Das Prionen-Protein (PrP) ist ein Oberflächenprotein von Zellen, insbesondere von Neuronen, das eine wichtige Rolle bei der Genese von neurodegenerativen Krankheiten wie Scrapie, BSE, Creutzfeld-Jakob-Krankheit etc. innehat. Ein gemeinsamer Faktor dieser Erkrankungen ist das Vorliegen einer atypisch ge- falteten Form des PrP. Die atypische, pathogene Faltung des PrP-Proteins kann durch eine vererbbare Mutation im PrP-Gen ausgelöst werden, wie sie z. B. in den Krankheiten familial fatal insomnia (FFI) und Gerstmann-Sträussler Syn- drom vorliegt. Eine atypische Faltung des PrP-Proteins kann jedoch auch spora- disch bei genetisch unverändertem Prp-Gen auftreten. Über einen nicht voll- ständig aufgeklärten Mechanismus kann solch atypisch gefaltetes PrP-Protein, wenn es mit der Nahrung aufgenommen wird, normal gefaltetes PrP-Protein in die atypisch gefaltete Form konvertieren. Daraus resultiert ein infektiöse Krank- heit, die u. a. bei Schafen unter dem Namen Scrapie, bei Rindern unter dem Namen BSE (bovine spongiforme encephalopathy), und beim Menschen unter dem Namen Creutzfeld-Jakob-Krankheit bekannt ist.

Das PrP-Protein ist mittels eines GPI-Ankers (Glycosyl-Phosphatidylinositol) an die Außenseite der Plasmamembran von eukaryontischen Zellen, vor allem von Neuronen, gebunden. Die räumliche Struktur des nicht-verankerten Proteins in Lösung ist bekannt. Sie weist einen hohen Anteil an alpha-Helices auf und wird durch eine Disulfid-Brücke stabilisiert. Die Struktur der pathogenen atypisch gefalteten Form ist nicht im Detail bekannt, sie besitzt jedoch einen hohen Anteil an beta-Faltblatt Elementen. Atypisch gefaltetes PrP-Protein besitzt einen Pro- tease-resistenten Anteil und zeigt die Tendenz zur Aggregation. Solcherart ag- gregiertes PrP Protein wird im Gehirn von Individuen gefunden, die an einer Prionen-Erkrankung leiden. Der Mechanismus, wie PrP-Aggregation zum Untergang von Neuronen und damit zu den Symptomen der Krankheit führt ist nicht bekannt. Mäuse mit einem arti- fiziell inaktivierten PrP-Gen zeigen keine Krankheit, neuronalen Zelltod, oder einen anderen deutlichen Phänotyp. Es ist daher nicht anzunehmen, dass der Verlust von aktivem PrP-Protein durch Aggregation eine Rolle bei der Krankheit spielt. Ein unbekanntes Protein, in der Literatur als"Protein X"bezeichnet, spielt eine wichtige Rolle bei der Umwandlung von normal gefaltetem PrP in die patho- gene Form. Protein X bindet an das PrP Protein und beschleunigt so die Verän- derung der Faltung.

Eine weitergehende Beschreibung der Eigenschaften des PrP-Proteins und den damit in Verbindung stehenden Erkrankungen findet sich in : SB Prusiner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 : 13363-13383 (1998) Es ist wahrscheinlich, dass das"Protein X"in die PrP-Aggregate eingebaut wird, und die Aggregation auf diese Weise beeinflusst. Wenn das Protein X eine phy- siologisch wichtige Funktion erfullt und im Unterschuss gegenüber PrP vorliegt, würde der Einbau in die Aggregate dazu führen, dass der Zelle nicht mehr genü- gend freies Protein zur Verfügung steht und dadurch geschädigt wird. Die exter- ne Verabreichung von Protein X oder einem Derivat davon würde in diesem Fall den neurodegenerativen Phänotyp von Prionen-Erkrankungen lindern.

Falls diesem Protein keine essentielle Funktion zukommt, könnte durch eine Depletion des"Protein X"die Umwandlung von normalem PrP in atypisch gefal- tetes PrP verhindert oder verlangsamt werden.

Durch die vorliegende Erfindung werden erstmals Nukleinsäuren verfügbar ge- macht, die für ein Prionen-verwandtes Protein codieren. Das Prionen-verwandte Protein ist dadurch charakterisiert, dass es signifikante Ähnlichkeit zu bekannten PrP-Proteinen aus den Spezies Mensch, Maus, Schaf, Rind, Huhn aufweist. Die Ähnlichkeit kann gezeigt werden mit Hilfe der generalized Profile,, Methode, wie beschrieben in : P. Bucher, K. Karpius, N. Moeri und K. Hofmann Comput. Chem.

20 : 3-23 (1996).

Das Prionen-verwandte Protein ist weiterhin charakterisiert durch das Vorliegen von zumindest einer Disulfid-Brücke, das Vorliegen einer Signal-Sequenz zur Proteinsekretion, sowie das Vorliegen einer C-terminalen hydrophoben Sequenz, die in eukaryontischen Zellen typischerweise durch einen Glycosyl- Phosphatidylinositol Anker ersetzt wird.

Figur 1 zeigt die Nukleinsäure-Sequenz der mRNA kodierend für humanes Prio- nen-verwandtes Protein Figur 2 zeigt die Nukleinsäure-Sequenz der mRNA kodierend für murines Prio- nen-verwandten Protein Figur 3 zeigt die Peptid-Sequenz des humanen Prionen-verwandten Proteins Figur 4 zeigt die Peptid-Sequenz des murinen Prionen-verwandten Proteins Bevorzugt handelt es sich bei der erfindungsgemäßen Nukieinsäure um eine Nukleinsäure, die für das Prionen-verwandte Protein codiert. In besonders be- vorzugter Weise handelt es sich dabei um das humane und murine Prionen- verwandte Protein. Die entsprechenden Nukleinsäuresequenzen sind als Seq. ID.

Nr. 1 und Seq. ID. Nr. 2 offenbart. Die entsprechenden Peptidsequenzen sind als Seq. ID. Nr. 3 und Seq. ID. Nr. 4 offenbart.

Bei Kenntnis der Aminosäure-und Nukleinsäurestruktur des humanen und mu- rinen Prionen-verwandten Proteins kann der Fachmann unter Berücksichtigung der hohen Homologie die Nukleinsäuren und Proteine aus anderen Eukaryonten leicht auffinden. Dazu kann er zum einen kreuzreagierende Antikörper für eine spezifische affinitätschromatographische Aufreinigung einsetzen, oder er kann auf der Grundlage der Nukleinsäuresequenz Oligonukleotidprimer synthetisieren und die gesuchten Nukleinsäuren mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion in einer cDNA-Bank des Eukaryonten amplifizieren. Die entsprechende cDNA-Bank kann durch Isolierung von mRNA aus einer Gewebeprobe und anschließende Reverse-Transkription in an sich bekannter Weise erhalten werden. Aus der Nukleinsäuresequenz kann mit Hilfe des genetischen Codes die Aminosäurese- quenz abgeleitet werden. Alternativ ist es hierzu auch möglich, homologe Se- quenzen in EST (Expressed Sequence Tags)-Datenbanken zu suchen und zu kombinieren.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren eignen sich zur Expression des Prionen- verwandten Proteins in pro-oder eukaryontischen Systemen. Darüber hinaus sind sie auch zur Expression des Prionen-verwandten Proteins in vivo im Sinne einer Gentherapie oder insbesondere in Form von Fragmenten auch in komple- mentärer Struktur als Antisense-Nukleotide zur Verringerung der Expression des Prionen-verwandten Proteins geeignet.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können durch chemische Synthese oder durch Vervielfältigung in gentechnisch veränderten Organismen nach dem Fachmann an sich bekannten Verfahren hergestellt werden.

Gegenstand der Erfindung ist auch das durch die Expression der erfindungsge- mäßen Nukleinsäuren erhältliche Prionen-verwandte Protein.

Das erfindungsgemäße Prionen-verwandte Protein ! ässt sich durch Expression in gentechnisch veränderten Organismen herstellen. Insbesondere sind eukaryon- tische Expressionssysteme geeignet. Entsprechende eukaryontische Expressi- onssysteme sind dem Fachmann bekannt wie beispielsweise pRc/CMV (Firma Stratagene). Die Aufreinigung aus gentechnisch veränderten Organismen bietet, insbesondere im Falle der Überexpression, ein leichten und direkten Zugang zum erfindungsgemäßen Protein und erlaubt darüber hinaus die Isolierung in größe- ren Mengen.

Weiterhin beansprucht werden Varianten des Prionen-verwandten Proteins.

Unter den Begriff"Varianten"fallen sowohl natürlich vorkommende allelische Variationen des Prionen-verwandten Proteins sowie durch rekombinante DNA- Technologie (insbesondere durch in vitro Mutagenese mit Hilfe von chemisch synthetisierten Oligonukleotiden) und anschlief3ende Expression erzeugte Protei- ne, die hinsichtlich ihrer biologischen und/oder immunologischen Aktivität dem Prionen-verwandten Protein entsprechen. Dabei können sowohl Aminosäuren deletiert, eingefügt oder konservativ ausgetauscht werden. Konservativer Aus- tausch bedeutet, dass eine Aminosäure durch eine Aminosäure ersetzt wird, die ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften aufweist.

So sind beispielsweise folgende Aminosäuren austauschbar : Serin für/gegen Alanin, Alanin für/gegen Glycin, Methionin für/gegen Serin, Lysin für/gegen Arginin, Lysin für/gegen Serin.

Insbesondere umfaßt der Begriff Varianten auch N-und/oder C-terminale ver- kürzte Proteine sowie acetylierte, glykosylierte, amidierte und/oder phosphory- lierte Derivate. Auch Verbindungen, bei denen das Prionen-verwandte Protein oder dessen Varianten mit weiteren Molekülen wie Farbstoffen, Radionukliden oder Affinitätskomponenten gekoppelt sind, stellen erfindungsgemäße Varianten dar.

Beansprucht werden auch Nukleinsäuren, die für das Prionen-verwandte Protein codieren bzw. komplementär zu diesen Nukleinsäuren sind. Bei den Nuklein- säuren kann es sich beispielsweise um DNA, RNA, PNA oder um nukleaseresis- tente Analoga handeln. Nukleaseresistente Analoga sind insbesondere solche Verbindungen, in denen die Phosphodiesterbindung durch hydrolysestabile Ver- bindungen modifiziert sind, beispielsweise Phosphothioate, Methylphosphonate o. a.

Für Antisensenukleotide sind insbesondere kurze Fragmente der Nukleinsäuren geeignet. Diese sollten aus Gründen der Spezifität bevorzugt mehr als 6, noch mehr bevorzugt mehr als 8 und am meisten bevorzugt mehr als 12 Nukleotide aufweisen. Aus Gründen der Diffusion und der Kosten haben sie üblicherweise eine Länge von weniger als 30 Nukleotiden, bevorzugt 24 oder weniger und noch mehr bevorzugt 18 oder weniger Nukleotide.

Gegenstand der Erfindung sind auch Derivate von Nukleinsäuren, die for diagno- stische oder therapeutische Zwecke mit anderen Molekülen gekoppelt sind, beispielsweise mit Fluoreszenzfarbstoffen, radioaktiven Markern oder Affinitäts- komponenten, sowie Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und der zu diesen Nukleinsäuren komplementären Nukleinsäuren sowie Varianten der Nukleinsäuren.

Fragmente bezeichnet dabei Nukleinsäuren, die am 5'oder 3'oder an beiden Seiten verkürzt sind. Unter dem Begriff"Varianten"wird verstanden, dass diese Nukleinsäuren unter stringenten Bedingungen mit der erfindungsgemäßen Nu- kleinsäure bzw. dazu komplementären Nukleinsäuren hybridisieren. Unter dem Begriff"stringente Bedingungen"wird verstanden, dass die Hybridisierung bei Bedingungen durchgeführt wird, bei der die Temperatur noch bis zu 10°C unter der Temperatur liegt (bei sonst identischen Bedingungen), bei der exakt kom- plementäre Nukleinsäuren gerade noch hybridisieren würden. Wenn beispiels- weise eine exakt hybrisierende Nukleinsäure unter gegebenen Bedingungen bis zu einer Temperatur von ca. 55°C hybridisiert, dann sind stringente Bedingun- gen Temperaturen gleich oder höher 45°C. Bevorzugt ist der Temperaturbereich für stringente Bedingungen von 5°C, noch mehr bevorzugt von 3°C.

Des weiteren betrifft die Erfindung Antikörper, die gegen das erfindungsgemäße Prionen-verwandte Protein oder die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren gerichtet sind. Diese Substanzen eignen sich insbesondere zum Einsatz in der Diagnostik, dem Fachmann an sich bekannten Immunoassays, zur histologischen Untersu- chung sowie als Arzneimittel zur Behandlung von Zuständen, die mit einer Überexpression des Prionen-verwandten Proteins verbunden sind. Solche erfin- dungsgemäßen Antikörper können mit dem Fachmann an sich bekannten Ver- fahren durch Immunisierung mit Prionen-verwandtem Protein, erfindungsgemä- ßen Nukleinsäuren oder Peptid-und Nukleinsäurenfragmenten in Gegenwart von Hilfsreagenzien erhalten werden.

Weiterhin sind Gegenstand der Erfindung Zellinien, die das erfindungsgemäße Prionen-verwandte Protein überexprimieren. Solche Zellinien sind erhältlich durch Transfektion mit Vektoren, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, die für das Prionen-verwandte Protein kodieren, enthalten. Im Falle von eukaryonti- schen Zellinien kann die Transfektion beispielsweise durch Elektroporation erfol- gen. Die Zellinien sind dabei vorzugsweise stabil transfiziert.

Das erfindungsgemäße Prionen-verwandte Protein, die erfindungsgemäßen Nu- kleinsäuren sowie die erfindungsgemäßen Antikörper können in Arzneimitteln und Diagnostikmitteln gegebenenfalls zusammen mit weiteren Hilfsstoffen ent- halten sein. Diese Arznei-und Diagnostikmittel eigenen sich zur Diagnose und Behandlung von Erkrankungen, die auf einer Über-oder Unterexpression und/oder einer erhöhten oder verminderten Aktivität des Prionen-verwandten Protein und/oder auf Störungen der Proteinaggregation, der Kupferhaushaltes der Zelle beruhen und/oder solche, die mit einem erhöhtem Maß an neuronalen Zelltod einhergehen. Insbesondere sind dies Erkrankungen bei denen das PrP- Protein oder das Prionen-verwandte Protein selber Aggregate bilden oder die Aggregation anderer Proteine beeinflussen.

Ein erfindungsgemäßes pharmazeutisches Screening-Verfahren beruht auf der Beobachtung von Protein-Agggregaten in Zellinien, die das erfindungsgemäße Prionen-verwandte Protein, ggf. in Kombination mit PrP, überexprimiern, wobei mindestens eine potentiel pharmazeutisch wirksame Substanz zugefügt wird.

Solche Zellinien eignen sich somit insbesondere zur Entwicklung und Prüfung von pharmazeutischen Leitstrukturen. Alternativ beruht ein erfindungsgemäßes pharmazeutisches Screening-Verfahren auf der Messung der Zell- Überlebensfähigkeit der erwähnten Zellinien unter Einfluss mindestens einer potentiell pharmazeutisch wirksamen Substanz.