Procédé et Méthodes de détection de la maladie d'Alzheimer

La présente demande concerne des méthodes et compositions utilisables pour la détectioi de la maladie d'Alzheimer chez les mammifères, en particulier les humains. Elle décri notamment des marqueurs sériques de la maladie d'Alzheimer et leurs utilisations dans de; méthodes de diagnostic. Elle concerne également des outils et/ou kits utilisables pour h mise en œuvre de ces méthodes (réactifs, sondes, amorces, anticorps, puces, cellules, etc.) leur préparation et leurs utilisations. L'invention est utilisable pour détecter la présence o\ l'évolution de la maladie d'Alzheimer chez les mammifères, y compris en phase précoce.

La maladie d'Alzheimer représente la principale cause de démence et la maladii neurodégénérative la plus fréquente. Cette maladie, d'évolution progressive, est caractérisé' par la perte de mémoire et par une dégradation des aptitudes au langage, à l'orientation e au jugement. La nature des symptômes, souvent confondus avec les désagrément physiologiques liés à la vieillesse, leur sévérité ainsi que l'âge de leurs apparitions, varien selon les individus. Ceci contribue à la difficulté d'établir un diagnostic aux stades précoce de la maladie.

L'examen de cerveaux de patients atteints de cette maladie révèle une perte de neurones dι l'hippocampe, centre important de la mémoire, et du cortex cérébral, impliqué dans L raisonnement, le langage et la mémoire. Les neurones cholinergiques sont particulièremeπ affectés par cette déplétion.

Une autre anomalie majeure observée dans les cerveaux des malades atteints de la maladi d'Alzheimer est l'accumulation d'agrégats intracellulaires et extracellulaires de protéines Des agrégats neurofibrillaires intracellulaires de la protéine tau semblent bien corrélés avei la gravité de la démence. Des plaques séniles formées par agrégation intra et extracellulain de peptide beta-amyloïde caractérisent des régions d'altérations de neurones et de cellule gliales.

II est cependant remarquable de noter que ces zones d'agrégation ne correspondent pas aux sites de la déplétion en synapses caractéristique du déclin des fonctions cognitives.

Les études génétiques menées sur les formes familiales ont montré que 4 gènes sont associés au développement de la maladie. L'APP (Amyloid Precursor Protein ; précurseur du peptide beta amyloide), les présénilines 1 et 2 (PSl et PS2) et l'apolipoprotéine E

(ApoE). Bien que des mutations ou polymorphismes dans chacun de ces gènes aboutissent à une production accrue de peptide beta amyloïde, les mécanismes qui président aux pertes synaptiques et neuronales restent mal connus. A cet égard, plusieurs hypothèses et mécanismes semblent ainsi coexister, qui impliquent différents phénomènes:

1 Des phénomènes purement cérébraux impliquant les neurones et les cellules gliales:

- le stress oxydatif, qui peut être induit notamment par le peptide beta amyloïde et modulé par le métabolisme du cholestérol; - des modifications de flux calciques et l'excitotoxicité.

2 Des phénomènes inflammatoires et immunitaires réactionnels ;

3 Une altération des hormones sexuelles ;

4 L'hypothyroïdisme et des défauts dans la régulation des signaux insuliniques.

Par conséquent, la maladie d'Alzheimer serait caractérisée par une altération de différents systèmes d'intégration régulant l'homéostasie, l'atteinte de certains neurones entraînant à la fois une réaction inflammatoire impliquant le système immunitaire et des modifications des régulations endocriniennes. Ces dernières ont en retour un impact sur l'activité et la viabilité d'autres neurones et sur les fonctions immunitaires, ces réactions en cascade soulignant le rôle non seulement de la neurodégénérescence mais aussi des régulations hormonales et de la réponse immunitaire dans la progression de la maladie d'Alzheimer.

Il n'existe actuellement aucune signature robuste et spécifique de la maladie dAlzheimer, susceptible de permettre d'établir un diagnostic de cette pathologie, notamment des différents stades de l'évolution de la maladie. La mise à disposition d'un test de diagnostic

efficace, notamment précoce, permettrait aux patients d'être pris en charge dès le début de la maladie, et de bénéficier ainsi d'un traitement plus efficace et plus adapté, notamment par des inhibiteurs d'acétylcholinestérase tels que la tacrine, le donepezil et la rivastigmine, dans des conditions optimales.

La présente invention apporte une réponse à ce besoin. L'invention décrit notamment l'identification de marqueurs sériques de la maladie d'Alzheimer, permettant la mise au point de diagnostics efficaces et prédictifs de la présence, du stade ou du risque de développer cette maladie. L'invention décrit ainsi l'identification de signatures moléculaires spécifiquement ou préférentiellement exprimées dans le sang de patients atteints de la maladie d'Alzheimer, résultant notamment d'épissages alternatifs. De manière particulièrement inattendue, la présente demande démontre l'existence, au niveau des cellules sanguines de patients atteints de la maladie d'Alzheimer, d'une dérégulation de l'horloge interne et de voies de signalisation moléculaire impliquées dans la phagocytose et/ou le stress oxydatif. L'invention peut donc proposer, pour la première fois, des outils et méthodes de diagnostic, de prédiction et/ou de suivi de l'évolution de la maladie d'Alzheimer, basés sur une mesure, dans le sang de sujets, de l'expression d'un ou plusieurs gènes choisis parmi les gènes régulés selon un rythme circadien et les gènes impliqués dans la régulation de la phagocytose ou du stress oxydatif. La présence d'une dérégulation dans l'expression de tels gènes permet d'établir le risque ou la prédisposition à la maladie d'Alzheimer, ou de confirmer la présence de cette pathologie chez un sujet.

Un objet de l'invention réside ainsi dans une méthode pour détecter (in vitro ou ex vivo) la présence ou le risque de développer la maladie d'Alzheimer chez un mammifère, comprenant la détermination de la présence, dans un échantillon biologique du mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans un ou plusieurs gènes ou ARN choisis parmi les gènes régulés selon un rythme circadien et les gènes impliqués dans la régulation de la phagocytose ou du stress oxydatif, la présence d'une telle altération étant indicative de la présence ou du risque de développer la maladie d'Alzheimer chez ce mammifère.

Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour évaluer ou suivre l'efficacité d'un traitement de la maladie d'Alzheimer, comprenant une étape de mesure de l'expression d'un ou, de préférence, de plusieurs gènes choisis parmi les gènes régulés selon un rythme circadien et les gènes impliqués dans la régulation de la phagocytose ou du stress oxydatif, au cours du traitement, et une comparaison de l'expression ainsi mesurée à celle mesurée à un stade antérieur du traitement.

Un autre objet de l'invention concerne une amélioration aux méthodes de traitement de la maladie d'Alzheimer, l'amélioration consistant à mesurer l'expression d'un ou, de préférence, de plusieurs gènes choisis parmi les gènes régulés selon un rythme circadien et les gènes impliqués dans la régulation de la phagocytose ou du stress oxydatif, chez un sujet, avant et/ou pendant le traitement. La mesure de l'expression permet d'adapter le traitement en fonction de l'évolution de la pathologie. Le traitement est typiquement un traitement par des inhibiteurs d'acétylcholinestérase, tels que la tacrine, le donepezil et la rivastigmine.

Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un inhibiteur d'acétylcholinestérase, tel que la tacrine, le donepezil et la rivastigmine, pour la préparation d'un médicament pour traiter la maladie d'Alzheimer chez un patient présentant une dérégulation de l'expression d'un gène (au moins) tel que défini précédemment.

L'altération dans un gène ou ARN désigne au sens de l'invention (i) toute altération de l'expression, à savoir en particulier une dérégulation dans les niveaux d'expression (e.g., de transcription ou de traduction), une dérégulation de l'épissage, conduisant par exemple à l'apparition de formes épissées particulières ou à une modification de la quantité (relative) ou du rapport entre les différentes formes d'épissage, de même que (ii) toute altération dans la structure de la protéine produite (apparition ou disparition de formes tronquées, allongées, mutées, etc.).

Comme il sera décrit dans la suite du texte, la présente demande décrit l'identification de dérégulations de l'épissage des acteurs des cascades de signalisation impliquées dans le rythme circadien et dans la régulation de la phagocytose ou du stress oxydatif dans le sang de patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Toute molécule ou technique permettant de mesurer l'expression de ces gènes dans le sang peut être mise en œuvre dans le cadre de la présente invention, telles que des amorces nucléotidiques, des sondes nucléotidiques ou des anticorps spécifiques, qui peuvent être en suspension ou sous forme immobilisée, comme il sera décrit en détails dans la suite du texte.

Ainsi, un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel sont immobilisés des acides nucléiques comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'un ou, de préférence, plusieurs gènes ou ARN tels que définis précédemment. De préférence, le produit comprend des acides nucléiques distincts comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'au moins 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus gènes ou ARN tels que définis précédemment.

Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel est immobilisé au moins un ligand d'un polypeptide codé par un gène ou un ARN tel que défini ci-dessus. De préférence, le produit comprend au moins 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus ligands de polypeptides différents choisis parmi les polypeptides mentionnés ci- dessus.

Un autre objet de la présente demande concerne un kit comprenant un compartiment ou conteneur comprenant au moins un, de préférence plusieurs, acides nucléiques comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'un ou plusieurs gènes ou ARNs tels que définis précédemment et/ou un, de préférence plusieurs ligands d'un ou plusieurs polypeptides tels que définis précédemment. De préférence, le produit comprend au moins 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus acides nucléiques et/ou ligands différents choisis parmi les acides nucléiques et ligands mentionnés ci-dessus. Le kit peut comprendre par ailleurs des

réactifs pour une réaction d'hybridation ou immunologique, ainsi que, le cas échéant, des contrôles et/ou instructions.

Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un produit ou kit tel que défini ci- dessus pour la détection de la maladie d'Alzheimer chez un sujet mammifère, de préférence un sujet humain.

Marqueurs sériques de la maladie d'Alzheimer

La présente invention repose sur la mise en évidence et la caractérisation d'événements biologiques sériques caractéristiques de la maladie d'Alzheimer chez un patient humain. Ces événements constituent des biomarqueurs, dont la détection chez un patient permet, de préférence en combinaison, de déterminer, même à un stade précoce, le risque de développer une telle maladie, la présence d'une telle maladie, ou le stade d'évolution de cette maladie. En outre, les marqueurs selon l'invention sont également utilisables pour mesurer l'efficacité d'un traitement, et/ou pour sélectionner des médicaments candidats. Les combinaisons de marqueurs de l'invention peuvent permettre de distinguer la maladie d'Alzheimer des autres pathologies neurodégénératives.

Les événements biologiques identifiés correspondent typiquement à des modifications dans la régulation de l'expression de gènes. Il peut s'agir d'une inhibition partielle ou totale de l'expression de gènes ou d'ARN, ou de certaines formes de gènes ou d'ARN, d'une augmentation de l'expression de gènes ou de certaines formes de gènes ou d'ARN, de l'apparition ou de la disparition de formes d'épissages de gènes, etc.

Au sens de l'invention, on entend par le terme « gène régulé selon un rythme circadien » tout gène dont l'expression est régulée par l'horloge biologique interne. Il s'agit en particulier de tout ARN ou toute protéine dont l'expression ou l'activité est régulée selon un rythme chronologique, par exemple une périodicité de 24h. Chez l'homme, le rythme circadien est contrôlé par une "horloge biologique" (le noyau suprachiasmique) située dans

l'hypothalamus. Elle tient sous sa dépendance d'autres horloges biologiques, contrôlant entre autres le rythme thermique du corps ou la synthèse d'hormones. A titre d'exemples illustratifs de gènes régulés selon un rythme circadien pour la mise en œuvre de l'invention, on peut citer notamment tous les gènes mentionnés dans le tableau 1.

Ainsi, un objet particulier de l'invention réside ainsi dans une méthode pour détecter (in vitro ou ex vivo) la présence ou le risque de développer, la maladie d'Alzheimer chez un mammifère, comprenant la détermination de la présence, dans un échantillon biologique du mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans un ou plusieurs gènes indiqués dans le Tableau 1, ou dans les ARN correspondants, en particulier d'une altération de l'épissage d'un tel gène ou ARN, la présence d'une telle altération étant indicative de la présence ou du risque de développer la maladie d'Alzheimer chez ce mammifère.

Dans un mode de mise en œuvre particulier, la méthode de l'invention comprend au moins la détermination de la présence, dans un échantillon biologique du mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans le gène BMALl ou CLOCK, ou dans un ARN correspondant, en particulier d'une altération de l'épissage d'un tel gène ou ARN.

Au sens de l'invention, on entend par le terme « gène impliqué dans la régulation de la phagocytose ou du stress oxydatif » tout gène dont le produit d'expression participe au mécanisme de la phagocytose ou du stress oxydatif dans les cellules sanguines. La phagocytose est le mécanisme par lequel certaines cellules vivantes englobent et digèrent certaines particules étrangères. A titre d'exemples illustratifs de tels gènes au sens de l'invention, on peut citer notamment tous les gènes mentionnés dans le tableau 2.

Ainsi, un autre objet particulier de l'invention réside ainsi dans une méthode pour détecter

(in vitro ou ex vivo) la présence ou le risque de développer, la maladie d'Alzheimer chez un mammifère, comprenant la détermination de la présence, dans un échantillon biologique du

mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans un ou plusieurs gènes indiqués dans le Tableau 2, ou dans les ARN correspondants, en particulier d'une altération de l'épissage d'un tel gène ou ARN, la présence d'une telle altération étant indicative de la présence ou du risque de développer la maladie dAlzheimer chez ce mammifère.

Dans un mode de mise en œuvre particulier, la méthode de l'invention comprend au moins la détermination de la présence, dans un échantillon biologique du mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans le gène de la L- Plastin ou de la Calnexin, ou dans un ARN correspondant, en particulier d'une altération de l'épissage d'un tel gène ou ARN.

De manière préférée, l'invention repose sur la détection combinée d'une altération dans plusieurs gènes choisis parmi les gènes mentionnés ci-dessus. Le terme détection « combinée » indique que l'altération de plusieurs gènes est déterminée pour aboutir à un évaluation, cette détermination pouvant être réalisée de manière simultanée ou non. Ainsi, un mode de mise en œuvre particulier de l'invention implique la détection combinée d'une altération dans au moins un gène régulé par le rythme circadien et dans au moins un gène impliqué dans la régulation de la phagocytose ou du stress oxydatif.

L'invention repose donc sur la détection, dans un échantillon, d'une ou plusieurs molécules cibles choisies avantageusement parmi : a) les gènes indiqués dans les Tableaux 1 et 2, ou les ARN correspondants, ou un fragment distinctif de ceux-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, b) les acides nucléiques ayant une séquence complémentaire d'une séquence selon a), c) les analogues fonctionnels d'acides nucléiques selon a) ou b), ou d) les polypeptides codés par les acides nucléiques selon a) à c).

La molécule cible peut être la séquence complète du gène ou de l'ARN ou de la protéine correspondante, ou un fragment distinctif de celle-ci, c'est-à-dire un fragment dont la séquence est spécifique dudit gène ou ARN, ou de la dite protéine, et/ou comporte un domaine de variabilité (épissage, délétion, polymorphisme, etc.) représentatif de l'événement biologique à détecter.

Le terme « analogue fonctionnel » désigne un analogue provenant d'une autre espèce de mammifère. En effet, les gènes indiqués dans les tableaux 1 et 2 sont des gènes humains, et ces séquences constituent des marqueurs efficaces et adaptés à la détection de la maladie dAlzheimer chez les patients humains. Néanmoins, pour une application des méthodes de l'invention à d'autres espèces de mammifères, il est généralement préférable d'utiliser des analogues fonctionnels de ces séquences, caractérisés dans l'espèce considérée. Ces analogues peuvent être identifiés par toute technique connue de l'homme du métier, notamment en considération des séquences fournies dans la demande et des noms des gènes correspondants.

Dans un mode de réalisation particulier, la méthode comprend la détermination de la présence d'au moins un acide nucléique selon a) à c).

Dans un mode de réalisation tout particulier, la méthode est utilisée pour détecter la maladie d'Alzheimer chez un sujet humain et comprend la détermination de la présence d'au moins un acide nucléique selon a) ou b).

Méthodes de détection d'une altération dans un gène

Comme indiqué précédemment, une altération dans un gène ou ARN désigne au sens de l'invention (i) toute altération de l'expression, à savoir en particulier une dérégulation dans les niveaux d'expression (e.g., de transcription ou de traduction), une dérégulation de l'épissage, conduisant par exemple à l'apparition de formes épissées particulières ou à une modification de la quantité (relative) de ou du rapport entre différentes formes d' épissage,

de même que (ii) toute altération dans la structure de la protéine produite (apparition ou disparition de formes tronquées, allongées, mutées, etc.).

Différentes techniques permettant la détection d'une espèce d'acide nucléique dans un échantillon sont utilisables dans la présente invention, comme par exemple le Northern Blot, l'hybridation sélective, l'utilisation de supports revêtus d'oligonucléotides sondes, l'amplification d'acide nucléique comme par exemple par RT-PCR, PCR quantitative ou ligation-PCR, etc. Ces méthodes peuvent comprendre l'utilisation d'une sonde nucléique (par exemple un oligonucléotide) capable de détecter sélectivement ou spécifiquement l'acide nucléique cible dans l'échantillon. L'amplification peut être réalisée selon différentes méthodes connues en soi de l'homme du métier, telles que la PCR, la LCR, l'amplification médiée par transcription (TMA), l'amplification par déplacement de brin (SDA), NASBA, l'emploi d'oligonucléotides spécifiques d'allèles (ASO), l'amplification spécifique d'allèle, le Southern blot, l'analyse conformationnelle SSCA, l'hybridation in situ (e.g., FISH), la migration sur gel, l'analyse d'hétéroduplexes, etc. Si nécessaire, la quantité d'acide nucléique détectée peut être comparée à une valeur de référence, par exemple une valeur médiane ou moyenne observée chez des patients qui ne sont pas atteints de la maladie d' Alzheimer, ou à une valeur mesurée en parallèle dans un échantillon témoin. Ainsi, il est possible de mettre en évidence une variation de niveaux d'expression.

Selon un mode préféré de mise en oeuvre, la méthode comprend la détection de la présence ou de l'absence ou de la quantité (relative) d'un acide nucléique selon a) à c) par hybridation sélective ou amplification sélective.

L'hybridation sélective est typiquement réalisée en utilisant des sondes nucléiques, de préférence immobilisées sur un support, tel qu'un support solide ou semi-solide présentant au moins une surface, plane ou non, permettant l'immobilisation de sondes nucléiques. De tels supports sont par exemple une lame, bille, membrane, filtre, colonne, plaque, etc. Ils peuvent être réalisés en tout matériau compatible, comme notamment du verre, silice, plastique, fibre, métal, polymère, etc. Les sondes nucléiques peuvent être tout acide

nucléique (ADN, ARN, PNA, etc.), de préférence simple -brin, comprenant une séquence spécifique d'une molécule cible telle que définie en a) à c) ci-dessus. Les sondes comprennent typiquement de 5 à 400 bases, de préférence de 8 à 200, plus préférentiellement moins de 100, et encore plus préférentiellement moins de 75, 60, 50, 40 ou même 30 bases. Les sondes peuvent être des oligonucléotides synthétiques, produits sur la base des séquences de molécules cibles de l'invention selon des techniques de synthèse classique. De tels oligonucléotides comportent typiquement de 10 à 50 bases, de préférence de 20 à 40, par exemple 25 bases environ. Dans un mode particulièrement avantageux, on utilise plusieurs oligonucléotides (ou sondes) différents pour détecter la même molécule cible. Il peut s'agir d' oligonucléotides spécifiques de régions différentes de la même molécule cible, ou centrés différemment sur un même région. On peut également utiliser des couples de sondes, dont un membre est parfaitement apparié à la molécule cible, et un autre présente un mésappariement, permettant ainsi d'estimer le bruit de fond. Les sondes peuvent être conçues pour s'hybrider à une région d'un exon ou d'un intron, ou à une région de jonction de type exon-exon, exon-intron ou intron-intron. Ainsi, les sondes permettent de mettre en évidence et de distinguer différentes formes d'épissage d'un gène.

Les sondes peuvent être synthétisées préalablement puis déposées sur le support, ou synthétisées directement in situ, sur le support, selon des méthodes connues en soi de l'homme du métier. Les sondes peuvent également être fabriquées par des techniques génétiques, par exemple par amplification, recombinaison, ligation, etc.

Les sondes ainsi définies constituent un autre objet de la présente demande, ainsi que leurs utilisations (essentiellement in vitro) pour la détection de la maladie dAlzheimer chez un sujet.

L'hybridation peut être réalisée dans des conditions classiques, connues de l'homme du métier et ajustables par celui-ci (Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989) Molecular Cloning,

CoId Spring Harbor Laboratory Press). En particulier, l'hybridation peut être réalisée dans des conditions de stringence élevée, moyenne ou faible, selon le niveau de sensibilité

recherché, la quantité de matériel disponible, etc. Par exemple, des conditions appropriées d'hybridation incluent une température comprise entre 55 et 63°C pendant 2 à 18 heures. D'autres conditions d'hybridation, adaptées à des supports de haute densité, sont par exemple une température d'hybridation entre 45 et 55°C. Après l'hybridation, différents lavages peuvent être réalisés pour éliminer les molécules non-hybridées, typiquement dans des tampons SSC comprenant du SDS, tels que un tampon comprenant 0,1 à 10 X SSC et 0,5-0,01% SDS. D'autres tampons de lavage contenant du SSPE, du MES, du NaCl ou du EDTA peuvent également être utilisés.

Dans un mode de mise en oeuvre typique, les acides nucléiques (ou les puces ou supports) sont pré -hybrides dans un tampon d'hybridation (Rapid Hybrid Buffer, Amersham) contenant typiquement 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon à 65°C pendant 30 min. Les acides nucléiques de l'échantillon sont ensuite mis en contact avec les sondes (typiquement appliqués sur le support ou la puce) à 65°C pendant 2 à 18 heures. De préférence, les acides nucléiques de l'échantillon sont marqués au préalable, par tout marquage connu (radioactif, enzymatique, fluorescent, luminescent, etc.). Les supports sont ensuite lavés dans un tampon 5X SSC, 0,1% SDS à 65°C pendant 30 min, puis dans un tampon 0.2X SSC, 0,1% SDS. Le profil d'hybridation est analysé selon des techniques classiques, comme par exemple en mesurant le marquage sur le support au moyen d'un instrument adapté (par exemple Instantlmager, Packard Instruments). Les conditions de l'hybridation peuvent naturellement être ajustées par l'homme du métier, par exemple en modifiant la température d'hybridation et/ou la concentration saline du tampon ainsi que par ajout de substances auxiliaires comme le formamide ou de l'ADN simple brin.

Un objet particulier de l'invention réside ainsi dans une méthode pour détecter la présence ou le risque de développer la maladie dAlzheimer chez un mammifère, ou pour évaluer l'efficacité d'un traitement contre la maladie d'Alzheimer, comprenant la mise en contact, dans des conditions permettant une hybridation entre séquences complémentaires, des acides nucléiques issus d'un échantillon de sang du mammifère et d'un ensemble de sondes spécifique des molécules cibles identifiées précédemment pour obtenir un profil

d'hybridation, le profil d'hybridation étant caractéristique de la présence ou du risque de développer la maladie d'Alzheimer chez ce mammifère, ou de l'efficacité du traitement.

L'amplification sélective est de préférence réalisée en utilisant une amorce ou une paire d'amorces permettant l'amplification de tout ou partie d'un des acides nucléiques cibles dans l'échantillon, lorsque celui-ci y est présent. L'amorce peut être spécifique d'une séquence cible telle que définie précédemment, ou d'une région flanquant la séquence cible dans un acide nucléique de l'échantillon. L'amorce comprend typiquement un acide nucléique simple -brin, d'une longueur comprise avantageusement entre 5 et 50 bases, de préférence entre 5 et 30. Une telle amorce constitue un autre objet de la présente demande, ainsi que son utilisation (essentiellement in vitro) pour la détection de la maladie d'Alzheimer chez un sujet. Les amorces peuvent être conçues pour s'hybrider à une région d'un exon ou d'un intron, ou à une région de jonction de type exon-exon, exon-intron ou intron-intron. Ainsi, les amorces permettent de mettre en évidence et de distinguer différentes formes d'épissage d'un gène.

A cet égard, un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'une amorce nucléotidique ou d'un ensemble d'amorces nucléotidiques permettant l'amplification de tout ou partie d'un ou, de préférence plusieurs gènes mentionnés dans les Tableaux 1 et 2, ou des ARNs correspondants, pour détecter la présence ou le risque de développer la maladie d'Alzheimer chez un mammifère, ou pour évaluer l'efficacité d'un traitement contre de la maladie d'Alzheimer chez un mammifère, tout particulièrement chez un être humain.

Détection d'une altération dans un polypeptide

Dans un autre mode de réalisation, la méthode comprend la détermination de la présence ou de la quantité (relative) d'un polypeptide codé par un gène tel que défini précédemment. La mise en évidence ou le dosage d'un polypeptide dans un échantillon peut être réalisée par toute technique connue en soi, comme notamment au moyen d'un ligand spécifique, par

exemple un anticorps ou un fragment ou dérivé d'anticorps. De préférence, le ligand est un anticorps spécifique du polypeptide, ou un fragment d'un tel anticorps (par exemple un Fab, Fab', CDR, etc.), ou un dérivé d'un tel anticorps (par exemple un anticorps simple-chaîne, ScFv). Le ligand est typiquement immobilisé sur un support, tel qu'une lame, bille, colonne, plaque, etc. La présence ou la quantité du polypeptide cible dans l'échantillon peut être détectée par mise en évidence d'un complexe entre la cible et le ligand, par exemple en utilisant un ligand marqué, en utilisant un deuxième ligand de révélation marqué, etc. Des techniques immunologiques utilisables et bien connues sont les techniques ELISA, RIA, etc. Si nécessaire, la quantité de polypeptide détectée peut être comparée à une valeur de référence, par exemple une valeur médiane ou moyenne observée chez des patients qui ne sont pas atteints de la maladie d'Alzheimer, ou à une valeur mesurée en parallèle dans un échantillon témoin. Ainsi, il est possible de mettre en évidence une variation de niveaux d'expression.

Des anticorps spécifiques des polypeptides cibles peuvent être produits par des techniques conventionnelles, notamment par immunisation d'un animal non-humain avec un immunogène comprenant le polypeptide (ou un fragment immunogène de celui-ci), et récupération des anticorps (polyclonaux) ou des cellules productrices (pour produire des monoclonaux). Des techniques de production d'anticorps poly- ou monoclonaux, de fragments ScFv, d'anticorps humains ou humanisés sont décrites par exemple dans Harlow et al, Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988 ; Ward et al, Nature 341 (1989) 544 ; Bird et al, Science 242 (1988) 423 ; WO94/02602 ; US5,223,409 ; US5,877,293 ; WO93/01288. L'immunogène peut être fabriqué par synthèse, ou par expression, dans un hôte approprié, d'un acide nucléique cible tel que défini ci-avant. Un tel anticorps, monoclonal ou polyclonal, ainsi que ses dérivés ayant la même spécificité antigénique, constituent également un objet de la présente demande, de même que leur utilisation pour détecter un cancer.

Des modifications de l'expression et/ou de la structure des protéines peuvent aussi être détectées au moyen des techniques connues en soi de l'homme du métier et impliquant la

spectroscopie de masse, plus généralement regroupées sous le nom d'analyse protéomique, afin de détecter des signatures spécifiques du sang des patients atteints de la maladie d'Alzheimer.

Mise en œuyre du procédé

La méthode de l'invention est applicable à tout échantillon biologique du mammifère testé, en particulier tout échantillon comportant des acides nucléiques ou des polypeptides. On peut citer avantageusement un échantillon de sang, plasma, plaquette, salive, urine, selles, etc., plus généralement tout tissu, organe ou, avantageusement, fluide biologique comportant des acides nucléiques ou des polypeptides.

Dans un mode de mise en œuvre préféré et particulièrement avantageux, l'échantillon est un échantillon dérivé du sang, par exemple un échantillon de sang, de sérum ou de plasma. L'invention découle en effet de l'identification de marqueurs sanguins de la maladie d'Alzheimer, et permet donc une détection de cette pathologie sans biopsie tissulaire, mais uniquement à partir de prélèvements sanguins.

L'échantillon peut être obtenu par toute technique connue en soi, par exemple par prélèvement, par des techniques non invasives, à partir de collections ou banques d'échantillons, etc. L'échantillon peut par ailleurs être pré -traité pour faciliter l'accessibilité des molécules cibles, par exemple par lyse (mécanique, chimique, enzymatique, etc.), purification, centrifugation, séparation, etc. L'échantillon peut également être marqué, pour faciliter la détermination de la présence des molécules cibles (marquage fluorescent, radioactif, luminescent, chimique, enzymatique, etc.).

Dans un mode de mise en œuvre préféré, l'échantillon biologique est un échantillon de sang total, c'est-à-dire n'ayant pas subi d'étape de séparation, qui peut être éventuellement dilué.

De préférence, la méthode comprend la détermination combinée de la présence, absence ou quantité de 5, 10, 20, 30, 40, 50 ou 60 molécules cibles telles que définies ci-dessus.

Un autre objet particulier de la présente demande concerne une méthode pour détecter la présence, l'évolution ou le risque de développer la maladie d'Alzheimer chez un sujet humain, comprenant la mise en contact d'un échantillon biologique du sujet contenant des acides nucléiques avec un produit comprenant un support sur lequel sont immobilisés des acides nucléiques comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'un ou, de préférence, plusieurs gènes ou ARN tels que définis précédemment et la détermination du profil d'hybridation, le profil indiquant la présence, le stade ou le risque de développer la maladie d'Alzheimer chez ledit sujet humain. De préférence, le produit comprend des acides nucléiques distincts comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'au moins 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus gènes ou ARNs différents tels que mentionnés ci- dessus.

Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel sont immobilisés des acides nucléiques comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'un ou, de préférence, plusieurs gènes ou ARN tels que définis précédemment. De préférence, le produit comprend des acides nucléiques distincts comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'au moins 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus gènes ou ARN tels que définis précédemment.

Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel est immobilisé au moins un ligand d'un polypeptide codé par un gène ou un ARN tel que défini ci-dessus. De préférence, le produit comprend au moins 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus ligands de polypeptides différents choisis parmi les polypeptides mentionnés ci- dessus.

Le support peut être tout support solide ou semi-solide présentant au moins une surface, plane ou non (c'est-à-dire en 2 ou 3 dimensions), permettant l'immobilisation d'acides

nucléiques ou de polypeptides. De tels supports sont par exemple une lame, bille, membrane, filtre, colonne, plaque, etc. Ils peuvent être réalisés en tout matériau compatible, comme notamment du verre, silice, plastique, fibre, métal, polymère, polystyrène, téflon, etc. Les réactifs peuvent être immobilisés sur la surface du support par des techniques connues, ou, dans le cas des acides nucléiques, synthétisés directement in situ sur le support. Des techniques d'immobilisation incluent l'adsorption passive (Inouye et al., J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 1469), la liaison covalente. Des techniques sont décrites par exemple dans WO90/03382, WO99/46403. Les réactifs immobilisés sur le support peuvent être ordonnés selon un schéma pré-établi, pour faciliter la détection et l'identification des complexes formés, et selon une densité variable et adaptable.

Dans un mode de mise en oeuvre, le produit de l'invention comprend un pluralité d'oligonucléotides synthétiques, d'une longueur comprise entre 5 et 100 bases, spécifiques d'un ou plusieurs gènes ou ARNs tels que définis précédemment.

Les produits de l'invention comprennent typiquement des molécules contrôle, permettant d'étalonner et/ou normaliser les résultats.

Un autre objet de la présente demande concerne un kit comprenant un compartiment ou conteneur comprenant au moins un, de préférence plusieurs, acides nucléiques comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'un ou plusieurs gènes ou ARNs tels que définis précédemment et/ou un, de préférence plusieurs ligands d'un ou plusieurs polypeptides tels que définis précédemment. De préférence, le produit comprend au moins

5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus acides nucléiques et/ou ligands différents choisis parmi les acides nucléiques et ligands mentionnés ci-dessus. Le kit peut comprendre par ailleurs des réactifs pour une réaction d'hybridation ou immunologique, ainsi que, le cas échéant, des contrôles et/ou instructions.

Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un produit ou kit tel que défini ci- dessus pour la détection de la maladie d'Alzheimer chez un sujet mammifère, de préférence un sujet humain.

D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.

Exemple 1; Identification de marqueurs sériques de la maladie d'Alzheimer liés au rythme circadien

Une analyse génétique a été réalisée à partir d'ARN extraits de sang de patients atteints de la maladie dAlzheimer et présentant différents degrés d'évolution de la maladie, d'une part, et d'ARN préparés à partir de sang d'individus sains contrôles, présentant une moyenne d'âge identique à celle des individus malades, d'autre part.

Les signatures ainsi obtenues ont été analysées par des techniques bioinformatiques et ont permis d'identifier les bases moléculaires de phénomènes dérégulés dans la maladie d'Alzheimer.

Ainsi il a été identifié une signature qui dérive de l'ARNm codant pour BMALl et qui correspond aux nucléotides 128 à 247 de la séquence Genbank AB000816. BMALl code , tout comme le gène CLOCK, un facteur de transcription de la famille « basic helix-loop- helix (bHLH) -PAS domain containing transcription factors ». Les produits de BMALl et de CLOCK forment un complexe transcriptionnel impliqué dans la régulation de l'horloge interne, de la régulation des rythmes circadiens. Par conséquent, la présente invention décrit, pour la première fois une dérégulation du rythme circadien des cellules sanguines chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Le système circadien chez les mammifères implique des oscillateurs centraux et périphériques. Il a été montré une dominance hiérarchique entre le système circadien du système nerveux central et celui des tissus périphériques. Ainsi, le système central assure le synchronisme périphérique. La zone du cerveau qui contrôle cette horloge interne centrale est altérée au cours de la maladie

d'Alzheimer et la présente invention documente pour la première fois une répercussion au niveau des cellules sanguines d'une dérégulation de l'horloge interne. Le Tableau 1 ci- dessous donne une liste de gènes régulés selon le rythme circadien, qui constituent des cibles au sens de la présente invention.

Tableau 1

Exemple 2: Identification de marqueurs sériques de la maladie d'Alzheimer impliqués dans le phénomène de phagocytose

Une analyse DATAS entre des ARN extraits de patients atteints de la maladie d'Alzheimer d'une part et des patients contrôles d'autre part a également permis de montrer une altération de l'épissage de gènes impliqués dans le phénomène de phagocytose. Ce phénomène, régulé par les cascades de signalisation qui contrôlent de stress oxydatif, est représentatif des macrophages et de leur contribution au phénomène d'immunité innée.

Une diminution des propriétés de phagocytose des macrophages a été rapportée chez certains patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Cependant, aucune base moléculaire n'a pu être identifiée pour expliquer ce phénomène.

L'analyse DATAS réalisée par les inventeurs a permis d'identifier des séquences correspondant aux ARN de la L-Plastin et de la Calnexin. Plus particulièrement, la séquence identifiée pour la L-Plastin correspond aux nucléotides 3249-3487 de la séquence Genbank NM 002298 et la séquence identifiée pour la Calnexin correspond aux nucléotides 3764-4007 de la séquence Genbank NMJ)01746. La Calnexin est connue par l'homme de métier pour interagir avec la préséniline 1 (PSl), protéine impliquée dans la maladie d'Alzheimer et dans la production de la plaque bêta amyloïde. La Calnexin interagit également avec le récepteur CD 14 et est impliqué dans le phénomène de phagocytose. La L-Plastin, dans le phénomène de phagocytose est plus particulièrement impliquée dans l'activation du stress oxydatif consécutif à l'internalisation.

Par conséquent, la présente invention fournit pour la première fois des informations sur l'origine moléculaire des défauts de phacocytose que présentent les macrophages de patients atteints de la maladie d'Alzheimer.

Le Tableau 2 ci-dessous donne une liste de gènes impliqués dans les mécanismes de la

phagocytose et du stress oxydatif, qui constituent des cibles au sens de la présente invention.

Tableau 2

L-Plastin - Genbank NM_002298

Calnexin - Genbank NMJ)01746

Homo sapiens CD 14 molécule (CD 14), transcript variant 1, mRNA. ACCESSION NM 000591

Homo sapiens CD 14 molécule (CD 14), transcript variant 2, mRNA. ACCESSION NM_001040021

Homo sapiens toll-like receptor 4 (TLR4), mRNA. ACCESSION NM_138554

Homo sapiens toll-like receptor 2 (TLR2), mRNA. ACCESSION NM_003264 Homo sapiens toll-like receptor 7 (TLR7), mRNA. ACCESSION NM_016562

Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) receptor 4 (CXCR4), transcript variant 2, mRNA. ACCESSION NM_003467

Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) receptor 4 (CXCR4), transcript variant 1 , mRNA. ACCESSION NM_001008540

Homo sapiens interferon, gamma (IFNG), mRNA. ACCESSION NM 000619

Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) ligand 3 (CXCL3), mRNA. ACCESSION NM_002090

Homo sapiens interferon, beta 1, fibroblast (IFNBl), mRNA. ACCESSION NM_002176

Homo sapiens interferon regulatory factor 3 (IRF3), mRNA. ACCESSION NM_001571 Homo sapiens ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (rho family, small GTP binding protein Racl) (RACl), transcript variant Racle, mRNA. ACCESSION NM_198829 Homo sapiens ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (rho family, small GTP binding protein Racl) (RACl), transcript variant Racl, mRNA. ACCESSION NM_006908 Homo sapiens ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (rho family, small GTP binding protein Racl) (RACl), transcript variant Raclb, mRNA. ACCESSION NM_018890 Homo sapiens lipopolysaccharide binding protein (LBP), mRNA. ACCESSION NM_004139

Homo sapiens interleukin 1 receptor-like 1 (ILlRLl), transcript variant 2, mRNA. ACCESSION NM_003856

Homo sapiens interleukin 1 receptor-like 1 (ILlRLl), transcript variant 1 , mRNA. ACCESSION NM_016232

Homo sapiens toll-like receptor 9 (TLR9), transcript variant B, mRNA. ACCESSION NM_138688 Homo sapiens toll-like receptor 9 (TLR9), transcript variant A, mRNA. ACCESSION NM 017442

Homo sapiens NADPH oxidase 4 (NOX4), mRNA. ACCESSION NM_016931 Homo sapiens interleukin 6 (interferon, beta 2) (IL6), mRNA. ACCESSION NM_000600

Homo sapiens macrophage migration inhibitory factor (glycosylation-inhibiting factor) (MIF), mRNA. ACCESSION NM_002415

Homo sapiens ras homolog gène family, member A (RHOA), mRNA. ACCESSION NM_001664 Homo sapiens nuclear factor of kappa light polypeptide gène enhancer in B-cells 1 (plO5) (NFKBl), mRNA. ACCESSION NM_003998

Homo sapiens interleukin 1, beta (ILlB), mRNA. ACCESSION NM_000576

Homo sapiens interferon, alpha 1 (IFNAl), mRNA. ACCESSION NM_024013 Homo sapiens nuclear factor of kappa light polypeptide gène enhancer in B-cells inhibitor, alpha (NFKBIA), mRNA. ACCESSION NM_020529

Homo sapiens interleukin 4 (IL4), transcript variant 2, mRNA. ACCESSION NM_172348

Homo sapiens interleukin 4 (IL4), transcript variant 1, mRNA. ACCESSION NM_000589 Homo sapiens PRotein Associated with Tlr4 (MGC40499), mRNA. ACCESSION NM_152755

Homo sapiens toll-like receptor 3 (TLR3), mRNA. ACCESSION NM_003265

Homo sapiens toll-like receptor 5 (TLR5), mRNA. ACCESSION NM 003268

Homo sapiens interleukin 1 receptor accessory protein-like 1

(ILlRAPLl), mRNA. ACCESSION NM_014271

Homo sapiens toll-like receptor 1 (TLRl), mRNA. ACCESSION NM_003263

Homo sapiens interleukin 1 receptor-like 2 (IL1RL2), mRNA. ACCESSION NM_003854

Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) ligand 10 (CXCLlO), mRNA. ACCESSION NM_001565 Homo sapiens interleukin-1 receptor-associated kinase 1 (IRAKl), transcript variant 3, mRNA. ACCESSION NMJ)01025243

Homo sapiens interleukin-1 receptor-associated kinase 1 (IRAKl), transcript variant 2, mRNA.

ACCESSION NMJ)01025242

Homo sapiens interleukin-1 receptor-associated kinase 1 (IRAKl), transcript variant 1 , mRNA. ACCESSION NM 001569

Homo sapiens toll-like receptor adaptor molécule 2 (TICAM2), mRNA. ACCESSION NM_021649

Homo sapiens toll interacting protein (TOLLIP), mRNA. ACCESSION NMJ) 19009

Homo sapiens toll-like receptor 8 (TLR8), transcript variant 2, mRNA.

ACCESSION NM_138636

Homo sapiens toll-like receptor 8 (TLR8), transcript variant 1, mRNA. ACCESSION NMJ) 16610

Homo sapiens interleukin 1 receptor accessory protein-like 2

(IL1RAPL2), mRNA. ACCESSION NM_017416

Homo sapiens interleukin-1 receptor-associated kinase 4 (IRAK4), mRNA.

ACCESSION NM_016123

Homo sapiens toll-like receptor 6 (TLR6), mRNA. ACCESSION NM_006068

Homo sapiens toll-like receptor 10 (TLRlO), transcript variant 2, mRNA. ACCESSION NM_001017388 Homo sapiens toll-like receptor 10 (TLRlO), transcript variant 1, mRNA. ACCESSION NM_030956

Homo sapiens interleukin-1 receptor-associated kinase 2 (IRAK2), mRNA.

ACCESSION NM_001570

Homo sapiens myeloid differentiation primary response gène (88)

(MYD88), mRNA. ACCESSION NM_002468

Homo sapiens CD55 molécule, decay accelerating factor for complément (Cromer blood group) (CD55), mRNA. ACCESSION NM 000574