本发明以药用植物一盾叶薯蓣 （ )/ί« ^α ζ/^/ «^ϊ。.Η. Wright ) 即黄姜为原 料， 采用溶剂提取总皂 柱色谱等方法分离疏水性皂苷组分。黄姜盾叶 新苷进行了体内 外抗肿瘤活性研究， 对结肠癌、 肺癌、 乳腺癌、 宫颈癌、 卵巢癌等肿瘤具有明显地抑 制活性。 背景技术

肿瘤是危害人类健康和生命的主要疾病。全世 界每年约有 500万人死于恶性肿瘤。 近年来， 由于环境的恶化， 以及现代人的工作压力， 疾病的传播， 恶性肿瘤的发病率 呈上升趋势， 并成为继心血管疾病之后的第二大致死病因。 因此， 全球每年投入大量 的人力物力用于研究开发防治癌症的新药物。 近年来， 药物学专家除了研究西药以外， 也对中药进行了很多研究， 对恶性肿瘤形成的机理也进行探讨， 组合化学、 基因工程 等先进技术的发明和应用加速了对恶性肿瘤药 物开发进程。 特别是目前以天然活性成 分为先导化合物寻找新药有广阔的发展前景。 迄今为止已评估了 4万余种高等植物的 抗肿瘤活性。 据国外资料介绍， 全世界己经开发了几百种抗癌新药， 其中有很多属于 天然植物提取物， 近年来， 研究人员从传统中药进行的广泛的筛选， 发现了大量的抗 肿瘤植物， 如红豆杉、 银杏、 喜树、 灵芝等。 但上述植物中， 人们对红豆杉、 喜树碱 的研究较多， 很多植物由于生长缓慢， 资源贫乏， 很难满足市场需求。

近年来人们发现 体皂苷具有广泛的抗肿瘤活性， 是一种高效， 低毒的较理想的 抗癌药物。 甾体皂苷（Steroidal saponins )是一类螺甾垸（spirosanes )化合物衍生物的 寡糖苷。 主要分布在薯蓣科、 百合科、 玄参科、 菝葜科、 龙舌兰科等植物中， 其他科 如石蒜科、 豆科以及鼠李科的一些植物中也含有 体皂苷。 常用中药知母、 天门冬、 麦门冬、 七叶一枝花等都均有大量 体皂苷。 体皂苷经水解脱糖而得的苷元， 除因 作为天然人工半合成 ¾体激素类药物和避孕用药的基础而著名外， 其皂苷本身的药用 价值近十几年来也得到较快发展。 研究发现， 某些皂苷具有降血脂、 降血糖、 抗癌、 抗病毒、 抗菌抗感染、 治疗冠心病及调节生理机能等活性。 菝葜 illin 具有显著 的抗霉菌作用。 蒺藜 buius terresris ) 总皂苷不但用于治疗冠心病， 还可以防止肺 心病、 降血压、 增强性功能与抗衰老等作用。 以黄山药 Dioscorea panthaiapraia et Burkill ) 为原料提取而得的甾体总皂苷制成的地奥心血 康， 用于治疗冠心病、 心绞痛、 气短、 心悸、 胸闷、 胸痛等症状， 总有效率达 90%以上。 可见； 陣着现代分离技术的 进步， 研究手段的发展， 使得极性较大， 糖链复杂的皂苷也有突破性发展， 这将促进 甾体皂苷自身药用价值的发展和利用。

薯蓣皂苷 (dioscin)是 体皂苷中的重要成分， 薯蓣皂苷具有较好的生物活性。前苏 联的科研人员发现高加索薯蓣中的皂苷提取物 有降胆固醇的作用，临床实验也有证明。 80 年代 Ravikumer 等发现云南白药中的薯蓣皂苷有抗癌活性。 另外薯蓣皂苷元 ( diosgenin) 及其苷还有抗关节炎作用。 从重楼、 穿龙薯蓣 D. nipponicc 中分离得 到的薯蓣皂苷具有明显的心血管、 抗肿瘤和抗真菌的活性。 最近几年的研究发现薯蓣 皂苷 (dioscin) 对肺癌、 乳癌、 胃癌、 白血病、 结肠癌、 宫颈癌、 黑色素等肿瘤细胞都 有很好的细胞毒性。 目前， 国内以不同种的薯蓣属植物为原料， 提取其总 体皂苷作 为临床上的降血脂药已有数家工厂生产， 其中用盾叶薯蓣 (D. zingibernsis) 为原料研 制成功的新药 "盾叶冠.心宁"， 临床治疗冠心病、 心绞痛有一定疗效。

经文献检索发现， 在临床上， 体皂苷主要运用于降血脂， 治疗心血管疾病等。 工业上， 盾叶薯蓣作为原料主要用于生产皂素， 作为合成 体激素类药物和避孕药的 原料。 同时， 在临床上主要应用于治疗心血管疾病， 但其 体皂苷的成分并不十分清 楚， 且目前的研究并未涉及抗肿瘤活性研究。 目前， 在甾体皂苷抗肿瘤活性研究中， 薯蓣皂苷 (dioscin), 甾体皂苷元 (diosgenin)等报道较多， 盾叶新苷 (zingiberensis saponin) 并没有文献报道。 发明内容

本发明的目的在于提供一种制备黄姜盾叶新苷 的方法。

本发明的另一个目的在于提供黄姜盾叶新苷在 制备用于治疗或预防癌症的药物中 的用途。

黄姜盾叶新苷 （zingiberensis saponin ) , 其结构特征为：

Zingiberensis saponin (C51H82O22, 1046)

3-O- -D-吡喃糖 -[ ( 1—2 ) - -L-吡喃鼠李糖 ]-[ ( 1—4 ) - -D -吡喃葡萄糖- ( 1— 3 ) - ^ -D-吡喃葡萄糖] -薯蓣皂苷元 （ 3-O-9-Z)-glucopyranosyl(l→3)-g-/)-glucopyranosyl ( 1 ^→ 4)- [«-Z-rhamnopyranosyl( 1→2)] -^-D-glucopyranoside-diosgenin )， 属于螺甾院阜苷，

C3位链接糖基部分，糖基部分含有三分子葡� ��糖和一分子鼠李糖，内侧葡萄糖的 C2 和 C4位分别连有一分子鼠李糖和两分子葡萄糖。

本发明开发了药用植物盾叶薯蓣 Dioscorea Zingiberensis C.H. Wright. ) 疏水性 甾体皂苷的提取分离方法， 确定了主要组分结构， 同时对于黄姜盾叶新苷进行了体内 外抗肿瘤活性研究， 最后将黄姜盾叶新苷开发运用于治疗结肠癌、 肺癌、 乳腺癌、 宫 颈癌、 卵巢癌等恶性肿瘤。 通过质谱 (HR-ESI-MS )、 红外光谱 (IR)、 一维核磁共振 (1D-NMR)和二维核磁共振 (2D-NMR)分析鉴定其结构。

本 一种制备具有下式结构的黄姜盾叶新苷的方法 ，

包括以下步骤： 以黄姜的块茎为原料， 采用一种或多种选自水和 CM-脂肪醇的溶 剂提取， 减压浓缩、 冷冻干燥得到黄姜 体总皂苷组分， 采用正相硅胶柱色谱、 凝胶 色谱、 重结晶分离纯化， 得到黄姜盾叶新苷。

本发明的制备黄姜盾叶新苷的方法， 具体包括以下步骤- (1) 将药用植物黄姜块茎烘干， 粉碎， 按药用植物粉末重量的 2-3倍加入 70-100% (体 积比)乙醇浸提 10-24小时， 固液分离；

(2) 过滤分离的固相按药用植物重量的 3-5倍加入 70-100% (体积比)乙醇回流 2-5小时， 趁热过滤， 重复回流 3-5次；

(3)将浸泡的液相与热回流提取的液相合并后， 减压蒸馏回收乙醇， 得褐色浸膏；

(4)将褐色浸膏按重量的 6-10倍加水超声波溶解；

(5)将 (4)得到的混合物离心， 分离水相与固相；

(6)将 (5)得到的固相得到的固相冷冻干燥得到黄姜甾 体总皂苷组分；

(7) 采用正相硅胶柱色谱、 凝胶色谱、 重结晶分离纯化， 得到黄姜盾叶新苷。

在本发明中， 溶剂提取在 20至 50°C的温度下浸润提取， 或回流提取。

根据本发明，所述正相硅胶柱色谱为常压或加 压硅胶柱色谱，采用选自苯:丙酮（例 如 3: 1 )、 三氯甲垸:丙酮（例如 3:7)、 二氯甲垸:甲醇（例如 2:8)、 乙酸乙酯:甲醇（例 如 6:4)、苯:丙酮:水（例如 1 :7:3 )、三氯甲烷:甲醇冰 (例如 6:2:2)、 乙酸乙酯:甲醇:水 (例 如 4:3:3)中的一种或多种洗脱剂等度洗脱或梯度洗 脱。

在本发明中， 凝胶色谱的洗脱剂选自氯仿 /甲醇、 甲醇 /水、 乙醇 /水的一种或多种 洗脱剂等度洗脱或梯度洗脱。

根据本发明， 重结晶步骤是将产物溶解在甲醇中重结晶。

本发明还提供了具有下式结构的黄姜盾叶新苷 在制备用于治疗或预防癌症的药物 中的用途

优选地， 所述癌症选自结肠癌、 肺癌、 乳腺癌、 宫颈癌和卵巢癌。

在本发明的一个优选实施方案中， 黄姜盾叶新苷的提取方法包括以下步骤：

(1) 将药用植物黄姜块茎 50 'C烘干， 粉碎， 按药用植物粉末重量的 2-3 倍加入 70-100% (体积比)乙醇浸提 10-24小时， 固液分离；

(2) 过滤分离的固相按药用植物重量的 3-5倍加入 70-100% (体积比)乙醇回流 2-5小时， 3-5次， 趁热过滤；

(3) 将浸泡的液相与热回流提取的液相合并后， 减压蒸馏回收乙醇至基本无乙醇味， 得褐色浸膏；

(4)将褐色浸膏按重量的 6-10倍加水超声波溶解；

(5) 将 (4)得到的混合物 4000-6000r/min离心 15-20分钟， 分离水相与固相；

(6) 将 (5)得到的固相得到的固相冷冻干燥得到一种具 有高效抗癌活性的黄姜 体总皂 苷组分。

(7) 将 (6)得到总皂苷采用正相硅胶柱色谱分离， 采用洗脱剂梯度洗脱， 合并 Rf值相同 组分。

(8)将 (7)得到 Rf值相同组分采用凝胶色谱分离， 采用洗脱剂洗脱， 再反复重结晶后得 盾叶新苷。

本发明的方法与现有技术方法比较， 有操作较简单， 重现性好， 很容易线性放大 等特点。

本发明的黄姜盾叶新苷可以用作药物， 例如以药物组合物的形式。 药物组合物可 以口服施用， 例如以片剂、 包衣片剂、 糖锭剂、 硬和软明胶胶囊、 溶液、 乳剂或混悬 剂的形式。 然而， 给药还例如以注射液的形式肠胃外进行。

本发明的药物组合物可以含有防腐剂， 增溶剂， 稳定剂， 润湿剂， 乳化剂， 甜味 剂， 着色剂， 调味剂， 改变渗透压的盐， 缓冲液， 掩蔽剂或抗氧化剂。 它们也可以还 含有其它的在治疗上有价值的物质。

剂量取决于各种因素而定， 例如， 给药方式， 物种， 年龄和 /或个体健康状况。 一 般情况下， 剂量可以为 20mg/kg-40mg/kg。

附图说明

图 1显示了黄姜盾叶新苷对肿瘤细胞生长增殖影� �， 图中黄姜盾叶新苷药物浓度 均为 10mg/L， 其中控制组 （control ), 即阴性对照组。

图 2显示了相差显微镜观察黄姜盾叶新苷处理的� �肠癌细胞株。 相差显微镜观察 盾叶新苷处理结肠癌细胞系形态学变化， 其中： A为阴性对照组； B为 10mg/L盾叶新 苷处理组， 处理时间为 48h,目镜放大倍数为 200倍。 形态学观察发现， 盾叶新苷能诱 导结肠癌细胞系凋亡。

图 3显示了黄姜盾叶新苷对 C26小鼠结肠癌肿瘤体积影响。 具体实施方式：

实施例 1

新鲜盾叶薯蕷块茎清洗干净后， 切成块状， 5CTC烘干， 粉碎。 称取约 600g黄姜粉 末于 5000mL烧杯中， 加入约 2000mL95%乙醇浸泡过夜， 抽滤， 分离固相与液相， 固 相转入 5L回流瓶中， 加入 1200-2000mL乙醇， 78 °C回流 2h-5h， 趁热过滤， 重复回流 提取 3次。 将滤液与浸泡液合并， 减压蒸馏至基本无乙醇味， 回收乙醇， 再按浸膏重 量的 6-10倍加水约 2000mL水超声波溶解可溶性皂苷， 悬浊液离心 （4000-6000r/min， 10-20min) , 分离水溶液与沉淀， 再将沉淀 -65 °C低温冷冻干燥 36h， 即得疏水性甾体总 皂苷 40g。

盾叶薯蓣疏水性的甾体总皂苷 16g， 首先采用正相硅胶柱色谱分离， 洗脱剂为混 合溶剂氯仿 -甲醇 （V/V )， 梯度洗脱， 梯度为 100: 10 (600mL)-90: 10(1000mL)-80:20 (800mL)-70:30(500mL), TLC跟踪检测， 10%硫酸乙醇显色， 合并 Rf值相同组分， 收 集 5个不同组分， 再过凝胶色谱 Sephade _X LH20， 洗脱剂氯仿 -甲醇 （8: 1 ) (体积比)， 再反复在甲醇中重结晶， 得单体甾体皂苷， 经 HPLC检测纯度均大于 98%， 经高分辨 率质谱 HR-ESI-MS , 红外光谱 IR， 核磁共振谱， 包括 1H-NMR、 ¹³ C-NMR、 ¹³⁵ DEPT、 1H-1HCOSY、 HMBC、 HMQC、 NOECOSY等光谱方法， 其中化合物 5鉴定其为盾叶 新苷 （30mg)。 部分光谱分析的数据如下：

无定型粉末，易溶于吡啶，可溶于甲醇，难溶 于水，分子式 C ₅₁ H ₈₂ 0 ₂₂ 。 ESI-MS m/z 1045.2[M-H]" , 883.4[Μ-Η-162]- , 721.4[Μ-Η-162-162]- , 574.7[Μ-Η- 162- 162-146]"； IR(KBr)v _max : 3418 (ν _ΟΗ )， 1637(v _c =c)» 919 , 900(900919) cm" ; 1H-NMR (600MHz, C ₅ D ₅ N): δ0.69(3Η， d， J=5.4Hz， H-27), 0.82(3H， s， H-18), 1.04(3H, s， H-19), 1.13(3H, d, J=6.6Hz， H-21), 5.29(1H, d， J=4.8Hz, H-6), 4.90(1H， d， J=7.8Hz, H-l -Glc'), 5.03(1H， d， J=7.8Hz , H-1-Glc〃)， 5.22(1H , d， J=7.8Hz， H-l-Glc'") , 6.18(1H， s， H-l-Rha), 1.75(3H， d, J=6.0Hz， H-6-Rha); ¹³ C-NMR (150MHz, C ₅ D ₅ N): 16.4(C-18)， 19.4(C-19) , 15.0(C-21) , 109.7(C-22) 17.3(C-27) , lOO. l (C-l-Glc')， 77.7(C-2-Glc')， 81.9(C-4-Glc'), 104.7(C-l-Glc〃)， 88.2(C-3-Glc〃)， 106.0(C-l-Glc"'), 101.8(C-l -Rha), 18.7(C-6-Rha)。 结合氢谱和碳谱数据， 与参考文献对照， 两者基本一致， 故鉴定为盾 叶新昔 ( zingiberensis saponin) 。 活性实施例：

黄姜盾叶新苷抑制恶性肿瘤活性研究

一、 体外抗肿瘤活性研究

1. 细胞株和培养

将结肠癌 C26、肺癌 A549、 乳腺癌 MCF-7、 宫颈癌 HeLa和卵巢癌肿瘤 SKOV3细 胞培养于 10%灭活胎牛血清， 100U/mL青霉素， 100 g/mL链霉素的 RPMI1640或 DMEM培养基中， 37°C 10%CO2培养箱及饱和湿度条件下培养， 3-4天传代一次。

2. 药物抗肿瘤活性测定

在 96孔培养板中每孔加入 200uL (含有 2-3 X 105个 /mL结肠癌、 肺癌、 乳腺癌、 宫颈癌和卵巢癌肿瘤细胞） 含 10%FBS的 RPMI1640或 DMEM 培养基的细胞悬液， 置 37°C 10%CO ₂ 培养箱中培养 12h后， 受试药设 6个剂量组， 每组 5个平行孔， 对照 组则加入等浓度等体积溶剂的培养液， 重复 3次实验。 96孔培养板置 rrc io%co ₂ 培养箱中培养 48h后， 弃去上清液， 加入 200uL/孔新鲜配制的含 0.5mg/mL MTT的无 血清培养液， TTC 继续培养 4h。 弃去清夜， 加入 150uLDMSO， 震荡混匀后， 在酶标 仪上以波长为 570nm， 参比波长为 490nm 测定 OD值， 计算抑制率， 公式为： 细胞生 长抑制率= (对照组 OD值-实验组 OD值） /对照组 OD值 X 100%。 并由细胞生长抑制 率与对应的浓度， 通过软件计算 IC _5Q 值 （半数抑制率）， IC ₅₀ (细胞生长抑制率为 50% 的药物浓度。

3. 实验结果

MTT法测定不同浓度黄姜盾叶新苷对于肿瘤细胞 株生长活性影响， 结果如图 1所 示。

黄姜盾叶新苷对各种肿瘤细胞体外生长抑制活 性 IC50值如下表 1所示。

表 1 黄姜盾叶新苷对肿瘤细胞体外生长抑制活性

έ _Η π,| 卵巢癌细胞 乳腺癌细胞 宫颈癌细胞 结肠癌细胞 肺癌细胞

^J (SK-OV-3) (MCF-7) (HeLa) (C26) (A549)

IC50 ( μ Μ) 1. 5 ± 1. 4** 1. 2±0. 7** 0. 8±0. 5* 0. 75 + 0. 5** 1. 5 ± 0. 7** 与对照组比较 *P<0.05, **P<0.01

采用相差显微镜观察黄姜盾叶新苷处理的结肠 癌细胞株， 结果如图 2所示。形态 学观察发现， 盾叶新苷能诱导结肠癌细胞系凋亡。 二、 体内抗肿瘤活性研究 1. 实验材料

1. 1实验动物与瘤株

昆明种小鼠 60只， 7-8周， 雌雄各半， 体重 18-20g

C26鼠结肠癌细胞

1. 2 药物

黄姜盾叶新苷 （阳性对照）

2. 实验步骤

2. 1 动物造模与分组

健康昆明种小鼠 60只， 雌雄各半， 置于清洁动物室中， 自由摄食饮水， 适应两天后， 随机分 10只为正常对照组，剩余 50只造模。在小鼠右前腋接种 C26肿瘤细胞 5 X 106， 造 C26实体瘤模型， 两周后， 按质量随机分成黄姜盾叶新苷组。

2. 2 给药方法

黄姜盾叶新苷用吐温 （TW-80 ) 分散。 药物组每只小鼠每次按 20mg/Kg灌胃给药， 一周两次， 对照组灌以无药 TW- 80。 测量肿瘤大小， 每周两次。 连续给药 10次后处死 小鼠分离瘤块，用电子天平称量瘤块重量。按 下列公式计算抑瘤率：抑瘤率 = (吐温 -80 组瘤重-药物组瘤重） I TW-80组瘤重 X 100%。

3. 实验结果

实验结果如表 2和图 3所示。

表 2 黄姜盾叶新苷对 C26小鼠结肠癌的抑瘤率 组别 N 瘤块重量 （g) 抑瘤率(％) 吐温对照组 10 2.45±0.24 ―

盾叶新苷组 10 0.81±0.13 * * 67.33% 与吐温对照组比较 * P<0. 05, * * P<0. 01 三、 结论

实验数据显示， 黄姜盾叶新苷对结肠癌、 肺癌、 乳腺癌、 宫颈癌、 卵巢癌等恶性 肿瘤肿瘤具有显著的抑瘤活性， 将其开发为抗肿瘤新药具有广泛的应用前景。