SECTOR TECNICO

La presente tecnología esta destinada al sector salud, principalmente a la recuperación de pacientes oncológicos inmunocomprometidos por causa de los tratamientos a los cuales se ven sometidos, ésta formulación permite la elaboración de alimentos funcionales que son administrados por vía oral a pacientes oncológicos, favoreciendo el aumento de peso en estos pacientes y contrarrestando los efectos colaterales que produce este tipo de terapias.

TÉCNICA ANTERIOR A lo largo de los últimos años, el interés por las terapias preventivas y los suplementos nutricionales, para mejorar la salud ha ido en aumento. El hecho de que el ser humano esté predispuesto genéticamente a adquirir ciertas enfermedades, ha orientado a los investigadores a buscar nuevas alternativas para la prevención de las mismas, siendo la alimentación uno de los factores más importantes. Según la Asociación Americana del Cáncer de Estados Unidos, se registran anualmente 1 ,5 millones de casos al año y se estima que el 70% de los casos de cáncer son debidos a la alimentación. Los efectos devastadores de esta enfermedad pueden ser prevenidos o atenuados a través de una dieta equilibrada, con el consecuente cambio en los hábitos alimenticios. En Chile, al año, cerca de 40.000 personas desarrollan algún tipo de cáncer. Sin embargo, un porcentaje considerable de personas en el mundo viven con la enfermedad o se han recuperado de ella, a través de cirugías y el consiguiente tratamiento de quimioterapia y/o radioterapia. El objetivo principal de este tipo de tratamiento es la curación de la enfermedad, sin embargo, algunos tipos de cáncer no tienen tratamiento curativo, en esos casos las terapias se administran para mejorar, en cierto modo, la calidad de vida del paciente. Los fármacos que se utilizan en quimioterapia, no sólo afectan las células cancerosas, también afectan las células normales y, generalmente causan efectos secundarios indeseables. Náuseas, vómitos, fatiga, caída del cabello y severos problemas estomacales, además de síntomas imperceptibles por el paciente, tales como la disminución del número de glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas en la sangre, son algunos de los efectos colaterales que causa el tratamiento con quimioterapia y por los cuales los pacientes se quejan frecuentemente.

La mayoría de estos efectos desaparecen cuando termina el tratamiento y las células sanas tienen la oportunidad de estabilizar su metabolismo y reproducirse hasta alcanzar su número normal. Mientras tanto, existen varios métodos que los pacientes pueden utilizar para controlar ciertos problemas menores. En los casos de efectos secundarios severos, el médico da ciertas recomendaciones para paliar y de alguna forma aliviar las sensaciones desagradables. Por lo general, las personas tienden a sentirse mejor durante el tratamiento del cáncer si descansan bastante y siguen un régimen alimenticio equilibrado. Muchos pacientes necesitan dormir más, así como también ingerir una cantidad mayor de proteínas y calorías, para ayudar al cuerpo a recuperarse. Es frecuente que algunas personas sufran de estreñimiento o diarrea por la quimioterapia. Por otro lado, las drogas que se utilizan en este tipo de tratamientos reducen la producción de saliva, por lo tanto la boca tiende a secarse, constituyendo un riesgo de lesiones y ulceraciones, lo que se conoce como mucositis. Esto, trae como consecuencia diferentes grados de infecciones, lo que provoca mucho dolor en el paciente y, a su vez, no le permite alimentarse bien debido a esta molestia. Para disminuir estos riesgos se debe mantener la boca limpia y húmeda, para lo cual se recomienda ingerir abundantes líquido, entre ellos alimentos muy refrescantes al paladar y con un alto contenido nutricional, debido a que este tipo de tratamientos conlleva una pérdida muy grande de proteínas, carbohidratos, vitaminas, etc. lo que se demuestra con la disminución de la masa muscular del paciente y la pérdida considerable de peso.

A partir de todos estos antecedentes, la iniciativa que se propone ayuda en gran medida a contrarrestar los efectos provocados por la quimioterapia. Algunos documentos encontrados que guardan relación con la presente invención se detallan a continuación:

En la patente de invención norteamericana US5922375 (1999) Probiotic bifidobacte um strain, describe una cepa probiótica, bifidobacterium la que se incorpora a alimentos, bebidas, alimentos para animales y/o a suplementos dietéticos. Se utiliza para proveer de una bacteria saludable a mamíferos humanos y no humanos. La bacteria ayuda a los recién nacidos en la producción de ácido acético y ácido láctico protector, así como antimicrobianos y vitaminas. La bacteria se utiliza también para restaurar la flora bacteriana perdida por causa de diarreas, quimioterapia, edad avanzada, u otras causas. La diferencia principal de esta tecnología con lo que se desea proteger es la cepa que se está reivindicando y el uso que se le está dando.

En la patente de invención de la oficina mundial de patentes WO0182711 (2001), Lactic acid food producís, se refiere a productos alimenticios que contienen la cepa probiótica Lactobacillus acidophilus y leche de soya. Entre los alimentos se mencionan una variedad de productos lácteos entre ellos, crema agria, queso cottage, postres y helados. La diferencia con la iniciativa que se desea proteger radica principalmente en la formulación que se utiliza para la elaboración de dichos alimentos y la utilización que se le da a esta formulación.

La patente de invención china CN1552229 (2004), Health-care ice cream powder containing active lactic acid bacteria, resguarda un postre de helado en polvo para el cuidado de la salud, que contiene lactobacilos activos y se prepara con azúcar, leche en polvo, mantequilla vegetal, malto-dextrina, éster de sacarosa, goma, CMC, esencia, colorantes, etc. Este producto es capaz de mantener un microambiente ecológico en el cuerpo humano y promueve la descomposición y absorción de nutrientes. En relación a la tecnología a proteger, se diferencia en la formulación y el uso que se le da a este alimento funcional.

La patente de invención sueca SE526711 (2005), novel strain of bifidobacterium having ability to survive in intestinal tract and produce glutamine and arginine in vivo, useful for preparing medicament for treatment of intensive care patients with intestinal failure, resguarda una cepa de bifidobacterium que tiene la habilidad de sobrevivir en tracto intestinal y produce glutamina in vivo. En esta patente se reivindica una cepa de bifidobacterium, una composición que comprende la cepa con un carrier y reivindica un medicamento para el tratamiento de pacientes que requieren cuidados intensivos con disfunción multiorgánica y daño intestinal. Este medicamento se puede utilizar para profilaxis en pacientes con quimioterapia y pacientes con enfermedades inflamatorias o posquirúrgicos. La iniciativa que se desea proteger no es un medicamento y la cepa que se utiliza no es la misma que la reivindicada en la presente patente de invención. Por otra parte, la patente de invención rusa RU2294647 (2007), Ice cream with functional characteristics, protege un helado que incluye leche, crema, azúcar, estabilizantes, complejos vitamínicos y concentrado de bacteria. Como concentrado bacteriano contiene Bifidobacterium lognum, Lactobacillus acidophilus y Propionibacterium shermanii. La tecnología que se desea proteger se diferencia con la iniciativa acá expuesta en la formulación propiamente tal y el uso que se le da a dicha formulación lo cual no guarda relación alguna con la presente iniciativa.

Otros documentos relacionados son Survival of lactobacillus acidophilus and bifidobacterium bifidum in ice cream for use as a probiotic food (Sharareh Hekmat, 1992. Journal Dairy Science 75: 1415-1422) y Survival of probiotic microoganisms lactobacillus acidophilus and bifidobacterium lactis in whipped ice cream

(Alejandro Corrales, Junio 2007. Revista Chilena de Nutrición Vol. 34 N°2, pág: 157-163) en ellos se comparan dos cepas probióticas midiendo parámetros como sobrevivencia, alteraciones organolépticas del producto, etc. además de estas publicaciones se encontraron otras relacionadas con la utilidad de ciertos alimentos que ayudan a individuos que padecen de colitis o problemas inmunológicos, pero ninguno de ellos reproduce totalmente la iniciativa que se está proponiendo. DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención corresponde a un alimento funcional para pacientes oncológicos inmunocomprometidos por causa de los tratamientos a los cuales se ven sometidos; el cual se prepara a partir de una formulación probiótica, cuyo principio activo comprende cepas viables probióticas productoras de ácido láctico, Lactobacillus spp, preferentemente pero no exclusivamente, la cepa Lactobacillus plantarum LPM 01 , aislada de leche materna, la que se condiciona para soportar temperaturas entre -30 a - 40°C, manteniendo la concentración en un rango entre 10 ⁶ - 10 ⁹ UFC/ml, por largos períodos de tiempo, de al menos 120 días. Esta formulación permite la elaboración de alimentos funcionales, preferentemente helados, además de jaleas, postres, jugos y/o derivados de la leche, los cuales son administrados por vía oral a pacientes oncológicos, preferentemente, bajo tratamiento de quimioterapia y radioterapia, donde dicho alimento favorece el aumento de peso en estos pacientes y contrarresta los efectos colaterales que produce este tipo de terapias, como la mucositis, resequedad bucal, lesiones y erosiones en el tracto digestivo.

Para llevar a cabo esta iniciativa, en primera instancia, se selecciona entre varias cepas probióticas, la cepa LPM O1 , aislada de leche materna, por ser el microorganismo que ha mostrado resultados más promisorios, en comparación a otras cepas del mismo origen. (Tabla N°1 )

Tabla N°1

Hidrofobicidad

Cepas Origen (%) Producción de Peróxido

Hexadecano Tolueno Xileno

LPM 01

85 65,9 64,7 +

L. plantarum Leche materna

LPM B ₄

74 80,6 69,9 +++

L. plantarum Leche materna

LPM AK1

80,6 86,7 79,2 +++

L. plantarum Leche materna

LPM AR2

Leche materna 84 88 91 - Lactobacillus spp.

LPM P1

Leche materna 66,5 72,6 68,2 ++

L. salivarius

Se ha descrito que en patologías gastrointestinales, las bacterias probióticas se utilizan tanto para fines terapéuticos como preventivos. Estas, al ser adicionadas a determinados alimentos por diferentes mecanismos, son eficaces en la prevención y el tratamiento de diversas enfermedades. Algunos estudios demuestran que niños suplementados con probióticos, presentan un aumento de ¡nmunoglobulinas, lo que disminuye la intensidad y duración de la diarrea producida por rotavirus. Inclusive son capaces de inhibir el crecimiento de bacterias patógenas intrahospitalarias, es por esta razón que se realizan pruebas de inhibición, (figura N°1 , A Salmonella enteritidis, B Shigella spp) en donde se evalúa la capacidad de la cepa LPM 01 aislada de leche materna de inhibir a patógenos intrahospitalarios y Campylobacter jejuni (figura N°2) en ensayos de interacción en placa.

Para demostrar los beneficios de la cepa LPM 01 , además de las pruebas de inhibición de patógenos intrahospitalarios, se realizan pruebas de inmunización con ovoalbúmina (OVA) en ratones alimentados con la cepa LPM 01. Para ello se agrupan los individuos en tres grupos experimentales, y dos grupos controles de la siguiente forma:

Grupo N° 1 (preventivo): los ratones se alimentan durante 7 días con la cepa LPM 01 en una dosis de 10 ⁷ en suero glucosado y luego se inmunizan con antígeno OVA.

Grupo N° 2 (preventivo): los ratones se alimentan durante 7 días con la cepa LPM 01 en una dosis de 10 ⁷ en suero glucosado, se inmunocomprometen los individuos con dexametasona (4 dosis, una cada dos días) y se inmunizan con antígeno OVA a partir del día 7.

Grupo N° 3 (control): individuos expuestos al antígeno OVA

Grupo N° 4 (control): individuos inmunocomprometidos con dexametasona e inmunizados con antígeno OVA

Grupo N° 5 (curativo): corresponden a individuos inmunocomprometidos con dexametasona, se inmunizan con antígeno OVA y posteriormente se alimentan los ratones durante 7 días con la cepa LPM 01 en una dosis de 10 ⁷ en suero glucosado.

Posteriormente, por cada grupo experimental, se toman muestras de sangre a los 0, 7, 14, 21 , 28 días de la primera inmunización y luego se les toma una muestra de sangre los 7, 14, 21 y 28 días después de la segunda inmunización. En la tabla N°2, se observa el título de anticuerpos obtenidos. Tabla N°2

Tal como se observa en la tabla N°2 Los resultados que se obtienen al administrar la cepa LPM O1 por vía oral, demuestran que, a los 14 días, en todos los grupos se observa un aumento en el título de anticuerpos, el grupo curativo es el mayor de todos; la respuesta es similar en los distintos tiempos estudiados. Sin embargo, luego de la segunda inmunización, se observa un aumento significativo en el título de anticuerpos, siendo los grupos preventivo (inmunocomprometido) y el grupo curativo los con mayor título de anticuerpos, lo que da cuenta que la cepa LPM O1 reactiva de forma relevante la respuesta inmune humoral.

Una vez determinadas estas propiedades, se trabaja con la cepa LPM O1 condicionándola y promoviendo su capacidad de soportar temperaturas extremas para finalmente elaborar un alimento funcional, preferentemente un helado artesanal.

Para condicionar las cepas a soportar bajas temperaturas, se realizan ciertos procedimientos y elementos que durante el proceso de cultivo y manejo posterior, permiten a la cepa LPM O1 adquirir esta propiedad. En primera instancia, se optimiza el cultivo de esta bacteria láctica. Para ello se utiliza un medio de cultivo que contiene permeado de lactosuero hidrolizado, el cual es la principal fuente de carbono del medio y, en este caso particular, actúa como crioprotector, con aditivos y sales de magnesio y manganeso. La adición de surfactantes no iónicos derivados de sorbitán, como el monooleato de sorbitán polioxiteno 20, modifica la permeabilidad de la membrana celular de las bacterias, favoreciendo su sobrevivencia durante la etapa de congelado; esto se debe a que aumenta la proporción de ácidos grasos insaturados en la membrana celular. Este antecedente es relevante, considerando que la cepa en cuestión se cultiva en un medio que contiene monooleato de sorbitán polioxiteno 20 y la biomasa obtenida no se lava, por lo tanto contiene una cantidad no menor de nutrientes no digeridos, entre ellos el compuesto aquí descrito.

Otro factor importante es el estado fisiológico de las bacterias. Las bacterias en fase estacionaria son más resistentes al congelamiento o secado por sublimación (liofilización) que aquellas bacterias que se encuentran en fase exponencial. Es por esta razón que el cultivo se cosecha a las 12 horas, que corresponde a la fase estacionaria de la cepa LPM O1 .

La adición de agentes choprotectores, además del permeado de lactosuero, sorbitol, glutamato monosódico, glicerol, entre otros; atenúa los daños de la membrana durante el congelamiento de las cepas bacterianas. Por otra parte la sacarosa, componente principal del helado, genera un efecto protector debido a la interacción de ésta con proteínas de la membrana, disminuyendo de esta forma el daño celular.

La naturaleza de los aditivos es gravitante en la etapa de almacenamiento, puesto que influyen directamente en la viabilidad de las bacterias, pero por otro lado, no deben alterar la calidad del producto alimenticio. En conclusión, tanto el medio de cultivo como los aditivos en la formulación del helado probiótico contienen agentes crioprotectores que explican la conservación de la viabilidad de este producto durante el tiempo de almacenamiento. Una vez determinadas las condiciones mediante las cuales la cepa LPM O1 conservará sus propiedades a bajas temperaturas, se elabora una partida de helado artesanal, el cual mantiene sus propiedades organolépticas y conserva excelentes índices de estabilidad de biomasa probiótica la que alcanza a 1x10 ⁸ UFC/ml al final de los monitoreos realizados. Esto se determina a partir de la muestra que se extrae de cada pote de helado elaborado, los que se homogenizan y siembran en diferentes medios de cultivo para evaluar la viabilidad (UFC/ml) y las propiedades probióticas. En la figura N°3 se observa que la cepa LPM O1 , incorporada al helado artesanal se conserva a altas concentraciones probióticas, cercanas a 1x10 ⁸ UFC/ml por al menos 120 días de preparado el helado. Respecto a las características bioquímicas de la cepa LPM 01 , en la tabla N°3 se observa que éstas se conservan respecto a la cepa original, lo que da cuenta de que el condicionamiento es efectivo y la cepa es capaz de soportar bajas temperaturas sin perder sus propiedades.

Tabla N°3

En la tabla N°4 corresponde a la evolución de la propiedad probiótica de hidrofobicidad de la cepa contenida en el helado. En ella se observa que la propiedad se conserva respecto a la original.

Tabla N°4

La figura N°4 muestra el perfil polimórfico que se obtiene por RAPD-PCR de la cepa LPM 01 y las colonias aisladas desde las muestras de helado a los 30 y 70 días de análisis, El carril N°1 corresponde a la cepa LPM 01 (extracción kit); carril N°2 colonia helado día 30 (extracción kit); carril N°3 colonia helado 70 días (extracción kit); carril N°4 cepa LPM 01 (extracción enzimática); carril N°5 colonia helado 30 días (extracción enzimática); carril N°6 colonia helado 70 días (extracción enzimática); carril N°7 control negativo y M marcador peso molecular. En esta figura se observa que los perfiles muestran el mismo bandeo, la diferencia de intensidad esta dada por el tipo de extracción realizada, ya que las bandas 1 , 2, y 3 se realizaron con un kit comercial de extracción y las bandas 4,5 y 6 se realizaron por extracción enzimática.

De estos análisis se concluye que la cepa probiótica LPM 01 que se incorpora al helado artesanal, mantiene las concentraciones probióticas a través de los monitoreos. Las pruebas bioquímicas de las cepas aisladas desde los helados conservan el mismo perfil de la cepa probiótica incorporada. Además, se observa que las propiedades probióticas de las cepas aisladas de los preparados, se conservan respecto a la original y las propiedades organolépticas del helado - color, sabor y textura - se mantienen sin variaciones durante los monitoreos. Una vez que se miden estos parámetros, se procede a realizar la prueba en pacientes con tratamiento de quimioterapia, que es el objetivo de la elaboración del helado probiótico. Se reclutan cinco pacientes oncológicos voluntarios, los cuales presentan cáncer de colon, cáncer mamario y cáncer ovárico, entre otros, y que se encuentran en tratamiento de quimioterapia, además de seis voluntarios sanos. Se diseña un ensayo doble ciego, randomizado, donde a través de un sorteo, los voluntarios seleccionan el preparado según su color: naranjo o verde. Los preparados naranjos contienen sólo el helado y los preparados verdes contienen la cepa probiótica. Esta identificación, se realiza sólo al momento de analizar los resultados y el contenido de los preparados es conocido únicamente por la persona encargada del proceso de elaboración. El ensayo tiene una duración de 60 días y previo a su desarrollo se realiza una sensibilización del procedimiento. Los voluntarios ingresan con consentimiento informado.

Para el caso de los voluntarios sanos, el resumen de la evolución individual de los participantes respecto a la inmunoglobulina A salival y sérica, se presenta en las tablas N°5 y N°6, como promedios 3 voluntarios con helado con probióticos y 3 voluntarios con placebo, a tiempo 0, 30 y 60 días de consumo del helado, y en las figuras N°5 A y B. Si bien los resultados obtenidos se encuentran dentro de los rangos normales, para el caso de la IgA sérica en aquéllos pacientes que consumen el helado con probiótico, se observa un ascenso más marcado que en el caso de los pacientes que consumieron placebos.

Tabla N°5

Tabla N°6 Luego, se realiza un recuento microbiológico en heces de voluntarios sanos. En la figura N°6 se grafican las concentraciones de la flora ácido láctica que se obtienen de los voluntarios sanos hasta los 60 días de análisis. Se observa que los voluntarios tienen una concentración de lactobacilos basal, aproximada entre 10 ⁷ - 10 ⁹ UFC/ml. A los 30 días, se observan diferencias entre los dos grupos de voluntarios. En el grupo probiótico, todos los voluntarios aumentan su concentración significativamente, mientras que en el grupo placebo se observa una baja. Una vez que termina el ensayo a los 60 días, el grupo probiótico mantiene recuentos similares a los que se obtienen a los 30 días, mientras que el grupo placebo aumenta la concentración respecto a las que se obtienen a los 30 días.

En voluntarios oncológicos, se observa que los parámetros de la IgA son más estables en los pacientes que consumieron el preparado con probióticos en comparación con los pacientes que el placebo (tabla N°7, como promedios 3 voluntarios con helado con probióticos y 2 voluntarios con placebo, a tiempo 0, 30 y 60 días de consumo del helado,). En las personas que emplean el helado con probiótico se observa un aumento progresivo y sostenido en el tiempo, a diferencia de los voluntarios que emplean placebo, donde la evolución es más errática. Si bien se observa un aumento de la IgA salival en el día 60, ésta no es estadísticamente significativa (ANOVA p = 0.790123).

Tabla N°7

Respecto a la evolución de la IgA (tabla N°8, como promedios 3 voluntarios con helado con probióticos y 2 voluntarios con placebo, a tiempo 0, 30 y 60 días de consumo del helado), el comportamiento es bastante errático en los usuarios del placebo, a diferencia de los usuarios del helado probiótico, donde la evolución es más estable. Si bien se observa una diferencia, ésta no es estadísticamente significativa (ANOVA p = 0.149651 ).

Tabla N°8 Uno de los parámetros más importantes a considerar y que hace más innovadora esta iniciativa es el relacionado a las variaciones de peso que presentan los pacientes que están bajo tratamiento de quimioterapia. Para los voluntarios que ingieren el preparado con la cepa LPM 01 , la recuperación del peso corporal es notoria en estos pacientes, quienes en promedio suben entre 2 a 6 kg, preferentemente, 3 kg al mes (tabla N°9). La diferencia de peso que se obtiene entre el inicio y al mes de tratamiento es, estadísticamente significativa según la prueba t para datos pareados (p= 0,00492623). La prueba ANOVA, para muestras correlacionadas, demuestra que la diferencia de las medias de los pesos al inicio, a los 30 y 60 días es significativa p<0, 03381 y según la prueba de HSD de Tuckey demuestra que el par que indica diferencia de media de pesos significativa es entre 1 y 2 y entre 1 y 3 (inicio, a los 30 días y a los 60 días).

Tabla N°9 En la tabla N°10, presenta los resultados de los pacientes tratados con placebo, en la cual se observa, que la diferencia de la media de pesos, entre el inicio y el final del tratamiento, en estos pacientes no es significativo, con lo cual se confirma que la cepa probiótica LPM O1 influye y actúa en beneficio del paciente oncológico, lo que se demuestra con la ganancia de peso.

Tabla N°10

El recuento microbiológico en heces de voluntarios oncológicos (figura N°7) muestra las concentraciones de bacterias ácido láctica obtenidas de los voluntarios con quimioterapia hasta los 60 días de análisis. Al inicio del ensayo todos los voluntarios presentan una baja concentración de lactobacilos básales entre 10 ⁶ - 10 ⁷ UFC por gramo de heces, la cual se ve aumentada a los 60 días con valores cercanos a 10 ⁸ UFC por gramo de heces. Estos datos demuestran que existe una clara recuperación de la flora basal en la población bacteriana intestinal.

Respecto al producto propiamente tal, las propiedades organolépticas del helado -color, sabor y textura- se mantienen similares durante los monitoreos y son ampliamente valoradas por los participantes, esta observación reafirma el hecho de que la cepa que se incorpora al helado mantiene sus propiedades bioquímicas inalteradas y por otra parte, también confirma la recuperación de la sensación del gusto y la percepción del sabor de los pacientes oncológicos tratados con el helado.

Otro factor importante a considerar son los efectos que se manifiestan con el consumo del preparado. Del total de pacientes a los cuales se les administra el preparado probiótico, ninguno de los dos grupos manifiesta diarrea con la ingesta del producto. No se describen reacciones adversas con la administración tales como mucositis, diarrea, náuseas o vómitos, como la que se describen en la mayoría de los pacientes bajo tratamiento de radioterapia y quimioterapia.

El preparado se conceptualiza como postre. Se describe como de textura suave y de sabor exquisito. Tanto para voluntarios oncológicos como en voluntarios sanos se obtiene la misma apreciación. Más aún para los voluntarios oncológicos, estos tres factores juegan un rol motivador para mantener la constancia en el consumo, a pesar de los distintos estados por los que pasa el organismo producto de la quimioterapia: ardor intenso del tubo digestivo superior, mal humor, decaimiento, nauseas, cefalea constante. Por otra parte, los participantes describen que el helado probiótico constituye un apoyo en la alimentación, ya que no dejan de consumirlo a pesar de tener días muy difíciles de desequilibrio orgánico. En algunos momentos se transforma en el único alimento consumido.

EJEMPLOS DE APLICACIÓN

Ejemplo N°1 : Activación y evaluación de cepa probiótica

1.1 Preparación de Lactobacillus plantarum (LPM 01). La cepa fue activada desde cepario; luego de su activación, las bacterias fueron centrifugadas, lavadas con solución fisiológica y ajustada a una densidad óptica DOs ₄ o 0,6; sembradas mediante tórulas en la superficie de agar MRS e incubadas por 24 horas a 25°C.

1.2 Preparación de patógenos intrahospitalarias y Campylobacter. Jejuni. Las cepas enteropatógenas fueron activadas y llevadas a una concentración de Me. Farland 0,5 para luego sembrarlas en superficie en placa de agar tripticasa, para el caso de los patógenos intrahospitalarios, y en agar brusela con sangre equina al 5%, para C. jejuni. Se utilizaron 20 cepas de Shigella spp., 20 cepas de Escherichia coli, 30 cepas de Salmonella spp., y 3 cepas de C. jejuni aisladas desde pacientes con Síndrome Diarreico Humano

Para el ensayo de inhibición realizado en placas de agar tripticasa para el desarrollo de la cepa patógena, la cepa láctica fue inoculada en pocilios, la incubación se realizo a 37° C por 12 y 24 hrs.

1.3 Ensayo de Interacción con Campylobacter Jejuni. Este ensayo se realizo mediante la técnica de interacción en pocilios con modificaciones, más la técnica de Campbells. Para la técnica de interacción en pocilios se realizaron tratamientos a la cepa de L. plantarum (LPM 01 ) donde se prepararon 5 condiciones:

- inhibición de peróxido

- Neutralización de ácido láctico

- inhibición de peróxido y neutralización de ácido láctico.

- sobrenadante sin bacterias

- cultivo entero a una concentración aproximada 10 ⁹ UFC/ml.

Para el ensayo de Campbells, se tomaron trozos del agar MRS con la cepa lácticas crecida y se depositaron en la superficie del agar Brusela recién sembradas con las cepas de C. jejuni, colocando un disco con la cepa láctica en contacto el patógeno y colocando otro disco con la superficie del disco en contacto con la cepa patógena. Luego de realizar el ensayo se incubó a 37°C en ambiente microarofílico por 48 h.

Ejemplo N°2: Cultivo v condicionamiento de cepa LPM 01.

2.1 Preparación de medio de cultivo.

Hidrólisis de Permeado de Suero: Se adiciona la cantidad necesaria de enzima (lactasa o β-galactosidasa) en permeado de suero disuelto en agua destilada, y se incuba por 1 a 4 h a 40°C, bajo agitación constante.

Adición de nutrientes: Trascurrida la hidrólisis, se adicionan el resto de los componentes del medio de cultivo, se ajusta a pH=6.0 y se autoclava para su posterior uso.

Compontente medio de cultivo Cantidad (g/L)

Permeado de Lactosuero entre 10 - 70; preferentemente entre 30 - 50

Enzima (β-galactosidasa) entre 0,1 - 4; preferentemente entre 0,25 - 2

Peptona de Caseína entre 1 - 10; preferentemente entre 4 - 7

Extracto de Levadura entre 1 - 8; preferentemente entre 2 - 5

Potasio dihidrógenofosfato entre 0,5 - 7; preferentemente entre 1 - 4

onooleato de sorbitán polioxiteno 20 entre 0, 1 - 3; preferentemente entre 0,5

- 1 ,5

Sulfato de Magnesio entre 0,005 - 0,1 ; preferentemente entre 0,01 - 0,03

Sulfato de Manganeso entre 0,05 - 2, preferentemente entre 0,2 - 0,5

2.2 Cultivo de la cepa LPM 01. Una vez activada la cepa LPM O1 a 37°C, por sucesivos repiques, el primero por 24 h y el segundo por 12 h, se ajusta la concentración a una DO de 0,5 (625 nm), para luego inocular la cantidad necesaria en el fermentado con el medio permeado de lactosuero a 37°C, asegurando una concentración inicial de bacterias de 10 ⁵ UFC/ml. Se incuba a 37°C por 12 h, aproximadamente.

2.3 Cosecha de biomasa. Transcurrido el tiempo de cultivo, se centrifuga el caldo con la biomasa a 8000 rpm por 20 min a 15°C. Una vez centrifugada la muestra, se descarta el sobrenadante, y se almacena la biomasa decantada para su posterior uso a 4°C.

2.4 Mezclado. Se resuspende la biomasa obtenida desde el cultivo en leche entera (parte de la composición del helado) y se homogeniza la suspensión en un agitador orbital, para luego adicionar el resto de la mezcla líquida del helado (previamente pasteurizada). Se almacena a 4°C para posteriormente pasar a la etapa enfriamiento del helado probiótico.

Ejemplo N°3: Preparación de Helado de leche con probiótico

Ingredientes

50 gr Base para helados

40 gr Preparado de grasas

240 gr Azúcar

1 It. Leche

50 gr Crema de leche

1 gr.de bacterias lácticas con 10 ⁹ UFC

65 gr saborizante

3.1 Mezcla de ingredientes: Se obtuvo una mezcla homogénea de los distintos ingredientes, lo normal es la incorporación de los ingredientes líquidos, calentando a temperaturas entre 30 - 40°C para agregar base en polvo mezclado con el estabilizante y emulsificante.

3.2 Pasteurización: Se obtuvo un producto libre de bacterias patógenas viables y mejoró la calidad de almacenaje del producto, el efecto del calentamiento de la mezcla sirve para disolver los azúcares y estabilizantes-emulsificantes, al mismo tiempo que licúa la materia grasa. La temperatura recomendada para proceso continuo es de 80°C por 25 seg y para pasteurización discontinua 72°C por 30 min.

3.3 Homogeneización: La finalidad de esta etapa es: obtener un glóbulo graso de tamaño uniforme en la emulsión, distribuir los emulsificantes y proteínas de la leche en la superficie del glóbulo graso (coloides protectores), mejorar el batido e incorporación de aire, producir una textura suave y mejorar el derretimiento.

3.4 Enfriamiento: Una vez homogeneizada la mezcla, se enfría a 4°C para permitir su maduración o envejecimiento. Este proceso puede tomar entre 2 y 4 horas.

3.5 Incorporación de bacteria láctica probiótica: Aprovechando la condición fría de la mezcla se incorpora la cepa láctica, asegurando una concentración de 10 ⁹ UFC/mL uniforme en todo su contenido, aplicando un mezclado suave.

3.6 Congelación: La congelación y batido de la mezcla se efectúan para transformarla de un estado líquido a un estado semi-sólido. El contenido de aire incorporado depende de la velocidad de mezclado en el congelador. La temperatura de salida del congelador fluctúa alrededor de -5°C, y a esta temperatura prácticamente el 50% del agua de la mezcla está en estado sólido.

3.7 Endurecimiento y Almacenamiento: Una vez que sale el producto del congelador envasado, este se estabilizará rápidamente, procediendo al congelamiento de la mayor parte del agua que aún permanece en estado líquido hasta una temperatura entre - 30°C y -40°C, lo que endurece el helado.

Terminado el proceso de endurecimiento, el helado puede ser almacenado en congelador a -20°C hasta el momento de su comercialización, donde se deben emplear canales de frío apropiados para evitar cambios indeseables en la textura por fluctuaciones en la temperatura de conservación.

Finalmente se debe asegurar en el helado una concentración de la bacteria láctica probiótica de 10 ⁸ UFC/g

3.8 Estabilidad del producto elaborado. El helado artesanal tuvo presentaciones de 200 mi. Se extrajeron aproximadamente 5 mi de cada pote, los que fueron homogenizados y sembrados en los diferentes medios de cultivo para la evaluación de la viabilidad (UFC/ml) y las propiedades probióticas. Las placas fueron incubadas de 24 a 48 h a 37° C. La conservación del helado se efectuó en un congelador convencional a -20° C. Ejemplo N°4: Ensayo clínico.

4.1 Criterio de inclusión. Se reclutaron cinco pacientes oncológicos voluntarios que presentaban cáncer de colon, cáncer mamario y cáncer ovárico, entre otros y que se encontraban en ciclos de quimioterapia y seis voluntarios sanos.

4.2 Reclutamiento. Se diseñó un ensayo doble ciego y randomizado, donde a través de un sorteo, los voluntarios seleccionaron un preparado de color naranjo o de color verde. Los preparados naranjos contenían sólo el helado y los preparados verdes contenían la cepa probiótica. Esta identificación, sólo se realizó al momento de analizar los resultados y el contenido de los preparados sólo fue conocido por la persona encargada del proceso de elaboración. El ensayo tuvo una duración de 60 días y previo a su desarrollo se realizó una sensibilización del procedimiento, los voluntarios ingresaron con consentimiento informado donde sortearon el esquema a ingerir.

4.3 Dosificación. El ensayo clínico contempló el consumo de la cepa probiótica LPM 01 a una concentración probiótica de 10 ⁷ -10 ⁹ UFC/ml en cada preparado, el que fue consumido diariamente por un mes en una dosis de 100 mi de helado diaria. La conservación de estos preparados se efectuó en un frezzer a -20°C. A cada participante se le entregó material educativo con las indicaciones a seguir, así como una planilla de registro de síntomas.

4.4 Monitoreos de los preparados. Para determinar la viabilidad del preparado, se utilizó el siguiente protocolo. Muestras de helados fueron sembradas serialmente para determinar el número de unidades formadoras de colonias (UFC/ml de helado) en placas de agar Rogosa y MRS. Los resultados se analizaron después de 48 h de incubación a 37°C en microaerofilia.

4.5 Evaluación clínica. A cada participante se le realizó un chequeo a los días 0, 30 y 60 días, el que consistió en hemograma, VHS, proteína C reactiva, IgA salival, factor

C3 de sistema complemento, muestra de deposiciones. Además cada paciente oncológico evaluó diariamente sus cuadros diarreicos en planillas, según la clasificación entregada por la organización mundial de la salud (OMS):

Grado 0= No diarrea Grado 1= Aumento de 2 ó 3 deposiciones/día sobre basal

Grado 2= Aumento de 4-6 deposiciones/día o deposiciones nocturnas, o dolores moderados

Grado 3= Aumento de 7 a 9 deposiciones/día, incontinencia o dolores graves

Grado 4= Aumento de más de 10 deposiciones/día, diarrea macrohemorrágica o necesidad de soporte parenteral

4.6 Análisis de heces. A cada participante se les realizaron tres tomas de muestras de heces, la primera correspondió antes de la ingesta del helado (T0), y luego a los 30 (T30) y 60 (T60) posterior a su consumo. El transporte de las muestras de heces se realizó en frascos estériles en cadena de frió. Las muestras fueron sembradas en el medio selectivo MRS e incubadas a 37°C en microaerofília (5% C0 ₂ ) durante 24-48 h. Mediante la metodología descrita, se logró determinar la presencia y concentración de bacterias lácticas presentes en las heces de los voluntarios. De las placas con crecimiento positivo se seleccionaron colonias con distintas morfología, para ser incubadas en caldo MRS por 24 h a 37°C. A los tubos con crecimiento positivo se les realizó tinción de Gram y prueba de catalasa, seleccionando las cepas catalasa negativas y Gram positivas con morfología bacilar o cocobacilar, las que fueron guardadas en leche-extracto levadura (LEL) a -20°C, para los estudios moleculares.