol sur la dimension des vésicules est conn

L'examen au microscope électronique a montré que ces vésicules sont unilamellaires. Ceci est confirmé par la comparaison du volume du compartiment intra¬ vésiculaire (donné par l'équation ci-dessus rappelée) avec celui auquel on s'attend pour les vésicules unilamellaires et mesuré dans la même préparation de liposomes par microsco- pie électronique. Le compartiment intravésiculaire est mesuré

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en encapsulant soit des anticorps couplés à de la fluorescéin soit des ARN ; on en déduit le diamètre suivant la relation connue entre les dimensions vésiculaires et le % de volume de substance encapsuléedans les vésicules unilamellaires. . Le tableau ci-dessus établit une nette correspondance entre les diamètres obtenus par ces deux techniques. Ainsi les. liposomes de 1'invention sont principa¬ lement unilamellaires.

En outre, ces liposomes renferment une quantité très importante de substance encapsulée, à savoir

35 1/mole de lipide dans le cas des liposomes PC-PS-cholestér Cette quantité est bien supérieure à celle que l'on peut obtenir par exemple par évaporation avec inversion de phase qui serait de 10 1/mole de lipide. De plus, une quantité raisonnable de lipide (13 mM) permet l'incorporation d'une proportion allant jusqu'à 50 % de macromolécules, ce qui est comparable aux résultats que l'on peut avoir dans le cas de l'inversion de phase. Par ailleurs, en raison du potentiel élevé créé dans de petits liposomes chargés, l'encapsulage de molécules portant la même charge est réduit. Ceci élimine la possibilité d'utiliser de petits liposomes contenant des PS pour encapsul des acides nucléiques. Or, les liposomes de l'invention évite cette contrainte et permettent le même taux d'encapsulage, aus bien pour les ARN que pour les IgG qui sont des protéines légèrement positives.

Ainsi les liposomes de l'invention présente toutes les propriétés recherchées pour le transfert de macromolécules à des cultures de cellules. De grosses vésicul sont plus efficaces pour des travaux portant sur le transfert de macromolécules à des cellules en raison du fait qu'elles peuvent encapsuler une quantité plus importante de substance par masse de lipides. C'est ainsi, par exemple, qu'un liposom

7 de 1 000 nm véhicule 3.10 molécules lorsqu'il est chargé avec une solution 1 M. De ce fait, la capture d'un liposome par cellule semble couvrir la plupart des cas. De plus, la composition de lipide (PC-PS-cholestérol) n'est pas toxique

à l'égard de nombreuses cellules et permettrait même la fusion avec des membranes cellulaires sous des conditions connues pour favoriser ce phénomène comme, par exemple, l'utilisation de poly(éthylèneglycol) . Dans ce cas, les 5 liposomes unilamellaires de l'invention rendent le processus plus aisé.

Les IgG et ARN ne sont pas dénaturés et gardent toute leur activité après leur encapsulage. Le taux élevé d'incorporation (jusqu'à 50 % pour 13 mM de phos- ° pholipide) fait que l'invention convient très bien pour l'encapsulage de macromolécules qui sont normalement diffici à obtenir en grandes quantités telles que les RNA, les anti¬ corps monoclonés et les ADN monoclonés.

2.2. Pré-garation_extemgoranée :

Une application fort intéressante découlant de ces propriétés consiste à préparer et à administrer extemporanément un médicament à un patient en mélangeant directement la solution mixte (lipide + substance active + détergent) aux billes. Pour cela on procède de la façon suivante : Après avoir obtenu la solution mixte de lipides, , de détergent et de la substance à administrer comme décrit ci-dessus, on procède à un prélèvement de cette solution au moyen d'une seringue munie à sa base d'un tamis et renfermant des billes telles que définies précédemment. Au bout de quelques minutes d'agitation, on peut, avec la même seringue, injecter les liposomes unilamellaires dépourvus de tout détergent et contenant la substance active résultant de cette opération conforme à l'invention avec un taux d'encapsulatio compatible avec la quantité de lipides utilisée.

Il va du reste de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre purement explicatif et nullement limitatif et que toute modification utile pourra y être apportée sans sortir de son cadre.