生物医药范畴， 更确切说是应用人工合成显色基质， 利用真菌细胞壁成分 （1-3 ) -β-D葡聚糖激活东方鲎 血细胞裂解物中 G 因子， 从而水解合成显色基质 Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN (N， N-二乙氨基苯胺）、 Boc-leu-Gly-Arg-DIAN或 Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN (N，N-二乙氨基苯胺）进而发生缩合反应而定� �检测（ 1-3 ) -β-D 葡聚糖方法及相关应用于临床诊断深部真菌感 染的产品。

背景技术：

经初步检索， 未査到以人工合成显色基质 Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN (N， N_二乙氨基苯胺)制备成比色检 测真菌细胞壁成分 （1-3 ) -β-D 葡聚糖试剂专利。

发明内容：

本发明是以人工合成显色基质 Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN (N， N-二乙氨基苯胺）、 Boc-leu-Gly-Arg-DIAN 或 Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN (N， N-二乙氨基苯胺）利用微量（1-3) - β -D葡聚糖特异性地激活东方鲎血细胞裂 解物中含有的 G因子、 凝固酶原及凝固蛋白原，从而诱发东方鲎血细 胞裂解物凝固化反应。 被激活的凝固 酶水解合成显色基质释放出显色基团 DIAN (N，N-二乙氨基苯胺)， DIM与 1_萘酚 _4_磺酸钠、 （1-萘酚 _2_ 磺酸钠或 1-萘酚 -5-磺酸钠） 在高碘酸钠存在下生成蓝色缩合物，在 630-680nm波长处，酶原激活量与形成 的缩合物的吸收度在一定范围内呈线形关系， 从而定量检测出样品中（1-3) - β -D葡聚糖浓度。 该试剂盒可 以用来早期诊断临床深部真菌感染。 参照说明书附图将本发明内叙述如下：

一、 合成显色基质

采用生物技术人工合成 Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN (N, N-二乙氨基苯胺）、 Boc-leu-Gly-Arg-DIAN或 Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN (N，N-二乙氨基苯胺)类显色基质。 具体合成工艺 （见工艺路线图）。

二、 东方鲎血细胞裂解物提取、 分离

2. 1 血细胞裂解液配制：其中裂解液中成分应含有 Na ⁺ ， Mg ²⁺ , Ca ²⁺ 等金属离子，调节 pH后并进行 121 °C 90 分钟灭菌处理后方可使用。

2. 2 血细胞裂解： 无菌操作， 取约 20g血细胞， 按照 1-5比例加入血细胞裂解液， 并用高速均浆机进行 200000 rpm/min, 5-10分钟破损细胞， 将破损后的组织细胞液放入 _30 °C冰箱内快速冷冻保存 10 小时，之后将冷冻细胞液取出，在室温下缓慢 溶解，待全部溶解后，再用高速组织均浆机进 行 200000 rpm/min， 5-10 分钟破损细胞， 然后将破损后的组织细胞液再次放入 _30 °C冰箱内快速冷冻保存 10小时， 重复上次过程 2遍即可。

2. 3 血细胞分离、 提取： 将上述血细胞裂解液取出后进行 3000 rpm/min， 5-8分钟离心， 取上清液， 按照 1-2比例加入氯仿， 剧烈震荡 10分钟， 然后转移至无热原离心沉淀管中在 4 °C下进行 10000 rpm/min， 5_10分钟分离， 仔细取出上清液备用。

三、 显色合成基质及缩合溶液的配制及处理

1、 显色合成基质溶液配制

将显色合成基质用灭菌注射用水溶解， 配制成 6mM浓度， 使用 0. 22um滤膜过滤， 4°C保存备用。

2、 显色液 A

为 6mM的 1-萘酚 -4-磺酸钠溶液 （使用 pH 8. 5 浓度为 0. 05mol的硼酸缓冲液配制）。

3、 显色液 B 为 2%高碘酸钠溶液 （使用注射用水配制）。

4、 显色液 A及显色液 B处理

将上述显色液 A及显色液 B配制后， 分装至西林瓶或安瓿瓶中然后进行冷冻干燥。

5、 显色合成基质溶液处理

将显色合成基质溶液， 分装至西林瓶或安瓿瓶中然后进行冷冻干燥。

四、 反应主剂的制备与标定

1、 取提取、 分离好的东方鲎血细胞的上清液， 加到含有 1. 0M氯化镁 0. 5M氯化钙溶液中， 分装至西 林瓶或安瓿瓶中进行冷冻干燥即为反应主剂。

2、 取上述冷冻干燥好的反应主剂， 按照标示值加入溶解液使其完全溶解，然后用 灭菌注射用水 1-10 倍稀释， 用紫外分光光度计检测， 应在 270 ± 3nm处有吸收峰。

3、 将 （1-3 ) -β-D 葡聚糖标准品用溶解液溶解并稀释成最终浓度 为 100pg/ml溶液， 与反应主剂反 应， 应出现反 S型检测峰。

五、 （1-3 ) -β-D葡聚糖比色检测试剂盒的性能

1、 灵敏度 ：将 （1-3 ) -β-D 葡聚糖标准品用溶解液依次稀释成 1000pg/ml， 500pg/ml, lOOpg/ml, 50pg/ml, lOpg/ml, 5pg/ml的标准系列， 参照试剂盒使用说明书进行检测， 测定各自的吸光度值； 以各标准溶液浓度为 X轴， 以吸光度值为 Y轴作图分析， 其直线相关系数 r应大于 0. 980。

2、 特异性： 在已知 （1-3 ) -β-D 葡聚糖浓度的空白血浆中添加一定量的 （1-3 ) -β-D 葡聚糖标准溶 液， 其检测回收率应在 80-120%之间。

3、 重复性： 对同一样品进行 4回检测， 其吸光度值的 CV值应在 10%以内。

4、 测定范围： 5-500pg/ml之间。

六、 （1-3 ) -β-D葡聚糖比色检测试剂盒的组成

1、 组成如下表所示

2、 质控方法： 使用 （1-3 ) -β-Ρ 葡聚糖标准品， 其标准品试剂盒组成如下。 七、 检测试剂盒操作方法

( 1 ) 样品处理液 检测样品处理液包装有无破裂或液体溢出， 使用砂轮在安瓿颈部进行划痕， 然后使用 75%的酒精棉进行消毒处理， 放置 10分钟再将安瓿开启即可。

(2 ) 样品制备 无菌操作， 使用无菌、 无热原含有肝素类抗凝剂的真空采血管， 收集 2-4ml静脉血， 轻 轻混允， 然后进行 3000rpm/min lmin快速离心分离， 得含富血小板血浆样品， 直接取上清液即可。

( 3 ) 样品前处理 无菌操作， 取 0. 1ml上清液加入装有 0. 9ml样品处理液中， 轻轻混匀， 立刻放入 T01恒 温加热仪中 70° C保温 10分钟， 取出立刻防入冰水浴中冷却 10分钟， 即为待测样品。

( 4) 标准操作法

无菌操作， 将反应主剂安瓿掰开， 加入反应主剂用溶解液 0. 1ml， 轻轻混匀溶解， 然后分别加入标准品稀 释系列、 阴性对照及待测样品各 0. lml，37°C保温 60分钟； 之后分别加入 0. lml合成显色基质， 37°C保温 15 分钟； 取出振摇均匀， 然后加入显色剂 A 50ul，混匀， 再次加入 0. lml显色剂 B，混匀， 室温放置 5分钟， 在 波长 630-680nm检测吸光度。

结果计算方法

按照下列公式计算样品中的（1-3) - β -D-Glucan浓度：

Cspl = (As l - Abl) * Cstd * 10 / (Astd - Abl)

其中： Cspl为样品中的（1-3) - β -D-Glucan浓度；

Cstd 为标准液中的（1-3) - β -D-Glucan浓度；

Aspl样品的吸光度

Abl 空白对照的吸光度

Astd 为标准液的吸光度

测定结果的判断：

参考 Cut off 值为 20 pg/ml. 八、 操作上的注意事项

检测样本

血浆： 使用无菌、 无热源的含有肝素类抗凝剂的真空采血管；

血清： 使用无菌、 无热源的真空采血管；

肺泡灌洗液： 使用无菌、 无热源的真空采血管。

无菌操作， 无论在采血还是转移过程中， 一定要避免（l-3)- e -D-Glu _Can 的污染。

干扰物质

测定过程中外环境的影响以及所使用器具中含 有的（1_3) - β -D-Glucan的污染， 会对测定值产生影响； 尤 其是显色试剂添加前操作一定要避免微生物以 及（l-3)- e -D-Glu _Can 的污染。

以（1-3) - β -D-Glucan为成分的一些药品， 以及纤维素类透析膜进行血液透析时， 都会对测定值产生影响。 蛋白类制剂以及部分抗生素也会对测定值产生 影响。