RUTH, Peter (Zollweg 7A, Melsbach, 56581, DE)
WILHELMS, Tim, Axel (Löhrstrasse 125, Koblenz, 56068, DE)
ROHRER, Christian (Tauberweg 17, Linz, A-4020, AT)
ALUPEI, Corneliu, Lulian (Im Hostert 4, Neuwied, 56567, DE)
RUTH, Peter (Zollweg 7A, Melsbach, 56581, DE)
WILHELMS, Tim, Axel (Löhrstrasse 125, Koblenz, 56068, DE)
ROHRER, Christian (Tauberweg 17, Linz, A-4020, AT)
Ansprüche
1. Pharmazeutische Zubereitung zur Hemmung von Matrix- Metallo-Proteasen umfassend marines Kollagen als Proteasehem- mer .
2. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das marine Kollagen aus Chondrosia renifor- mis gewonnen worden ist.
3. Pharmazeutische Zubereitung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix-Metallo- Protease 13 gehemmt wird.
4. Pharmazeutische Zubereitung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung neben Kollagen weitere Inhalts- und Hilfsstoffe enthält.
5. Pharmazeutische Zubereitung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung Konservierungsstoffe und/oder antimikrobiell wirksame Verbindungen enthält, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die Silbersulfadiazin, Biguanide, Polyhexamethylenbiguanidin, Polyhexa- methylenbiguanidin-Hydrochlorid, Nitroxolin, Octenidin, Tau- rolidin, Chlorhexidin und Benzalkonium-Halogenide und/oder pharmakologisch akzeptable Salze oder Derivate dieser Verbindungen umfaßt.
6. Pharmazeutische Zubereitung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens einen weiteren, Matrix-Metalloproteasen nicht hemmenden Wirkstoff enthält.
7. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der weitere Wirkstoff ein Antibiotikum ist.
8. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß der weitere Wirkstoff ein nichtsteroidales Antirheumatikum ist.
9. Pharmazeutische Zubereitung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Begasung mit Ethylenoxid oder durch Bestrahlung mit 25 kGy sterilisiert wurde.
10. Pharmazeutische Zubereitung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung als Lösung oder Suspension vorliegt.
11. Pharmazeutische Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung als kolla- genhaltiger Schwamm vorliegt .
12. Pharmazeutische Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung eine Wundauflage ist.
13. Verwendung eines marinen Kollagens zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Hemmung der Matrix-Metallo- Proteasen. χ η
14. Verwendung nach Anspruch 13 , dadurch gekennzeichnet, daß das Kollagen aus Chondrosia reniformis gewonnen worden ist.
15. Verwendung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix-Metallo-Protease 13 gehemmt wird.
16. Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung zu einer Wundauflage verarbeitet wird.
17. Verfahren zur Behandlung Matrix-Metallo-Protease- vermittelter Erkrankungen unter Applikation einer pharmazeutischen Zubereitung mit aus Chondrosia reniformis extrahiertem und gereinigtem Kollagen zur Hemmung und Immobilisierung der Matrix-Metallo-Proteasen.
18. Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Behandlung Matrix-Metalloprotease- vermittelter Erkrankungen. |
Zubereitung mit marinem Kollagen zur Proteinasehemmung
Die vorliegenden Erfindung betrifft pharmazeutische Zubereitungen und Hilfsmittel, die marines Kollagen enthalten, zur Hemmung von Matrix-Metallo-Proteasen sowie die Verwendung marinen Kollagens zur Herstellung von Zubereitungen zur Behandlung und Therapie von Erkrankungen, die durch Matrix- Metallo-Proteasen vermittelt sind.
Die Matrix-Metallo-Proteasen (Matrix-Metallo-Proteinasen / Matrix-Metallo-Peptidasen / MMP) bilden eine Enzym-Familie, die in verschiedenen Zellen gebildet wird und die für die extrazelluläre Degradation von Makromolekülen verantwortlich ist. Der Name "Matrix-Metallo-Proteasen" ist darauf zurückzuführen, daß die katalytische Aktivität der Proteasen auf einem Zinkatom im katalytischen Zentrum beruht und die strukturelle Stabilität des Proteins durch Kalium gewährleistet wird.
MMPs werden in vier verschiedene Klassen eingeteilt, wobei diese Einteilung unter anderem aufgrund der Domänenstruktur und bevorzugter Substrate erfolgt, so daß beispielsweise KoI- lagenasen und Gelatinasen unterschieden werden.
Aufgabe der MMPs ist die Hydrolyse von Komponenten der extrazellulären Matrix wie Kollagenen, Gelatine, Nektinen, Lamini- nen, Elastin und Core-Proteinen der Proteoglykane. Sie spielen daher bei den physiologischen Prozessen der Gewebeumwandlung, beispielsweise in der Embryonalentwicklung, dem Wachstum, aber auch in der Wundheilung und in pathobiologischen Prozessen eine entscheidende Rolle.
Während MMPs unter "normalen Bedingungen" in Haut, Gewebe und Gelenken praktisch nicht oder nur in geringen Konzentrationen
nachgewiesen werden können, treten sie bei Verletzungen der Haut und bei Erkrankungen wie Rheuma und Arthritis verstärkt auf. Darüber hinaus konnte ihre Wirkung bei der Tumorbildung und Metastasierung verschiedener Tumore gezeigt werden. So ist beispielsweise die MMP 13 bei zahlreichen Malignomen hochreguliert .
Neben der Behandlung der zuvor genannten MMP-vermittelten Erkrankungen wie Rheuma und Arthritis, die bei einer Vielzahl älterer und zunehmend auch jüngerer Patienten auftreten, stellt auch die Heilung von Wunden, in denen naturgemäß erhöhte MMP 13 -Konzentrationen nachgewiesen werden können, seit jeher ein Problem dar. Dieses gilt umsomehr für chronische Wunden, wobei unter chronischen Wunden solche verstanden werden, die nach 6 - 8 Wochen keine Tendenz zur Heilung zeigen und unter denen nach aktuellen Schätzungen ca. vier Millionen Menschen in Deutschland leiden, wobei jährliche Behandlungskosten in Höhe von zwei bis drei Milliarden Euro anfallen.
Ein wichtiger Faktor bei der Ausbildung dieser chronischen Wunden ist, wie bereits erwähnt, ein starkes Ungleichgewicht zwischen der Proteasekonzentration (MMP-Konzentration) im Wundsekret und der Konzentration der korrespondierenden Pro- teasehemitier (TIMP-Konzentration) . Normalerweise erfolgt die Regulierung der MMPs, die nach der Sekretion zunächst aktiviert werden, durch die TIMPs (Tissue inhibitors of metal- loproteinases) . Bei einer Störung dieses empfindlichen Gleichgewichts liegt jedoch ein überschuß an Proteasen vor, der nicht nur neu gebildetes, zur Wundheilung und zum Wundschluß erforderliches Gewebe sofort wieder abbaut, sondern auch gesundes Gewebe angreift und lysiert und Wachstums-
faktoren deaktiviert, wodurch es zu einer kontinuierlichen, teilweise schleichenden Verschlechterung der Wunde kommt.
Studien zur Wundheilung haben gezeigt, daß dagegen in MMP-13- defizienten Wunden die Wundheilung in starkem Maße gefördert und beschleunigt ist.
Eine stärkere Hemmung und eine geringere Aktivität bzw. Konzentration der MMPs, insbesondere der MMP 13, wäre somit ein geeigneter Ansatzpunkt für die Behandlung chronischer Wunden sowie arthritischer und rheumatischer Erkrankungen.
Jn vitro können MMPs durch Chelatbildner wie EDTA inhibiert werden, die das Zink des katalytischen Zentrums oder das strukturell relevante Kalium binden oder blockieren. Darüber hinaus sind zahlreiche pharmakologische Präparate bekannt, die die Aktivität der MMPs hemmen. Allerdings sind diese Hemmer oft wenig spezifisch, so daß sie neben MMPs auch andere Enzyme beeinflussen oder sogar eine zytotoxische oder toxische Wirkung auf den gesamten Organismus ausüben.
Eine alternative, im Stand der Technik bekannte Behandlungsmethode für chronische Wunden ist beispielsweise die Applikation von kollagenhaltigen Wundauflagen, wodurch den in der Wunde sezernierten Proteasen ein alternatives Substrat angeboten wird und die abbauenden Enzyme kompetitiv gehemmt werden sollen.
Ein Problem dieser Behandlung ist, daß die Proteasen eine mangelnde Spezifität gegenüber den verwendeten Kollagenauflagen aufweisen und die Aktivität der MMPs durch den Kollagenüberschuß nur unzureichend gehemmt wird. Ein weiteres Problem ist, daß diese Kollagenauflagen meist aus Rindersehnen oder
Häuten gewonnen werden. Bei dieser Kollagenquelle besteht die latente Gefahr und bei Verbrauchern immer noch die verbreitete Angst, daß die Wundauflagen BSE-Erreger (BSE = Bovine Spongioforme Enzephalopathie) enthalten könnten. Mit der Auswahl alternativer Quellen wie z.B. Pferd oder Schwein kann diese Problematik zwar weitgehend umgangen werden, aber auch hier besteht das Restrisiko einer Infektion mit TSE-Erregern (TSE = Transforme Spongioforme Enzephalopathie) .
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, eine pharmazeutische Zubereitung oder ein pharmazeutisches Hilfsmittel zur Verfügung zu stellen, das die Aktivität der MMPs hemmt und die Wundheilung und chronisch entzündliche Erkrankungen verbessert, ohne dabei die inhärente Gefahr einer Infektion mit Erregern einer spongioformen Enzephalopathie zu tragen, toxische Wirkungen zu zeigen oder andere unerwünschte Arzneimittelwirkungen aufzuweisen.
überraschenderweise hat sich gezeigt, daß pharmazeutische Zubereitungen, die aus marinen Organismen gewonnenes Kollagen (marines Kollagen) , insbesondere aus Chondrosia rβniformls gewonnenes Kollagen, enthalten, eine stark hemmende Wirkung auf die MMP-Aktivität und insbesondere auf MMP 13 ausüben, so daß pharmazeutische Präparate auf Basis dieses Kollagens zur Behandlung MMP-veπnittelter Erkrankungen eingesetzt werden können. Ein Vergleich zu handelsüblichen Kollagenzubereitungen (z.B. aus bovinem oder poreinem Kollagen) zeigte keine Aktivitätsbeeinträchtigung der Proteasen gegenüber dem Kontrollexperiment. Marines Kollagen gemäß der vorliegenden Erfindung wird dabei als Kollagen definiert, das aus marinen Schwämmen (Porifera) oder anderen marinen Organismen ohne Nervensystem gewonnen worden ist.
Ein weiterer Vorteil dieser Zubereitungen mit marinem Kollagen ist, daß der Quellorganismus kein Nervensystem besitzt, so daß die Gefahr einer übertragung von TSE-Erregern und eine damit einhergehende Infektion völlig ausgeschlossen ist.
Weiterhin besitzen die erfindungsgemäßen Zubereitungen nur ein sehr geringes allergenes Potential und die Zubereitungen können vom Organismus vollständig abgebaut werden.
Wie bereits dargelegt, hemmen Zubereitungen mit aufbereitetem marinen Kollagen, das vorzugsweise aus Schwämmen, und besonders bevorzugt aus Chondrosia reniformis, gewonnen worden ist, die Aktivität von MMPs signifikant (s. Figur 1) . Die Abnahme der Konzentration und somit der Aktivität der MMPs zeigt sich dabei bereits eine Stunde nach Applikation der Zubereitung. Die Zugabe weiterer Inhibitoren ist nicht erforderlich, da im Gegensatz zu den bekannten Präparaten die Kollagenpräparate der vorliegenden Erfindung. MMPs hinreichend inhibieren und binden.
Das für die pharmazeutischen Zubereitungen der vorliegenden Erfindungen verwendete Kollagen wird durch Extraktion der Kollagenfraktion aus Chondrosia reniformis und anschließende Reinigung des Extraktes gewonnen, wobei eine Kollagenlösung erhalten wird.
In einer Ausführungsform liegt die pharmazeutische Zubereitung als sterile Kollagenlösung vor. Die Lösung kann sowohl zur Wundbehandlung als auch zur intrakorporalen Anwendung, z.B. zur Injektion in das Gelenk bei Gelenkerkrankungen wie Arthrose, verwendet werden.
Zur Wundbehandlung können beispielsweise handelsübliche, kollagenfreie Wundauflagen mit der erfindungsgemäßen Kollagenlösung getränkt werden.
Eine weitere Ausführungsform sieht vor, daß das Kollagen aus der dargestellten Lösung durch Veränderung des pH-Wertes oder durch Zugabe von Ethanol oder anderer geeigneter, physiologisch akzeptabler Lösemittel zur Herstellung eines Kolloids oder einer Dispersion ausgefällt wird.
Die Viskosität des erhaltenen Kolloids oder der Dispersion kann durch Reduktion der Lösemittel, z.B. durch Entfernung im Vakuum oder durch Zentrifugation, oder durch Viskositätsmodi- fikatoren wie PVP (Polyvinylpyrrolidon) , Polyacrylaten oder Cellulosederivaten, wie z.B. Carboxymethylcellulose (CMC), Hydroxyethylcellulose (HEC) , Hydroxyethylpropylcellulose (HEPC) oder Methylcellulose (MC) , eingestellt werden, so daß ein Gel oder eine hochviskose Lösung entsteht.
Sowohl die Dispersion oder das Kolloid als auch das Gel können dann zur Wundbehandlung oder als Injektion in ein Gelenk zur Arthrosetherapie verwendet werden.
Eine weitere Ausführungsform sieht vor, daß das gereinigte Kollagen aus der Lösung ausgefällt, getrocknet und zu einem Granulat verarbeitet wird, das in Zubereitungen wie Cremes und Salben oder Wundauflagen eingearbeitet wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Zubereitungen poröse Schwämme, die ein marines Kollagen enthalten, bevorzugt Kollagen, das aus Chondrosia reniformis gewonnen und gemäß dem Verfahren nach Beispiel 1 aufbereitet wurde, wobei Wundauflagen zur Hemmung der MMPs, die den Wund-
Schluß beschleunigen, besonders bevorzugt allein aus marinem Kollagen bestehen.
Die Kollagenzubereitungen der vorliegenden Erfindung können dabei neben anderen Wirk- und Hilfsstoffen zusätzlich mindestens einen weiteren, die MMPs nicht hemmenden Wirkstoff enthalten, beispielsweise nichtsteroidale Antirheumatika wie A- cetylsalicylsäure oder Ibuprofen und/oder Antibiotika.
Zur Herstellung der Wundauflagen wird eine aus Chondrosia re- niformis extrahierte und gemäß der Vorschrift aus DE 10 2005 008 416 Al (siehe Beispiel 1) aufgearbeitete Kollagenlösung gefriergetrocknet, wobei ein poröser KoIlagenschwamm entsteht. Der so erhaltene Kollagenschwamm kann in flächige Stücke entsprechender Größe zerteilt und bis zur Verwendung steril verpackt gelagert werden. Um die Lagerfähigkeit des Produktes zu verbessern und um einer Infektion im Produkt verbliebene Erreger vorzubeugen, können der Kollagenlösung anti- mikrobielle Wirkstoffe zugesetzt, die verpackten Einheiten bestrahlt (Dosis: 25 kGy) und/oder mit Ethylenoxid begast werden.
Die Vorteile der so erhaltenen Wundauflagen sind, daß von ihnen keinerlei Infektionsgefahr mit TSE-Erregern ausgeht und die im Wundexsudat vorhandenen MMPs, insbesondere MMP 13, deaktiviert und die Wundheilung gefördert werden. Die Deaktivierung der MMPs ist dabei zum einen auf eine kompetitive Hemmung des Substrats zurückzuführen, da das in den Wundauflagen vorhandene marine Kollagen entweder bevorzugt oder aber langsamer als das natürliche Substrat abgebaut wird, zum anderen darauf, daß in die Auflage aufgenommenes Exsudat gebunden und die MMP 13 immobilisiert wird, so daß ein "Rückfluß"
zur Wundoberfläche und somit der Abbau neu gebildeter Strukturen verhindert und die Wundheilung verbessert wird.
Wie aus Figur 1 ersichtlich, ist eine deutliche Verminderung der Aktivität der MMP 13 bereits 60 min nach Zugabe des Kollagens zu beobachten, während bei handelsüblichen Kollagenzubereitungen eine deutlich höhere Aktivität der MMP 13 und keine Veränderung gegenüber dem Kontrollexperiment zu sehen ist. Die hier gezeigte schnelle und effiziente Aktivitätsmin- derung der MMP 13 ist aber, wie bereits oben beschrieben, eine der Grundvoraussetzungen, um die Wundheilung bei chronischen Wunden einzuleiten. Die Zugabe eines weiteren Inhibitors der MMP 13, z.B. eines unspezifischen Chelatbildners, ist bei den erfindungsgemäßen Zubereitungen nicht erforderlich.
Die Immobilisierung der MMPs in der Kollagenmatrix kann in einer weiteren Ausführungsform dadurch verstärkt werden, daß wundseitig eine semipermeable Membran auf dem Kollagenschwamm angeordnet ist, die die Aufnahme von Exsudat in den Schwamm gestattet, den Rückfluß von Exsudat und Abbauprodukten aber verhindert .
Ein weiterer Vorteil der so dargestellten Wundauflagen ist ihr aufgrund der hohen Reinheit geringes allergenes Potential und die vollständige biologische Abbaubarkeit auch in der Wunde .
Neben Kollagenschwämmen können mittels modifizierter Verfahren wie Ausstreichen und Trocknen auch Kollagenfilme hergestellt werden.
Darüber hinaus ist die Beschichtung von geeigneten Trägerma- terialien wie Folien und Textilgewebe mit Kollagenfilmen und -schwämmen möglich, wobei die Folien und Gewebe sowohl eine undurchlässige als auch eine semipermeable Rückschicht bilden können .
Eine weitere Ausführungsform sieht vor, daß die Rückschicht zusätzlich auf eine der zuvor beschriebenen Auflagen aufgebracht wird, wobei bevorzugt die Fläche der Rückschicht größer als die Fläche des Kollagenschwammes ist und die überstehenden Bereiche mit einem hautverträglichen Haftkleber beschichtet sind, so daß die Wundauflage auf der Haut über der Wunde fixiert werden kann.
Die oben genannten erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen und Hilfsmittel können weiterhin Konservierungs- stoffe und antimikrobiell wirksame Verbindungen (z.B. Silber- sulfadiazin, Biguanide, Polyhexanid, Nitroxolin, Octenidin, Taurolidin, Chlorhexidin, Benzalkonium-Halogenide und pharmakologisch akzeptable Salze oder Derivate der genannten Verbindungen) , Viskositätsmodifikatoren (z.B. Polyvinylpyrroli- don oder Acrylate) , Wachstumsfaktoren und andere Wundhei- lungsfaktoren, Hautschutzmittel (Fettsäuren, Fettsäureester) und dergleichen enthalten.
Darüber hinaus ist eine weitere Sterilisierung der Produkte mittels Strahlung (25 kGy) , durch Begasung mit Ethylenoxid oder mit anderen geeigneten und dem Fachmann auf dem Gebiet bekannten Mitteln vorgesehen.
In den folgenden Beispielen werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung dargestellt.
Beispiel 1: Kollagenaufbereitung
Nach dem in der DE 10 2005 008 416 Al beschriebenen Verfahren wurde ein in einem sauren Medium (pH 3) ausgefälltes Kollagenpräzipitat aus Chondrosia reniformis durch Filtration vom Medium abgetrennt und die Feuchtigkeit auf einen Restfeuchtigkeitsgehalt von etwa 84 Gew.-% reduziert. Anschließend wurden 121 Gramm der Kollagenrohmasse unter zweistündigem Rühren in 1300 ml einer wäßrigen 0,5 %-igen (v/v) H 2 O 2 -Lösung suspendiert und der pH der Lösung mittels einer 5 N NaOH- Lösung auf einen Wert von 12,4 eingestellt, um die Kollagenfasern in Lösung zu bringen. Die resultierende Kollagenlösung wurde zur Entfernung unlöslicher Bestandteile filtriert und anschließend unter kräftigem Rühren in 2600 ml Ethanol (Konz . 98 %) oder, abweichend von der DE 10 2005 008 416 Al, in eine HCl-Lösung mit einem pH von 0-3 gegeben und während der Zugabe in den Grenzen von 0-3 gehalten, wobei das Kollagen mit einer weißen oder leicht gelblichen Farbe in faseriger Form ausfiel. Die Kollagenfasern wurden durch Filtration vom Medium abgetrennt, von anhaftender Feuchte befreit und anschließend unter Rühren in 300 ml Reinstwasser homogen suspendiert. Der pH der Suspension wurde mit einer 5 N HCl-Lösung auf einen Wert von 6,5 eingestellt. Die so erhaltene Kollagenlösung hatte eine Kollagen-Konzentration von 2,8 Gew.-%.
Alle Verfahrensschritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt .
Um gemäß einer alternativen Ausführungsform eine sterile Kollagenlösung zu erhalten, wurden sämtliche Objekte, die mit dem Kollagen in Kontakt kommen, vor ihrer Verwendung mit einer 0,5 %-igen (v/v) H 2 O 2 -Lösung gespült und die gefällten
Kollagenfasern nicht in Wasser, sondern in 300 ml einer wäßrigen 0,5 %-igen (v/v) H 2 O 2 -Lösung suspendiert.
Beispiel 2 :
Aus der in Beispiel 1 hergestellten Zubereitung wird unter Verwendung von Verdickern (z.B. PVP (Polyvinylpyrrolidon) , Polyacrylaten oder anderen, dem Fachmann bekannten Creme- und Salbenbasen) eine Creme oder Salbe zur kutanen Anwendung hergestellt, die bei Applikation in einer Wunde die MMPs hemmt und den Wundschluß fördert.
Ein besonderer Vorteil dieser Zusammensetzung ist der noch in der Salbe verbliebene Wasserstoffperoxidanteil der Kollagenlösung, der zum einen die Haltbarkeit der Zubereitung erhöht und zum anderen in der Wunde eine antiseptische Wirkung entfaltet.
In einer anderen Ausführungsform kann die Kollagenlösung kurzzeitig erhitzt oder mit einem Reduktionsmittel oder Katalysator versetzt werden, um das Restperoxid zu zerstören.
Beispiel 3:
Die nach Beispiel 1 hergestellte Kollagenlösung wird mit 0,5% Wasserstoffperoxidlösung oder mit Reinstwasser auf eine Kollagenkonzentration von 1-2% eingestellt. In der bevorzugten Ausführung wird die Kollagenkonzentration auf 1 Gew.-% und der pH Wert auf 6,1 eingestellt. Die Lösung wird in einer Schale ausgebracht und gefriergetrocknet. Der so erhaltene Kollagenschwamm kann als Wundauflage zur Behandlung schlecht heilender oder chronischer Wunden verwendet werden.
Beispiel 4 :
In einer weiteren Ausführungsform werden der Kollagenlösung vor der Gefriertrocknung antibiotische oder antimikrobielle Wirkstoffe zugesetzt.
Dazu wird der nach Beispiel 1 hergestellten Kollagenlösung unter starkem Rühren eine zuvor in 0,5 %-iger (v/v) H 2 O 2 - Lösung oder Reinstwasser gelöste antimikrobielle Substanz zugesetzt bis der Kollagengehalt 1 Gew.-% beträgt. Die Konzentration der antimikrobiellen Sustanz liegt zwischen 0,5 - 2 Gew.-% bezogen auf das Trockengewicht des Kollagens. Vorzugsweise ist die antimikrobielle Substanz Polyhexamethy- lenbiguanid-Hydrochlorid (Polymerisationsgrad = 12-18) mit einer Konzentration von 1 Gew.-% bezogen auf das Trockengewicht des Kollagens. Die so hergestellten antimikrobiellen Lösungen bzw. Dispersionen werden in eine Schale gegeben eingefroren und anschließend gefriergetrocknet.
Beispiel 5:
In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird eine antimikrobielle Wundauflage durch Imprägnierung mit einer antimikrobiellen Substanz hergestellt.
Dazu werden nach Beispiel 3 hergestellte Kollagenschwämme mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren (z.B. Beschichten oder Besprühen) mit einer antimikrobiell wirksamen Substanz imprägniert. Hierbei wird eine konzentrierte wässri- ge oder alkoholische Lösung (10-50%) einer antimikrobiellen Substanz hergestellt und durch Sprühen oder Beschichten auf den Kollagenschwamm aufgebracht, so daß eine Konzentration der antimikrobiellen Substanz von 0,5 - 2 Gew.-% bezogen auf das Trockengewicht des Kollagens erhalten wird.
In einer bevorzugten Ausführung wird eine wäßrige oder eine ethanolische Polyhexamethylenbiguanid-Hydrochlorid-lösung (20 Gew. -%) durch Sprühen auf den Kollagenschwainm in einer Konzentration von 50 μl Lösung pro Gramm Kollagenschwamm aufgebracht, so daß eine Polyhexamethylenbiguanid-Hydrochlorid- Konzentration von 1 Gew.-% bezogen auf das Trockengewicht des Kollagens erhalten wird.
Beispiel 6:
Die Versuche zur Bestimmung der Hemmung der MMP-13 durch die erfindungsgemäßen Kollagenzubereitungen wurden wie folgt durchgeführt .
1. Probenvorbereitung
Für die Experimente zur Hemmung der MMP-13 wurde aus lyophilisierten Proteinstandards eine Lösung mit einer Konzentrationen 2000 pg/mL hergestellt.
Aus den gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Zubereitungen sowie aus handelsüblichen KoIlägenauflagen wurden mit einer 8 mm Biopsie-Stanze (Stiefel Laboratorium GmbH, Offenbach, Germany) Stücke einheitlicher Größe (je 0,5 cm 2 ) ausgestanzt und in 24-Well-Zellkulturplatten überführt. Jede Probe wurde in 1 mL Proteinlösung aufgenommen und anschließend für 24 h auf einem Schüttler (ThermoStar, BMG Labtech GmbH, Offenburg) bei 37 0 C inkubiert. Die Abnahme des überstandes zur Kontrolle der MMP-13 -Konzentration erfolgte nach 0, 1, 8 und 24 h, wobei die Proben sofort bei -20 0 C bis zur Messung eingefroren wurden. Als Kontrollexperiment wurden Proben ohne Kollagenzubereitung gemessen.
2. Bestimmung der MMP-13 -Konzentration
Die Matrix-Metalloproteinase- 13 -Konzentration wurden mit Hilfe Enzym-markierter Immunosorbent-Assays (Quantikine pro-MMP- 13 Immunoassay DM1300, R&D Systems GmbH, Wiesbaden) quantifiziert. Die Bestimmung der MMP-Konzentration erfolgte im Plattenreader (Fluostar, BMG Labtech GmbH, Offenburg) durch Messung der optischen Dichte (OD) bei 450 um (Referenzwellenlänge: 620 nm) . Anschließend konnte die Enzymkonzentration anhand einer „lin-log" Auftragung (OD bzw. Fluoreszenz - lineare Skala; Konzentration - Logarithmische Skala) mittels 4- Parameter-Fit berechnet werden. Alle Proben wurden in Doppel- bestimmung gemessen, die erhaltenen Werte gemittelt und der Standardfehler berechnet.
Die MMP-13 -Konzentration wurde für jeden Mess-Zeitpunkt durch zwei bis vier unabhängige Ansätze bestimmt. Die einzelnen Messungen erfolgten in Doppelbestimmung. Die in Figur 1 angegebenen Konzentrationen sind die gemittelten Werte aus jeweils 4, 6 bzw. 8 Messdaten unter Berücksichtigung des Standardfehlers. Zur Ermittlung der statistischen Signifikanz wurde eine einfache Varianzanalyse (ANOVA one way) durchgeführt .
Next Patent: SYSTEM FOR GENERATING A USEFUL GAS ENRICHED IN A GIVEN COMPONENT