ALIMENTO PROBIOTICO ADECUADO PARA PECES DE ESPECIES SALMONIDAS

Y SU ELABORACIÓN.

SECTOR TECNICO La presente tecnología esta destinada al sector industrial, principalmente a la industria acuícola, se refiere a un proceso para la elaboración de un alimento y dicho alimento, que incorpora cepas probióticas, con propiedades inmunoestimulantes y protectoras, las cuales facilitan la prevención de enfermedades, evitando el uso de técnicas invasivas utilizadas hasta hoy día.

TÉCNICA ANTERIOR

La salmonicultura juega hoy en día un rol muy importante en la economía de nuestro país, ya que presenta una tasa de crecimiento anual promedio de 20% en sus envíos durante los últimos 16 años. En el año 2008 los envíos de salmones ascendieron a 2.475 millones de dólares, lo que supone un aumento del 6,4% con respecto al año anterior. Las especies de cultivo más importantes son: el Salmón del Atlántico (Salmo salar), que en el año 2007 representó el 50,5% de las exportaciones chilenas de salmónidos, el Salmón del Pacífico (Oncorhynchus kisutch), que representó el 20,7%; y la Trucha Arcoíris (Oncorhynchus mykiss), que aportó con el 27,4% de las exportaciones.

A nivel global, se observa una marcada tendencia hacia la producción limpia, previniendo los efectos adversos que puede provocar el proceso productivo tanto en el medio ambiente como en la salubridad de la población. La acuicultura como actividad productiva no está ajena a ello y a nivel internacional se encuentra en franca promoción de la introducción de nuevos métodos de control biológico de los cultivos de peces, moluscos, y crustáceos. Chile, como un actor relevante de este mercado no puede sustraerse a ello. Actualmente, con la firma de acuerdos comerciales, se han abierto mayores posibilidades comerciales para este sector productivo, pero a su vez aumenta el desafío para nuestra producción acuícola debido al creciente desarrollo e implementación de barreras sanitarias cada vez más exigentes para Chile.

i El surgimiento de diversas patologías en los peces es directamente proporcional al estado fisiológico de éstos, los factores de virulencia del microorganismo infectante, la dosis infectante y principalmente, al grado de contaminación y calidad ambiental. Debido a lo mencionado anteriormente, el aspecto sanitario en las salmoniculturas es de vital importancia, ya que los sistemas de confinamiento, la producción intensiva de peces en estanques y la presencia de fauna silvestre acompañante, incrementan considerablemente la transmisión de enfermedades infecto contagiosas y la aparición de nuevos patógenos.

La industria salmonera chilena, en estos días vive una severa crisis sanitaria, que está generando importantes consecuencias laborales y sociales. Esta crisis se debe principalmente al uso indiscriminado de grandes cantidades de fármacos, cuyos índices superan ampliamente los volúmenes administrados por Noruega, principal mercado competidor de Chile. Los principales métodos utilizados en la suministración de fármacos han sido las aplicaciones a través de baños de inmersión y, últimamente, la inclusión de éstos en las dietas de los peces. Sin embargo, investigaciones a nivel mundial señalan que entre un 75 y 93% de los antibióticos suministrados en salmonicultura, no son consumidos o son defecados.

El suministro de antibióticos de manera indiscriminada por vía indirecta (baños de inmersión) se asocia a impactos ambientales negativos, especialmente en áreas costeras, donde las adversas condiciones climáticas provocan un estrés adicional a los peces. De esta forma, la fracción de antibióticos no asimilados queda disponible para la fauna nativa presente en la columna de agua y en los sedimentos, los que, al ser atraídos por el alimento sobrante pueden acumular pequeñas cantidades de antibióticos en su organismo, favoreciendo de esta manera el desarrollo de patógenos resistentes. Investigaciones realizadas en centros salmoneras tratados con antibióticos, muestran que las bacterias ubicadas bajo los módulos de los centros de cultivo presentan un aumento en la resistencia a los antibióticos, hasta un año después del tratamiento. Es por esta razón que los efectos de los antibióticos sobre las comunidades bacterianas y los niveles de composición específicos son evidentes varias semanas o meses después de los tratamientos.

Actualmente, la administración de antibióticos en cultivos de salmónidos es una práctica frecuente y masiva en la acuicultura. Esto provoca la presencia de estas sustancias en humanos y en animales y, por consiguiente, provocando resistencia bacteriana en estos individuos. Por ello, se han establecido métodos de reemplazo del control de patógenos con antibióticos mediante el control biológico, el cual representa una interesante oportunidad desde el punto de vista científico, ambiental y económico.

Frente a este escenario, ha surgido la búsqueda de nuevos métodos para el control biológico de enfermedades en salmónidos y disminuir el impacto que han provocado estos productos químicos y alimentos artificiales en el ambiente. Como una alternativa innovadora y ambientalmente amigable surgen los probióticos, definidos como "microorganismos vivos los cuales administrados en cantidades adecuadas, confieren un beneficio en la salud del hospedador". El desarrollo de probióticos adecuados no es una tarea simple, requiere de investigación empírica y fundamental, pruebas a gran escala y el desarrollo de instrumentos apropiados de monitoreo y la producción bajo un estricto control de calidad. Los probióticos comúnmente usados en acuicultura incluyen un amplio rango de taxas, desde bacterias lácticas hasta otros microorganismos como levaduras Es por esta razón que a través de la presente tecnología se utilizan los beneficios de los probióticos para incrementar la productividad y la competitividad en el mercado nacional e internacional de los salmónidos.

Se encontraron 5 documentos vinculados con la presente tecnología, los que se divulgan a continuación: La patente de invención de la oficina de patentes de invención japonesa JP2004298080 (2004;, Feed for fish and shellfish, and method for producing the same, resguarda un método para la producción de alimentos para peces y moluscos que comprende la fermentación de algas utilizando al menos un tipo de lactobacilo seleccionado desde el grupo consistente en L plantarum, L. casei, L. rhamnosus, L. kéfir, L. fermentum, después del tratamiento de las algas con una enzima que digiere sacáridos o en paralelo al tratamiento. Por este método, la fermentación de las algas permite obtener partículas finas utilizando un determinado lactobacilo cuyo resultado es obtener un alimento seguro para el zooplancton, peces pequeños, bivalvos u otro animal acuático, teniendo una alta eficiencia en la producción y buena preservación. Este método no se asemeja al proceso que se desea resguardar.

Por otra parte la patente de invención de la oficina de patentes mundial WO200404186 (2004), Probiotic additive and the production method thereof, describe un compuesto alimenticio que contiene probióticos para animales de granja, avícolas y peces de crianza. El aditivo probiótico es producido por una mezcla de biomasa bacteriana de Bacillus subtilis B-2250 y/o Bacillus licheniformis B-2252 con sustancias auxiliares así como transportadores absorbentes y rellenos de alta absorbencia. Dicha invención hace posible producir aditivos probióticos microencapsulados, el cual contiene probióticos, es de fácil uso, consumo y tiene propiedades preservantes estabilizadas en todas las etapas de la producción. Dicho aditivo probiótico seco microencapsulado mejora el alimento y el estado del animal, aumentando la ganancia de peso y reduciendo la mortalidad. Esta tecnología, si bien es cierto menciona un alimento probiótico, el método y la forma en que se presenta este aditivo probiótico difiere con la tecnología que se desea proteger.

La solicitud de patente de invención de la oficina de patentes de invención de Estados Unidos US2002192202 (2002), Probiotic compounds derived from Lactobacillus casei strain KE01, protege una composición probiotica que comprende Lactobacillus casei KE01 que se utiliza en la inhibición de enfermedades producidas por patógenos entéricos en animales manteniendo la salud del animal. Esta tecnología describe un método para producirlo y un método para utilizar esta composición probiotica a través de de capsulas de gelatina, tabletas alimento animal y bebestibles. Esta propuesta difiere completamente con la iniciativa que se desea salvaguardar. La solicitud de patente de invención de la oficina de patentes neozelandesa NZ335458 (2001), Feed production salmonides (atlantic salmón or rainbow trout) wich increases growth rates, digestibility of protein and fat and feed utilisation of fish, describe un método para la producción de un alimento para peces el que comprende productos de pesca componentes estándares de alimentación y piensos para peces. Comprende además diformato de amonio, sodio o potasio, además de ácido fórmico o mezclas de ellos. Finalmente, el alimento para peces contiene preferentemente, 0,3-2,5% en peso de formatos del peso total del alimento. Esta invención es totalmente diferente de la tecnología que se quiere proteger, aunque ambas se refieren a un alimento para peces, preferentemente para salmónidos, la composición del alimento y la metodología para producirlo difieren completamente.

Por último la solicitud de patente de invención de la oficina de patentes de Estados Unidos US6168815 (2001), Method for continuous production of dry feed for fish and shell fish, se refiere a un método para la producción continua de alimento seco para peces y crustáceos el que comprende pescado fresco crudo, carbohidratos de vegetales junto con otros aditivos que se agregan para dar un contenido de carbohidratos de al menos un 5% durante le producción del alimento. Durante todos los pasos del proceso los pellet formados el contenido de agua de estos es superior al 10%. El alimento producido contiene 25-60% de proteínas, 10-40% de grasa y 5-25% de carbohidratos. Además el alimento contiene 25-60% de proteína de pescado así como grasa a la forma de aceite de pescado superior a 40%. Este producto difiere totalmente con lo que se desea proteger ya que no utiliza ningún probiótico en su formulación y el procedimiento para la elaboración de este alimento es diferente alo que se desea resguardar.

Además de las patentes, se encontraron documentos que se relacionan, en cierta medida con la presente invención; los que se analizan a continuación:

Probiotic effect of lactic acid bacteria in the feed on growth and survival of fry of Atlantic cod (Gadus morhua) Hydrobiologia 352: 279-285, 1997.

Este documento se refiere a la búsqueda de métodos alternativos para el control de enfermedades en organismos acuáticos. En este estudio menciona el uso de probióticos en la alimentación de un pequeño pez del atlántico {Gadus morhua) al que posteriormente lo exponen a una cepa virulenta de Vibrio anguillarum. La razón de mortalidad se observó tres semanas después de la alimentación suplementada con la bacteria ácido láctica. Los resultados obtenidos demostraron una mejora en la resistencia hacia la enfermedad y una colonización de la bacteria ácido láctica en la flora intestinal del individuo. Se observó además una inhibición en el crecimiento de la cepa patógena. La diferencia fundamental con la tecnología que se desea proteger, radica en la preparación del alimento. En el caso del estudio, se utiliza como base un alimento comercial al cual se le agrega, en una proporción determinada, biomasa liofilizada de la cepa probiótica y se les administra a los peces pequeños, en cambio, en nuestra iniciativa, el probiótico está incorporado al alimento de una forma muy diferente a lo que se expone en este artículo científico. Immune enhancement in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) by potential probiotic bacteria (Lactobacillus rhamnosus) Fish & Shellfish Immunology 15 (2003) 443-452.

El presente estudio está relacionado con el mejoramiento de la inmunidad de peces por bacterias ácido láctica Lactobacillus rhamnosus. La bacteria es administrada de forma oral en distintas dosis a trucha arcoíris la cual se alimenta por dos semanas. Se tomaron muestras periódicamente de sangre, mucus de la piel y además se tomaron muestras desde el tanque de agua. Los resultados demuestran que los parámetros inmunes de la trucha arcoíris mejoraron considerablemente utilizando la cepa probiótica. La diferencia con la iniciativa que se desea proteger, al igual que en el punto anterior el alimento que se les da a los peces es una mezcla proporcional de alimento comercial, el que se utiliza como base y biomasa seca de Lactobacillus rhamnosus, lo cual se diferencia completamente con la tecnología que se desea proteger.

DIVULGACION DE LA INVENCION

La invención describe un alimento probiótico para salmónidos, el que comprende cepas ácido lácticas, las cuales se obtienen desde dichos salmónidos, entre las que destacan Lactobacillus plantarum LPS47, Lactococcus lactis lactis LPS148, LPS28 Pediococcus acidilactic, obtenidas desde salmón y las cepas, Pediococcus damnosus LPT32 y Lactobacillus plantarum LPT87 obtenidas desde truchas {Onchorhynchus mykiss), con excelentes propiedades de colonización y de protección hacia algunos agentes microbianos, además de procesos para su elaboración.

Dentro de las técnicas que se utilizan en la prevención de enfermedades en el campo de la acuicultura, la vacunación es una de las más utilizadas. Las desventajas que presenta este método es que es invasivo y no es preventivo en estadios tempranos de los peces, además su acción está restringida a algunos patógenos. La gran ventaja que tienen las cepas aisladas, es que protegen a los peces contra enfermedades que prevalecen en centros de cultivo. Por otra parte, el uso de probióticos se ha convertido en un medio alternativo al empleo de antibióticos para reducir enfermedades y la incorporación de biomasa probiótica al alimento es otra alternativa para proteger a los peces de patógenos y ha sido tema de constante investigación. Una de las formas que se utiliza es la adición de biomasa deshidratada, mediante secado por atomización (bajo la forma de polvo) la cual se mezcla con alimento comercial en el instante de la alimentación. Sin embargo, se ha determinado que la desventaja más importante de este método es la poca homogeneidad de la mezcla polvo probiótico - alimento comercial.

La tecnología que aquí se propone, supera con ventajas este problema existente, a través de las siguientes vías: 1 ) se adiciona el probiótico en otras etapas del proceso de producción del alimento, como por ejemplo, en la formación de pellets o en la etapa de secado ya sea en un lecho fluidizado o al vacío, y 2) un proceso alternativo, como la incorporación de la biomasa en la etapa de formulación y mezclado del alimento, desde ensilado biológico que contenga cepas lácticas, o 3) una mezcla de ambas (alimento pulverizado mezclado con el cultivo incorporado para ser deshidratado en un secador por atomización). Todos estos procesos implican un solo objetivo final: obtener un producto probiótico con alta concentración bacteriana, de baja humedad (menor a un 10%) y cuyo principio activo, la cepa probiótica, conserve su viabilidad y sus propiedades durante el almacenamiento a temperatura ambiente.

Para llevar a cabo esta tecnología, en primera instancia, se realiza el aislamiento de cepas, obtenidas en condiciones de asepsia a partir de muestras de hisopado estomacal e intestinal y un frotis de branquias y piel de salmón (Salmo salar y Oncorhynchus kisutch) y de trucha arcoíris {Onchorhynchus mykiss). Luego de una serie de análisis, se seleccionan las cepas con más competentes, Lactobacillus plantarum LPS47, Lactococcus lactis lactis LPS148, LPS28 Pediococcus acidilactic, obtenidas desde salmones y Pediococcus damnosus LPT32 y Lactobacillus plantarum LPT87 obtenidas desde truchas.

Estas cepas se identifican molecularmente caracterizando previamente sus propiedades probióticas, para ser definidas como LPS (Lactobacilo Probiótico de Salmón) o LPT (Lactobacilo Probiótico de Trucha).

Una etapa importante asociada al mecanismo de acción probiótico es la adhesión y posterior colonización de epitelio, el que se caracteriza por la atracción de la bacteria ensayada con la superficie del tejido de interés, seguido de la asociación de la mucosa con las células epiteliales. La adhesión y la colonización de la mucosa en la superficie del tejido son posibles mecanismos de protección contra patógenos por competición por los sitios y estimulación del sistema inmune.

Es por esta razón que se realizan pruebas de adhesión de cepas ácido lácticas, donde se mide la adhesión de dichas cepas aisladas en el tracto gastrointestinal, branquias y piel de salmones en mucus extraído de tejidos de salmón utilizando distintos métodos y se evalúa el potencial antibacteriano de estas cepas en un soporte biológico. Para el caso de las cepas obtenidas de truchas se evalúa la capacidad de colonizar el tracto gastrointestinal (Gl), donde el aislamiento se hace por medio de baño sónico (BS) el cual reviste mayor relevancia, debido a que estas se encuentran íntimamente adheridas a la superficie del tejido del tracto Gl. También se evalúa el potencial antibacteriano de estas cepas en un soporte biológico donde se estudia la interacción de ambos microorganismos en epitelio gastrointestinal, emulando las condiciones existentes en el tracto de peces vivos. Luego se determinan los mayores índices de adherencia, propiedad cuantificada por métodos directos e indirectos. Las experiencias en salmones, demuestran diferencias significativas en la adherencia de las cepas probióticas a los sustratos mucosos empleados. La cepa LPS148, resulta ser altamente adherente a todos los mucus empleados, en comparación con otras cepas estudiadas, siendo los mucus de piel, branquias y estómago significativamente más afines con la bacteria que el mucus intestinal (figura N°1 ). Esta cepa, además de demostrar una adherencia excelente, es la que inhibió la adherencia de Aeromonas hidrophyla (figura N°2A) y Yersinia ruckeri (figura N°2B) en todos los mucus, con resultados siempre estadísticamente significativos, además su capacidad excluyente fue en casi todas las combinaciones experimentales superiores a las otras bacterias lácticas estudiadas.

De acuerdo con los resultados obtenidos en trucha, tanto en la cepa LPT32 como LPT87, estas son capaces de permanecer en el tracto Gl hasta los 12 días postinoculación. En el caso de las bacterias sonicadas, sus densidades son aceptables y se proyecta que su permanencia sería mayor. Estos resultados son auspiciosos, pues uno de los requisitos importantes en la selección de un microorganismo probiótico, es la capacidad de permanecer por períodos prolongados en el tracto Gl de los animales tratados (Figura 3).

Para el caso de las truchas, se observa que la mayor parte de las cepas presenta resistencia a gentamicina (7 cepas con halos < 12 mm), neomicina (7 cepas con halos < 11 mm) y clindamicina (6 cepas con halos < 10 mm). Todas las cepas de lactobacilos presentan resistencia a metronidazol y vancomicina. Se observa que todas las cepas de lactobacilos presentan resistencia a cloxacilina, norfloxacina y ciprofloxacino. Los valores de los halos de inhibición para doxiciclina fluctuaron de 13 mm a 17 mm, que las definiría las cepas como: mediana resistencia (13-14 mm) y susceptibles (> 16 mm). En cuanto a las pruebas de resistencia en estrés salino, realizadas en salmón, se observa que la exposición a diferentes salinidades, incluso cercanas a la marinas, no afecta la la capacidad antagónica de las cepas lácticas (cepa 47, figura 4A y cepa 148, figura 4B), las cepas probióticas estudiadas resisten satisfactoriamente el estrés salino al cual fueron sometidas. Por lo tanto, se demuestra que estas cepas son capaces de resistir altas salinidades, incluso semejantes a la concentración que posee el agua de mar, con lo que se reafirma el potencial uso, aplicación y permanencia de estos organismos en productos utilizados en los diferentes estadios de crecimiento de los salmones, particularmente la fase engorda. Por otra parte, las cepas se someten a pruebas para evaluar la resistencia de éstas a la acción de ácidos presentes en el tracto gastrointestinal de Onchorhyncus mykiss. Para ello se prepara un set de tubos con caldo MRS con concentraciones progresivas del ácido en estudio. El rango de pH de los ácidos fue de pH 2.4 a un pH 5.3 para el ácido acético y para el ácido clorhídrico de un pH 1.2 a un pH 6.0.

Tabla N° 1

ÁCIDO ACÉTICO

pH mínimo bactericida

ESPECIE BACTERIANA

pH mínimo inhibitorio

Lactobacillus brevis (19) 4.48 3.94

Lactobacillus brevis (21 ) 4.45 3.60

Lactobacillus rhamnosus (22) 4.48 3.59

Lactobacillus rhamnosus (26) 4.44 3.58

Lactobacillus brevis (28) 4.47 4.17

Lactobacillus brevis (32) 4.78 3.87

Lactobacillus divergens (34) 4.46 3.92

Lactobacillus casei (67) 4.74 3.87

Lactobacillus plantarum (87) 4.48 3.60

Tabla N° 2

ÁCIDO CLORHIDRICO

ESPECIE BACTERIANA

pH mínimo inhibitorio pH mínimo bactericida

2.36 1.25

Lactobacillus brevis (19)

Lactobacillus brevis (21 ) 2.23 2.23

Lactobacillus rhamnosus (22) 2.32 2.32

Lactobacillus rhamnosus (26) 2.42 2.42

Lactobacillus brevis (28) 2.06 1.20

Lactobacillus brevis (32) 3.90 1.25 Lactobacillus divergens (34) 2.37 1.24

Lactobacillus casei (67) 2.23 > 1.20

Lactobacillus plantarum (87) 3.19 3.19

De acuerdo a los resultados que se observan en las tablas N°1 y N°2, las cepas de lactobacilos de origen gastrointestinal de trucha arcoíris presentan una inhibición de su crecimiento en el medio MRS con ácido acético a un rango de valores de pH mucho mas elevados que el rango de pH de inhibición de estas mismas cepas en ácido clorhídrico.

Con lo anterior, se observa que todas las cepas ensayadas resisten un pH mucho más bajo que el pH presente en el tracto gastrointestinal de las truchas. Por lo tanto, de acuerdo a estos resultados, todas las cepas ensayadas presentan características de resistencia a ácido clorhídrico lo cual les permite ser administradas por vía oral. Una de las etapas importantes en la selección final de un probiótico es la capacidad que tiene de colonizar los epitelios de los organismos de interés. Para el caso de las cepas seleccionadas, LPS47 Lactobacillus plantarum y LPS148 Lactobacoccus lactis lactis, las que son incluidas en un preparado, tienen la capacidad de permanecer viables, adherirse y colonizar el tracto gastrointestinal de salmones, durante y después de la administración del preparado. Ambas cepas probióticas, son capaces de permanecer viables en los peces por un período prolongado, la cepa LPS148, se aisla hasta 11 días después del cese de la administración de probiótico en los estanques, mientras que la cepa LPS47, se aisla hasta el último monitoreo, correspondiente al día 23 del ensayo y 13 sin la administración continua de cepas probióticas en la dieta, lo que nos demuestra que la cepa es capaz de persistir en los peces por un período mayor a 13 días. Estos ensayos de colonización resultan muy favorables, ya que son capaces de permanecer en el tracto gastrointestinal del salmónido luego de varios días después de concluida la administración del probiótico a través del alimento. Figura N° 5

Dentro de los análisis que se realizan, se evalúa además el efecto inmunoestimulante de la aplicación oral de las cepas probióticas, LPS148 y LPS47 en juveniles de trucha arcoíris (20-40 grs). Los peces se alimentan durante 28 días con pellet comercial suplementado con cepas probióticas a una concentración de 10 ⁹ UFC/gr de alimento. Cada siete días se sacrifican seis peces de cada grupo, incluyendo los controles sin suplementación.

Los principales parámetros hematológicos e inmunológicos celulares y humorales que se evalúan son: el hematocrito, el recuento total de células sanguíneas, la concentración de proteínas plasmáticas totales, la concentración de anticuerpos totales, la actividad de lisozima plasmática y la activación inmunológica de los macrófagos renales mediante quimioluminiscencia (estallido respiratorio).

El principal parámetro inmunológico que aumenta significativamente es el estallido respiratorio, el que se observa sólo con la aplicación del probiótico LPS148 (figura N°6). El resto de los parámetros no presentan diferencias, estadísticamente significativas, y fluctúan dentro de los rangos normales para la especie y etapa de crecimiento.

En cuanto a los resultados inmunológicos, estos muestran que las bacterias probióticas generan una estimulación inespecífica semejante a la obtenida por un inmunoestimulante comercial y levemente superior a la generada en el grupo control, con lo que se puede afirmar que el efecto provocado por el producto es benéfico y no genera respuestas negativas sobre los peces. Además se observa que la aplicación oral de probióticos produce un efecto más eficiente y duradero comparado con la aplicación intraperitoneal.

También se evalúa el rol protector de estas cepas probióticas en bioensayo de desafío, el cual las cepas lácticas se desafían frente a una cepa virulenta de Aeromonas sp. Los resultados de este estudio, confirman que la adición de probióticos en el alimento tiene un efecto protector importante sobre Aeromonas salmonicida, el agente causal de la furunculosis, que es una enfermedad aguda cuyo periodo de incubación fluctúa entre 5 a 12 días en agua dulce. Para este estudio se utilizan dos grupos de peces de la especie salmón coho, donde un grupo recibe una alimentación probiótica (cepa LPS47) y un grupo control que recibe sólo dieta comercial. Posteriormente, ambos grupos se desafían con una cepa virulenta de Aeromonas salmonicida vía intraperitoneal (IP). Posterior al desafío, el grupo probiótico continúa con la dieta suplementada con la cepa LPS47 por 10 días adicionales. La temperatura y calidad de agua se registran diariamente. Todos los peces muertos se someten a un completo examen de necropsia para determinar la causa de muerte. Para ambos grupos se detecta el inicio de los signos patológicos propios de furunculosis y se comprueba que las lesiones encontradas corresponden a Aeromonas salmonicida.

La mortalidad en el grupo control comienza a los 6 días post desafío y alcanza el 83% al día 21. En el grupo alimentado con probióticos, en cambio, la mortalidad comienza al día 7 post desafío pero alcanza una mortalidad acumulada de solo 10% al término del bioensayo (día 21 ). Por lo tanto, se confirma el rol protector al desafiar las cepas probióticas frente a una cepa virulenta de Aeromona sp. el cual muestra una dramática reducción en la mortalidad de los peces respecto al grupo control (10% contra 83%, respectivamente), con lo que se confirma el rol protector de esta cepa probiótica. (Figura N° 7)

También se observa el efecto protector de dos cepas de bacterias probióticas administradas vía oral, en alevines de truchas arcoíris desafiados experimentalmente con una cepa virulenta de F. psychrophilum. Se logra reproducir la enfermedad exitosamente mediante infección, por cohabitación en condiciones de laboratorio, lográndose el reaislamiento desde el bazo de peces moribundos de una cepa virulenta de la bacteria. Esto se realiza, también por inoculación intraperitoneal en varios grupos de peces con y sin suplementacion probiótica. El probiótico LPS148 provee el mayor grado de protección contra flavobacteriosis interna con solo 15% de mortalidad acumulada comparado con el 35% del grupo control. El probiótico LPS47 presenta niveles de mortalidad levemente superiores a LPS148, pero casi la mitad de la mortalidad que la que presenta el grupo desafiado sin probiótico (grupo control). (Figura N° 8)

Para el caso del efecto protector en truchas se analiza el efecto probiótico de dos cepas ácido lácticas endógenas en experiencias de antagonismo in vitro como en bioensayos en trucha arcoíris Oncorhynchus mykiss. Las cepas probióticas Pediococcus damnosus (LPT32) y Lactobacillus plantarum (LPT87), se administran oralmente a una concentración de 1*10 ⁹ UFC/gr de alimento. Luego de dos semanas de tratamiento probiótico, los peces se infectan experimentalmente con el patógeno Yersinia ruckeri, la respuesta inmune inespecífica y la sobrevivencia fue monitoreada. Las cepas estudiadas poseen capacidad inhibitoria contra Yersinia ruckeri en condiciones in vitro y son capaces de disminuir significativamente la mortalidad de trucha arcoíris ante la infección experimental con este patógeno y son potencialmente empleables en centros de cultivo de trucha arcoíris. (Figura N° 9) Una vez establecidas todas estas características de las cepas probióticas aisladas desde especies salmónidas, se diseña un proceso para producir un alimento que contenga cepas probióticas y que dichas cepas mantengan su viabilidad y concentración en el tiempo. Se realizan diferentes pruebas para asegurar la viabilidad de la cepa probiótica en el alimento. Un requisito importante para fines de preparar alimento con biomasa fresca es minimizar la adición del agua, por lo que se diseña el proceso para que la humedad final del producto probiótico no supere el 9% final, en base húmeda (considerando tanto el tiempo de cultivo, como el de cosecha de biomasa y desinfección de equipo de mezclado). Para ello, se centrifuga el cultivo bacteriano y se resuspende la biomasa en suero fisiológico estéril, donde la relación cultivo:suero es de 4:1. Respecto a la concentración bacteriana, la relación cultivo:alimento es de 1 :20, es decir, por 1 L de cultivo bacteriano se puede preparar 20 kg de alimento, con una concentración promedio de 10 ⁸ UFC/g. Dado que el pellet es un sólido altamente poroso, absorbe rápidamente el líquido que se incorpora con biomasa. De esta forma se obtiene una distribución homogénea de la biomasa probiótica en la cantidad de alimento preparada. Las concentraciones promedio de todos los lotes producidos de esta forma son de 10 ⁸ UFC/g. Se almacenan en bolsas plásticas en un lugar fresco y seco (temperatura ambiente 20°C, presión 1 atm (ó 760 mmHg) y Humedad relativa del aire ambiental). Puesto que el alimento se prepara para consumo semanal, los resultados mostrados son óptimos, dado que a los 14 días el producto aun conserva una concentración superior a 10 ⁷ UFC/g (figura N°10)

Una alternativa ambientalmente sustentable y de bajo costo lo constituye el ensilaje biológico, en donde se obtienen proteínas de alto valor nutricional. Otra de las ventajas es su fácil elaboración, puesto que utiliza residuos de la industria pesquera, como: cabezas, visceras y otras partes que no son destinadas a consumo humano.

Mediante un proceso de fermentación controlada con bacterias lácticas y carbohidratos, se obtiene un producto acidificado (pH < 4.5), de excelente calidad nutricional y antimicrobiana, dado que inhibe la proliferación de bacterias que causan la descomposición, que además puede ser almacenado por largos períodos de tiempo.

Se observan ciertos parámetros que pueden influir en la calidad del alimento que se está proponiendo como por ejemplo: fermentación en sustratos sólidos, efecto de la temperatura de cultivo, efecto de la fuente de carbono, efecto de la incorporación de sales minerales; los cuales se analizan y estandarizan a fin de obtener un producto óptimo.

Dado que las cepas que se utilizan para preparar este alimento probiótico producen ácido láctico en altas concentraciones en medios de cultivo (entre 30 y 40 g/L), tanto comerciales como formulados en base a permeado de lactosuero, se hace necesario determinar la cantidad de ácido láctico que es capaz de producir al introducir esta bacteria en sustratos sólidos, ya que, la disminución de pH en los ensilados es directamente proporcional a la adición de fuente de carbono y a la consecuente producción de ácido láctico, lo que aumenta proporcionalmente con el tiempo de cultivo, hasta que alcanza un valor relativamente constante a partir de las 48 h, por disminución de la concentración de la fuente de carbono.

Una alternativa a la fermentación de las cepas en sustratos proteicos crudos (esto es, descarte de pescados, en particular, descarte de jurel), es la fermentación en harinas de pescado, considerada la mejor fuente de energía concentrada para la alimentación de animales, constituida en un 70 a un 80% de proteína de alta calidad. Se realizan ensayos a 35°C, con la incorporación de melaza como fuente de carbono e inulina, un glúcido complejo (polisacárido), compuesto de cadenas moleculares de fructosa, considerado un prebiótico, por lo que también se determina su influencia en el crecimiento de las cepas probióticas en presencia de esta sustancia. Se formularon cuatro medios, cuya composición se muestra en la Tabla 3:

Tabla 3.

Medio tipo Inoculo [%] Melaza [%] Harina [%] Inulina [%]

A 5 9 85 1

B 5 10 85 -

C 5 8 85 2

Se observa un efecto tanto de la concentración de melaza como de la adición de inulina, dado que si se disminuye la cantidad de melaza adicionada al medio, y se reemplaza por inulina la concentración máxima que alcanza en fase estacionaria es prácticamente la misma (curvas B y C en la Figura N°11 ). Si bien los tres cultivos alcanzan concentraciones máximas similares, el medio A tiene un retardo mayor que los cultivos B y C. Técnicamente es mejor el cultivo B que contiene sólo melaza, pero en una concentración del 10%.

Elaboración de alimento a partir de ensilado biológico y harinas de pescado.

Una vez que el ensilado alcanza una acidez igual a pH 4.5, se puede utilizar la fase sólida para formular alimento para peces, según la siguiente fórmula:

Tabla N° 4.

Componente Cantidad [%]

Harina de Pescado 35

Ensilado (fase sólida) 35

Poroto de soya 14

Harinilla de trigo 8

Aceite de pescado 5

Almidón de maíz 3

Según la tabla N°4, se reemplaza la proteína cruda (descarte de pescado) por ensilado con alto contenido en biomasa probiótica y otros metabolitos, como por ejemplo, ácido láctico, producto de la fermentación de la cepa en el sustrato sólido.

En un proceso típico de elaboración de alimento de pescado, el porcentaje de proteína total (alrededor de un 70%) está compuesto por harina de pescado y descarte de pescado. Este proceso considera las siguientes etapas: a) adicionar en un fermentador, descartes de pescado, fuente de carbono e inoculo de al menos una cepa probiótica, y obtención de producto nutritivo de alta concentración de biomasa probiótica al final del tiempo de fermentación (48 a 72 horas). Concentración viable de 10 ⁹ UFC/g. b) adición de componentes nutricionales, del tipo harina de pescado, poroto de soya, harinilla de trigo, aceite de pescado y almidón de maíz; según lo indicado en la Tabla N°4. c) extrusión en frío de la mezcla; a temperatura ambiente, para controlar que el proceso se mantenga a temperatura no superior a 20°C. d) formación de pellets de, aproximadamente 1 ,5-4 mm de diámetro, e) Secado de alimento en forma de pellets, en un secador de Lecho Fluidizado.

Condiciones de secado: 40°C de temperatura de entrada de aire, tiempo de secado: 40-60 min, para obtener un producto de humedad menor a un 5% (en base húmeda).

El objetivo del ensilado biológico es incorporar la cepa probiótica en la etapa donde se trata el descarte de pescado (en el recipiente de molienda). De tal forma que la cepa fermente en un sustrato homogéneo, con adición de fuente de carbono que corresponde a melaza en una concentración de 10%. Pasa por una etapa de secado, para disminuir la actividad de agua en el producto y evitando así las reacciones degradativas tanto de la biomasa probiótica como de la proteína cruda (descarte de pescado).

Las ventajas del proceso propuesto, donde se agrega una etapa de secado en la producción de alimento probiótico para salmones a partir de ensilado biológico: se ahorra en medios de cultivos líquidos, se evita una etapa de fermentación, con el consiguiente gasto energético, tanto en la agitación como en el control de temperatura; y, por otro lado, se elimina una etapa de separación de la biomasa desde el medio de crecimiento, dado que en este caso se adiciona directamente el ensilado al mezclado con los otros ingredientes.

En el caso particular de las harinas de pescado, se puede adicionar biomasa probiótica fermentada en este tipo de sustrato. Por lo que se cuenta con dos alternativas de cultivo altamente factibles tanto técnica como económicamente.

Debido a la necesidad de preservar las propiedades nutricionales y la viabilidad de la cepa probiótica por mayor tiempo, se realiza una etapa de secado previo el almacenamiento del producto final. Como se puede observar en la Figura N° 11 , el producto mantiene una viabilidad superior a 10 ⁸ UFC/g durante aproximadamente 20 días, y sobre la especificación mínima de 10 ⁷ UFC/g durante 30 días. Cabe destacar que el producto analizado fue almacenado a temperatura ambiente (20°C, envase hermético en ausencia de luz).

Las ventajas que presentan estos alimentos probióticos desarrollados, son:

1 ) Se obtiene un alimento al cual se le incorpora la cepa probiótica fresca, en solución a un alimento comercial para salmones, de baja humedad y alta concentración bacteriana

(8-9% y 10 ⁸ UFC/g, respectivamente) que conserva su viabilidad por 15 días almacenado a temperatura ambiente (sobre 10 ⁷ UFC/g) y sobre 10 ⁶ UFC/g hasta los 91 días de almacenamiento, para todos los tipos de alimentos formulados (LPS47, LPS148 y LPS28, LPT32 y LPT87). La capacidad de producción semanal actual es de 400,00 kg por lote, y al incorporar un mezclador de mayor capacidad, se obtienen 1200,00 kg semanales por lote, considerando todas las etapas involucradas (cultivo, separación, mezclado y disposición final del producto probiótico).

2) En relación a la fermentación en sustratos sólidos, se formula un alimento a base de ensilado biológico con la cepa probiótica, con la adición de harina de pescado, poroto de soya, aceite de pescado, entre otros aditivos, el cual se pelletiza en una extrusora y se seca en un lecho fluidizado a 40°C por 60 min obteniendo un producto con una concentración de 10 ⁸ UFC/g, con una humedad inferior al 10%, que se mantuvo sobre la concentración mínima de 10 ⁷ UFC/g durante 30 días almacenado a temperatura ambiente (25°C). Las mejores condiciones de fermentación corresponden al medio formulado con 10% de melaza, 85% jurel o harina de pescado y 5% de inoculo, incubada a 32°C.

3) También se evalúa la incorporación de biomasa probiótica proveniente de la etapa de cultivo, previa separación por centrifugación, a un alimento pulverizado con posterior etapa de extrusión, formando pellets de 1 ,5; 2 y 4 mm, los que son deshidratados por dos operaciones de secado: lecho fluidizado y vacío. En ambos equipos, se obtienen alimentos con alta viabilidad (10 ⁸ UFC/g), con humedades entre 5 y 7%, donde el tiempo de secado es proporcional al tamaño del pellet, independiente de la temperatura de secado.

4) Se obtiene un producto probiótico mediante la adición en un fermentador, alimento en forma de polvo o pulverizado con cepas probióticas Lactobacillus plantarum LPS47,

Lactococcus lactis lactis LPS148, Pediococcus acidilactic LPS28, Pediococcus damnosus LPT32 y/o Lactobacillus plantarum LPT87; en fase estacionaria sin centrifugar y posteriormente se deshidrata el alimento pulverizado en secado por atomización, donde las cepas están soportadas en alimento pulverizado, que sobrevive por 6 meses almacenada a 4°C y por 20 días almacenada a 25°C, con una concentración superior a 10 ⁷ UFC/g, esto independiente de la temperatura de salida desde el secador. .(Figura N° 12). Una vez transcurrido el tiempo de fermentación, se mezcla todo el suspendido (sin centrifugar) con alimento pulverizado hasta lograr una solución homogénea al 10% en sólidos. Se alimenta al secador por atomización a presión constante y se regula el caudal para controlar a la temperatura de salida de producto deseada, por ejemplo, a 70°C. Se almacena el producto obtenido y se extrae una muestra para determinar humedad final y viabilidad.

Se debe señalar que el producto obtenido, finamente particulado, sirve para la alimentación desde los primeros estadios del ciclo de vida de los peces, esto es, desde la etapa de eclosión. Es una alternativa altamente viable para peces de pequeño tamaño, o para la primera alimentación de alevines en salmónidos. Si se requieren tamaños de alimentos mayores, a medida que los peces se desarrollan, se utiliza un proceso adicional de aglomeración y pelletización para los distintos diámetros requeridos.

5) Finalmente, se obtiene un producto probiótico mediante secado en lecho fluidizado donde las cepas están soportada en alimento pelletizado, cuya humedad fluctúa entre 6 y 7%, y que sobrevive entre un 70% cuando se deshidrata a 80°C, y cercano a 100% cuando se deshidrata a 60°C. Se determina que el mecanismo de transferencia que describe el proceso es el de difusión, y que el diámetro del alimento afecta la sobrevivencia bacteriana y el tiempo de exposición durante el secado. (Figura N° 13)

Mediante ensayos de campo, se evalúa el efecto de diversas dietas probióticas y aditivos alimenticios comerciales, en base al crecimiento determinado por el peso total promedio de los grupos de peces estudiados, mediante muéstreos en el inicio y final del ensayo. En relación con el peso inicial se observa un aumento significativo de peso, los valores más altos coinciden con las dietas probióticas LPT 148 y LPT 47, y el valor más bajo pertenece al grupo control. Los resultados de crecimiento determinado por el peso total promedio, son positivos e incluso los grupos con probióticos muestran mejores rendimientos. (Tabla N°5) Tabla N°5

El tiempo de administración de probióticos (21 días) en los grupos experimentales, demuestra resultados positivos en el peso promedio total en comparación con el grupo control. En la figura 15 se observa la diferencia en peso de los peces al inicio de la experimentación y al final (Figuras N° 14A y 14B, respectivamente)

EJEMPLOS DE APLICACIÓN

Ejemplo N° 1 : Aislamiento y almacenamiento de los microorganismos.

Para la obtención de la muestra se efectuó la disección de los peces (aproximadamente 20 individuos por piscicultura), en condiciones de asepsia, luego se procedió a tomar una muestra de hisopado estomacal e intestinal y un frotis de branquias y piel mediante tórulas estériles, las cuales fueron depositadas en caldo LBS (Lactobacillus selective médium) y MRS (Man, Rogosa y Sharpe) y se incubaron por 48 h a 25°C. Los caldos de cultivo crecidos, se sembraron en placas de agar LBS, procurando obtener colonias bien definidas las que fueron incubadas por 48 h a 25°C en condiciones de microaerofilia, postenormente se identificaron las diversas colonias existentes y se traspasaron a caldos MRS, los cuales fueron examinados por tinción de Gram y prueba de catalasa. Se seleccionaron los organismos Gram positivos y catalasa negativos, las cepas obtenidas fueron almacenadas a -20°C en leche extracto levadura (LEL) para los análisis posteriores 1.1 Identificación bioquímica de los organismos aislados.

Las cepas crecidas, activadas por tres subcultivos en caldo MRS fueron centrifugadas a 4.000 rpm, el pellet fue lavado dos veces con suero fisiológico y suspendido en 1 mL de esta solución, posteriormente, se tomó alícuotas de 100 pL para los medios Gibson, Gluconato, 50 pL para Esculina, Arginina, Nitrato e Indol, y 25 pL fueron inoculados en medios MRS, las muestras fueron incubadas por una semana a 25° C, excepto para los caldos MRS que fueron incubados a 15 y 45° C, transcurrido este tiempo se realizó el revelado de cada test con reactivos específicos según corresponda.

Ejemplo N° 2: Identificación de cepas bacterianas acido lácticas de peces salmonídeos, con actividad probiótica a través de PCR-DGGE ARNr 16s.

Las cepas fueron aisladas, a partir de muestras de agua, sedimentos, filtros biológicos, pero predominantemente del tracto gastrointestinal de Salmonídeos. Las cepas fueron nombradas y numeradas como Lactobacilos Probióticos de Salmón (LPS) y Lactobacilos Probióticos de Trucha (LPT). El almacenamiento de las cepas se realizó en Leche Extracto de Levadura (LEL) a una temperatura de -20 °C, y activadas, en caldo MRS a una temperatura de 32 °C durante un período de 24 h, siendo subcultivadas dos veces por 12 h y luego sembradas en placa para corroborar la pureza de éstas.

2.1 Extracción ADN

Para la extracción de ADN se utilizó Urea-SDS-NaOH. Un volumen de 1 ,0 ml_ de cultivo bacteriano de 15 h, fue centrifugado a 10.500 rpm por 3 min., Se descartó el sobrenadante, y el pellet bacteriano se lavó tres veces con PBS (buffer salino fosfatado) pH 7.4. Seguidamente, el pellet nuevamente se lavó una vez con agua PCR (MQ-H2O autoclavada dos veces). Posteriormente, el pellet fue resuspendido en 0,5 mi _¬ de urea 6M, adicionándole 0,1 ml_ de SDS 10% (Dodecil Sulfato Sódico). La mezcla fue incubada a 37 °C por 20 min en un baño termorregulado, seguido por una incubación a 100 °C por 5 min. Transcurrido el período de incubación, nuevamente se centrifuga a 13.300 rpm por 10 min a 25 °C. Se eliminó el sobrenadante y al pellet se le adiciono 0,1 ml_ NaOH 0,2 N, posteriormente fue incubado a 37 °C por 10 min, seguido de una centrifugación a 8.200 rpm por 3 min a 25 °C, El pellet fue descartado, se traspaso el sobrenadante a un nuevo tubo. El sobrenadante, fue mezclado con 2,5 volúmenes de etanol absoluto, y se precipitó el ADN durante 2 h a -20 °C. Finalmente se centrifugó a 14.500 rpm por 15 min a temperatura ambiente. Se descartó el sobrenadante y el ADN sedimentado, se lavó con etanol 70%. Finalmente el pellet fue resuspendido en 20 pL de buffer TE (Tris EDTA). Posterior a la extracción se cuantificó el contenido de ADN. 2.3 Determinación de MOTUs en cultivos.

2.3.1 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) con Gradiente Denaturante (DGGE).

Para la amplificación de ADN, se usaron partidores universales para bacterias 341 -F y 907-R que amplifican un segmento de un tamaño cercano a los 600pb del gen ARNr16s (Tabla N° 6). Al partidor 341 se le adicionó una cola enriquecida con GC de aproximadamente 28 pb. Cada 50 pL de reacción para PCR contiene 10 pL de Buffer 5X, 3,5 mM de MgCI ₂ , 200 pM de la mezcla dNTPs, 1 mM de cada partidor, 1 ,25 U de Taq polimerasa, 29,75 pL de agua-PCR y 1 pL de la extracción de ADN. La amplificación se lleva a cabo con el siguiente programa de temperaturas: denaturación inicial 94 °C por 3 min, 30 ciclos de 94 °C por 45 seg, 52,5 °C por 45 seg, 72 °C por 2 min, y una elongación final a 72 °C por 7 min. Tabla N° 6.

Partidor Secuencia (5' - 3')

^~ 8 ^F AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG

341 -F* CCT ACG GGR GGC AGC AG

907 -R CCC GTC AAT TCC TTT GAG TTT

2.3.2 Electroforesis de amplicones PCR.

Los productos PCR fueron analizados en un gel de agarosa al 1%. durante 30 min por 100 volt. Posteriormente, la matriz de agarosa fue teñida en solución de bromuro de etidio. Luego fue lavada en agua destilada y traspasada a un equipo de fotodocumentación donde fue visualizada y fotografiada.

2.3.3 Prueba de DGGE.

La electroforesis se realizó en un sistema de detección para DGGE, a una concentración de 6 % de poliacrilamida (acrilamida/bisacrilamida, 37,5:1. El gradiente denaturante desarrollado fue de 20-80 % (Urea/Formamida), donde el 100 % denaturante es definido como 7 moles χ L ^"1 y 40 % (v/v) de formamida. Finalmente se realizaron concentraciones denaturantes de 30-60 % y de 45-53 %, según se observó el desplazamiento de las bandas. Luego del ensamblado del gel, se efectuó la carga de los pocilios con 40 μί de producto PCR-DGGE junto con 10 μί de buffer de carga. El gel se corre a 100v a 60 °C por 10h. Después la matriz de poliacrilamida, fue teñida por inmersión en una solución de BrEt. Finalmente la matriz fue montada en un equipo de fotodocumentación, visualizada y fotografiada.

2.3.4 Análisis de bandas desde DGGE. Una vez obtenidas las imágenes a partir de geles de poliacrilamida desde DGGE, se calcularon los índices de Frecuencia relativa (R _f ) para cada una de las bandas detectadas en relación al desplazamiento de una banda referencia, particularmente empleando como referencia bandas identificadas en ATCC 8014, según la siguiente expresión: R _f = (M _r X) * (M _r Ref.)^ Donde; Rf: Frecuencia relativa (Relative frequency), M _r : Movilidad relativa de las bandas, X: Bandas del casos de estudio, Ref.: Banda empleada como referencia, Con lo anterior se dio una respuesta en relación a la cantidad de Unidades Taxonómicas Operativas Moleculares (MOTUs). 2.4 Determinación de relaciones filogenéticas entre cepas LPS.

2.4.1 Obtención de bandas desde DGGE.

Se cortaron las bandas disponiéndolas en los microtubos previamente marcados según el orden de las bandas a rescatar. Una vez rescatadas, fueron dejadas en agitación por un período de tiempo no menor a 12 h. Finalizado las 12 h, los microtubos fueron almacenados a -20 °C en un congelador.

2.4.2 PCR para clonación.

Las amplificaciones del ADN, desde las extracciones de las cepas, se realizaron con los partidores universales para bacterias 8-F y 907-R (Tabla N°6), que amplifican un segmento con un tamaño cercano a los 900 pb del gen ARNr 16s. Cada 100 pL de reacción para PCR contiene 20 pL de Buffer 5X, 7 mM de MgCb, 400 μΜ de la mezcla dNTPs, 2 mM de cada partidor, 2,5 U de Taq polimerasa, 59,50 pL de agua-PCR y 2 pL de la extracción de ADN. Finalmente la reacción de PCR se realizó con el siguiente perfil de temperaturas: denaturación inicial 94 °C por 3 min, 30 ciclos de 94 °C por 45 seg, 53,8 °C por 45 seg, 72 °C por 2 min, y una elongación final a 72 °C por 7 min. 2.4.3 Electroforesis de amplicones para clonación.

Los productos PCR fueron separados en un gel de agarosa al 1 % durante un tiempo de 45 a 50 min por 100 v. Luego la matriz de agarosa se tiñó en solución de BrEt, durante 15 min, luego visualizada y fotografiada. Las bandas fueron cortadas y la purificación de las bandas se realizó con un kit comercial. 2.4.4 Proceso de clonación.

Ligación.

El producto de PCR purificado fue ligado al vector pGEMT- Easy (50 ng) utilizando una relación molar entre el inserto y el vector de 3:1 en un volumen final de 10 pL. La reacción de ligación se incubó por 12 h a 4 °C. Transformación.

Posteriormente, 4 μΙ_ del producto de ligación (plásmido recombinante), fueron transformadas en 50 μΙ_ de células competentes Escherichia coli JM109 mediante la metodología de shock térmico. Las bacterias ya transformadas fueron sembradas en placas de agar/LB (Luria-Bertoni) con β-Galactosidasa (50 mg χ ml_ ^"1 ) y ampicilina (100 pg χ ml_ ^"1 ), que permiten la identificación de las bacterias que incorporan el plásmido recombinante.

2.4.6 Confirmación de los clones.

La confirmación de los clones positivos se realizó mediante PCR de colonias en un volumen final de reacción de 10 pL, que contenía: 0,2 mM de dNTPs, 2,0 mM MgC , 20 pmoles de cada partidor específico; 8-F y 907-R, buffer Taq polimerasa 1X, 2,5 unidades de Taq Polimerasa y 3 pL de colonias bacterianas resuspendidos en agua- PCR. El programa de amplificación utilizado fue: denaturación inicial a 95 °C por 10 seg, 30 ciclos de 95 °C por 30 seg, 53,8 °C por 30 seg y 72°C por 2 min, con una extensión final de 72 °C por 7 min. El total de la mezcla de PCR fue fraccionada en un gel de agarosa 1 % y las bandas fueron visualizadas por tinción del gel con BrEt y exposición en un transiluminador UV.

2.4.7 Extracción de plásmidos.

Los clones positivos fueron sembrados en placas de agar/LB con ampicilina (100 pg χ mL ^"1 ), e incubados a 37 °C durante 12 h para su crecimiento y almacenaje. Las colonias positivas fueron cultivadas en medio líquido LB con ampicilina, y el ADN plasmidial fue purificado utilizando un kit comercial. Los plásmidos extraídos fueron cuantificados en un biofometro. De igual modo, los plásmidos fueron sometidos a un proceso electroforético para observar bandas concordantes con el tamaño del plásmido (« 3000 pb) y con el plásmido/segmento de interés ligado (« 4000 pb).

2.4.8 Secuenciación.

Se lleva a cabo la secuenciación de los plásmidos purificados que contiene el inserto de una región de « 900. La secuenciación fue ejecutada en ambos sentidos de lectura utilizando los partidores específicos para el vector pGEM-T Easy SP6 y T7, con esto se logró obtener la secuencia completa del segmento amplificado. 2.4.9 Análisis bioinformático.

Las secuencias obtenidas fueron limpiadas y posteriormente alineadas con secuencias existentes para el gen ARNr 16s, utilizando un software de alineamiento múltiple. La determinación, asignación de la identidad y relaciones entre los filotipos, para los clones secuenciados, fue realizada alineando y comparando dichas secuencias con otras disponibles en la red para el género Lactobacillus y otros, haciendo uso de la herramienta Linnaeus BLAST. Finalmente se generó un árbol filogenético UPGMA con las secuencias correspondientes a la identificada y otras.

Ejemplo N° 3: Evaluación de adherencia de cepas probióticas -Salmones

Las muestras de mucus fueron extraídas desde peces sanos, Salmo salar, de 3000 a 4000 g de peso. Los peces fueron mantenidos en inanición durante 72 h, lo que permitió la evacuación de restos de alimento del tracto gastrointestinal. Para la obtención de las muestras de mucus de la piel de los salmones, se aplicó una pequeña cantidad de PBS en toda la superficie y posteriormente se raspó con una espátula de silicona extrayendo la mayor cantidad posible de mucus. El mucus de las branquias fue extraído, raspando con espátula las branquias, evitando contaminar la muestra con sangre del propio individuo. Para la obtención de mucus gastrointestinal, primeramente se separó el estómago del intestino y ambos tejidos fueron colocados en una bandeja y lavados con PBS (pH 7.2), luego, el mucus estomacal e intestinal fue recolectado raspando la superficie interna de los tejidos con espátula. Las muestras obtenidas fueron contenidas en frascos de vidrio y almacenados a -20° C para su posterior filtrado. Las preparaciones de mucus obtenidas fueron homogenizadas y centrifugadas 2 veces a 8.000 rpm por 20 min a 4 °C, el sobrenadante final se filtró en serie decreciente en grado (poro), en un sistema al vacío, utilizando, en un primer filtrado, un filtro de papel de 2,5 μητι y los siguientes, membranas de nitrocelulosa de 47 mm de diámetro con 0,45 y 0,2 pm de grado. Las muestras de mucus se ajustaron a 0,5 mg de proteínas/mL en PBS. La concentración de proteínas fue determinada mediante el método de Bradford. Luego de esto, los distintos tipos de mucus fueron almacenados separado en recipientes de vidrio y guardados a -20 °C para su posterior utilización.

3.1 Mareaje de cepas con fluorocromo y determinación de las curvas de calibración.

3.1.1 Obtención de las soluciones bacterianas marcadas con CFDA-SE.

Previamente al mareaje de las cepas, las soluciones bacterianas fueron lavadas 2 veces con 200 pL de PBS (7 mmol L ^"1 , pH 7.3), resuspendiendo en 5 ml_ de PBS (7 mmol L ^"1 , pH 7.3), y a una densidad óptica de 625 nm la solución bacteriana fue ajustada a 0,5 ± 0,05. Para el mareaje, a cada una de las soluciones estandarizadas se le agregaron 100 pmol L ^" de CFDA-SE (Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester) incubando durante 30 min a 37 °C en baño dubnoff, y luego lavadas 2 veces con 200 pL de PBS (7 mmol L ^'1 , pH 7.3) y resuspendida en 5 ml_ de PBS (7 mmol L ^"1 , pH 7.3). 3.1.2 Curvas de calibración.

Para cada una de las bacterias ácido lácticas utilizadas, se desarrolló una curva de calibración, para lo cual se prepararon 3 diluciones de las soluciones bacterianas (1 ^* 10 ³ , 1 ^* 10 ⁵ y 1 ^* 10 ⁸ UFC/mL.) marcadas con CFDA-SE. En la placa de microtitulación se sembró por triplicado cada solución bacteriana, incubando a 25° C durante 1 h y luego lisadas con buffer de lisis incubando a 25 °C durante 1 h. La intensidad de la fluorescencia del sobrenadante fue medida, a longitudes de onda de excitación y emisión de 492 y 517 nm respectivamente.

3.1.3 Pruebas de Medición de la adherencia de Bacterias Marcadas a mucus.

El mucus estandarizado (0.5 mg/mL) fue pasivamente inmovilizado, colocando 100 μί de la solución en pocilios de placas de microtitulación, incubando 12 h a 4° C. Después de la incubación, el mucus se lavó 1 vez con 250 μί de PBS para eliminar restos no adheridos. Un volumen de 100 μΙ_ con una concentración aproximada de 10 ⁷ UFC/mL de células marcadas con el fluorocromo se agregó a los pocilios incubando a 25° C durante 1 h, luego los pocilios fueron lavados 2 veces con 250 μί PBS, para eliminar las bacterias no adheridas. Las bacterias adheridas fueron liberadas y lisadas agregando 100 μΙ_ de buffer de lisis incubando a 25 °C durante 1 h. El porcentaje de adherencia se obtuvo midiendo la fluorescencia con el fluorómetro y posterior análisis de la ecuación determinada por la curva de calibración determinada previamente.

3.1.4 Pruebas Antibacterianas de Cepas Seleccionadas en mucus de salmón. Para determinar las interacciones entre las cepas ácido lácticas seleccionadas con los patógenos, se agregó un volumen de 100 μΙ_ de solución conteniendo cepas ácido lácticas no marcadas en una concentración de 10 ⁸ cel/mL, las que se sembraron en placas de microtitulación, conteniendo mucus, e incubadas por 1 h a 25 °C; luego los pocilios fueron lavados 2 veces con 250 μΙ_ de PBS. 100 μΙ_ de solución de ictiopatógenos (10 ⁸ cel/mL) marcados con fluorocromos se adicionaron por triplicado en los pocilios, con y sin probióticos, e incubados a 25 °C durante 1 h. Los pocilios fueron lavados y las bacterias adheridas desprendidas y lisadas con 100 pL de buffer de lisis incubando por 1 h a 37 °C. La fluorescencia fue medida en el fluorímetro. En esta experiencia el porcentaje de inhibición de la adhesión se calculó como la diferencia entre la adhesión de los patógenos en ausencia y presencia de cepas probióticas y la inhibición que pudiesen realizar los probióticos. Cada ensayo se realizó por cuadruplicado.

3.1.5 Análisis estadísticos

Los datos obtenidos de la determinaciones realizadas en cuadruplicado, luego fueron analizados estadísticamente mediante el test ANOVA y test de medias de Duncan, mediante el programa estadístico.

-Truchas

Del sacrificio de especímenes de trucha arcoíris con peso y tamaño prácticamente similares (aproximadamente 150g), se obtuvo asépticamente trozos de tejido de estómago, intestino, branquias y piel, los que se depositaron inmediatamente en la solución Buffer (50 mM NaH2P04, 8,2 mM glucosa, y 0,01% gelatina) a pH 7.2. Luego se realizó un baño sónico a una frecuencia no letal de 35 KHz por 7 min, con el propósito de desprender la flora basal de las diversas superficies utilizadas. A continuación, trozos de tejido de 1 g para branquias e intestino y de 1 cm ² para piel y estómago fueron lavados repetidas veces en buffer fosfato salino (PBS) y resuspendidos en el buffer descrito anteriormente. Las cepas activadas de Lactobacillus spp., fueron centrifugadas a 4.000 rpm durante 15 min, lavadas con PBS y suspendidas hasta una ϋθβοο 0,25 ± 0,1 equivalente a 10 ⁷ a 10 ⁸ UFC/ml_. Se inoculó 1 ml_ de esta suspensión bacteriana con el tejido a evaluar, a una agitación constante de 130 rpm por aproximadamente 1 h. A continuación, se realizaron nuevamente lavados con PBS para eliminar las bacterias no adheridas a la superficie y luego se procedió a realizar una sonicación no letal durante 12 min para desprender del epitelio las bacterias lácticas adheridas, las que fueron suspendidas en suero fisiológico estéril y cuantificadas mediante la siembra en el medio selectivo LBS (Lactobacillus Selective Médium). Los resultados fueron expresados como UFC/g o UFC/cm ² de tejido húmedo. En este ensayo se empleó también un control, en el que un trozo de tejido a evaluar se monitoreó sin inoculo bacteriano, sino que adicionando 2 mL de PBS estéril.

Ejemplo N° 4: Análisis de susceptibilidad antibiótica de cepas de lactobacillus plantarum con potencial probiótico 4.1 Microorganismos y condiciones de crecimiento:

Cepas de referencia: Staphylococcus aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922,.

Cepas Lácticas aisladas desde muestras de Salmón: Lactobacillus plantarum LPS47, Lactococcus lactis lactis LPS148 Las cepas de referencia fueron cultivadas en caldo Caso (Peptona de caseína-peptona de soja,) y las cepas lácticas fueron subcultivadas dos veces en caldo MRS.

4.2 Agentes Antibacterianos

Discos comerciales de antibióticos, con diferentes mecanismos de acción antibacterianos.

-Inhibidores de síntesis de la pared celular:

Penicilina G (10 U), ampicilina (10 pg), cefazolina (30 pg), ampicilina/sulbactam (25 pg), teicoplanina (30 pg), vancomicina (30 pg).

-Inhibidores de síntesis de proteínas: Gentamicina (10 pg), estreptomicina (10 pg), oxitetraciclina (30 pg), cloranfenicol (30 pg), eritromicina (15 pg), clindamicina (2 pg), linezolid (30 pg).

-Inhibidores de síntesis de ácidos nucleicos:

Trimetoprim-sulfametoxazol (25 pg), trimetoprim (5 pg), ciprofloxacina (5 pg), moxifloxacina (5 pg), flumequina (30 pg), ácido oxolinico (2 pg).

4.3 Estudio de susceptibilidad

Se estudió la susceptibilidad a 19 antibacterianos en los medios de cultivo para bacterias lácticas LSM, MRS y LAPTg y agar Miller-Hinton.

Se evaluó el perfil de susceptibilidad de las cepas de referencia Staphylococcus aureus ATCC 29213 y Escherichia coli ATCC 25922, utilizadas como control del método (medio de cultivo, potencia y difusión de los discos de antibióticos y concentración).

Los microorganismos de referencia fueron incubados por 18 h a 37° C en caldo Tripticasa y las cepas lácticas a 30° C en caldo MRS. Una suspensión de cada cepa fue ajustada a McFarland 0,5 en un turbidímetro (10 ⁸ Ufc/mL) para luego ser diseminada con una tórula estéril, en forma homogénea en la superficie de placas de agar. Las cepas lácticas y la cepa S. aureus ATCC 29213 fueron sembradas en agar LSM, MRS, Laptg y Miller-Hinton. La cepa E. coli ATCC 25922 fue diseminada en agar LSM y Miller-Hinton.

Los discos de antibióticos fueron puestos en la superficie del agar y las placas fueron incubadas por 24 h a 37° C, en el caso de las cepas de referencia y 24-48 h a 30° C para las cepas lácticas. Después de la incubación fueron medidos los diámetros de los halos de inhibición. Para las cepas lácticas se realizó una lectura a las 24 h y las 48 h de incubación, diversos estudios proponen estos tiempos de lectura para la evaluación antibacteriana en cepas ácido lácticas.

Ejemplo N° 5: Resistencia de cepas ácido lácticas expuestas a salinidad marina

Con el propósito de determinar el efecto de altas salinidades sobre la respuesta probiótica de los microorganismos aislados, se realizó ensayo de interacción con patógenos. En ésta experiencia se espera que no ocurran variaciones significativas en el potencial antagónico de las cepas por la acción de sales en el medio de cultivo. Para esto, se utilizó el método de difusión en agar, posterior a stress salino. Primero se realiza la activación y preparación de bacterias ácidos lácticas aisladas de salmón. Activación de cepas seleccionadas en agua de mar 37 ppm, dos subcultivos de 24 h, escala M ^c Farland 0,5 a 625 nm - 0,1- 0,085 aproximadamente (10 ⁸ ). Se centrifugó a

4.000 rpm por 10 min y se lavó dos veces con 2 mL de suero fisiológico estéril, hasta una lectura espectrofotométrica de 0,2 a D0625- Luego cada resuspensión fue inoculada en placas de agar MRS y llevadas a 25 °C por 24 h hasta formar un tapiz.

5.1 Activación y preparación de Patógenos Las cepas patógenas de peces Vibrio anguillarum, V. ordalli, Streptococcus phocae, y Pseudomonas fluorescens, Edwarsiela tarday y Aeromonas sobria, fueron activadas, lavadas y ajustadas luego fueron sembradas en placas petri con 25 mL de agar TSA, TSA y TYES según corresponda.

Con las cepas de Lactobacillus spp., en las placas con crecimiento positivo de las cepas lácticas se realizaron socavados en condición de esterilidad, obteniendo discos de agar de 5 mm de diámetro los que se depositaron en las placas que contenían los patógenos con orientación del disco de agar con la cepa láctica hacia abajo, en contacto directo con la siembra de los patógenos, tales discos fueron orientados de tal forma que se produjera un contacto directo o indirecto entre los organismos en interacción Luego, se incubó a 20°C por 24 h, se midió en milímetros los halos de inhibición correspondiente a la acción de cada cepa acido láctica estudiada.

Ejemplo N° 6: Resistencia a ácido clorhídrico y acético con acción inhibitoria y bactericida. Se preparó un set de tubos con 2 mL de caldo MRS con concentraciones progresivas del ácido en estudio, adicionando un volumen conocido de éste. El rango de pH de los ácidos fue de pH 2.4 a un pH 5.3 para el ácido acético y para el ácido clorhídrico de un pH 1.2 a un pH 6.0. Los niveles de susceptibilidad a los ácidos acético y clorhídrico de las cepas de lactobacilos, se evaluaron mediante la técnica de dilución seriada en medio líquido. Después de la última activación de las cepas lácticas, éstas fueron diluidas a una concentración final equivalente a 5x 10 ⁵ UFC/mL mediante la siguiente técnica:

Del medio con la cepa activada se obtuvo una concentración final de 5x 10 ⁵ UFC/mL de la cepa en estudio. De este último tubo se extrajo inóculos de 100 μΐ los que fueron sembrados en un set de tubos con 2 mL de caldo MRS con concentraciones progresivas de la sustancia en estudio. Un control negativo del ensayo fue tubos con caldos MRS con diversas concentraciones la sustancia investigada y los controles positivos fueron caldos MRS con las cepas bacterianas. Todos los tubos fueron incubados a 20 °C durante 20 h en agitación (90 rpm). A todos los tubos se les realizó una lectura espectrofotométrica a DO540 nm antes y después de ser incubados. Para determinar el pH mínimo bactericida, se sembraron en placas de agar MRS, inóculos de los tubos que no presentaron desarrollo bacteriano después de 20 h de incubación, las placas fueron incubadas 24 h a 25°C, y se definió como un pH mínimo bactericida para la cepa en estudio al pH de la sustancia correspondiente al tubo que al ser sembrado en la placa de agar MRS no se observó desarrollo bacteriano.

Ejemplo N° 7: Evaluación de la colonización de la cepa LPS47 Lactobacillus plantarum y LPS148 Lactococcus lactis lactis en el tracto gastrointestinal de Oncorhynchus kisutch, en un modelo de bioensayos.

7.1 Microorganimos.

Las cepas bacterianas estudiadas corresponden a los microorganismos LPS47 Lactobacillus plantarum y LPS148 Lactococcus lactis lactis.

7.2 Diseño experimental.

Doscientos ejemplares de salmón Cono, fueron acondicionados en estanques de 400 L con agua potable declorada, sistema de aireación y temperatura controlada entre 10 y 14° C. Posteriormente, los peces fueron separados en los distintos tratamientos, cada uno en triplicado:

Tratamiento A: Alimento base suplementado con la cepa LPS47 Lactobacillus plantarum. Tratamiento B: Alimento base suplementado con la cepa LPS148 Lactobacillus lactis. Tratamiento C: Control negativo, alimento base.

Los tratamientos A y B, fueron alimentados con dieta probiótica por 15 días, posteriormente se alimentaron con dieta basal, al igual que los demás tratamientos. 7.3 Análisis microbiológicos.

Para la determinación de viabilidad bacteriana en muestras de tejido se empleó la técnica de mareaje con un agente selectivo (Rifampicina). Para ello, las cepas LPS47 y LPS148, fueron sembradas en medios provistos de rifampicina en gradiente de concentración, se aisló aquellas colonias que aparecieran en la zona de mayor concentración del antibiótico, las que fueron sometidas a un ensayo de concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración mínima bactericida (CMB), además se probó la eficacia del método sembrando muestras de flora basal de peces y cultivos puros de las cepas en estudio en medios suplementados con rifampicina y medios comunes.

Bacterias transitorias: A cada pez se le extrajo el TGI completo, el que fue tratado para eliminar excesos de alimento e irrigado con 5 ml_ de suero, de los cuales 100 μΙ_ fueron sembrados en medios MRS suplementados con Rifampicina en diluciones apropiadas, las muestras fueron incubadas por 48 h en estufa a 25°C.

Bacterias adheridas al TGI: El TGI una vez que fue tratado por el método anterior, fue dividido en estómago e intestinos, nuevamente se irriga la superficie interna de cada uno con 5 ml_ de suero fisiológico para desprender microbios no adheridos. Estas muestras fueron maceradas, y se aplicó un baño sónico a una frecuencia no letal de 35 KHz por 10 min con el propósito de desprender la flora bacteria altamente adherida. 100μΙ_ de ésta muestra fueron sembrados en medios MRS suplementados con rifampicina, y posteriormente incubados a 25°C por 48 h. 7.4 Muéstreos de agua

Se realizaron 3 monitoreos del agua de cultivo de los peces. Para ello se tomó muestras de cada estanque las que fueron sembradas en medios MRS con Rifampicina e incubadas por 48 h en estufa a 25°C. 7.5 Análisis estadísticos

Los resultados obtenidos en el crecimiento de las placas MRS en los diversos monitoreos y tratamientos, fueron registrados y analizados mediante planillas Excel, posteriormente, los datos fueron sometidos a análisis estadísticos. La diferencia entre tratamientos fue analizada mediante el test ANOVA de medias repetidas.

Ejemplo N° 8: Evaluación del efecto inmunoestimulante de cepas de bacterias acido lácticas aisladas desde peces salmonídeos

Se utilizó un grupo de 150 juveniles de trucha arcoíris de 20 a 40 g, aproximadamente. Los peces fueron mantenidos en acondicionamiento durante 30 días en estanques de 800 L con aireación constante. Se utilizó agua dulce potable, previamente declorada, la cual se cambió cada 48 h. Los peces fueron alimentados con pellet comercial, al 1 % de la biomasa por día.

8.1 Obtención y cultivo de cepas Se usaron las cepas LPS148 y LPS47, aisladas y caracterizadas previamente desde el tracto digestivo de salmonídeos.

8.2 Diseño del Bioensayo

Las cepas lácticas mantenidas a -20 °C fueron cultivadas en caldo MRS a 25 °C. Los peces se trasladaron desde el estanque stock a 3 nuevos estanques de igual volumen y se mantuvieron en las mismas condiciones mencionadas anteriormente, conteniendo 40 peces cada uno. Diariamente se registró la temperatura y la mortalidad. Después de un periodo de ayuno de 48 h, los peces fueron sometidos al siguiente esquema de alimentación por 28 días y en base al 1 % del a biomasa: Grupo A: 40 peces alimentados con dieta probiótica, cepa LPS148.

Grupo B: 40 peces alimentados con dieta probiótica, cepa LPS47.

Grupo C (control): 40 peces alimentados con dieta comercial, sin probióticos.

En los días 14, 21 y 28 se sacrificaron seis peces de cada estanque para realizar las pruebas hematológicas e inmunológicas. Los peces fueron sacrificados con un fuerte golpe en la cabeza y se obtuvo la mayor cantidad de sangre posible mediante punción de la vena caudal. Posteriormente se realizaron cortes de arcos branquiales para un desangrado total y luego fueron rociados con alcohol 70 % en toda su superficie para la extracción de riñon en forma aséptica. Se determinó el hematocrito, el recuento total de células sanguíneas, la concentración de proteínas plasmáticas totales y la concentración de anticuerpos plasmáticos totales (IgM)

8.3 Estallido respiratorio por quimioluminiscencia

Se preparó un cultivo primario de macrófagos renales a partir de riñon anterior de 6 peces y se aislaron las células mediante un gradiente de percoll. La concentración de las células se ajustó a 1 x 10 ⁸ cel. por mL ^"1 . Se agregaron 200 pL de células fagocíticas en una placa de quimioluminiscencia de 96 pocilios. Inmediatamente se agregaron 70 pL de luminol por pocilio, seguido por 70 pL de zimosano. Las placas se leyeron inmediatamente en un equipo multidetector, programado para luminiscencia, a intervalos de 2 min hasta completar 20 lecturas.

8.4 Test de fagocitosis

La suspensión de macrófagos se obtuvo a partir de tejido renal como se describió en el ítem anterior. Sobre un portaobjeto, se agregaron 70 pL de células fagocíticas y se incubaron por 1 h en cámara húmeda. Luego se lavaron 2 veces con medio L-15 y se agregaron 70 pL de suspensiones de células inactivadas y opsononizadas de Sacharomyces cerevisiae, Vibrio ordalii, Aeromonas salmonicida, Staphilococcus aureus y partículas de zimosano. Se incubaron por 1 h en cámara húmeda y cada 20 min se tomaron muestras para ser fijadas en metanol, luego teñidas con May Grünwald Giemsa y observadas en microscopio óptico para el recuento de microorganismos fagocitados.

8.5 Análisis estadístico Se utilizó el análisis ANOVA y se realizó una prueba múltiple de Tukey al 95% de confiabilidad, para las variables que registraron significancia entre tratamientos y de esta manera establecer los mejores tratamientos. Se consideró un P<0,05 como una diferencia estadísticamente significativa. Los datos se muestran como promedio ± error estándar. Ejemplo N° 9: Evaluación del efecto protector de la cepa probiótica LPS47 incorporada en el alimento, en un desafío experimental de salmón coho con Aeromonas salmonicida.

Un total de 80 peces de la especie de salmón coho, no vacunados, de peso promedio 35 g, fueron transportados con aireación constante, temperaturas controladas y aclimatados por 20 días en estanques con 800 L de agua dulce declorada y alimentados con una dieta estándar comercial. Luego fueron divididos al azar en dos grupos experimentales, con 40 peces cada uno y ubicados en estanques circulares de 400 L. Uno de los grupos recibió alimentación con probiótica (cepa LPS47) durante 15 días en cambio el grupo control recibió solo la dieta comercial. Posteriormente, ambos grupos fueron desafiados con una cepa virulenta de Aeromonas salmonicida vía intraperitoneal (IP). Posterior al desafío, el grupo probiótico continuó con la dieta suplementada con la cepa LPS47 durante 10 días adicionales. La temperatura y calidad de agua se determinó diariamente. Todos los peces muertos fueron sometidos a un completo examen de necropsia para determinar la causa de muerte.

Ejemplo N° 10: Evaluación del efecto protector de la suplementación de la dieta con dos cepas probióticas, mediante desafío de alevines de trucha arco iris (o. mykiis) con Flavobacterium psychrophilum.

10.1 Cultivo de Flavobacterium psychrophilum y caracterización microbiológica

Se utilizó la cepa UDEC03 de F. psychrophilum obtenida desde trucha arco iris y mantenida en nitrógeno liquido a -196°C. La cepa fue descongelada y cultivada en agar TYES a 15 C° durante 48-96h. La caracterización de la cepa incluyó observación directa de las características de las colonias, tinción Gram, pruebas de motilidad, catalasa, oxidasa, elastinasa, APY ZYM y PCR.

10.2 Pasaje in vivo para activación de virulencia.

Se utilizó un grupo de 50 alevines de truchas arcoíris de 1 a 2 g. Los peces se mantuvieron en acondicionamiento en estanques de 80 L durante 12 días, con tratamiento sanitario preventivo de formalina y sal, recambio de agua día por medio y alimentados con dieta de mantención al 1 %.

El desafío se realizó según lo reportado por Madsen y Dalsgaard (1999). Los peces fueron estresados exponiéndolos a un baño de formalina (0,005%) por 30 min para luego trasladarlos a un recipiente con 200 ml_ que contiene una suspensión de F. psychrophilum a una densidad previamente establecida y mantenidos en ella por 1 h para luego regresarlos a sus estanques de origen.

Se registró diariamente la temperatura y la mortalidad. Los peces moribundos o muertos recientemente, fueron sometidos a un completo examen de necropsia para establecer la causa exacta de muerte. Se inocularon placas de TYES y TSA desde los órganos internos para recuperar la bacteria las que fueron incubadas a 15 y 20 °C respectivamente por un total de 72 h. Las colonias bacterianas obtenidas se analizaron y caracterizaron como se describió anteriormente.

10.3 Suplementación de peces con probióticos y desafío experimental Se utilizaron 200 alevines de truchas arcoíris de 2 a 4 g. Los peces fueron mantenidos en acondicionamiento durante 14 días, tratamiento preventivo en base a formalina y sal, recambio de agua día por medio en estanques de 400 L con aireación y dieta de mantención al 1 %. Con el propósito de descartar la presencia de animales portadores asintomático de F. psychrophillum, se sacrificaron 3 peces para realizarles necropsia y examen microbiológico.

Al inicio del ensayo, los peces fueron divididos en cuatro grupos conteniendo 40 peces por estanque excepto uno de los controles que solo tuvo 25 animales. Los peces sometidos a suplementación con probióticos comenzaron a recibir la cepa LPS148 ó LPS47 en la dieta al día 26 antes del desafío. El desafío de los peces se realizó por inoculación intraperitoneal de una suspensión de la cepa virulenta de F. psychrophilum recuperada previamente de un pasaje in vivo. Cada pez, previamente anestesiado con BZ 20, recibió un inoculo de 100 pL de la suspensión bacterianas (D0 ₆ oo = 0,5). Por otra parte, los dos grupos controles fueron inyectados con 100 pL de suero fisiológico estéril. Luego de la inoculación, los alevines fueron devueltos a sus respectivos tanques, siendo los grupos de tratamiento los siguientes: alimento con cepa probiótica LPS47, alimento con cepa probiótica LPS148 y alimento comercial (control positivo). A su vez, los alevines inyectados con suero fisiológico (control negativo) fueron alimentados con alimento comercial.

Se registró diariamente la temperatura y la mortalidad. Los peces moribundos o muertos recientemente, fueron sometidos a un completo examen de necropsia para establecer la causa exacta de muerte. Se inocularon placas de TYES y TSA desde los órganos internos para recuperar la bacteria las que fueron incubadas a 15 y 20 °C respectivamente por un total de 72 h. Las colonias bacterianas obtenidas se analizaron y caracterizaron como se describió anteriormente.

Ejemplo N° 11 : Producción alimento probiótico

11.1 Crecimiento en sustratos sólidos

Se muelen los descartes de pescado y se adiciona la fuente de carbono. Se homogeniza en un mezclador y se adiciona la cepa probiótica a una DO 0,5 a 625 nm. Se cultiva en frascos de vidrio cerrados por 24 a 36 h, con chequeo constante de pH y viabilidad bacteriana.

11.2 Preparación de alimento probiótico con cepa fresca.

Se cultiva en fermentador de 3 L la cepa probiótica de interés, por 24 h a 32°C. Luego se centrifuga por 15 min a 8.000 rpm a 4°C, se elimina el sobrenadante y se adiciona a la biomasa sedimentada suero fisiológico estéril en relación medio de cultivo: suero de 4:1. Se cargan lotes de 20 kg de alimento en el mezclador de sólidos y se le agrega la suspensión bacteriana. Se tapa el equipo y se agita por 30 min. Una vez transcurrido este período, se descarga en bolsas plásticas y se extrae una muestra representativa para determinar humedad y viabilidad. Se dispone el producto en un lugar fresco y seco para su posterior uso.

11.3 Preparación alimento probiótico a partir de ensilado biológico.

Se cultiva la cepa probiótica en el sustrato sólido. Una vez transcurrido el tiempo de fermentación, se mezcla el ensilado con los componentes del alimento, esto es, harina de pescado, harinilla de trigo, poroto de soya, aceite de pescado. Se forman pellets de distintos tamaños en una extrusora y se extrae muestras para medir humedad y viabilidad. Se almacena para su posterior uso.

11.4 Secado de alimento probiótico en secador por atomización.

Se cultiva la cepa probiótica. Una vez transcurrido el tiempo de fermentación, se mezcla todo el suspendido (sin centrifugar) con alimento pulverizado hasta lograr una solución homogénea al 10% en sólidos. Se alimenta al secador por atomización a presión constante y se regula el caudal para controlar a la temperatura de salida de producto deseada, por ejemplo, a 70°C. Se almacena el producto obtenido y se extrae una muestra para determinar humedad final y viabilidad. 11.5 Secado de alimento probiótico en secador de lecho fluidizado.

Se enciende el ventilador que alimenta aire al equipo y las resistencias eléctricas que lo calientan. Se introduce en el panel de control la temperatura de secado deseada y se espera a que el sistema alcance estado estacionario. En paralelo, se pesan lotes iguales de alimento probiótico, que ya ha sido pelletizado en una extrusora. Se carga cada lote y se instalan los sensores de temperatura, uno para controlar la temperatura del aire de entrada y otro para controlar la temperatura del aire de salida. Se seca por el tiempo indicado para lograr una humedad inferior al 10%.

11.6 Secado de alimento probiótico en secador a vacío.

Se encienden resistencias eléctricas y se introduce en el panel de control la temperatura requerida para los ensayos de secado. Se pesan aproximadamente 300 gr. de alimento a un diámetro de pellet determinado, y se carga en el equipo. Se cierra la cámara de secado y se enciende la bomba de vacío. Se seca por el tiempo indicado para lograr una humedad inferior al 10%.

A partir de la necesidad de producir cantidades superiores a 100 kg semanales de alimento probiótico para los ensayos in vivo en piscicultura, se estudió el efecto de incorporar la biomasa probiótica fresca a alimento comercial en la viabilidad en el almacenamiento a temperatura ambiente, en las condiciones reales a las que se iba a someter el producto para fines de la experimentación en terreno.

El alimento que se utiliza es comercial, con una humedad aproximada entre 6 y 7%. Un requisito importante para fines de preparar alimento con biomasa fresca es minimizar la adición del agua, por lo que se diseñó el proceso para que la humedad final del producto probiótico no superara el 9%. Para ello, es necesario centrifugar el cultivo bacteriano y resuspender la biomasa en suero fisiológico estéril, donde la relación cultivo: suero es de 4:1. Respecto a la concentración bacteriana, la relación cultivo: alimento es de 1 :20, es decir, por 1 L de cultivo bacteriano se puede preparar 20 kg de alimento, con una concentración promedio de 10 ⁸ UFC/g. Considerando que se cuenta con un fermentador de 20 L, la capacidad de operación a nivel de planta piloto corresponde a 400 kg por lote, que corresponde a la producción semanal. Aumentando el tamaño del equipo de mezclado, suponiendo que se diseñase con capacidad de 400 kg, se podría incluso aumentar la producción a 200 kg semanales (considerando tanto el tiempo de cultivo, como el de cosecha de biomasa y desinfección de equipo de mezclado).

Ejemplo N° 12: Efecto en el crecimiento en base a peso de trucha arcoíris, de las diferentes dietas aplicadas durante el ensayo

Sé utilizaron un total de 1000 individuos de Trucha Arcoíris Oncorhynchus mykiss de 200 - 250 gramos. En una primera etapa los animales se dividieron en dos estanques de 7 m ³ con sistema de semi-recirculación de agua, y fueron sometidos a una terapia antimicrobiana por 14 días. Posteriormente, los peces se dividieron en 5 tratamientos experimentales y analizados microbiológica y anatómicamente.

1) Probiótico LPT148: Dieta Probiótica Desarrollada por el Proyecto Innova Chile 05CT6PP-13 en base a la cepa LPT148 L lactis.

2) Probiótico LPT47: Dieta Probiótica Desarrollada por el Proyecto Innova Chile 05CT6PP-13 en base a la cepa LPT47 L. plantarum.

3) Biomar: Dieta Probiótica comercial adquirida por Biomar

4) Biofocus: Aditivos alimentos Biomar.

5) Control: Dieta comercial empresa Biomar