DE LA FUENTE MARTINEZ JULIO (ES)
| WO2003022046A1 | 2003-03-20 | |||
| WO1992021234A1 | 1992-12-10 |
| EP1000541A1 | 2000-05-17 |
STOJKOVIC M. ET AL.: "Effects of high concentrations of hyaluronan in culture medium on development and survival rates of fresh and frozen-thawed bovine embryos produced in vitro", REPRODUCTION, vol. 124, no. 1, July 2002 (2002-07-01), pages 141 - 153, XP008091032
| R F. T V T N D T γ A γ T O N F, S
I a .- Procedimiento de preparación de vesículas unilamelares, para la criopreservación y cultivo de células germinales y embriones, especialmente concebidas para la preparación de diluyentes espermáticos y de medios para el cultivo in vitro de embriones de diferentes especies de mamíferos, tanto domésticos como salvajes, incluyendo así mismo a los humanos, caracterizado porque consiste en hacer una presolución de lípidos, preferentemente de origen vegetal, que contengan al menos un 10 % de phosphatidylcholine (PCH), de forma que una cantidad adecuada de lípidos se mezcla con una pequeña cantidad de agua pura calentada, y agitada constantemente, la suspensión así obtenida se mantiene a 50 — 60 0 C durante la siguiente hora y agitada periódicamente, posteriormente se añade hialurona de alto peso molecular a dicha suspensión lipídica hasta alcanzar una concentración final de aproximadamente lmg/ml que se emulsiona mediante sonicación, la suspensión lipídica se bombea entonces e inmediatamente se pasa a través de una membrana de forma que en la suspensión final producida el 70% de las partículas (SVU) en suspensión se encuentran en un rango de 5 a 15 nM.
2 a .- Procedimiento de preparación de vesículas unilamelares, para la criopreservación y cultivo de células germinales y embriones, según reivindicación I a , caracterizado porque la cantidad de lípidos de origen vegetal mezclados con el agua caliente está comprendida entre 4 y 12 mg/ml.
3 a .- Procedimiento de preparación de vesículas unilamelares, para la criopreservación y cultivo de células germinales y embriones, según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el agua de agua pura se calienta hasta los 50 - 60 C, y agitada constantemente durante 30 minutos con un agitador, por ejemplo un agitador magnético.
4 a .- Procedimiento de preparación de vesículas unilamelares, para la criopreservación y cultivo de células germinales y embriones, según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la mezcla de lípidos y agua caliente es agitada durante 2 minutos cada 20 minutos.
5 a .- Procedimiento de preparación de vesículas unilamelares, para la criopreservación y cultivo de células germinales y embriones, según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la hialurona empleada en dicho procedimiento presenta un peso molecular alto comprendido entre 0.3 y 2 mg/ml.
6 a .- Procedimiento de preparación de vesículas unilamelares, para la criopreservación y cultivo de células germinales y embriones, según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el proceso de sonifϊcación se lleva a cabo de la forma siguiente: a 10 segundos por pulso cada 10 segundos con una intensidad de pulsos de 30 unidades durante 5 minutos.
7 a .- Procedimiento de preparación de vesículas unilamelares, para la criopreservación y cultivo de células germinales y embriones, según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la suspensión lipídica se bombea con una válvula homogeneizadora a 20.000 PSI.
8 a .- Procedimiento de preparación de vesículas unilamelares, para la criopreservación y cultivo de células germinales y embriones, según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la membrana a través de la que pasa la suspensión lipídica es preferiblemente de policarbonato de 0.05μ de diámetro. |
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OBJETO DE LA INVENCIóN
La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para la preparación de pequeñas vesículas unilamelares especialmente concebidas para la criopreservación de espermatozoides, o preparación de diluyentes de semen, de diferentes especies de mamíferos y para el cultivo y congelación de los ovocitos embriones producidos in Vitro e in vivo.
El objeto de la invención es, por tanto, proporcionar un nuevo método basado en el uso de las vesículas unilamelares compuestas por moléculas de hialurona (HA) de alto peso molecular (de 5 a 15 nanómetros de tamaño), , y que en suspensión presentan lípidos de baja densidad para la preparación de diluyentes de semen, y para la obtención de los medios de cultivo de embriones de diferentes especies de mamíferos.
Específicamente, esta invención se centra en concreto, como el principal componente de los medios de cultivo y de congelación de las células germinales y los embriones de mamíferos, dentro de la ciencia dedicada a la reproducción animal y a la conservación de recursos zoogenéticos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIóN
Los procedimientos que existen en la actualidad para la
criopreservación de espermas se basa en la utilización de yema de huevo con soluciones tamponadas que contienen crioprotectores permeables (glicerol, DMSO 5 etc.).
Se pueden considerar dos grandes razones por las cuales la yema de huevo de gallina resulta un componente indispensable en los más usados diluyentes de esperma. Primero, la yema de huevo contiene una alta concentración de lípidos de baja densidad (LDL), específicamente, fosfatidilcolina (P-CH) que es el mas frecuente fosfolípido de las membranas celulares de los mamíferos, incluyendo las membranas espermáticas, ovocitarias y embrionarias. Segundo, los lípidos de la yema de huevo de gallina son vesículas muy homogéneas inferiores a 50 nanómetros (nM) en tamaño.
La ineficacia en la incorporación dentro de las membranas biológicas es muy dependiente del tamaño de las vesículas. A menor tamaño de las vesículas, mayor será la incorporación a través de las membranas del esperma, del ovocito y de los embriones.
Las membranas bicapa de los mamíferos están sujetas entre si por fuerzas muy débiles de Van der Valls y cuando las células son retiradas del ambiente in vivo tiene propensión a perder fosfolípidos, especialmente de la capa extema de la membrana, la cual esta principalmente compuesta por fosfatidilcolina y esfingomielina. Esta demostrado que los espermatozoides metabolizan los fosfolípidos endógenos durante el almacenaje in vitro (Scoot and Dawson 1968).
Específicamente la significativa disminución de fosfatidilcolina en particular, ha sido observada durante el cultivo y almacenamiento in vitro del espermatozoide (Douard et al 2000).Una
depresión similar de lípidos sucede durante la manipulación o el cultivo de los embriones de mamíferos (Palasz, observación no publicada). Sin embargo las membranas de los mamíferos pueden modificar y llevarse lípidos exógenos desde el medio de cultivo (Spector and Yorek 1985).
La transferencia de fosfolípidos ha sido usada con éxito para incorporar lípidos exógenos en los espermatozoides humanos (Arienti et al 1997), en bovinos (Streiner and Graham 1997) en porcinos (He et al 2001).
Sin embargo la preparación actual de las vesículas lipídicas no es muy efectiva ya que las vesículas producidas son muy heterogéneas. Los métodos actuales de preparación de diluyentes de espermas con diferentes lípidos de diferentes orígenes producen vesículas de distintos tamaños que pueden oscilar desde 50 a 200 nM, y por tanto no homogéneos.
DESCRIPCIóN DE LA INVENCIóN
El procedimiento para la preparación de vesículas unilamelares para la criopreservación de espermatozoides de especies de mamíferos y cultivo de embriones producidos in vitro e in vivo, que la invención propone, resuelve de forma plenamente satisfactoria la problemática anteriormente expuesta, en los diferentes aspectos comentados.
De forma más concreta, se trata de un sistema que permite el uso de pequeñas vesículas unilamelares compuestas por moléculas de hialurona (HA) de alto peso molecular que llevan en suspensión lípidos de baja densidad para la preparación de los diluyentes de semen y para
los medios de cultivo de embriones de diferentes especies de mamíferos.
La reducción del tamaño de las vesículas unilamelares es posible gracias al uso de una mezcla de hialuronidasa de alto peso molecular, comprendido entre 0,3 y 2 mg/ml, y lípidos de baja densidad
LDL, conteniendo una alta concentración de fosfatidilcolina, PCH, preferiblemente de origen vegetal. De esta forma se obtiene vesículas unilamelares de tamaño muy homogéneo y reducido, comprendido entre 5 y 15 nM. Esto, además, incrementa la eficiencia en la incorporación de los lípidos en las membranas tanto espermáticas como embrionarias, y como consecuencia aumenta la eficiencia de los diluyentes seminales y de los medios de cultivo in vitro de embriones para diferentes especies de mamíferos.
La hialurona (HA) es un polisacárido simple con complejas funciones biológicas. Contrariamente a otros glucosaminoglucanos que son sintetizados por el aparato de Golgi citoplásmico, la HA es sintetizada por la membrana interna de las membranas celulares. Esto muestra que la interacción entre los fosfolípidos y la HA comienza muy tempranamente durante el desarrollo y resulta crucial para el funcionamiento y desarrollo normal de las membranas celulares de los mamíferos. El hecho de que la HA este presente intracelularmente en los momentos claves para la proliferación y migración celular indica que la HA es un componente clave para la regulación intracelular de estos procesos. Además la HA es un antioxidante muy efectivo y si se usa con material de origen biológico como la yema de huevo o la albúmina del suero bovino (BSA) puede prevenir muy eficazmente contra la contaminación por virus de muestras congeladas, así es el caso de la enfermedad de New Castle (transmitida por la yema de huevo) o de otros patógenos que podrían estar presentes en las muestras.
Hay pues una aplicación inmediata para el uso de las pequeñas vesículas compuestas con HA y LDL de alto peso molecular, preferiblemente de origen vegetal, para la preparación de diluyentes espermáticos y de medios para el cultivo in vitro de embriones de diferentes especies de mamíferos, tanto domésticos como salvajes, incluyendo así mismo a los humanos.
Para preparación de la hialurona (HA) y de las vesículas unilamelares de lípidos de baja densidad, en primer lugar se hace una presolución de lípidos de origen vegetal que contengan al menos un 10 % de fosfatidilcolina (PCH), para ello se emplean métodos tradicionales de agitación y mezcla. Una cantidad adecuada de lípidos, como puede ser de
4 a 12 mg/ml, se mezcla con una pequeña cantidad de agua pura calentada hasta los 50 - 60 0 C, y agitada constantemente durante 30 minutos con un agitador, por ejemplo un agitador magnético.
La suspensión así obtenida se mantiene a 50 — 60 0 C durante la siguiente hora y agitada durante 2 minutos cada 20 minutos. La hialurona de alto peso molecular se añade a la suspensión lipídica hasta alcanzar una concentración final de lmg/ml.
La suspensión de lípidos e hialurona se emulsiona mediante sonicación (Sonicator, Sonic and Materials Inc., Danburry Connecticut, USA) de la forma siguiente: a 10 segundos por pulso cada 10 segundos con una intensidad de pulsos de 30 unidades durante 5 minutos. La suspensión lipídica se bombea por una válvula homogeneizadora a 20.000 PSI e inmediatamente se pasa a través de una membrana de policarbonato de 0.05μ de diámetro. En la suspensión final producida el 70% de las partículas (SVU) en suspensión se encuentran en un rango de
5 a l5 nM.
El tamaño y la distribución de las reducidas vesículas unilamelares (SUV) han sido evaluadas mediante sonda fluorescente especifica, Bodipy FL (Molecular Probes, Inc. Eugene OR, USA), y mediante un microscopio confocal.
Los dos componentes de las vesículas, HA y LDL son parte integral y vital de las membranas celulares del espermatozoide y del embrión, resultando necesarias para la función biológica normal de las células que se encuentran en condiciones in vitro ya que originan una reducción rápida de su viabilidad.
La utilización de estas pequeñas vesículas de 5-15 nM compuestas con HA y LDL simplifica mucho la preparación de diluyentes y facilita la incorporación de compuestos a través de las membranas del esperma y de las células embrionarias en los sistemas de cultivo in vitro, lo que supone una importante ventaja.
Además la utilización de las mencionadas vesículas de
HA/LDL en el diluyente de esperma y en el medio de cultivo in vitro de embriones protege a los espermas congelados y a los embriones cultivados contra cualquier tipo de oxigeno reactivo (ROS) que se produce durante el proceso de congelación - descongelación y de cultivo. Los diferentes tipos de oxigeno radiactivo (ROS) son una de la principales razones de la baja supervivencia espermática pos descongelación y de la pobre calidad de los embriones producidos in vitro.
Otra de las ventajas que se derivan del uso de HA y de
vesículas de origen vegetal LDL, es que pueden eliminar el potencial de transmisión de viras y de patógenos. Además su utilización hace posible la congelación de semen de especies salvajes, las cuales no se pueden congelar actualmente.
Las vesículas de HA/LDL de 5-15 nM de tamaño pueden ser utilizadas con cualquiera de los crioprotectores permeables actualmente mas utilizados como son el glicerol, DMSO, etilen glicol, propanodiol, y no permeables como diferentes azucares o aditivos al medio como los antioxidantes (EDTA) que son utilizados actualmente en los diluyentes de semen y en distintos medios de cultivo.
Y, por último, el empleo de vesículas LDL separadas o en conjunto con HA para la manipulación y el cultivo puede mejorar el cultivo in vitro y la viabilidad de los embriones de mamíferos después de la transferencia o la congelación.
EJEMPLOS DE REALIZACIóN DE LA INVENCIóN
Los ejemplos siguientes ilustran las realizaciones preferentes de la presente invención y no pretenden en absoluto limitar el alcance de la misma.
Congelación de semen de toro.
El semen fue colectado mediante vagina artificial de tres toros de carne cruzados. Los eyaculados con un mínimo del 70% de motilidad fueron divididos en tres partes iguales y diluidos a 26° C con cada uno de
los diluyentes a testar:
- Diluyente 1 : (control) 1% de grasa de leche conteniendo fructosa, acido cítrico (ver la formula de los diluyentes) y suplementado con 8% de yema de huevo intacta;
- Diluyente 2: La yema de huevo completa se sustituye a la misma concentración (8%) por yema de huevo rectificada por la centrifugación a 3000 x g durante 1 hora a 5 o C; y
- Diluyente 3: el mismo que el 2 mas 10 mg/ml de fosfolípidos homogeneizados que contienen 0.5% hialurona.
Los eyaculados fueron divididos en tres partes iguales, diluidos a 26° C en cada uno de los diluyentes y adicionados hasta una concentración final del 7% de glicerol. El semen fue aspirado dentro de pajuelas de 0.5ml, pajuelas de plástico, a 20 x 10 6 espermas por pajuela y congelados en vapores durante 10 minutos a 7cm de distancia del nitrógeno líquido (LN 2 ), para posteriormente ser volcados en LN 2 . Las pajuelas fueron descongeladas en un baño maría a 37° C durante 40 segundos.
Cada experimento fue replicado tres veces en diferentes días de colecta. La viabilidad espermática fue medida con ensayos de inseminación artificial. Los resultados se han basado en los diagnósticos de gestación a los 45 días después de la IA.
Tabla 1. Porcentajes de gestación en vacas de carne inseminadas con semen congelado con diluyente Triladyl con glicerol suplementado con yema de huevo rectificada y con lípidos de baja
densidad (LDL) y con hialurona de alto peso molecular (HA).
Diluyentes utilizados
1. Con yema de huevo intacta 2. yema de huevo rectificada 3. LDL + Hyaluronan Toro N de Vacas IA Gestantes % N de Vacas IA Gestantes % N de Vacas IA Gestantes 0 /
A 15 5 (33.3) a 9/20 45.0 b 11/22 50.0 b
B 14 6 (42.8) 8/19 42.1 9/20 45.0 a ' b P < 0.07
Resultados de Ia fecundación in-vitro
Un total de 1318 ovocitos bovinos fueron inseminados utilizando el método estandarizado de fecundación in vitro (FIV) con semen congelado con Triladyl (n = 668) o en un homogeneizado y hialurona de alto peso molecular (L+HA; n = 650). Los presuntos zigotos fueron cultivados en medio SOFaa suplementado con BSA y BLA. La tasa de división fue evaluada 48 horas después de la inseminación y el número de blastocistos desarrollados a los 7 y 8 días de cultivo. Los ovocitos inseminados con semen congelado en L+HA tienen una tasa de división
(61.5%) y de blastocistos excluidos (46.9%) significativamente superior (P<0.05) que los congelados en Triladyl 47.9 y 25.4%, respectivamente. Resultados que se pueden observar en la Tabla 2.
Tabla 2. Tasas de fertilización y división, numero de blastocistos bovinos producidos con semen congelado en 2 diluyentes
diferentes; usados comercialmente Triladyl o en diluyente conteniendo lípidos de baja densidad y con hialurona de alto peso molecular (LDL + HA).
P < 0.05
Congelación seminal de semental equino
En un ensayo ciego con tres sementales con diferentes niveles de fertilidad (alta, media y baja) los espermas fueron congelados en pajuelas de 0.5 mi en tres diluyentes diferentes (en un diseño factorial 3 x 3); A, Diluyente comercial alemán conteniendo yema entera de huevo
(control); B, homogeneizado de lípidos y HA de alto peso molecular como reemplazante de la yema de huevo y C, homogeneizado de lípidos solo y como reemplazante de la yema de huevo. Las dosis seminales fueron congeladas usando el protocolo lento tradicional y fueron descongeladas en baño maría a 39° C durante 40 segundos, evaluando la motilidad posteriormente de la forma estandarizada.
Preparación del semen
Inmediatamente después de la descongelación 0.5 mi de semen se transfirió a la zona inferior de una pipeta Pastear sellada y cubierto con sumo cuidado con 0.4 mi de medio fert-TALP suplementado con : 6mg/ml BSA-V, piruvato sódico (0.25 μM), heparina (5.0 μg/ml),
D-penicilamina (20 μM), hipotaurina (10 μM) y epinefrina (1 μM). " Después de una hora de incubación a 39° C los 3 A superiores del medio fueron aspirados y la concentración fue determinada, por un hemocitómetro, después del swim-up. La concentración de los espermas recuperados fue ajustada a IxIO 4 espermas/ml justo antes de la adición de los ovocitos (120μl por 6 ovocitos o 40μl gotas por cada zona). Los espermas y las zonas fueron incubadas conjuntamente durante 4 h a 39 C.
Hvain ación de los espermas unidos a. Ia zona intacta
Después de la co-incubación los ovocitos fueron transferidos a PBS suplementado con Pluronico F-68 y pipeteados 10 veces con una pipeta de 0.5-0.6 mm de diámetro interno para retirar los espermas pegados. El complejo zona-esperma son fijados con 2.5% de glutaldehido durante 10 minutos y lavados en PBS, teñidos con 10 μg/ml Hoechst 33342 durante 10 minutos y lavados de nuevo con PBS. Los complejos zona-esperma son colocados en portas y cubiertos. Se hace el recuento del total de espermas pegados con un microscopio de fluorescencia Nikon Labophot-2 (x200) equipado con un filtro ultravioleta UV-IA filter.
Tabla 3. Media del numero de espermatozoides de sementales
con alta (Al), media (Me) y baja (Bj) fertilidad congelados en 3 diferentes diluyentes A, B y C unidos a la zona intacta.
P< 0.05
*A-EI diluyente alemán contiene yema de huevo entera (control); B-homogeneizado de lípidos de baja densidad e hyalurona de alto peso molecular (HA + LDL) y C-*lípidos homogenizados solo como sustitutivo de los lípidos de la yema de huevo.
Congelación de semen por Reindeer
Los resultados preliminares de la congelación de semen equino (Reindeer) en diluyente conteniendo 10% de lípidos LDL y 0.5mg/ml de HA de alto peso molecular produjeron un 60% de fecundación frente a un 40% conseguido utilizando un diluyente con yema de huevo.
HOJA DE SUSTITUCIóN (REGLA 26)