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Title:
PROCESS FOR THE BIOLOGICAL ELIMINATION OF NITRATES AND/OR NITRITES USING STRAINS OF KLEBSIELLA OXYTOCA
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/1995/001311
Kind Code:
A1
Abstract:
Two new strains of Klebsiella oxytoca have been isolated, identified as K. oxytoca clone-15 and clone AH1, which are capable of using nitrates and/or nitrites as nitrogen source and, consequently may be used for the biological elimination of nitrates and/or nitrites contained in industrial effluents, waters and grounds contaminated by said substances, through a process which comprises the inoculation of cultures of said strains into said effluents, waters and grounds contaminated of cultures of said strains. The strain K. oxytoca clone-15 is capable of using, both in aerobic and anaerobic conditions, nitrates and/or nitrites present in a concentration up to 100 mM, whereas the strain K. oxytoca clone AH1 is capable of using, in aerobic conditions, nitrates present in a concentration up to 400 mM. The process applies to the elimination of nitrates and/or nitrites contained in industrial effluents, waters and grounds which have been contaminated.

Inventors:
Ramos, Martin
Jos�, Luis Pi�ar Larrubia
Guadalupe, Duque Martin Oliva DE.
Estrella, Haidour
Ali
Application Number:
PCT/ES1994/000069
Publication Date:
January 12, 1995
Filing Date:
July 01, 1994
Export Citation:
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Assignee:
Union, Espa�ola Explosivos DE. S.
Ramos Martin, Jos� Luis Pi�ar Guadalupe Duque Martin De Oliva Estrella Haidour Ali
International Classes:
B09C1/10; C02F3/34; C12P1/04; (IPC1-7): C02F3/34; B09C1/10; C02F3/12; C12N1/20
Domestic Patent References:
1991-10-17
Other References:
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 110, no. 7, 13 Febrero 1989, Columbus, Ohio, US; abstract no. 54294g, WONG,S.H. 'effects of carbon sources on nitrate assimilation of kebsiella species' página 374 ; & MICROBIOS LETT., vol.38, num.150, 1988 páginas 55 - 60
DATABASE WPI Section Ch, Week 8912, Derwent Publications Ltd., London, GB; Class D04, AN 89-091696 & SU,A,1 423 585 (MMAKEEVKA ENG CONS) 15 Septiembre 1988
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Claims:
REIVINDICACIONES
1. Klebsiella oxytoca clón15, depositada en la CECT con el nE de accesión CECT 4460, capaz de utilizar nitratos y/o nitritos como fuente de nitrógeno bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas.
2. Klebsiella oxytoca clon AHÍ, depositada en la CECT con el nB de accesión CECT 4500, capaz de utilizar nitratos y/o nitritos como fuente de nitrógeno y etilenglicol como fuente de carbono bajo condiciones aeróbicas.
3. Procedimiento para la eliminación biológica de nitratos y/o nitritos contenidos en efluentes industriales o en aguas contaminadas con dichos compuestos, caracterizado porque comprende las etapas de: a) neutralizar el efluente o el agua contaminada a tratar; b) añadir los nutrientes necesarios para el funcionamiento óptimo del procedimiento; c) inocular el efluente o el agua contaminada a tratar con un cultivo de alguno de los microorganismos citados en las reivindicaciones 1 ó 2 hasta la desaparición de los nitratos y/o nitritos contenidos en dichos efluente o agua contaminada; y d) retirar dichos microorganismos y verter los efluentes y las aguas depuradas.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque el efluente a tratar es un efluente procedente de una fábrica productora de explosivos o de una fábrica que utilice o produzca nitratos y/o nitritos.
5. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque el efluente o el agua a tratar se neutraliza por adición de un álcali hasta alcanzar un pH comprendido entre 6.0 y 10.5, cuando se utilizan bacterias de la cepa Klebsiella oxytoca clón15.
6. 6 Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque el efluente o el agua a tratar se neutraliza por adición de un álcali hasta alcanzar un pH comprendido entre 6.0 y 8.0, cuando se utilizan bacterias de la cepa Klebsiella oxytoca clon AHÍ.
7. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque los microorganismos retirados, pueden ser reutilizados en un nuevo ciclo de tratamiento de efluentes o de aguas contaminadas.
8. Procedimiento para la eliminación biológica de nitratos y/o nitritos contenidos en suelos superficiales contaminados con dichos compuestos, caracterizado porque comprende las etapas de: a) efectuar una inyección primaria con un cultivo de los microorganismos de las reivindicaciones 1 ó 2 en el suelo a tratar; y b) efectuar inyecciones sucesivas de dichos microorganismos hasta que el suelo quede libre de nitratos y/o nitritos.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque el suelo a tratar se inyecta con dichos microorganismos hasta alcanzar una densidad del orden de 105 microorganismos por cm2 de suelo.
Description:
PROCEDIMIENTO PARA LA ELIMINACIÓN BIOLÓGICA DE NITRATOS Y/O NITRITOS UTILIZANDO CEPAS DE KT.KRHTTCT.T OXYTOCA

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a nuevas cepas de Klebsiella oxytoca adecuadas para su empleo en un procedimiento para la eliminación biológica de nitratos y/o nitritos. En particular, la invención proporciona un procedimiento para la eliminación de nitratos y/o nitritos contenidos en efluentes industriales o urbanos y en suelos, mediante el empleo de cepas de Klebsiella oxγtoca capaces de utilizar dichos compuestos como fuente de nitrógeno, evitando de esta manera la contaminación medioambiental producida por dichos compuestos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La industria en general, y en particular, la industria de explosivos fabrica grandes cantidades de diversos compuestos sustituidos con grupos nitro que se utilizan como explosivos y propelentes. Los efluentes de lavado de plantas de nitración de diversos compuestos contienen altas cantidades de nitratos y niveles detectables de nitritos, que si no se tratan de manera adecuada, constituyen una fuente de contaminación medioambiental por lo que deben ser eliminados ya que los primeros, a concentraciones moderadas, son tóxicos y los segundos, agentes mutagénicos, y, por tanto, agentes sospechosos de inducir cáncer.

Los efluentes de fábricas de explosivos, especialmente de aquéllas productoras de 2,4,6- trinitrotolueno (TNT) , nitroetilenglicol y nitroglicerina, presentan bajos niveles de los nitroorgánicos mencionados y altos niveles de nitratos, amén de un pH ácido (valores entre 1 y 2). Los sistemas actuales de tratamiento de los efluentes

procedentes de plantas de fabricación de explosivos incluyen fundamentalmente la neutralización de las aguas y la dilución al infinito de los mismos con agua. Este tratamiento conlleva un problema de adición continuada de contaminantes a ríos, aguas subterráneas y suelos, por lo que no resulta adecuado.

La microbiología en general y la biotecnología en particular, pueden ofrecer una alternativa biológica a la eliminación de nitratos y nitritos mediante la utilización de los mismos como fuente de N por microorganismos adecuados. Así, en varios estudios se recoge la posibilidad de tratar biológicamente efluentes que contienen nitratos. Entre estos trabajos cabe destacar los siguientes:

Kaplan et al. (International Biodeterioration. 23 : 233-248 , 1987 ) utilizaron microorganismos no definidos lo cual genera problemas de reproducibilidad de tratamiento; - Hensen Christensen y Harremoes {Prog. Wat . Tech . 8: 509-555, 1977 ) revisan el estado de la técnica en plantas de tratamientos con cargas bajas de nitrato; du Toit y Davies (Water Res . 7 : 489-500 , 1973 ) estudian la eliminación de nitratos en flujo continuo con residuos domésticos con baja carga de nitrato;

Hochstein y Tomlinson (Annu . Rev . Microbiol . 42: 231- 261 ) revisan el proceso de desnitrificación desde distintos puntos de vista; y

Ye et al. (Applied Environmental Microbiology 59 : 250-254 , 1993 ) muestran la versatilidad de enzimas implicados en los procesos de desnitrificación.

Sería conveniente, por tanto, disponer de microorganismos capaces de utilizar los nitratos y/o nitritos presentes en los efluentes de las plantas de

fabricación de explosivos, como fuente de N, al objeto de efectuar una eliminación biológica de los mismos, superando los inconvenientes anteriormente citados y evitando de este modo los problemas medioambientales asociados con el vertido incontrolado de dichos efluentes o con su tratamiento inadecuado.

Por consiguiente, un objeto de esta invención lo constituye el aislamiento y caracterización de microorganismos capaces de eliminar nitratos y/o nitritos. Tales microorganismos, pertenecientes a dos cepas de Klebsiella oxytoca. constituyen un objeto adicional de esta invención.

Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un procedimiento para la eliminación biológica de nitratos y/o nitritos contenidos en efluentes industriales, aguas residuales urbanas o suelos, mediante el empleo de los microorganismos proporcionados por esta invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona nuevas cepas de Klebsiella oxytoca capaces de utilizar nitratos y/o nitritos como fuente de nitrógeno, así como un procedimiento para la eliminación biológica de nitratos y/o nitritos contenidos en efluentes industriales, aguas residuales urbanas y suelos, mediante el empleo de las cepas de Klebsiella oxytoca proporcionadas por esta invención.

A modo de resumen, la invención comprende, por una parte, el aislamiento y caracterización de microorganismos capaces de utilizar nitratos y/o nitritos como fuente de N, y por otra, el empleo de los microorganismos aislados para la eliminación de nitratos y/o nitritos presentes en efluentes de plantas industriales, en aguas residuales urbanas y en suelos contaminados con dichos compuestos.

1. Aislamiento y caracterización de microorganismos

capaces de utilizar nitratos y/o nitritos. 1.1 Aislamiento

Para el aislamiento de microorganismos capaces de utilizar nitrato como fuente de N se procedió del siguiente modo. Una muestra de un suelo próximo a una planta generadora de efluentes cargados con nitratos se suspendió en un medio de cultivo mínimo del tipo M8 [el medio M8 es idéntico al medio M9 excepto en que se omite la fuente de nitrógeno (NH 4 C1)]. La composición del medio M9 se describe en Abril et al . , Journal of Bacteriology , Vol . 171 , No. 12, págε . 6782-6790, ( 1989 ) . A dicha suspensión se añadió un volumen del agua efluente de la fábrica, rica en nitratos, y una cantidad adecuada de una fuente de C. Como fuente de C puede utilizarse un azúcar, preferentemente fructosa o glucosa, o un ácido orgánico adecuado, preferentemente ácido acético o succínico, o alcoholes del tipo de la glicerina y el etilenglicol. Posteriormente se incuba la suspensión resultante a temperaturas comprendidas entre 15°C y 42°C, preferentemente entre 25°C y 30°C, con agitación opcional, y, tras una semana de incubación, se siembran diluciones apropiadas en placas de medio sólido selectivo tal como el constituido por M8, agar noble, nitrato potásico (20-100 mM) y una fuente de C. Tras un periodo de incubación comprendido entre 24 h y una semana las colonias aisladas se purifican y su capacidad para crecer a expensas de nitratos y/o nitritos se comprueba en medio liquido. En el Ejemplos 1 se describe el aislamiento de bacterias capaces de utilizar nitrato como fuente de N, en particular, de las dos cepas de Klebsiella oxytoca de esta invención.

1.2 Caracterización de los microorganismos aislados

Siguiendo análisis tipo [Test API 20E, de Biomerieux,

Francia, n B de referencia del catálogo 20.100] se ha podido verificar que los microorganismos aislados capaces

de utilizar nitratos y/o nitritos como fuente de N, eran bacterias pertenecientes al género Klebsiella. Dos de las cepas aisladas más eficientes fueron las denominadas Klebsiella oxytoca clón-15 y Klebsiella oxytoca clon AHÍ, que han sido depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Valencia, España, los días 15 de Junio de 1993 y 10 de Junio de 1994, correspondiéndoles los números de accesión CECT 4460 y CECT 4500, respectivamente. Las bacterias aisladas presentan forma bacilar, y no presentan pigmentación cuando se cultivan en placas de medio mínimo o medio rico en LB ( Maniatis et al . Molecular Cloning, A Labor atory Manual , Cold Spring Harbor Labor atory , NY , 1982) . Una de las cepas aisladas, concretamente, la denominada Klebsiella oxytoca clón-15, en medio mínimo tipo M8 puede utilizar fructosa, glucosa, ácido acético, ácido succínico y glicerol como fuente de C y amoníaco, nitrato y nitrito como fuente de N, en condiciones aeróbicas o anaeróbicas, mientras que la otra cepa aislada, la denominada Klebsiella oxytoca clon AHÍ, puede utilizar nitrato y nitrito como fuente de N y etilenglicol como fuente de C en condiciones aeróbicas.

Las características taxonómicas comunes de las cepas Klebsiella oxytoca clón-15 y Klebsiella oxytoca clon AHÍ son las siguientes:

1. Características morfológicas Forma: Bacilar Movilidad: No móvil Esporas: No forman

Tinción Gram: Negativa

2. Características de cultivo

Cultivo en medio Mac Conkey: Crecimiento Siembra en placas de agar nutritivo: Crecimiento

Siembra en tubo inclinado de agar nutritivo: Crecimiento

3. Características fisiológicas pH: 6.0-10.5 (para K. oxytoca clón-15) 6.0-8.0 (para K. oxytoca clon AHÍ) Temperatura: 15 e C-42 s C Comportamiento frente al 0 2 : ambas son anaeróbicas facultativas, pero la cepa K. oxytoca clon AHÍ sólo utiliza etilenglicol como fuente de C en aerobiosis β-galactosidasa: Positiva Arginina dehidrolasa: Negativa Lisina descarboxilasa: Positiva Ornitina descarboxilasa: Negativa Utilización de citrato: Positiva Producción de H 2 S: Negativa Ureasa: Positiva Triptófano desaminasa: Negativa Producción de indol: Positiva Gelatinasa: Negativa Fermentación/oxidación de azúcares: Glucosa: Positiva Manitol: Positiva Inositol: Positiva

Sorbitol: Positiva Ramnosa: Positiva Sacarosa: Positiva Melibiosa: Positiva Amigdalina: Positiva

Arabinosa: Positiva Citocromo oxidasa: Negativa Producción de N0 2 : Positiva Reducción a gas N 2 : Positiva

La cepa Klebsiella oxytoca clón-15 es capaz de crecer en presencia de altas y bajas cargas de nitratos y/o nitritos. Una característica de esta cepa es el hecho de que es capaz de crecer en presencia de relativamente altas conci traciones de nitratos (hasta 100 mM) , lo que le da un carácter muy particular y constituye una ventaja fundamental para su aplicación en la eliminación de nitratos y/o nitritos presentes en efluentes, aguas residuales y suelos. Por otra parte, la cepa Klebsiella oxytoca clon AHÍ es capaz de crecer en presencia de altas cargas de nitratos, a concentraciones del orden de 225 mM en sistemas estancos, por lo que es muy adecuada para la eliminación de nitratos y/o nitritos presentes en efluentes, aguas residuales y suelos.

Dado que la vía de asimilación del nitrato incluye, entre otras reacciones, la reducción del nitrato a nitrito y amoniaco, se estudió la posibilidad de que las cepas aisladas fueran capaces de asimilar nitritos, observándose que dichas cepas son capaces de utilizar nitritos como fuente de N, en condiciones aeróbicas o anaeróbicas rKlebsiella oxytoca clón-15], tal como se describe en los Ejemplos 2 a 19, como en condiciones aeróbicas [Klebsiella oxytoca clon AHÍ], como se describe en los Ejemplos 20 a 22.

Una vez aisladas y purificadas las colonias de bacterias capaces de utilizar nitratos y/o nitritos como fuente de N, éstas pueden utilizarse para eliminar dichos compuestos presentes en efluentes de plantas industriales, en aguas residuales urbanas y en suelos.

2. Procedimiento de eliminación biológica de nitratos y/o nitritos.

Una primera aplicación de las bacterias de esta invención, lo constituye su empleo en un procedimiento de

eliminación biológica de nitratos y/o nitritos contenidos en un efluente industrial. Dicho procedimiento comprende básicamente las siguientes etapas:

a) neutralización del efluente a tratar; b) suplemento de los nutrientes necesarios para el funcionamiento óptimo del procedimiento; c) inoculación del efluente a tratar con cultivos de microorganismos capaces de utilizar nitratos y/o nitritos hasta la desaparición de los mismos; d) retirada de los microorganismos que pueden ser reutilizados en un nuevo ciclo de tratamiento de efluentes, si se desea; y e) vertido de las aguas depuradas.

Como puede apreciarse, el procedimiento comienza con una etapa de neutralización de los efluentes. Los efluentes susceptibles de ser depurados mediante este procedimiento pueden ser efluentes de cualquier proceso industrial en el que se utilicen o produzcan nitratos y/o nitritos, tales como efluentes procedentes de plantas de fabricación de explosivos. Asimismo también pueden tratarse cualquier tipo de aguas contaminadas con nitratos y/o nitritos.

En general, las aguas de desecho procedentes de las plantas de fabricación de explosivos son aguas acidas que se pueden neutralizar añadiendo cualquier álcali, preferentemente un hidróxido, carbonato o bicarbonato de un metal alcalino o alcalinotérreo, al objeto de qué dichas aguas alcancen un pH comprendido entre 6.0 y 10.5 tras la neutralización. Este intervalo de pH es adecuado cuando la cepa que se utiliza es la denominada Klebsiella oxytoca clón-15, mientras que si se utiliza la cepa Klebsiella oxytoca clon AHÍ, resulta más conveniente

neutralizar el efluente y mantener el pH del mismo en un intervalo comprendido entre 6.0 y 8.0, ya que ese es su intervalo de actuación.

Posteriormente, y tras análisis del efluente neutralizado, se añaden los nutrientes necesarios tales como fosfato o cualquier otro nutriente o micronutriente que sea necesario para el óptimo funcionamiento del proceso. A modo de ejemplo, pueden añadirse cantidades adecuadas de la solución de micronutrientes A9, cuya composición se describe en Abril et al . citado εupra , junto con cantidades apropiadas de Fe, Mg, Co y Mo (del orden de microraolar). En cualquier caso, la elección y cantidad de nutrientes y micronutrientes a añadir será función de la composición del efluente a tratar y de la demanda microbiológica. Adicionalmente se añade una fuente de C de las mencionadas anteriormente, apropiada para la cepa que se va a utilizar en el procedimiento.

A continuación se inoculan los efluentes neutralizados y debidamente suplementados con un cultivo de las bacterias proporcionadas por esta invención (Klebsiella oxytoca clón-15 o Klebsiella oxytoca clon AHÍ). La carga bacteriana puede estar comprendida entre 0.01 y 0.1 unidades de absorbancia a 660 n por i de cultivo, preferentemente, alrededor de 0.03 unidades de absorbancia a 660 nm por mi de cultivo.

La incubación debe realizarse a una temperatura comprendida entre 20° y 30°C con un aporte de hasta 2 litros de aire por litro de cultivo, si el procedimiento se realiza utilizando Klebsiella oxytoca clon AHÍ, mientras que puede no aportarse aire o pueden aportarse hasta 2 litros de aire por litro de cultivo si en el procedimiento se utiliza Klebsiella oxγtoca clón-15. El curso de la incubación se sigue midiendo periódicamente la cantidad de nitrato y nitrito presente en el efluente o agua a depurar, mediante un electrodo especifico de

nitrato (por ejemplo, un electrodo de nitrato del tipo Crison) y mediante un ensayo químico extremadamente sensible para la detección de nitrito (Snell y Snell , Colorimetric Methods of Analysis, Vol . 3 , págε . 804-805, Van Nostrand Co . Inc. , New York, 1949 ) respectivamente, dándose por finalizada esta etapa una vez dejan de detectarse nitratos y/o nitritos y fuente de C.

Posteriormente se retiran las bacterias por floculación o por cualquier otro método que permita, si se desea, su reutilización en un nuevo proceso y se retiran las aguas depuradas que pueden ser libremente vertidas.

Este procedimiento puede realizarse en continuo o en estanco, así como en balsas de grandes dimensiones o en fermentadores. Cuando se realiza en continuo debe regularse adecuadamente el caudal y la composición del efluente de entrada y del de salida, asi como la concentración de cultivo bacteriano y el aporte de nutrientes y micronutrientes necesarios.

Una segunda aplicación de las bacterias de esta invención lo constituye su empleo en un procedimiento para la eliminación biológica de nitratos y/o nitritos en suelos superficiales contaminados con dichos compuestos. Dicho procedimiento comprende las siguientes etapas:

a) inyección primaria de un cultivo de microorganismos capaces de utilizar nitratos y/o nitritos; y b) inyecciones sucesivas de cultivos de los microorganismos antes citados hasta que el suelo quede libre de nitratos y/o nitritos.

La inyección de microorganismos se realiza para alcanzar altas densidades celulares en los suelos, del orden de 10 5 bacterias por cm 2 de suelo, que faciliten la eliminación del contaminante. Si fuese necesario se

añadiría a los suelos fosfatos y una fuente de carbono que facilite su supervivencia.

Finalmente, una tercera aplicación de las bacterias de esta invención lo constituye su empleo en la eliminación de nitratos y/o nitritos contenidos en aguas residuales siguiendo un procedimiento similar al descrito anteriormente para la eliminación de nitratos y/o nitritos contenidos en efluentes industriales.

Las ventajas derivadas de los procedimientos de eliminación biológica de los nitratos y/o nitritos de esta invención, pueden resumirse en:

1) presentan una alta especificidad en la eliminación de nitratos y nitritos;

2) funcionan en un amplio intervalo de concentraciones de nitrato, nitrito o sus mezclas, en particular, funciona a concentraciones de:

0.01 a 100 mM de nitrato y de 0.01 a 50 mM de nitrito o sus mezclas, cuando el procedimiento se efectúa utilizando bacterias de la cepa Klebsiella oxytoca clón-15, o de

0.01 a 225 mM de nitrato en estanco y con suplemento de hasta 400 mM de nitrato en continuo, controlando la velocidad de suministro, cuando el procedimiento se efectúa utilizando bacterias de la cepa Klebsiella oxytoca clon AHÍ; y

3) presentan una alta versatilidad, ya que pueden ser utilizados ¿n situ para eliminar nitratos y/o nitritos contenidos en efluentes de plantas industriales, aguas residuales y suelos.

A continuación se describen unos ejemplos que sirven para ilustrar realizaciones particulares de la presente

invención sin que deban ser tomados en sentido limitativo del alcance de la misma.

EJEMPLO 1 Aislamiento de las bacterias \Klebsiella oxytoca clón-15 y Klebsiella oxytoca clon AHÍ]

Una muestra de 10 g de un suelo de Páramo de Masa (Burgos) se suspendió en un medio de cultivo mínimo del tipo M8, en una relación 1:10 (p/v). Posteriormente se añadió KN0 3 al medio hasta alcanzar una concentración de 20 mM o de 100 mM, y de la suspensión se tomaron 3 alícuotas idénticas a las que se añadieron:

MUESTRA GLICEROL ETILENGLICOL FRUCTOSA (g/1) (g/1) (g/1) I 5

II 5

III 5

Las suspensiones I a III resultantes se incubaron a una temperatura comprendida entre 25°C y 30°C, con agitación opcional, durante una semana. Posteriormente se sembraron diluciones apropiadas de dichas suspensiones en placas de medio sólido selectivo constituido por medio M8, agar noble 1.5% (p/v) y

20 mM KN0 3 + 5 g/1 de glicerol (muestra I) 100 mM KNO3 + 10 g/1 de glicerol (muestra I)

20 mM KNO 3 + 5 g/1 de etilenglicol (muestra II) 100 mM KNO 3 + 5 g/1 de etilenglicol (muestra II) 20 mM KNO 3 + 5 g/1 de fructosa (muestra III) 100 mM KNO 3 + 5 g/1 de fructosa (muestra III)

Tras incubar entre 24 horas y una semana, se purificaron las colonias aisladas y se comprobó su fenotipo cultivándolas en los medios arriba indicados.

Siguiendo los análisis del Kit API 20E (Biomerieux) , las bacterias aisladas fueron clasificadas como Klebsiella oxytoca. Las dos cepas más eficientes fueron las denominadas Klebsiella oxytoca clón-15 y Klebsiella oxytoca clon AHÍ, que presentan las características mencionadas previamente en la descripción. Sendos cultivos de esas cepas, se depositaron los días 15 de Junio de 1993 y 10 de Junio de 1994 en la CECT correspondiéndoles los n B de accesión CECT 4460 y CECT 4500 respectivamente.

EJEMPLO 2 Utilización de nitrato como fuente de N en condiciones aeróbicas 100 mi de medio mínimo M8 se suplementan con: 250 μl de solución de micronutrientes A9; - 6 μg de citrato de hierro;

100 μl de solución de Mg S0 4 1M; 20 mM KN0 3 ; y 1 g de glicerol. El cultivo se inicia añadiendo una cantidad de bacteria (Klebsiella oxytoca clón-15) tal que se alcanza una turbidez inicial a 660 nm de 0.03 unidades y se incuba a 30°C con agitación (150 rpm en un incubador orbital) y aerobiosis. Tras 24 horas de incubación la turbidez del cultivo a 660 nm está comprendida entre 1 y 2 unidades y la concentración de nitrato en el medio de cultivo es indetectable mediante análisis selectivo con un electrodo de nitrato de sobrenadante. Es igualmente indetectable la concentración de fuente de C.

EJEMPLO 3 Utilización de nitrato como fuente de N en condiciones aeróbicas

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 2, pero utilizando nitrato potásico en una concentración de 100 mM. El nitrato desapareció completamente en un plazo de 48 horas.

EJEMPLO 4 Utilización de nitrato como fuente de N en condiciones aeróbicas

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 2, pero utilizando agua de una factoría de manera que la concentración final en HN0 3 fuera de 25-30 mM. El nitrato desapareció completamente en un plazo de 24 horas.

EJEMPLO 5 Utilización de nitrato como fuente de N en condiciones aeróbicas Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 2, pero utilizando agua de una factoría de manera que la concentración en HN0 3 fuera de 75-100 mM. El nitrato desapareció completamente en un plazo de 48 h.

EJEMPLO 6 Utilización de nitrato como fuente de N en condiciones aeróbicas, en continuo

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 2, pero utilizando un sistema de adición en continuo de nitrato. El fermentador contenía 110 mi de medio y la turbidez del cultivo era del orden de 3 unidades a 660 mm. Agua de una factoría diluida para suministrar de 25 a 30 mM de HN0 3 se añadía a un flujo de 1-20 ml/h. El volumen de aire era de 0.5 volúmenes/min. El nitrato en el medio que rebosaba era indetectable.

EJEMPLO 7 Utilización de nitrato como fuente de N

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 4, pero se utilizaron 2 litros de medio de cultivo y la incubación se realizó en un fermentador. Las condiciones de operación fueron las siguientes: pH: 6.5-8.0

Temperatura: 25°C-35°C. Agitación: 400-800 rpm Aire: 0.5 volúmenes/minuto. El nitrato desapareció tras 24-30 h de cultivo.

EJEMPLO 8 Utilización de nitrato como fuente de N en anaerobiosis

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 2, pero utilizando condiciones anaeróbicas. El nitrato desapareció completamente en un plazo de 24 horas.

EJEMPLO 9 Utilización de nitrato como fuente de N en condiciones anaeróbicas

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 8, pero utilizando nitrato potásico a una concentración de 100 mM. El nitrato desapareció completamente en un plazo de 48 horas.

EJEMPLO 10 Utilización de nitrato como fuente de N en condiciones anaeróbicas

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 8, pero utilizando agua de una factoría hasta alcanzar una concentración en HN0 3 de 25-30 mM. El nitrato desapareció completamente en un plazo de 24 horas.

EJEMPLO 11 Utilización de nitrato como fuente de N en condiciones anaeróbicas Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 8, pero utilizando agua de una factoría hasta alcanzar una concentración en HN0 3 de 75-100 mM. El nitrato desapareció completamente en un plazo de 48 horas.

EJEMPLO 12 Utilización de nitrato como fuente de N en condiciones anaeróbicas, en continuo Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 6 excepto que no se burbujeaba aire. El fermentador contenia 110 mi de medio y la turbidez del cultivo era del orden de 1 unidad a 66? mm. Agua diluida de una factoría que contenía una concentración de 25 a 30 mM en HN0 3 se añadía a un flujo de 1-20 ml/h. El nitrato en el medio que

rebosaba era indetectable.

EJEMPLO 13 Utilización de nitrato como fuente de N

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 4, pero se utilizaron 2 litros de medio de cultivo y la incubación se realizó en un fermentador. Las condiciones de operación fueron las siguientes: pH: 6.5-8.0

Temperatura : 25°C-35°C . Agitación : 400-800 rpm

Sin Aire .

El nitrato desapareció tras 24-30 horas de cultivo.

EJEMPLO 14 Tratamiento de un efluente real Un efluente procedente de una fábrica de explosivos presentaba las siguientes características:

- Composición:

Nitratos: 200 mg/ml Sulfatos: 1000 mg/ml - pH: 2.0

Un volumen de 1 litro de dicho efluente se neutralizó con NaOH hasta alcanzar un pH de 7.0. 100 mi de este efluente se llevaron hasta 1 litro con agua destilada y se añadieron los nutrientes y micronutrientes del medio M8, utilizándose una fuente apropiada de C tal como las mencionadas en el Ejemplo 1.

Posteriormente se inoculó un cultivo de las bacterias de la cepa Klebsiella oxytoca clón-15, con una turbidez inicial de 0.05 a 660 nm. Las condiciones de la incubación fueron las siguientes:

- agitación: 600 rpm en un incubador orbital

- temperatura: 25°C

- tiempo: 24 h

La evolución de la incubación se siguió midiendo periódicamente el contenido de nitrato mediante un

electrodo selectivo, comprobándose que al cabo de 24 horas había desaparecido completamente el nitrato.

EJEMPLO 15 Utilización de nitrito como fuente de N en condiciones aeróbicas

100 mi de medio mínimo M8 estéril se suplementan con: 250 μl de solución de micronutrientes A9; 6 μg de citrato de hierro; 100 μl de solución de Mg S0 4 1M; 2 mM NaN0 2

1 g de glicerol

El cultivo se inicia añadiendo una cantidad de bacteria (Klebsiella oxytoca clón-15) tal que se alcanza una turbidez inicial a 660 nm de 0.03 unidades y se incuba a 30°C con agitación (150 rpm en un incubador orbital) y aerobiosis. Tras 24 h de incubación la turbidez del cultivo a 660 nm está comprendida entre 0.5 y 1 unidad y la concentración de nitrito en el medio de cultivo es indetectable mediante análisis químico de sobrenadantes. Es igualmente indetectable la concentración de fuente de

Carbono.

EJEMPLO 16 Utilización de nitrito como fuente de N en condiciones aeróbicas Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 15, pero utilizando una concetración de 10 mM de nitrito sódico. El nitrito desapareció completamente en un plazo de 48 horas.

EJEMPLO 17 Utilización de nitrito como fuente de N en condiciones aeróbicas

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 15, pero se utilizaron 2 litros de medio de cultivo y la incubación se realizó en un fermentador. Las condiciones de operación fueron las siguientes:

pH : 6 . 5-8 . 0

Temperatura: 25°C-35°C. Agitación: 400-800 rpm Aire: 0.5 volúmenes/minuto. El nitrito desapareció tras 24-30 horas de cultivo.

EJEMPLO 18 Utilización de nitrito como fuente de N en anaerobiosis

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 15, pero utilizando condiciones anaeróbicas. El nitrito desapareció completamente en un plazo de 24 horas.

EJEMPLO 19 Utilización de nitrito como fuente de N en condiciones anaeróbicas

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 18, pero utilizando una concentración de 10 mM en nitrito sódico. El nitrito desapareció completamente en un plazo de 48 horas.

EJEMPLO 20 Utilización de nitrato como fuente de N en condiciones aeróbicas 100 mi de medio mínimo M8 se suplementan con: 250 μl de solución de micronutrientes A9; 6 μg de citrato de hierro;

100 μl de solución de Mg S0 4 1M; 20 mM KN0 3 ; y 1.0 g de etilenglicol. El cultivo se inicia añadiendo una cantidad de bacteria (Klebsiella oxytoca clon AHÍ) tal que se alcanza una turbidez inicial a 660 nm de 0.03 unidades y se incuba a 30°C con agitación (150 rpm en un incubador orbital) y aerobiosis. Tras 48 horas de incubación la turbidez del cultivo a 660 nm está comprendida entre 5 y 15 unidades y la concentración de nitrato en el medio de cultivo es

indetectable mediante análisis selectivo con un electrodo de nitrato de sobrenadante. Es igualmente indetectable la concentración de fuente de C.

EJEMPLO 21 Utilización de nitrato como fuente de N en condiciones aeróbicas

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 20, pero utilizando nitrato potásico en una concentración de 225 mM. El nitrato desapareció completamente en un plazo de 48 horas.

EJEMPLO 22 Utilización de nitrato como fuente de N en condiciones aeróbicas, en continuo

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 20, pero utilizando un sistema de adición en continuo de nitrato. El fermentador contenía 110 mi de medio y la turbidez del cultivo era del orden de 3 unidades a 660 mm. Agua sin diluir de una factoría suministraba de 200 a 400 roM de HN0 3 y se añadía a un flujo de 1-5 ml/h. El volumen de aire era de 0.5 volúmenes/min. El nitrato en el medio que rebosaba era indetectable.

Descrito el objetivo de la presente invención se declara que lo que constituye la esencialidad de la misma es lo que se declara en las siguientes: