STEPHAN ALEXANDER (DE)
FRAATZ MARCO ALEXANDER (DE)
BÜTTNER JULIA (DE)
MÖLLER ANNIKA (DE)
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SILKE VERONIKA SCHIMANSKI: "Biotechnologische Erzeugung natürlicher Aromastoffe aus Submerskulturen von Asco- und Basidiomyceten", 1 January 2014 (2014-01-01), pages 1 - 105, XP055720516, Retrieved from the Internet
BOSSE ANDREA K ET AL: "Formation of complex natural flavours by biotransformation of apple pomace with basidiomycetes", FOOD CHEMISTRY, ELSEVIER LTD, NL, vol. 141, no. 3, 5 June 2013 (2013-06-05), pages 2952 - 2959, XP028678958, ISSN: 0308-8146, DOI: 10.1016/J.FOODCHEM.2013.05.116
Ansprüche 1. Getränk, umfassend mindestens einen fermentativen Extrakt, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine fermentative Extrakt aus mindestens einem Nebenstrom gewonnen ist, der bei der Gewinnung eines Gewürzes aus einer Gewürzpflanze angefallen ist, wobei der mindestens eine Nebenstrom Schalen und/oder Stängel und/oder Stiele und/oder Zweige und/oder Wurzeln und/oder Wurzelstöcke und/oder Zwiebeln und/oder Blätter und/oder ganze Blüten und/oder Blütenblätter und/oder Staubbeutel und/oder Narben derjenigen Gewürzpflanze umfasst, von der der mindestens eine Nebenstrom stammt. 2. Getränk gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem mindestens einen Nebenstrom um einen Safran-Nebenstrom handelt, wobei der mindestens eine Safran-Nebenstrom ganze Blüten und/oder Blütenblätter und/oder Staubbeutel und/oder Narben der Safranpflanze, Crocus spec., umfasst. 3. Getränk gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil an Narben im Safran-Nebenstrom im Bereich von 0,1% w/w bis 3,0% w/w liegt. 4. Verfahren zur Herstellung eines Getränks gemäß Anspruch 1 oder 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Schritte umfasst: a) Bereitstellung des Nebenstromes als Bestandteil des Fermentationsmediums, wobei das Fermentationsmedium eine Mischung aus einer wässrigen Flüssigphase und einer dispergierten Festphase ist, und wobei die dispergierte Festphase aus Zellen und/oder Zellbestandteilen und/oder Zellagglomeraten besteht, wobei Zellagglomerate auch ganze Blüten, ganze Blütenblätter, ganze Staubbeutel, ganze Schalen, ganze Stängel, ganze Stiele, ganze Zweige, ganze Wurzeln, ganze Wurzelstöcke, ganze Zwiebeln ganze Blätter umfassen; b) Inokulation des gemäß Schritt a) bereitgestellten Fermentationsmediums mit Myzel oder Sporen mindestens eines Pilzes der Abteilung Basidiomycota; c) Fermentation des gemäß Schritt b) inokulierten Fermentationsmediums; d) Gewinnung des fermentativen Extraktes durch zumindest teilweise Abtrennung der wässrigen Flüssigphase des Fermentationsmediums von der Festphase des Fermentationsmediums, wobei die Abtrennung durch mindestens ein Verfahren erfolgt, ausgewählt aus der Liste umfassend Dekatieren, Filtrieren, Zentrifugieren. 5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es weiterhin folgenden Schritt umfasst: e) Vermischen des gemäß Schritt d) gewonnenen fermentativen Extraktes mit weiteren Bestandteilen des Getränkes, unabhängig voneinander ausgewählt aus der Liste umfassend, Wasser, Ethanol, Kohlendioxid, Zucker, Zuckerersatzstoffe, Farbstoffe, Aromastoffe, Konservierungsmittel, Lebensmittelzusatzstoffe. 6. Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentationsbedingungen in folgenden Bereichen gehalten werden: - Temperatur : 0 °C bis 50°C, bevorzugt 10°C bis 40 °C und besonders bevorzugt 15 – 30 °C - pH-Wert : 1,0 bis 9,0, bevorzugt 1,5 bis 8,0 und besonders bevorzugt 1,7 – 6,5 - Fermentationsdauer : 0,25 h bis 300 h, bevorzugt 1 h bis 200 h und besonders bevorzugt 12 h – 168 h. 7. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der gemäß Schritt d) gewonnene fermentative Extrakt mindestens einem Reinigungs- und/oder einem Sterilisationsschritt unterzogen wird. 8. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem mindestens einen Pilz der Abteilung Basidiomycota um einen Pilz handelt, ausgewählt aus der Liste umfassend A. xantha, B. corium, F. fomentarius, F. betulina, F. pinicola, H. araucariae, H. marmoreus, I. benzoinum, L. sulphurous, L. betulina, P. radiate, P. pulmonarius, T. suaveolens, T. chioneus, W. cocos. |
Tabelle 2: Zusammensetzungen der Emers- und Submerskulturmedien; mit Stern (*) markierte Chemikalien/Bestandteile werden separat autoklaviert, Emersmedien werden 15 g/L Agar-Agar zugesetzt. VERWENDUNG MEDIUM CHEMIKALIEN KONZENTRATION ME Malzextrakt 20 g/L MEP Malzextrakt 20 g/L pH 5,6 Sojapepton 3 g/L Glucose-Monohydrat* 30 g/L Asparagin-Monohydrat 4,5 g/L Kaliumdihydrogenphosphat 1,5 g/L Referenz Magnesiumsulfat-Hydrat 0,5 g/L SNL Hefeextrakt 3 g/L pH 6,0 Eisen(III)-chlorid-Hexahydrat 80 ng/L Zink(II)-sulfat-Heptahydrat 90 ng/L Mangan(II)-sulfat-Monohydrat 30 ng/L Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat 5 ng/L EDTA 400 ng/L emers Blütenblätter oder Staubbeutel* 20 g/L Gemisch aus Blütenblättern & 25 g/L Screening Getränk Staubbeuteln Glucose-Monohydrat* 30 g/L Zur Kultivierung wird jeweils ein ca.0,5 cm² großes Myzelstück des Pilzes einer zu etwa 80% bewachsenen Agarplatte auf eine neue Agarplatte gesetzt, die Platte verschlossen z.B. mit Parafilm ® und bei 24 °C im Dunkeln inkubiert. 3. Screening auf Bestandteilen der Safranblüte Die Kultivierung der Pilze auf den Bestandteilen der Safranblüte (Blütenblätter oder Staubbeutel) erfolgt beispielhaft in Emerskultur. Hierbei werden die Nebenströme (Blütenblätter bzw. Staubbeutel) als alleinige Nährstoffquelle eingesetzt und jeweils Agar-Platten mit den beiden Substraten (Tabelle 2, Screening) hergestellt. Diese werden mit den 68 ausgewählten Pilzen (Tabelle 1) analog zur Stammhaltung angeimpft und bei 24 °C im Dunkeln inkubiert. 4. Sensorische Analyse Für die Auswahl geeigneter Pilz-Substrat-Kombinationen wird der Geruch der Pilze auf den Substratmedien herangezogen. Emerskulturen werden je nach Wachstum des Pilzes sensorisch beurteilt. Die Kulturen werden von einem sensorisch geschulten Panel (n=4) mit einer beschreibenden Prüfung mit Bewertung des Gesamteindruckes auf einer Skala von 0 (sehr negativ) bis 5 (sehr positiv) bewertet. Als Vergleich wird der Geruch der nicht inokulierten Agarplatte genutzt. Fachkundigen Personen ist bekannt, wie derartige sensorische Analysen und Bewertungen im Einzelnen durchzuführen sind, sodass eine genauere Beschreibung an dieser Stelle nicht erforderlich ist. 5. Kultivierung und Optimierung zur Getränke-Herstellung Die Kultivierung ausgewählter Pilze (fett markiert in Tabelle 1) in Submerskultur zur Getränke-Herstellung findet unter Food Grade-Bedingungen statt; alle Lösungen werden mit Trinkwasser hergestellt. Zunächst werden Vorkulturen mit 2% ME- Medium (Tabelle 2) angesetzt. Dazu wird ein Stück der mit Pilzmyzel bewachsenen Agarplatte entnommen und mit einem Dispergiergerät (10.000 U/min, 30 s, IKA, Staufen, DE) im Vorkulturmedium homogenisiert. Die Kulturen werden anschließend bei 150 U/min, 24 °C und Lichtausschluss kultiviert. Nach sieben Tagen wird die bewachsene Vorkultur homogenisiert (10.000 U/min, 30 s) und das Hauptkulturmedium (Tabelle 3) mit 10% homogenisierter Vorkultur angeimpft. Die Kultivierung der Hauptkultur erfolgt wiederum bei 150 U/min, 24 °C und Lichtausschluss. Nach Abschluss der Kultivierung wird die gesamte Kultur über ein Leinentuch abfiltriert, das Myzel wird verworfen. Die Überstände werden zur sensorischen Beurteilung (vgl. Abschnitt 6) und Analytik (vgl. Abschnitt 7) verwendet. Es ist ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, dass der verwendete Rohstoff (Agrar-Nebenstrom) vor der Verarbeitung (Fermentation) nicht in einen fließfähigen Zustand überführt werden muss, sondern direkt in fester Form, wie er im Rahmen der Gewürzherstellung anfällt, mit der wässrigen Flüssigphase des Fermentationsmediums in Kontakt gebracht werden kann. Nach Zugabe des Agrar-Nebenstroms zur wässrigen Flüssigphase liegt das Fermentationsmedium in fertiger Form vor, umfassend eine wässrige Flüssigphase und eine Feststoffphase. Die Feststoffphase ist im Wesentlichen durch den Agrar-Nebenstrom gebildet, der in der Flüssigphase dispergiert ist. Unter dispergiert wird hier im Zusammenhang mit dem Fermentationsmedium auch verstanden, dass die Festphase in groben Stücken oder ganzen Pflanzenteilen in der Flüssigphase verteilt ist. Der Rohstoff bzw. Agrar-Nebenstrom umfasst – je nachdem, von welcher Gewürzpflanze er stammt – Blüten, Blütenblätter, Staubbeutel, Schalen, Stängel, Stiele, Zweige, Wurzeln, Wurzelstöcke, Zwiebeln, Blätter usw. Es kann sich dabei auch um eine Mischung verschiedener Pflanzenteile handeln. Eine eventuelle Vorbehandlung des Rohstoffs/Agrar-Nebenstroms, beispielsweise Vermahlung, Pelletierung, Pulverisierung, Homogenisierung, Dispergierung o. dgl. fällt aber ebenso in den Umfang der Erfindung, da dadurch ggf. eine Prozessoptimierung erreicht werden kann, beispielsweise eine bessere Pumpfähigkeit des Fermentationsmediums infolge Zerkleinerung des ursprünglich stückigen Rohstoffes. Der Begriff fließfähiger Zustand beschreibt hierbei nicht nur Flüssigkeiten, die durch Verflüssigung im engeren Sinne erhalten werden, sondern auch Suspensionen, Dispersionen, Aufschlämmungen und dergleichen, die ähnlich wie Flüssigkeiten ebenfalls grundsätzlich fließfähig sind. Bevorzugt ist jedoch der Einsatz des Rohstoffs/Substrats ohne Vorbehandlung, da dadurch zeitaufwendige und kostspielige Verfahrensschritte vermieden werden können. Auch das Risiko mikrobieller Kontaminationen während des Herstellungsprozesses wird durch die direkte Einbringung der Agrar- bzw. Safran-Nebenströme ohne weitere Vorbehandlungen deutlich reduziert und der Gesamtprozess damit ausfallsicherer. Die Optimierung der Kultivierungsparameter erfolgt hier beispielhaft ausgehend vom Medium des Screenings (2,5% Safran-Nebenströme, 30 g/L Glucose) für die Kultivierung des Pilzes F. pinicola, ohne dass damit eine Beschränkung hierauf verbunden ist. Es werden sowohl der Erntezeitpunkt, der Anteil der Safran- Nebenströme und der Glucosegehalt im Medium als auch die pH-Werte der Vor- bzw. Hauptkulturen variiert (Tabelle 3). Alle anderen Parameter werden im Vergleich zum Screening wie oben beschrieben im Rahmen der Beispiele nicht verändert. Es ist jedoch erfindungsgemäß, auch andere als die genannten Parameter zu variieren; Anlass dafür kann etwa sein, den Geschmack an unterschiedliche Vorlieben der Konsumenten anzupassen. Der nach der Fermentation, d.h. der Kultivierung des mindestens einen ausgewählten Pilzes in wenigstens einem Agrar- bzw. Safran-Nebenstrom, erhaltene Kultur-Überstand stellt einen fermentativen Extrakt dar, der an sich bereits das erfindungsgemäße Getränk in einer ersten Ausgestaltung darstellt. Aus diesem fermentativen Extrakt werden weitere Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Getränks hergestellt, um verschiedenste konsumentenseitig gewünschte Geschmacksvariationen bereitzustellen und/oder lebensmittelrechtliche Vorgaben zu erfüllen. Aus den Überständen der Kultivierungen werden die zu verkostenden Getränke durch Zugabe von je 0,5 mL Zuckerlösung (100 g Saccharose in 100 mL Wasser) und ggf. je 0,5 mL Citronensäurelösung (13 g/L, Tabelle 3) zu 8 mL Filtrat hergestellt. Die Zugabe der Zuckerlösung nach der Fermentation wird ebenfalls beispielhaft optimiert und ist nicht einschränkend zu verstehen. Hier werden beispielsweise verschiedene Zuckerquellen (Saccharose, Glucose, Allulose) und Konzentrationen (1,5% bis 10%) bei Überständen der optimierten Fermentation (markiert in Tabelle 3) getestet. Die Pasteurisation des finalen Getränkes erfolgt in verschlossenen Glasflaschen im Wasserbad bei 75 °C für 10 bis 30 min mit anschließender sofortiger Abkühlung der Gefäße auf Raumtemperatur. Das finale Getränk kann zusätzlich mit variablen Mengen Kohlendioxid versetzt (carbonisiert) werden, beispielsweise durch folgende Vorgehensweise: Das zu carbonisierende finale Getränk wird in ein mit CO 2 vorgespültes Keg-Fass gefüllt und anschließend Kohlenstoffdioxid eingeleitet, bis der gewünschte Grad an Carbonisierung erreicht ist, etwa durch Beaufschlagung mit einem Druck von 1,5 bar über einen Zeitraum von 5 min. und anschließender Lagerung für 4 d bei 4 °C und gelegentlichem Umschütteln. Die genaue Vorgehensweise der Carbonisierung kann natürlich in aus dem Stand der Technik bekannter Weise variiert werden, ohne dadurch den Umfang der Erfindung zu verlassen. 6. Kulturbegleitende Sensorik Für die Auswahl der Pilze werden die Getränke von 2-6 Prüfpersonen in einer Rangordnungsprüfung mit Bewertung mit Skala von 0 (schlecht) bis 10 (gut) bezüglich des Gesamteindruckes beurteilt. Die Verkostung der Getränke des F. pinicola während der Medienoptimierung wird mittels einfach beschreibender Prüfung der Geruchs- und Geschmacksattribute durchgeführt. Hier wird ebenfalls die Farbe des Getränkes betrachtet. Die Durchführung und Auswertung derartiger sensorischer Prüfungen erfolgen entsprechend der jeweiligen DIN-Norm. Die hier beschriebene Vorgehensweise bei der Durchführung der Fermentation/Getränke-Herstellung ist nicht als einschränkend für das Herstellungsverfahren anzusehen, sondern als beispielhaft. Fachkundigen Personen ist bekannt, dass Parameter wie beispielsweise Rührgeschwindigkeit, Temperatur, Lichtverhältnisse, Gärdauer usw. in weiten Bereichen variiert werden können, ohne den Umfang der Erfindung oder ihrer Äquivalente zu verlassen. Es ist insbesondere auch bekannt, dass beim Hochskalieren in den Produktionsmaßstab andere Werte der Verfahrensparameter gewählt werden können oder gar müssen, um die Fermentation in gewünschter Weise durchzuführen. Alle diese allgemein üblichen Variationen sind vom Umfang der Erfindung mit umfasst.
Tabelle 3: Übersicht der sensorisch bewerteten Hauptkulturproben unter Angabe des möglichen Zusatzes an Citronensäure sowie die Anzahl an Personen bei der visuellen, olfaktorischen und gustatorischen Beurteilung KULTIVIERUNG GETRÄNK ANALYTIK 24 & l S 48 2 Tabelle 3 (Fortsetzung) z li P S 2,5 48-168 - 30 + 6 36 38 2 7 40 15 42 t r 44 ( c) 3 e 3,0 W- H 36 p 38 38 ( c) 2 9 40 3,5 42 44 3 10 42 3 (c) e 2 (a ,5 11 4 ) r u 2 7,5 --- 8 ä S 12 42 ( a/w) 42 ( 3,5 13 a) a Vorkultur mit Citronensäure auf pH 3,5 angesäuert; a/w mit Äpfel- und Weinsäure angesäuert; c mit Citronensäure angesäuert 7. Kulturbegleitende Analytik Der pH-Wert-Verlauf während der Fermentation bzw. der Getränke-Herstellung wird mittels pH-Meter (Mettler Toledo, Gießen, DE) in einem Aliquot des Überstandes bestimmt. Die während der Fermentation gebildete Oxalsäure wird in den Überständen nach Membranfiltration mittels Ionenchromatographie (IC) und einer externen Kalibrierung quantifiziert. Die Messung erfolgt an einem Metrohm 883 Basic IC plus mit Leitfähigkeitsdetektor (Metrohm, Filderstadt, DE), ausgestattet mit einer Metrosep A supp 4-250/4.0 Trennsäule und einer Metrosep A supp 4/5 Guard 4.0 Vorsäule. Der Eluent setzt sich aus 1,8 mM Na 2 CO 3 , 1,7 mM NaHCO 3 und 2% Aceton (Fluss 1 mL/min isokratisch) zusammen, die Suppressorlösung besteht aus 50 mM H2SO4 (Fluss 0,3 mL/min bei 18 U/min). Weitere Parameter sind im Folgenden aufgeführt: Laufzeit 22 min, Injektionsvolumen 20 µL, Säulentemperatur Raumtemperatur. 8. GC-MS/MS(-O)-Analyse Die Identifizierung der Aromastoffe von Submerskulturen ausgewählter Pilz- Substrat-Kombinationen erfolgt mittels GC-MS/MS(-O) nach solid phase microextraction (SPME) und Zugabe von 20 µL des internen Standards ^-Cyclocitral (0,169 g/L bzw.0,0845 g/L) sowie 0,6 g Natriumchlorid zu 4 mL Kulturüberstand. Die untersuchten Nebenströme werden ohne Vorbehandlung zur Analyse eingesetzt. Die Extraktion der Aromastoffe erfolgt mittels SPME-Faser (Divinylbenzen/Carboxen ® /Polydimethylsiloxan, Konditionierungstemperatur 270 °C, Agilent Technologies, Waldbronn, DE). Dazu wird nach Inkubation (5 min, 250 U/min, 40 °C) der headspace vials im Agitator (GERSTEL, Mülheim an der Ruhr, DE) für 30 min extrahiert (250 U/min, 40 °C). Die Desorptionszeit im SPME direct inlet liner beträgt 60 s bei einer Injektionstemperatur von 250 °C. Die Probenaufgabe erfolgt splitlos. Ebenfalls werden von den Substraten und dem Getränk in der optimierten Version Flüssig-Flüssig-Extrakte angefertigt. Dafür werden 4 g Trockenmasse der Substrate bzw. 40 mL Kulturüberstand mit 40 mL Methanol und 40 mL gesättigter Natriumchloridlösung versetzt und mittels Dispergiergerät für 1 min bei 10.000 U/min homogenisiert bzw. beim Kulturüberstand für 1 min bei 500 U/min gerührt. Anschließend wird dreimal für jeweils 30 min mit 40 mL n-Pentan/Diethylether- Gemisch (1:1,12, v/v) bei Raumtemperatur und 500 U/min extrahiert. Zur Phasentrennung wird bei 3.500 g für 15 min in PTFE-Bechern zentrifugiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Natriumsulfat getrocknet. Der so gewonnene Extrakt wird zur halbautomatischen solvent assisted flavor evaporation (SAFE) eingesetzt. Die SAFE wird unter folgenden Konditionen durchgeführt: Wasserbadtemperatur 50 °C, Wasserumlauftemperatur 50 °C, Druck 1-2,2·10 -3 mbar, Öffnung des Dosierventils für 1 s alle 20 s. Die SAFE-Extrakte wurden nach Trocknung über Natriumsulfat mittels Vigreux-Destillation bei 43 °C auf ca. 2 mL eingeengt. Je 1 µL der Extrakte werden splitlos in den Gaschromatographen injiziert. Zur Identifizierung der Substanzen werden 0,1 bis 1 mg Reinsubstanz in 1 mL Methanol gelöst, hiervon werden 2 µL in 1 mL n-Heptan verdünnt. Bei flüssigen Substanzen werden direkt 2 µL Reinsubstanz in 1 mL n-Heptan gelöst.1 µL der Standardlösungen werden splitlos in den Gaschromatographen injiziert. Die GC-Analyse wird an einem 7890A GC (Agilent Technologies) mit polarer Agilent VF-WAXms-Säule (30 m × 0,25 mm i.D. × 0,25 µm), gekoppelt mit einem Agilent 7000B Quadrupol Massenspektrometer sowie einem Olfaktometrie-Detektorport (ODP 3) (GERSTEL) durchgeführt. Als Trägergas wird Helium (5.0) mit einem konstanten Fluss von 1,56 mL/min verwendet. Die Ofentemperatur wird zu Beginn für 3 min bei 40 °C gehalten, anschließend um 5 °C/min auf 240 °C erhöht und hier wiederum für 7 min gehalten. Der Gasfluss wird mit einem Split von 1:1 in das MS und in den ODP geleitet. Weitere Einstellungen sind im Folgenden aufgeführt: Septum Purge-Fluss 3 mL/min, MS-Modus scan im Q1, Scan-Bereich m/z 33 – 300, Ionisationsenergie 70 eV, EI-Quellen-Temperatur 230 °C, Quadrupol-Temperaturen 150 °C, MS Transferline-Temperatur 250 °C, He Quench-Gas 2,25 mL/min, N 2 Kollisionsgas 1,5 mL/min, ODP 3 Transferline-Temperatur 250 °C, ODP Mischkammer- Temperatur 150 °C, ODP Makeup-Gas N2. Ergebnisse des Screenings der Pilze Die Emerskulturen der 68 getesteten Pilze auf den beiden Substraten Safranblütenblätter und Staubbeutel zeigen substratspezifisch sowohl unterschiedliche Wachstumsgeschwindigkeiten als auch unterschiedliche sensorische Eindrücke. Für jede kultivierte Pilz-Substrat-Kombination ist in Tabelle 4 (Fig. 1) exemplarisch für einen Kulturtag das Ergebnis der sensorischen Beschreibung und Bewertung aufgeführt. Hierbei wird deutlich, dass die verschiedenen Nebenströme bei einigen Pilzen keinen Einfluss auf das gebildete Aroma haben (z.B. A. xantha und T. chioneus), bei anderen Pilzen jedoch deutliche Unterschiede zwischen den Substraten registriert werden (z.B. P. radiata und T. hirsuta), wodurch die Schlussfolgerung gezogen werden kann, dass die beiden Nebenströme unterschiedliche Vorstufen für Biotransformationen enthalten bzw. diese für verschiedene Pilze unterschiedlich verfügbar sind. Allgemein ist zu beobachten, dass die Pilze auf den Blütenblättern deutlich langsameres Wachstum zeigen als auf dem Agar mit den Staubbeuteln. Weil zum Teil kein oder nur ein sehr geringes Wachstum erfolgt, konnten nicht alle Pilze sensorisch bewertet werden. Dies weist ebenfalls auf die unterschiedliche Verfügbarkeit von Nährstoffen in den Nebenströmen hin. Auf Grundlage der sensorischen Bewertung und des Wachstums der Pilze werden die Pilz-Substrat-Kombinationen beispielhaft für die weiteren Untersuchungen ausgewählt. Die Pilze I. benzoinum (Geruchseindruck Vanille, Marzipan) und B. corium (Flieder, Citrus) werden für die Fermentation der Staubbeutel am besten bewertet. I. benzoinum (Marzipan, blumig) wird ebenfalls bei der Fermentation auf den Blütenblättern genauso wie P. pulmonarius (Waldmeister, Anis) am besten bewertet (Fig.1, Tabelle 4). F. velutipes, F. betulina, F. pinicola, H. marmoreus, I. benzoinum und T. suaveolens werden wegen der Bewertung, der Art des gebildeten Aromas und der Wachstumsgeschwindigkeit beispielhaft für das Screening zur Produktion eines fermentierten Getränkes auf Basis der Safran-Nebenströme ausgewählt. Ergebnisse des Screenings des Getränks Für das Screening zur Produktion des Getränks werden beispielhaft sechs Pilze in Submerskultur untersucht. Die Pilze und deren sensorische Eindrücke sind in Tabelle 5 gezeigt. Die beispielhaft ausgewählten Erntezeitpunkte richten sich nach dem wahrgenommenen Geruchseindruck im Vergleich zum nicht fermentierten Medium, wobei nach sieben Kulturtagen alle Kulturen geerntet werden, die bis dahin keine Änderung des Geruchseindruckes zeigen. Verglichen mit den sensorischen Beschreibungen der Emerskulturen (Tabelle 4, Fig. 1) zeigen sich zumeist Übereinstimmungen (I. benzoinum & F. pinicola) bei den Geruchseindrücken. Die Geschmackseindrücke weichen zum Teil stark von den Geruchseindrücken ab und sind nur teilweise für Getränke erwünscht, was sich auch in der Bewertung der Proben widerspiegelt. Dies kann jedoch – je nach ggf. individuellem persönlichen Geschmacksempfinden – sowohl positiv als auch negativ bewertet werden. Die Geschmackseindrücke nach Schokolade und Nuss sind hierbei in den vorliegenden Beispielen eher unerwünscht, wohingegen fruchtige und blumige Noten als angenehm bewertet werden. Insgesamt wird das Getränk des F. pinicola mit fruchtigem Geruch und Geschmack nach Maracuja und Pfirsich am besten bewertet, weswegen dieses für das weitere Vorgehen beispielhaft ausgewählt wird.
Tabelle 5: sensorische Bewertung im Screening für die Getränkeherstellung; Spalte B: Bewertung des Gesamteindruckes auf einer Skala von 0 (schlecht) bis 10 (gut). PILZ TAG GERUCH GESCHMACK B 3 nussig, Honig, 5,2 F. velutipes krautig, Flieder süß, geröstet F . betulina 7 säuerlich, fruchtig, - v ergoren sauer 2 fruchtig 7,3 F. pinicola fruchtig (Maracuja), säuerlich (Maracuja, Pfirsich), sauer H. marmoreus 7 rauchig, Heu süß, krautig, bitter - I . 3 Marzipan, Kirsche, Apfel, süß, Honig, 4,8 P flaume Kuchenteig T . suaveolens 2 Schokolade, Karamell, fruchtig Schokolade, 6,7 K aramell Kulturbegleitende Sensorik Während der Medienoptimierung zur Herstellung des fermentierten Getränks auf Basis der Safran-Nebenströme mittels F. pinicola werden diverse Geruchs- und Geschmacksattribute sowie Beschreibungen des Mundgefühls und der Farbe beispielhaft untersucht (Tabelle 6). Deutlich erkennbar ist hierbei, dass die Fermentationsprodukte nach 72 h sehr sauer schmecken, weswegen die Fermentationsdauer in einzelnen Beispielen verkürzt ist. Auch werden 2% Safran- Nebenströme als Grundlage für das Medium beispielhaft gewählt, da in den vorliegenden Beispielen geringere Anteile nur schwache Geruchs- und Geschmackseindrücke erzielen und höhere Konzentrationen der Nebenströme einen vermehrt wahrnehmbaren bitteren Nachgeschmack und einen Geruch nach Heu aufweisen. Eine Fermentationsdauer von 36 bis 48 h ergibt Getränke mit einem intensiv fruchtigen Aroma ohne bitteren Nachgeschmack nach Heu; besonders die Getränke nach 42 h Fermentationszeit weisen diese harmonischen Eindrücke auf. Die Einstellung des pH-Wertes vor der Fermentation auf 3,0 resultiert in als stark sauer wahrgenommenen Produkten, wohingegen ein pH-Wert von 3,5 zu Beginn der Kultivierung zu einer angenehmen Säure führt. Zur weiteren Reduzierung der Oxalsäuregehalte werden die Vorkulturen ebenfalls beispielhaft auf einen pH-Wert von 3,5 angesäuert. Das daraus resultierende Getränk weist fruchtige Geruchseindrücke nach Pflaume und Quitte auf und kann auch im Geschmack als fruchtig und teeartig beschrieben werden. Medium 11 wird somit beispielhaft bevorzugt als Medium zur Herstellung des fermentierten Getränks ausgewählt. Fachkundigen Personen ist bekannt, dass die hier beschriebenen Geschmacks- und Geruchseindrücke und insbesondere die geschilderten Vorlieben sehr stark vom Kulturkreis der konsumierenden Person und individuellen Vorlieben beeinflusst sind, so dass andere geschmacks- und geruchsbeeinflussende Ausgestaltungen ebenfalls erfindungsgemäß sind, und zwar auch selbst dann, wenn sie hier nicht als optimal oder gar eher als nachteilig dargestellt sind, denn in diesem speziellen Zusammenhang der geschmacklichen Bewertung kann ein von einem Personenkreis oder einer einzelnen Person als nachteilig bewertetes Charakteristikum (Geruch, Geschmack) von einem anderen Personenkreis oder einer anderen Person als positiv und wünschenswert bewertet werden. Tabelle 6: sensorische Beschreibung der Getränke in den verschiedenen Optimierungsstufen DAUER MEDIUM GERUCH GESCHMACK FARBE [h] fruchtig (Pfirsich), 24 Pflaume Citronensäure, gelb, adstringierend 1 sauer, fruchtig, Pfirsich, 48 tropisch, vergoren pelzig/adstringierend Koralle, 72 fruchtig, tropisch, vergoren sauer, fruchtig Lachs pelzig/adstringierend, 24 Heu, süßlich, fruchtig gelb, braun, süß, fruchtig 2 Litschi, fruchtig, Pfirsich, sauer, süß, Pfirsich, Pfirsich, 48 süßlich pelzig/adstringierend Koralle, 72 fruchtig, tropisch, vergoren sauer Lachs 24 Honig, Apfelsaft fruchtig, süß, bitter braun, gelb süß, bitter, Heu, 3 48 Heu, Honig, Pflaume gelb, braun, Honig, fruchtig, pelzig 72 fruchtig, vergoren sauer orangefarben sauer braun, 36 säuerlich sauer, fruchtig, orange, Koralle Kupfer, 48 Citronensäure sauer, bitter Koralle 24 Honig, fruchtig Heu, sauer, fruchtig gelb säuerlich, fruchtig, Pfirsich, sauer, 36 braun, Zitroneneistee fruchtig, pelzig, Honig gold-gelb- 48 fruchtig, säuerlich, Apfel sauer braun fruchtig, Heu, Honig, süß, fruchtig, Heu, 24 gelb vergoren bitter fruchtig (Citrus), 36 fruchtig, säuerlich, Honig sauer, süß, Heu, trüb, braun pelzig fruchtig, Honig, vergoren, sauer, Heu, pelzig, gold-gelb- 48 Pflaume fruchtig braun Honig, fruchtig, Pflaume, 36 sauer, Heu gelblich Pfirsich 38 fruchtig/tropisch, säuerlich fruchtig, Honig, nussig trüb, braun säuerlich, vergoren, 40 sauer, Heu, Karamell fruchtig Kupfer- 42 säuerlich, grün, vergoren sauer farben säuerlich, Honig, fruchtig, 44 sauer, pelzig, nussig Pfirsich 36 fruchtig, Heu sauer, Heu, bitter gelblich 38 vergoren, säuerlich sauer, fruchtig, pelzig trüb, braun 40 Citronensäure, fruchtig sauer, Heu, fruchtig Apfelsaft, vergoren, 42 sauer, Heu Kupfer- säuerlich farben säuerlich, fruchtig, Honig, 44 sauer vergoren 36 fruchtig, süß, Heu gelblich Pfirsich säuerlich, fruchtig 38 fruchtig, Honig, nussig gelblich (Pfirsich) 9 säuerlich, vergoren, süß, sauer, fruchtig, 40 fruchtig Heu Kupfer- 42 säuerlich, fruchtig, Pfirsich fruchtig, sauer, süß farben, sauer, Honig, braun 44 blumig, Pfirsich Karamell, fruchtig 10 42 sauer Honig, fruchtig, säuerlich, (Citronensäure), Heu, rapsartig, süßlich, Apfel, fruchtig, Pfirsich-Konserve adstringierend, vergoren 11 42 Pflaume, Birne, Quitte, sauer, Apfel, süß, Honig, fruchtig, blumig Tee, adstringierend gelblich 12 42 Apfel, Honig, vergoren, sauer, süß, holzig, säuerlich, Pflaume, fettig, adstringierend, fruchtig fruchtig fruchtig, Pfirsich, sauer, süß, fruchtig, 13 42 säuerlich, blumig, süßlich, Apfel, adstringierend Honig Als Zuckerquelle wird in einem Rangordnungstest beispielhaft Saccharose (Rang 1,3) vor Glucose (Rang 2,2) und Allulose (Rang 2,5) festgelegt. Der Rangordnungstest zur Zuckerkonzentration im Bereich von 1,5% bis 10% ergibt 5% Saccharose als optimale Konzentration (Rang 1,9 vor 7,5% auf Rang 2,1). Mit dem fermentierten Getränk auf Basis von Medium 11 werden darüber hinaus beispielhaft Versuche zur Pasteurisierung und Carbonisierung durchgeführt. Da sich die Geruchs- und Geschmacksattribute, sowie die Farbe der pasteurisierten Proben nach 10 min, 20 min oder 30 min Pasteurisierung nicht wesentlich unterscheiden, wird hiermit gezeigt, dass dieser Prozessschritt keine negativen Auswirkungen auf das Getränk hat und somit zur Steigerung der Produktsicherheit durchgeführt werden sollte. Die Carbonisierung des Getränkes führt weder zu einer gesteigerten noch verminderten Akzeptanz des Getränkes. Kulturbegleitende Analytik Fig. 2A, 2B und 2C zeigen beispielhaft die Entwicklung des pH-Wertes und der Oxalsäurekonzentration der fermentierten Getränke im Verlauf der Optimierung (Rohdaten der Grafiken vgl. Tabelle in Fig. 3). Erkennbar ist ein starker Zusammenhang zwischen dem pH-Wert und der Oxalsäurekonzentration, weswegen davon ausgegangen werden kann, dass andere organische Säuren eine untergeordnete Rolle in diesen Fermentationen spielen. Die Zunahme der Oxalsäurekonzentration im Fermentationsverlauf zeigt sich vor allem in Optimierungsphase I, wobei nach 72 h Fermentation ein pH-Wert kleiner 2 und eine Oxalsäurekonzentrationen von bis zu 4,8 g/L (Medium 3) bestimmt werden. Dieser deutliche Anstieg der Oxalsäurekonzentration bzw. das starke Absinken des pH- Wertes kann in der Optimierungsphase II nicht beeinflusst werden, die pH-Werte sinken nach 48 h Kultivierungszeit auf Werte kleiner gleich pH 1,8. Die Einstellung des pH-Wertes vor der Fermentation auf 3,0 bzw.3,5, die Zugabe von Glucose und die Reduzierung der Kultivierungszeit in Optimierungsphase III hingegen zeigen einen Einfluss auf die Oxalsäureproduktion. Hier sinkt der pH-Wert nicht unter 2,4 nach 44 h Kultivierungszeit; die Oxalsäurekonzentrationen betragen nach 44 h nur noch maximal 1,1 g/L. Die Ansäuerung der Vorkulturmedien auf einen pH-Wert von 3,5, ebenso wie die Hauptkulturmedien ergeben in der letzten Optimierungsphase einen pH-Wert von 2,6 und eine Oxalsäurekonzentration von 0,9 g/L im zur Produktion des fermentierten Getränkes ausgewählten Medium, wobei sich die Medien 10-13 lediglich im Rahmen biologischer Schwankungen voneinander unterscheiden. Während der Fermentation der Nebenströme können durch den Pilz F. pinicola einige für den bereits erwähnten fruchtigen Geruch entscheidende Aromastoffe gebildet werden (Tabelle 7). Auch werden Aromastoffe, die in den unbehandelten Nebenströmen bzw. den Kulturmedien natürlicherweise enthalten sind, abgebaut; dies führt unter anderem zur Abnahme des Geruchseindruckes nach Heu im Laufe der Kultivierung. In den Safran-Nebenströmen können unter anderem Safran- typische Aromastoffe wie Safranal, Isophoron und 4-Oxoisophoron vorläufig identifiziert werden; diese sind teilweise auch in den fermentierten Getränken wiederzufinden und können dort zum Gesamtaroma beitragen. Die von F. pinicola gebildeten Aromastoffe unterscheiden sich in den verschiedenen Entwicklungsstufen des Getränkes (Screening FPI, M2, G, G10 in Tabelle 7) nur geringfügig. Dihydro- ^-ionol, Zimtalkohol und 3-Phenylpropanol können jedoch nur im finalen Getränk und dessen pasteurisierter Probe identifiziert werden. Tabelle 7: Vergleich der RI mit Standard-RI (RI NIST & RI STD. ) der mittels SPME-GC- MS/MS identifizierten Aromastoffe; BB: Blütenblätter, SB: Staubbeutel, B&S: Gemisch der Nebenströme im natürlichen Verhältnis, FPI: Fermentationsprodukt des F. pinicola im Screening, M2: 42 h fermentiertes Medium 2, G: Medium 11 42 h fermentiert mit Zuckerzusatz (finales Getränk), G10: finales Getränk 10 min pasteurisiert, M11: Medium 11 nicht fermentiert mit Zuckerzusatz SUBSTANZ RI RI NIST RI STD BB SB B&S FPI M2 G G10 M11 2-Methylbutanal 911 915 909 x x x 3-Methylbutanal 914 922 914 x x x Valeraldehyd 976 978 975 x x Isobutylacetat 1010 1005 1010 x Hexanal 1080 1080 1082 x x x x 3-Caren 1147 1147 1148 x x x Heptanal 1183 1186 1187 x x x x D-Limonen 1198 1199 1196 x x x (E)-Hex-2-enal 1216 1220 - x 2-Pentylfuran 1231 1235 1231 x x Octan-3-on 1252 1253 1249 x x x x p-Cymen 1268 1268 1268 x x x Acetoin 1281 1283 1283 x Octanal 1286 1289 1284 x x Octan-3-ol 1390 1396 1387 x x x x Nonanal 1390 1390 1388 x x x x Heptan-1-ol 1454 1462 1451 x x Oct-1-en-3-ol 1448 1446 1451 x x Essigsäure 1452 1452 1468 x x x Furfural 1465 1462 1454 x x x x x x x Benzofuran 1502 1488 - x x x x Benzaldehyd 1521 1520 1519 x x x x Linalool 1545 1544 1551 x x x x Octan-1-ol 1555 1549 1549 x x x 5-Methyl-2- 1572 1570 1565 x furfural Methyl-2-furoate 1577 1572 1578 x Isobuttersäure 1578 1581 1563 x Isophoron 1586 1595 1606 x x x x x x x 2-Methylbenzo- 1592 1563 1613 x x x x x furan Butyrolacton 1630 1626 1639 x x x x x x x Safranal 1642 1648 1657 x x x x x x x x 2-Hydroxy- 1659 1675 - x x x isophorone Nonan-1-ol 1662 1658 1664 x 2-Methyl- 1677 1660 1666 x x x x buttersäure (Z)-Non-3-en-1- 1685 1682 1676 x x x x ol 4-Oxoisophoron 1688 1690 1700 x x x x α-Terpineol 1692 1697 1698 x x 4-Ethyl- 1704 1730 - x x x benzaldehyd 2,4-Dimethyl- 1735 1742 1760 x x x benzaldehyd 2(5H)-Furanon 1757 1745 1763 x x x x x x x x Dihydrooxo- 1775 1782 - x x x phoron Cuminaldehyd 1781 1786 1773 x 2-Phenyl- 1811 1809 1819 x ethylacetat Dihydro-β-ionon 1827 1854 1842 x Hexansäure 1842 1839 1840 x x x Benzylakohol 1870 1879 1871 x x Phenylethanol 1909 1915 1910 x x x x x x x x Heptansäure 1957 1960 1958 x x Dihydro-β-ionol 1961 1966 - x x ^-Nonalacton 2025 2028 2014 x x 3-Phenyl- 2048 2050 2044 x x propanol ^-Decalacton 2140 2144 2135 x Nonansäure 2169 2174 2153 x x x x x Zimtalkohol 2286 2286 2281 x x Myristylalkohol 2165 2174 2162 x Die Analytik der Nebenströme und des finalen Getränkes mittels GC-MS/MS nach Flüssig-Flüssig-Extraktion (Tabelle 8) zeigt ähnliche Ergebnisse im Vergleich zur Aromaanalytik mittels SPME. Auch hier werden Safran-typische Aromastoffe wie Safranal, Isophoron und 4-Oxoisophoron in den Nebenströmen vorläufig identifiziert. Im finalen Getränk wird von diesen Aromastoffen nur Isophoron nachgewiesen. Dafür werden hier die Aromastoffe Zimtalkohol, Zimtaldehyd, ^- Nonalacton und 3-Phenylpropanol nur in dem Extrakt des Getränkes nachgewiesen. Die beschriebenen Geruchseindrücke dieser Verbindungen passen gut zu dem Geruchseindruck des finalen Getränkes. Tabelle 8: Vergleich der RI mit Standard-RI (RI NIST & RI STD. ) der mittels GC-MS/MS bisher identifizierten Aromastoffe der Flüssig-Flüssig-Extrakte nach SAFE; BB: Blütenblätter, SB: Staubbeutel, G: finales Getränk SUBSTANZ RI RI NIST RI STD BB SB G D-Limonen 1197 1199 1196 x 2-Pentylfuran 1234 1230 1231 x Pentan-1-ol 1252 1252 1251 x Nonanal 1390 1390 1388 x Oct-1-en-3-ol 1449 1446 1451 x Essigsäure 1464 1452 1468 x x x Benzaldehyd 1522 1520 1519 x Butan-2,3-diol 1542 1570 - x x Propansäure 1553 1564 - x Octa-3,5-dien-2-on 1568 1570 - x x x Isophoron 1587 1595 1606 x x x Butyrolacton 1630 1626 1639 x x Safranal 1643 1648 1657 x x 2-Hydroxyisophoron 1660 1675 - x 2-Furanmethanol 1663 1649 - x 2-Butyloct-2-enal 1664 1659 - x Isovaleriansäure 1679 1680 1660 x 2-Methylbuttersäure 1679 1660 1666 x x 4-Oxoisophoron 1688 1690 1700 x x 2(5H)-Furanon 1758 1745 1763 x x x Dihydrooxophoron 1776 1782 - x Phenylethylformiat 1784 1775 - x 2-Phenylethylacetat 1811 1809 1819 x Dihydro-β-ionon 1827 1854 1842 x Hexansäure 1854 1858 1840 x x Benzylalkohol 1877 1879 1871 x Phenylethanol 1911 1915 1910 x x x 2-Phenylbut-2-enal 1928 1922 - x β-Ionon 1933 1923 1921 x Heptansäure 1960 1954 1958 x Maltol 1964 1965 1942 x α-Acetylpyrrol 1973 1971 - x p-Anisaldehyd 2022 2038 2016 x ^-Nonalacton 2025 2028 2014 x Zimtaldehyd 2037 2037 2046 x 3-Phenylpropanol 2050 2048 2044 x Nonansäure 2171 2174 2153 x x Palmitinsäuremethylester 2210 2210 - x x Zimtalkohol 2287 2286 2281 x Vanillin 2566 2566 2565 x Myristinsäure 2698 2716 - x Die in Tab. 8 sowie auch an anderen Stellen dieser Beschreibung angegebenen bisher identifizierten Geruchs-/Geschmacksstoffe stellen keine abgeschlossene Liste dar, und es können auch einzelne u.U. fehlen, ohne dadurch den Umfang der Erfindung zu verlassen. Die vorgesehene Fermentation wird beispielsweise in einem Temperaturbereich von 4°C bis 36°C durchgeführt. Für die Fermentation mit Basidiomyceten-Myzel ist - abhängig von dem jeweiligen Basidiomyceten-Stamm - ein Temperaturbereich von 18°C bis 28°C, und vor allem von 20°C bis 26°C besonders geeignet. Die Dauer der Fermentation durch den Basidiomyceten liegt beispielsweise zwischen 15 min und 72 h oder zwischen 30 min und 36 h. Der Sauerstoffbedarf bei der aeroben Fermentation variiert in Abhängigkeit von dem eingesetzten Basidiomycetenstamm. Der Sauerstoff wird entweder durch Rühren des Fermentationsmediums an Luft oder durch aktive Begasung mit einer oder mehreren sauerstoffhaltigen Gasmischungen zugeführt. Möglich ist aber auch, dass bereits der in dem Fermentationsmedium vorhandene Sauerstoffgehalt zur Fermentation ausreicht. Es kann zweckmäßig sein, wenn der Sauerstoffgehalt in dem Medium im Verlauf der Fermentation verändert wird. Des Weiteren sieht die Erfindung vor, dass die Fermentation durch den Basidiomyceten nach Erhalt des gewünschten geschmacklichen Ergebnisses durch Inaktivierung des Organismus (d.h. des verwendeten Basidiomyceten) oder durch Abtrennung des Organismus gestoppt wird. Zur Inaktivierung sind verschiedene Methoden denkbar. Besonders geeignet sind Verfahren zur Pasteurisierung, Sterilisierung, die Ultrahocherhitzung, Einkochen, Tyndallisation und die Thermisation. Diese Methoden können gegebenenfalls an einem oder mehreren verschiedenen Verfahrensstadien wiederholt werden, um das Verfahrensprodukt des jeweiligen Verfahrensstadiums (Verfahrensschrittes) haltbar zu machen. Daneben können weitere Verfahrensschritte vorgesehen sein. Hierzu zählen insbesondere Maßnahmen zur Klärung eines Zwischenproduktes oder des Endproduktes. Hierbei kommen vor allem folgende Schritte in Betracht, die für sich allein oder nacheinander durchgeführt werden können: Zentrifugation, Grobfiltration, ein- oder mehrstufige Feinfiltration sowie Mikrofeinfiltration. Denkbar ist weiterhin, dass das direkte Fermentationsprodukt (der fermentative Extrakt) oder das Getränk in einem weiteren, möglicherweise nachgeschalteten Verfahrensschritt mit einem Saft, einem Saftkonzentrat, Wasser, Tee, einem anderen Getränk oder einer Getränkebase, einem alkoholischen Getränk, wie einem Wein (auch Apfelwein oder Reiswein, Schaumwein, Perlwein etc.), einem Bier, einem Likör oder einem Branntwein, gemischt wird, wobei die Verwendung eines natürlich hergestellten Produkts bevorzugt ist. Abbildungslegenden und Bezugszeichenliste Fig.1: Tabelle 4: Übersicht über die sensorische Bewertung der Pilz- Substrat-Kombinationen im Screening; Spalte B: Bewertung des Gesamteindrucks der Emerskulturen auf einer Skala von 0 (sehr negativ) bis 5 (sehr positiv) an dem jeweilig gezeigten Kulturtag (Spalte d). Fig.2A: Darstellung der Entwicklung des pH-Wertes und der Oxalsäure- konzentration von Beispielen der fermentierten Getränke im Verlauf der Optimierung (Medien 1, 2 und 3; Rohdaten lt. Tabelle in Fig.3). Fig.2B: Darstellung der Entwicklung des pH-Wertes und der Oxalsäure- konzentration von Beispielen der fermentierten Getränke im Verlauf der Optimierung (Medien 7, 8 und 9; Rohdaten lt. Tabelle in Fig.3). Fig.2B: Darstellung der Entwicklung des pH-Wertes und der Oxalsäure- konzentration von Beispielen der fermentierten Getränke im Verlauf der Optimierung (Medien 10, 11, 12 und 13; Rohdaten lt. Tabelle in Fig.3). Fig.3: Tabelle mit den Rohdaten zu den Figuren 2A, 2B und 2C. Fig.4: Vergleichende Zusammenstellung der elementaren Zusammen- setzung verschiedener organischer Kulturmedien-Bestandteile.