Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von 2-Phenylethanolen aus pflanzlichen Quellen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biokatalytischen Synthese von 2-Phenylethanolen, insbesondere 3-Hydroxytyrosol, einen Ganzzellkatalysator, insbesondere einem rekombinanten Mikroorganismus, und dessen Verwendung zur biokatalytischen Synthese eines 2- Phenylethanols durch die biokatalytische Umsetzung aus pflanzlichen Ausgangsstoffen wie Zimtsäuren, insbesondere Kaffeesäure.

3-Hydroxytyrosol gilt als eines der stärksten bekannten Antioxidationsmittel und hemmt durch freie Radikale ausgelöste Prozesse der Zellalterung und -entartung. Durch seinen antioxidativen Effekt wirkt es Krankheiten wie Krebs, Arteriosklerose oder Alzheimer vorbeugend entgegen (Hu et al. 2014). Weiterhin sind positive Wirkungen auf Volkserkrankungen wie Diabetes, auf das Herz-Kreislaufsystem, das Nervensystem und den Magen-Darm-Trakt belegt. In wissenschaftlichen Untersuchungen konnte zudem eine stark antimikrobielle Wirkung gegen verschiedene pathogene Bakterienarten nachgewiesen werden (Tafesh et al. 2011). Auch antivirale Eigenschaften, u.a. gegen HIV, sind nachgewiesen (Bedoya et al. 2016).

In der Natur kommt 3-Hydroxytyrosol in einigen Pflanzen vor, insbesondere in Oliven und Bestandteilen des Olivenbaums, allerdings mit einem geringen Gehalt. Zur Gewinnung von 3- Hydroxytyrosol existieren daher neben der extraktiven Gewinnung biotechnologische und chemische Verfahren.

Im Rahmen der extraktiven Gewinnung aus Olivenöl wird 3-Hydroxytyrosol in der wässrigen Flüssigkeit, die beim Pressen der Oliven entsteht und als Vegetationswasser bezeichnet wird, erhalten. Nachteilig ist dabei die aufwendige Produktaufbereitung zur Isolierung des reinen 3- Hydroxytyrosols aus dem komplexen Stoffgemisch mit strukturell ähnlichen Verbindungen. Fernandez-Bolanos et al. beschreiben den Einsatz großer Mengen an organischen Lösungsmitteln zur Isolierung von 3-Hydroxytyrosol aus Vegetationswasser (Fernandez-Bolanos et al. 2002).

Alternativ wird anstelle einer komplexen Aufreinigung direkt das Vegetationswasser in der Weiterverarbeitung eingesetzt. Allerdings ist hierbei eine gleichbleibende Produktqualität schwierig, da es sich bei Vegetationswasser um eine komplex zusammengesetzte Lösung handelt. Neben vielen anderen Komponenten ist 3-Hydroxytyrosol mit - je nach Charge - schwankender Konzentration enthalten. Folglich unterscheiden sich die daraus hergestellten Produkte hinsichtlich ihrer Inhaltstoffe, selbst wenn immer ein gleicher Gehalt an 3- Hydroxytyrosol eingestellt wird (Bellumori et al. 2019). Dieses Problem kann nur durch die Verwendung aufgereinigten 3-Hydroxytyrosols vermieden werden. Ein weiterer Nachteil der extraktiven Gewinnung unter Nutzung von Oliven besteht in der Abhängigkeit von den Erntezyklen.

Viele biotechnologische Verfahren setzten auf die Umsetzung des Ausgangsstoffes Tyrosol. US 2010/0047887 A 1 bzw. US 2010/0068775 A1 offenbaren ein Verfahren bzw. einen Mikroorganismus zur Umsetzung von Tyrosol mittels Hydroxylasen zu 3-Hydroxytyrosol, bevorzugt in Gegenwart von Vitamin C (Ascorbinsäure) und Gluthation. US 2010/0047887 A1 beschreibt Produktmengen bis 8 mM in 16 h. Mit einer Zellkonzentration mit einer ODeoo im Bereich von 21 bis 60 werden 3-Hydroxytyrosol-Konzentrationen im Bereich von 1 ,6 bis 1 ,8 g/l in wenigen Stunden erreicht, was Ausbeuten im Bereich von 58 bis 65 % entspricht. US 2010/0068775 A 1 beschreibt Umsätze mit bis zu 7,8 mM 3-Hydroxytyrosol in 18 h bzw. Ausbeuten von bis zu 91 %. Nachteilig wird dabei teures Tyrosol als Ausgangsstoff verwendet. US 2010/0047887 A 1 bzw. US 2010/0068775 A 1 beschreiben zudem die Verwendung teurer Cosubstrate, wie Vitamin C oder Gluthation.

CN 107201331 A und CN 107586794 A beschreiben die Verwendung von preisgünstigerer Glukose, welche zunächst durch den Shikimat-Metabolismus in der Bakterienzelle in 4- Hydroxyphenylpyruvat umgewandelt, über 4-Hydroxyphenylacetaldehyd in Tyrosol umgesetzt und schließlich zu 3-Hydroxytyrosol hydroxyl iert wird. Nachteilig weisen die Verfahren ausgehend von Glukose niedrige 3-Hydroxytyrosolmengen auf, insbesondere offenbart CN 107586794 A eine Produktmenge von 0,65 g/l nach 48 h. CN 107201331 A beschreibt Umsätze bis 0,4 g/l. WO 2012/135389 A2 offenbart die Gewinnung von 0,08 mM 3-Hydroxytyrosol bei der Verwendung von Glukose (siehe WO 2012/135389 A2 Fig. 7).

Andere Verfahren nutzen die Verbindungen Dopamin oder L-3,4-Dihydroxyphenylalanin, welche jeweils entweder direkt als Substrat dienen oder zellintern aus Tyrosin bzw. aus Glukose, welche zuvor in den Zellen in Tyrosin umgewandelt wird, gewonnen werden. CN 109295113 A, WO 2012/135389 A2 und WO 2017/223569 A1 beschreiben die Verwendung einer Decarboxylase bzw. einer Aminosäuretransferase und einer Dehydrogenase; einer Monoaminoxidase und einer Alkoholdehydrogenase zur Synthese von 3-Hydroxytyrosol aus L- 3,4-Dihydroxyphenylalanin. WO 2012/135389 A2 offenbart dabei Produktmengen im Bereich von 0,47 bis 0,74 mM bei direkter Verwendung der Intermediate L-3,4-Dihydroxyphenylalanin oder Dopamin als Substrat. Nachteilig wird dabei aber auf teure Ausgangsstoffe zurückgegriffen. Shanker et al. offenbaren die Umwandlung von Ferulasäure zu Acetovanillon (Apocynin) unter Verwendung von Rhizopus oryzae-Zellen, wobei Acetovanillon als Hauptmetabolit, Dihydroferulasäure, Coniferylalkohol und Dihydroconiferylalkohol als Nebenprodukte und Vanillin, Vanillylalkohol, Vanillinsäure und Phenylethylalkohol als Spurenprodukte (<1-3%) gebildet wurden (Shanker et al. 2007).

Mabinya et al. offenbaren die Biokonversion von Ferulasäure und 4-Vinylguaiacol durch einen Weißfäulepilz, isoliert aus verrottendem Holz, wobei 4-Vinylguaiacol weiter zu Acetovanillon umgewandelt wird (Mabinya et al. 2010). Weiterhin beschreiben Mabinya et al. die Bildung von Vanillin und Vanillinsäure, sowie als 2-Phenylethanol, 4-Ethyl-2-methoxyphenol, 1-(2,3- Dihydroxy-4-methoxy-6-methylphenyl)-ethanon, 4,5-Dimethoxy-2-methylphenol und Vanillinsäureethylester als Nebenprodukte.

Zhou et al. beschreiben eine enantioselektive Ein-Topf-Synthese von D-Phenylglycinen aus racemischen Mandelsäuren, Styrolen oder biobasiertem L-Phenylalanin über eine Kaskaden- Biokatalyse unter Verwendung eines rekombinanten Escherichia coli LZ110, welcher vier Enzyme koexprimiert (Zhou et al. 2017). Weiterhin beschreiben Zhou et al. die Verwendung von E. coli LZ116, welcher sieben Enzyme exprimiert, zur Umwandlung von Styrol zu enantiomerenreinem D-Phenylglycin, und die Verwendung von E. coli LZ143, welcher neun Enzyme exprimiert, zur Umwandlung von L-Phenylalanin zu enantiomerenreinem D- Phenylglycin.

Eine mögliche Alternative bieten chemische Verfahren. Das wichtigste chemische Verfahren, welches von der Wacker Chemie AG entwickelt wurde (US 8 822 738 B1), erlaubt die rein chemische Gewinnung von 3-Hydroxytyrosol aus 3,4-Dimethoxyphenylethanol mit Hilfe von Aluminium-basierten Katalysatoren, insbesondere Triisobutylaluminium oder Diisobutylaluminiumhydrid. Die Aufarbeitung erfolgt mittels einer wässrigen Lösung einer Hydroxycarboxylsäure und Extraktion mittels organischer Lösungsmittel.

EP 2 114 846 B1 bzw. CN 101641316 A beschreibt die Herstellung von 3-Hydroxytyrosol aus 4- Chloracetylcatechol mittels Metallformiat und Ameisensäure in einer wässrigen Lösung und katalytischer Hydrierung mittels Edelmetallkatalysator, bevorzugt Palladium (Pd) oder Ruthenium (Ru), insbesondere Pd/C oder Ru/C, in einem organischen Lösungsmittel, insbesondere einem flüssigen Alkylester. Bekannt ist zudem ein fünfstufiges Verfahren ausgehend von 3,4-Dihydroxybenzen (CN 103664536 A). CN 103664536 A beschreibt den Schutz der zwei Phenolgruppen durch die Synthese von 1 ,2-Methylendioxybenzen mittels Dichlormethan, eine Friedel-Crafts-Reaktion zur Herstellung von 3,4-Methylendioxyacetophenon, eine Wolff-Kishner-Huangminglong-Reduktion zur Herstellung von 3,4-Methylendioxyphenylessigsäure, eine Reduktion zur Herstellung von 3,4- Methylendioxyphenylethanol und eine Entfernung der Schutzgruppe mittels Bortribromid oder Pd/C.

Nachteilig werden bei chemischen Verfahren neben teuren Katalysatoren, wie Palladium, teure Ausgangsstoffe, wie 3,4-Dimethoxyphenylethanol, benötigt. Weiterhin ist die Verwendung von petrochemischen Ausgangsstoffen nicht nachhaltig.

Daher besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren zur Synthese von Verbindungen nach Formel (V) bereitzustellen, welches die Nachteile des Standes der Technik überwindet, insbesondere ein günstigeres, biotechnologisches Verfahren zur Synthese von Verbindungen nach Formel (V) bereitzustellen, wobei erhöhte Produktmengen erhalten werden.

Ferner ist es Aufgabe der Erfindung, einen Ganzzellkatalysator zur biokatalytischen Synthese einer Verbindung nach Formel (V) bereitzustellen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch das erfindungsgemäße Verfahren zur biokatalytischen Synthese einer Verbindung nach Formel (V) durch die biokatalytische Umsetzung eines Stoffes umfassend mindestens eine Verbindung nach

Formel (I)

wobei R ¹ -H oder -OH ist, wobei R ² -H, -OH oder -OCH3 ist, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellen mindestens eines Ganzzellkatalysators umfassend i. ein Gen kodierend für ein Enzym Phenolsäure-Decarboxylase und ii. mindestens ein Gen kodierend für ein Enzym umfassend eine Oxygenase- Untereinheit und/oder eine Reduktase-Untereinheit, bevorzugt einer Styrol- Monooxygenase oder Indol-Monooxygenase, und iii. ein Gen kodierend für ein Enzym Styroloxid-Isomerase, und iv. ein Gen kodierend für ein Enzym Alkoholdehydrogenase, und mindestens einen Promotor zur regulierbaren Expression der Gene i) bis iv), in einem wässrigen Medium, b) Aktivierung des Ganzzellkatalysators mit einem Induktor, wobei der Induktor zur Expression der Gene i) bis iv) führt, und c) Kontaktieren des Ganzzellkatalysators mit einem Stoff umfassend mindestens eine Verbindung nach Formel (I), wobei die mindestens eine Verbindung nach Formel (I) mit den in (a) definierten Enzymen zu einer Verbindung nach Formel (V) umgesetzt wird.

Erfindungsgemäß erfolgt keine signifikante weitere Verstoffwechselung der Verbindung nach Formel (V), d. h. keine signifikante weitere Umsetzung der Verbindung nach Formel (V) durch den Ganzzellkatalysator. Der Fachmann kann bei der Auswahl des Ganzzellkatalysators durch Einsicht in entsprechende Datenbanken (u. a. KEGG PATHWAY Database) oder durch einfache Vorversuche evaluieren, ob potenziell störende Stoffwechselwege in der Zelle vorhanden sind, beispielweise störende Gene im Tyrosin-Stoffwechsel (insbesondere Homoprotocatechuat- Abbau) oder im Phenylalanin-Stoffwechsel (ringöffnende Mechanismen bei dihydroxylierten aromatischen Strukturen). Im Falle von potenziell störenden Stoffwechselwegen sind Möglichkeiten der Inaktivierung solcher störenden Stoffwechselwege mittels gentechnischer Methoden (Negativmutante) oder über eine gezielte Kulturführung (z. B. substratvermittelte Inhibierung durch Glukose oder Verzicht auf Medienkomponenten, welche potenziell auf solche störenden Stoffwechselwege induzierend wirken) dem Fachmann bekannt oder ableitbar. Vorteilhaft erfolgt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kein Substituentenwechsel am Benzolring.

In Ausführungsformen erfolgt das erfindungsgemäße Verfahren mit der Reihenfolge der Schritte a), b) und c), wobei die Schritte b) und c) gleichzeitig oder Schritt c) nach Schritt b) erfolgt. Bevorzugt erfolgt das erfindungsgemäße Verfahren mit der Reihenfolge der Schritte a), b) und c), wobei die Schritte b) und c) gleichzeitig erfolgen.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, dass durch die Verwendung von Ganzzellkatalysatoren, welche eine Phenolsäure-Decarboxylase, eine Monooxygenase umfassend eine Oxygenase-Untereinheit und/oder eine Reduktase-Untereinheit, eine Styroloxid- Isomerase und eine Alkoholdehydrogenase exprimieren, alle Enzyme simultan für die biokatalytische Synthese von 2-Phenylethanolen, bevorzugt von 3-Hydroxytyrosol, vorliegen. Vorteilhaft ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine nachhaltige Gewinnung von Verbindungen nach Formel (V) bzw. von 2-Phenylethanolen, insbesondere von 3-Hydroxytyrosol, möglich. Weiterhin vorteilhaft wurden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Ausbeuten von mindestens 95 % erreicht.

Bevorzugt ist die Verbindung nach Formel (I) eine trans-Verbindung.

In Ausführungsformen ist mindestens ein Rest ausgewählt aus Ri und R2 eine Hydroxygruppe.

In Ausführungsformen ist die Verbindung nach Formel (I) aus Kaffeesäure (3-(3,4-Dihydroxy- phenyl)propensäure), Zimtsäure (3-Phenylpropensäure), 3-Hydroxyzimtsäure, p-Cumarsäure (4- Hydroxyzimtsäure), 3-Methoxyzimtsäure und Ferulasäure (4-Hydroxy-3-methoxyzimtsäure) ausgewählt. Bevorzugt ist die Verbindung nach Formel (I) Kaffeesäure.

In Ausführungsformen ist die Verbindung nach Formel (V) aus 3-Hydroxytyrosol (2-(3,4- Dihydroxyphenyl)ethanol), 2-(3-Hydroxyphenyl)ethanol, 2-(4-Hydroxyphenyl)ethanol, 2-(3- Methoxyphenyl)ethanol und 2-(4-Hydroxy-3-methoxy-phenyl)ethanol (Homovanillylalkohol) ausgewählt. Bevorzugt ist die Verbindung nach Formel (V) 3-Hydroxytyrosol.

In Ausführungsformen sind Ri und R2 jeweils eine Hydroxygruppe.

Unter dem Begriff „Ganzzellkatalysator“ wird eine katalytisch aktive Zelle verstanden. In Ausführungsformen ist der Ganzzellkatalysator ein authentischer Mikroorganismus (d. h. natürlicher bzw. unveränderter Mikroorganismus) oder ein genetisch veränderter Mikroorganismus.

Unter einem „genetisch veränderten Mikroorganismus“ wird ein Mikroorganismus mit mindestens einer Mutation, Deletion oder Substitution im Genom oder ein Mikroorganismus, in welchem über zusätzlich eingebrachte Vektoren weitere Gene bereitgestellt wärden, verstanden. Auch die Kombination aus künstlichen Veränderungen im Genom und durch Einbringung mittels Vektoren ist hier umfasst.

In Ausführungsformen ist der genetisch veränderte Mikroorganismus eine Knockout-Mutante oder eine Deletionsmutante eines authentischen Mikroorganismus (d. h. ein authentischer Mikroorganismus mit mindestens einem Gen-Knock-Out zur Inaktivierung eines bestimmten Gens) (Negativmutante) und/oder eine Insertionsmutante. Unter dem Begriff „Insertionsmutation“ wird die Einbringung von mindestens einem Gen durch Genom-Insertion oder durch Einbringung von Expressionsvektoren verstanden.

In bevorzugten Ausführungsformen ist der Ganzzellkatalysatoreine rekombinante Bakterienzelle.

In Ausführungsformen ist die Bakterienzelle aus Escherichia, Arthrobacter, Bacillus, Rhodococcus, Pseudomonas, Sphingobium, Sphingopyxis, Corynebacterium, Marinobacterium, Variovorax und Gordonia ausgewählt, bevorzugt aus Escherichia coli, Rhodococcus opacus 1 CP, Rhodococcus species ST-5, Pseudomonas fluorescens ST, Corynebacterium species AC-5, Pseudomonas putida CA-3, Pseudomonas putida 312 und Variovorax paradoxus EPS.

In bevorzugten Ausführungsformen ist die Bakterienzelle Escherichia coli, insbesondere ein Derivat von Stamm BL21 oder Stamm B.

In bevorzugten Ausführungsformen ist der Ganzzellkatalysator Escherichia coli mit Insertionsmutation.

Die Nukleotidsequenzen der Gene i.) bis iv.) umfassen dabei authentische und/oder artifizielle Leserahmen. Bevorzugt ist ein artifizieller Leserahmen über eine Gensynthese an das ’’Codon Usage" des Wirtsorganismus angepasst.

Prinzipiell können geeignete Gene i.) bis iv.) durch an sich bekannte Methoden, wie beispielsweise durch Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) mit Hilfe von kurzen, synthetischen Nukleotidsequenzen (Primern) ausgehend von der DNA denkbarer Spenderorganismen, amplifiziert und anschließend isoliert werden. Die Herstellung der verwendeten Primer erfolgt im Allgemeinen anhand bekannter Gensequenzen aufgrund bestehender Homologien zu den Genen i.) bis iv.). Alternativ können die Gene auch mittels Gensynthese konstruiert werden, was zusätzliche Anpassungen der Gene erlaubt. Idealerweise weist der Vektor für die Klonierung eines amplifizierten Gens eine geringe Molekülmasse auf und besitzt selektierbare Gene, um in einer Zelle zu einem leicht erkennbaren Phänotyp zu führen, so dass eine einfache Selektion von vektorhaltigen und vektorfreien Wirtszellen möglich ist. Um eine hohe Ausbeute an DNA und entsprechenden Genprodukten zu erhalten, sollte der Expressionsvektor mindestens einen starken Promotor und/oder Regulatorsequenzen aufweisen. Alternativ werden Promotoren durch eine PCR (über die Primer) oder mittels Gensynthesen vor den Genen eingebracht. Zweckmäßig wird vor jedem Gen zudem zur optimalen Translation eine ribosomale Bindungsstelle (RBS) mittels Vektor, PCR oder Gensynthese eingebracht. Für eine Replikation des Vektors ist zudem ein Replikationsursprung wichtig. Beispielsweise sind u.a. pET-Vektorsysteme basierend auf einer Antibiotikaselektion geeignet.

Die Methoden zur Kultivierung von Mikroorganismen sind dem Fachmann bekannt, wobei die Mikroorganismen kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed-batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Anzucht oder der biokatalytischen Umsetzung eines Stoffes umfassend eine Verbindung nach Formel (I) kultiviert werden.

In Ausführungsformen erfolgt die Anzucht in Schüttel kolben oder im Fermenter. Bevorzugt erfolgt die Kultivierung unter physiologischen Bedingungen bei einer Temperatur im Bereich von 10 °C bis 50 °C, bevorzugt im Bereich von 20 °C bis 40 °C, besonders bevorzugt im Bereich von 23 °C und 37 °C, wobei der pH-Wert der wässrigen Komponente bevorzugt im Bereich von 5,8 bis 8,5, besonders bevorzugt im Bereich von 6,5 bis 8,0 liegt.

In Ausführungsformen wird der Ganzzellkatalysator mit einer niedrigen Bakteriendichte, bevorzugt mit einer ODeoo im Bereich von 0,3 bis 1 ,7, besonders bevorzugt mit einer ODeoo im Bereich von 0,5 bis 1 ,1 , bereitgestellt. Zweckmäßig liegt der Ganzzellkatalysator in Schritt b) und zu Beginn von Schritt c) mit einer niedrigen Bakteriendichte, bevorzugt mit einer ODeoo im Bereich von 0,3 bis 1 ,7, besonders bevorzugt mit einer ODeoo im Bereich von 0,5 bis 1 ,1, vor. Unter dem Begriff „ODeoo“ wird ein Maß für die Bakteriendichte verstanden, welche mittels einer UV/Vis- Spektroskopie bzw. eines Photometers bei einer Wellenlänge von 600 nm gemessen wird. In Ausführungsformen erfolgt die Bereitstellung des mindestens einen Ganzzellkatalysators in Schritt a) durch Animpfen einer Hauptkultur mittels einer Vorkultur mit einer ODfeoo im Bereich von 0,7 bis 5, sodass die Hauptkultur eine ODeoo von maximal 0,1 aufweist, und anschließendes Anwachsen der Hauptkultur bis zu einer ODeoo im Bereich von 0,3 bis 1 ,7, besonders bevorzugt bis zu einer ODeoo im Bereich von 0,5 bis 1 ,1 , bei welcher die Induktion (Schritt b) durchgeführt und der Umsatz (Schritt c) gestartet wird.

In Ausführungsformen liegen die Gene i.) bis iv.) im erfindungsgemäßen Ganzzellkatalysator natürlich vor oder werden durch gentechnische Verfahren eingebracht.

Eine Phenolsäure-Decarboxylase ist ein Enzym in Bakterien, das die Abspaltung einer Carboxygruppe (-COOH) aus organischen Säuren, insbesondere Phenolsäuren, katalysiert.

In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Phenolsäure-Decarboxylase, welche fähig ist Verbindung (I) zu Verbindung (II) umzusetzen, wobei R ¹ -H oder -OH ist und wobei R ² -H, -OH oder -OCH3 ist.

Erfindungsgemäß weist der Ganzzellkatalysator mindestens ein Gen kodierend für ein Enzym umfassend eine Oxygenase-Untereinheit und/oder eine Reduktase-Untereinheit, bevorzugt einer Styrol-Monooxygenase oder Indol-Monooxygenase, auf. Vorteilhaft weisen Styrol- Monooxygenase und Indol-Monooxygenase ein Substratspektrum auf, welches einen hohen Umsatz der erfindungsgemäßen Verbindungen ermöglicht.

Eine Oxygenase ist ein Enzym in Bakterien, das mindestens ein Sauerstoffatom in eine organische Verbindung einbaut, wobei mindestens eine neue Hydroxy-, Carboxy- oder Epoxygruppe gebildet wird. Bevorzugt ist die Oxygenase eine Monooxygenase, d. h. ein Enzym, das ein Sauerstoffatom in eine organische Verbindung einbaut.

Eine Styrol-Monooxygenase ist ein Enzym in Bakterien, das die chemische Umsetzung von Styrol mit Flavin-Adenin-Dinukleotid (FADH2) gemäß der Reaktion:

Styrol + FADH2 + O2 «-> 2-Phenyloxiran + FAD + H2O als ersten Schritt des aeroben Styrol-Abbauweges (d. h. in Gegenwart von Sauerstoff) in Bakterien zum Zwischenprodukt 2-Phenyloxiran (Styroloxid) katalysiert. FAD wird dabei von der Reduktase-Untereinheit der Styrol-Monooxygenase unter NADH-Verbrauch wieder regeneriert.

Eine Indol-Monooxygenase ist ein Enzym in Bakterien, das die chemische Umsetzung von Indol mit Flavin-Adenin-Dinukleotid (FADH2) gemäß der Reaktion:

Indol + FADH2 + O2 «-> Indoloxid + FAD + H2O katalysiert. FAD wird dabei von der Reduktase-Untereinheit der Indol-Monooxygenase unter NADH-Verbrauch wieder regeneriert.

Eine Reduktase ist ein Enzym, welches eine Reduktion einer organischen Verbindung, insbesondere FAD, unter gleichzeitiger Oxidation eines Cosubstrats, insbesondere NADH, katalysiert.

In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator mindestens ein Enzym mit einer Oxygenase-Untereinheit und/oder einer Reduktase-Untereinheit, welches fähig ist Verbindung (II) zu Verbindung (III) umzusetzen, wobei R ¹ -H oder -OH ist und wobei R ² -H, -OH oder -OCH3 ist.

In Ausführungsformen ist das Enzym umfassend eine Oxygenase-Untereinheit und/oder eine Reduktase-Untereinheit ein Fusionsprotein.

Eine Styroloxid-Isomerase ist ein Enzym in Bakterien, welches die chemische Umsetzung von unsubstituierten oder substituierten Styroloxiden zu unsubstituierten oder substituierten Phenylacetaldehyden katalysiert.

In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Styroloxid-Isomerase, welche fähig ist Verbindung (III) zu Verbindung (IV) umzusetzen, wobei R ¹ -H oder -OH ist und wobei R ² -H, -OH oder -OCH3 ist.

Eine Alkoholdehydrogenase ist ein Enzym, welches die chemische Umsetzung von Alkoholen in Aldehyde oder Ketone sowie die Umkehrreaktion katalysiert. Das Enzym ist von Cofaktoren abhängig. Bevorzugt sind Cofaktoren NADH, NADPH oder Cytochrom C. Vorteilhaft weisen Alkoholdehydrogenasen oft ein breites Substratspektrum auf, weshalb eine größere Anzahl von Alkoholdehydrogenasen im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden kann. Weiterhin vorteilhaft kommen mehrere Alkoholdehydrogenasen natürlich in Bakterienzellen vor, weshalb bei einigen Ganzzellkatalysatoren authentische Alkoholdehydrogenasen genutzt werden können.

In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Alkoholdehydrogenase, welche fähig ist Verbindung (IV) zu Verbindung (V) umzusetzen, wobei R ¹ -H oder -OH ist und wobei R ² -H, -OH oder -OCH3 ist.

Die entsprechenden Gen- und Aminosäuresequenzen für die genannten Enzyme (Phenolsäure- Decarboxylase, Oxygenase einer Monooxygenase, Reduktase einer Monooxygenase, Styroloxid-Isomerase und Alkoholdehydrogenase) sind dem Fachmann bestens bekannt oder können bekannten Datenbanken (z. B. NCBI, RCSB PDB, UniProt, PDB Europa) entnommen werden.

In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator i. Mindestens zwei Gene kodierend für ein Enzym Phenolsäure-Decarboxylase und/oder ii. mindestens zwei Gene kodierend für ein Enzym umfassend eine Oxygenase- Untereinheit und/oder eine Reduktase-Untereinheit, bevorzugt einer Styrol- Monooxygenase oder Indol-Monooxygenase, und/oder iii. mindestens zwei Gene kodierend für ein Enzym Styroloxid-Isomerase, und/oder iv. mindestens zwei Gene kodierend für ein Enzym Alkoholdehydrogenase, wobei die Gene kodierend für ein Enzym jeweils gleich oder unterschiedlich sein können.

Vorteilhaft ermöglichen zwei unterschiedliche Gene für ein Enzym eine Erhöhung des Substratspektrums. Weiterhin vorteilhaft ermöglichen zwei unterschiedliche Gene für ein Enzym eine Variation der Expression und damit eine Optimierung der Laufzeit des erfindungsgemäßen Verfahrens.

In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator i. ein Enzym Phenolsäure-Decarboxylase, welches fähig ist Verbindung (I) _(N) umzusetzen, und ii. mindestens ein Enzym mit einer Oxygenase-Untereinheit und/oder einer Reduktase-Untereinheit, welches fähig ist Verbindung (II) zu Verbindung (III) umzusetzen, und iii. ein Enzym Styroloxid-Isomerase, welches fähig ist Verbindung (III)

(IV) umzusetzen, und iv. ein Enzym Alkoholdehydrogenase, welches fähig ist Verbindung (IV) umzusetzen, wobei R ¹ -H oder -OH ist und wobei R ² -H, -OH oder -OCH3 ist.

In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Phenolsäure-Decarboxylase mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 3, bevorzugt mit mindestens 95 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 3, besonders bevorzugt mit mindestens

98 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 3.

In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Phenolsäure-Decarboxylase mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 3.

In weiteren Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Oxygenase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 4 bis SEQ ID No. 9, bevorzugt mit mindestens 95 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 4 bis SEQ ID No. 9, besonders bevorzugt mit mindestens 98 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 4 bis SEQ ID No. 9.

In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Oxygenase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 4 bis SEQ ID No. 9.

In bevorzugten Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Oxygenase- Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 8 oder SEQ ID No. 9, bevorzugt mit mindestens 95 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 8 oder SEQ ID No. 9, besonders bevorzugt mit mindestens 98 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 8 oder SEQ ID No. 9.

In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Oxygenase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 8 oder SEQ ID No. 9. Vorteilhaft weist ein Ganzzellkatalysator mit einer Oxygenase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 8 oder SEQ ID No. 9 einen höheren Umsatz für hydroxylierte, insbesondere 3,4-dihydroxylierte, Verbindungen auf.

In weiteren Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysatoreine Reduktase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 10 bis SEQ ID No. 15, bevorzugt mit mindestens 95 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 10 bis SEQ ID No. 15, besonders bevorzugt mit mindestens 98 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 10 bis SEQ ID No. 15. In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Reduktase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 10 bis SEQ ID No. 15.

In weiteren Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Oxygenase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 4 bis SEQ ID No. 9, bevorzugt SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 8 oder SEQ ID No. 9; und/oder eine Reduktase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 10 bis SEQ ID No. 15.

Vorteilhaft erfolgt keine Hemmung des Enzyms umfassend eine Oxygenase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 8 oder SEQ ID No. 9 und/oder eine Reduktase- Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 10 bis SEQ ID No. 15 durch hydroxylierte, insbesondere 3,4-dihydroxylierte, Intermediate, welche in dem erfindungsgemäßen Verfahren auftreten können.

In weiteren Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Styroloxid-Isomerase mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17 oder SEQ ID No. 18, bevorzugt mit mindestens 95 % Sequenzidentität mit SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17 oder SEQ ID No. 18, besonders bevorzugt mit mindestens 98 % Sequenzidentität mit SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17 oder SEQ ID No. 18.

In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Styroloxid-Isomerase mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17 oder SEQ ID No. 18.

In bevorzugten Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator i. eine Phenolsäure-Decarboxylase mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 3, und ii. eine Oxygenase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 4 bis SEQ ID No. 9, und iii. eine Reduktase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 10 bis SEQ ID No. 15, und iv. eine Styroloxid-Isomerase mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17 oder SEQ ID No. 18.

In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Oxygenase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 4 bis SEQ ID No. 9 und eine Reduktase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 10 bis SEQ ID No. 13.

In alternativen Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Oxygenase- Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 4 bis SEQ ID No. 9 und eine Reduktase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit SEQ ID No. 14 oder SEQ ID No. 15.

In alternativen Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Reduktase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit SEQ ID No. 14 oder SEQ ID No. 15.

In Ausführungsformen kommt die Alkoholdehydrogenase in dem Ganzzellkatalysator natürlich vor.

Unter dem Begriff „Promotor“ wird eine Nukleotid-Sequenz auf der DNA verstanden, die die regulierte Expression eines Gens ermöglicht.

Die Gene kodierend für ein Enzym Phenolsäure-Decarboxylase, ein Enzym umfassend eine Oxygenase-Untereinheit und/oder eine Reduktase-Untereinheit, eine Styroloxid-Isomerase und eine Alkoholdehydrogenase, sind funktionell unter die Kontrolle mindestens eines regulierbaren Promotors gestellt, wobei die Promotoren identisch oder untereinander unterschiedlich sein können.

In Ausführungsformen erfolgt die Aktivierung des Ganzzellkatalysators signalabhängig durch das Kontaktieren des Ganzzellkatalysators mit einem Induktor, auch Aktivator, wobei die Induktion der Expression der Gene signalabhängig induziert und der Ganzzellkatalysator in seine aktive Form überführt wird. Vorzugsweise aktivieren die Induktoren den regulierbaren Promotor, in dem sie direkt mit einem regulierbaren Promotor interagieren bzw. in dem sie an ein Repressorprotein binden, das sich daraufhin vom Promotor löst. Durch das Kontaktieren des Ganzzellkatalysators mit einem Induktor werden die o. g. Enzyme in dem Ganzzellkatalysatorgebildet und stehen somit für die biokatalytische Umsetzung eines Substrates der Formel (I) zur Verfügung.

In Ausführungsformen ist der mindestens eine Promotor zur regulierbaren Expression der Gene i) bis iv) ein gemeinsamer Promotor.

In alternativen Ausführungsformen stehen die Gene i) bis iv) funktionell unter der Kontrolle jeweils eines regulierbaren Promotors.

In Ausführungsformen unterscheiden sich die regulierbaren Promotoren voneinander, sodass die Promotoren Primärsignal-spezifisch aktivierbar sind. Vorteilhaft kann somit die Anwesenheit unterschiedlicher Induktoren und/oder Aktivatoren in dem Ganzzellkatalysator zur Expression ausgewählter Gene führen, wodurch der Stress für eine rekombinante Zelle minimiert wird.

Die entsprechenden Nukleinsäuresequenzen für Promotoren, z. B. T7-Promotor bei pET16- Expressionsystemen, die für ein erfindungsgemäßes Verfahren eingesetzt werden können, sind dem Fachmann bekannt oder können bekannten Datenbanken (z. B. EPD, TRED, MPromDB) entnommen werden. Vorteilhaft können künstlich in Organismen eingebrachte Promotoren und natürliche vorkommende Promotoren verwendet werden.

Unter dem Begriff „Induktor“ wird eine meist niedermolekulare Verbindung verstanden, welche die für das erfindungsgemäße Verfahren notwendigen Gene anschaltet oder einen vorhandenen Repressor inaktiviert, sodass die genetische Information der Gene in Proteine bzw. Enzyme umwandelt werden kann.

In Ausführungsformen ist der Induktor aus Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG), Tryptophan oder Zuckern wie Arabinose oder Lactose ausgewählt.

In weiteren Ausführungsformen ist der Induktor ein Substrat-Induktor bei der Verwendung eines entsprechenden Promotors. Bevorzugt ist ein Substrat-Induktor Glukose, ein aromatischer und/oder aliphatischer Alkohol, Styrol oder deren Derivat. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Induktor Isopropybß-D-thiogalactopyranosid (IPTG).

Bevorzugt erfolgt das Kontaktieren der Ganzzellkatalysatoren mit einem Induktor in einer Konzentration des Induktors bezogen auf das Gesamtvolumen der wässrigen Komponente zwischen 10 pM und 1.500 pM, besonders bevorzugt zwischen 100 pM und 1.200 pM, ganz besonders bevorzugt zwischen 500 pM und 1.000 pM. Bevorzugt wird der Induktor einmalig zugegeben.

In Ausführungsformen erfolgt mindestens Schritte) in einem einphasigen wässrigen System oder in einem zweiphasigen System. Unter einem „zweiphasigen System“ wird ein Gemisch von zwei Lösungsmitteln verstanden, welche nicht mischbar sind. In Ausführungsformen wird als erste Phase Wasser bzw. ein wässriges Medium und als zweite Phase ein polares, organisches Lösungsmittel oder eine ionische Flüssigkeit, welche substanziell nicht mit Wasser mischbar ist, verwendet, wobei sich die Verbindung nach Formel (I), die Intermediate (II) bis (IV) und/oder das Produkt (V) bevorzugt in der organischen Phase akkumuliert. Vorteilhaft werden durch die organische Phase die Zellen, welche sich in der wässrigen Phase befinden, vor schädlichen Auswirkungen größerer Konzentrationen an den Intermediaten (II) bis (IV) und vor einer hohen Konzentration des Produkts (V) geschützt.

In Ausführungsformen sind substanziell nicht mit Wasser mischbare, polare, organische Lösungsmittel Ethylacetat, n-Octanol, n-Decanol oder Lösungsmittel mit einer vergleichbaren Polarität. Zweckmäßig sind die genannten Lösungsmittel für die Verbindungen nach Formel (I) bis (V) geeignet.

Durch das Kontaktieren des Ganzzellkatalysators mit einem Stoff umfassend eine Verbindung nach Formel (I) findet innerhalb eines Ganzzellkatalysators eine biokatalytische Umsetzung zu einem korrespondierenden Reaktionsprodukt der Formel (V) statt. In Ausführungsformen wird die Verbindung nach Formel (I) von dem Ganzzellkatalysator resorbiert, d. h. in die Zelle aufgenommen, und durch die Enzyme des Ganzzellkatalysators biokatalytisch umgesetzt.

Bevorzugt erfolgt das Kontaktieren des Ganzzellkatalysators mit einer Verbindung nach Formel (I) durch direkte Zugabe des Stoffes zum Kulturmedium als Lösung und/oder Feststoff. Bei direkter Zugabe zum Ganzzellbiokatalysator kann zudem eine organische Phase als Substratreservoir Anwendung finden.

Zweckmäßig erfolgt durch die Variation der Prozessführung hinsichtlich der Form der Zugabe des Stoffes umfassend eine Verbindung nach Formel (I) eine Anpassung an die Zelldichte und den verwendeten Organismus, wodurch ein optimaler biokatalytischer Umsatz von Verbindungen der Formel (I) und eine möglichst lange Prozesslaufzeit ermöglicht wird.

In Ausführungsformen ist der Stoff umfassend mindestens eine Verbindung nach Formel (I) ein Reinstoff, ein Pflanzenbestandteil oder ein Pflanzenextrakt. Vorteilhaft können auch Pflanzenabfallstoffe, beispielsweise Kartoffelschalen oder Kaffeereste aus Röstereien, im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Vorteilhaft wird durch die Verwendung eines Pflanzenbestandteils oder eines Pflanzenextraktes umfassend eine Verbindung nach Formel (I) nachwachsende Rohstoffe verwendet und somit ein nachhaltiges Verfahren bereitgestellt

In bevorzugten Ausführungsformen ist die Verbindung nach Formel (I) Kaffeesäure. Zweckmäßig wird Kaffeesäure aus verschiedenen Pflanzen oder durch eine enzymatische Synthese aus anderen Pflanzeninhaltstoffen, wie Chlorogensäure, erhalten. Geeignete Pflanzen zur Gewinnung von Chlorogensäure und/oder Kaffeesäure sind u.a. Beifuß, Brennnessel, Schafgarbe, Kaffee, Kartoffeln oder Giersch.

Der Stoff umfassend eine Verbindung nach Formel (I) wird vorzugsweise mit einer Gesamtkonzentration der Verbindung nach Formel (I) im Bereich von 5 mM und 30 mM, besonders bevorzugt im Bereich von 10 mM und 25 mM, ganz besonders bevorzugt im Bereich von 15 mM und 20 mM in einer biokatalytischen Umsetzung eingesetzt und kann kontinuierlich oder diskontinuierlich nachgeführt werden.

In Ausführungsformen erfolgt die Verwendung von Portionsgrößen im Bereich von 3mM bis 8 mM bei einer diskontinuierlichen Zugabe oder im Bereich von 1 mM bis 2 mM pro Stunde bei einer kontinuierlichen Zugabe. Besonders geeignet ist eine Kombination von diskontinuierlicher Zugabe am Anfang mit einer initialen Portionsgröße im Bereich von 5 mM bis 8 mM und anschließend nach 2 h bis 7 h einer kontinuierlichen Zugabe mit einer Portionsgröße im Bereich von 1 ,2 mM bis 1 ,8 mM pro Stunde.

Unter dem Begriff „wässriges Medium“ wird eine Flüssigkeit umfassend Wasser verstanden. Die wässrige Komponente muss in geeigneter Weise den Ansprüchen des Ganzzellkatalysators genügen.

Zusammensetzungen von wässrigen Komponenten, insbesondere Kulturmedien, für verschiedene Mikroorganismen sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise von Panke et al. beschrieben (Panke et al. 1999). Weitere Zusatzstoffe (z. B. Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Metallsalze) können zu der wässrigen Komponente in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugeführt werden. Zur pH-Wert-Kontrolle der wässrigen Komponente werden Pufferverbindungen, wie z. B. Hydrogenphosphatsalze oder TRIS; und basische Verbindungen, wie z. B. Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Ammoniak; oder saure Verbindungen, wie z. B. Phosphorsäure oder Schwefelsäure; in geeigneter Weise eingesetzt.

In Ausführungsformen werden im erfindungsgemäßen Verfahren Phosphat-gepufferte Medien verwendet (Panke et al. 1999), wobei Glukose als Kohlenstoffquelle eingesetzt wird. Bevorzugt wird Glukose initial mit einer Konzentration im Bereich von 10 mM bis 15 mM bezogen auf das Kulturvolumen, welches den Ganzzellkatalysator enthält, zur Anzucht eingesetzt.

In weiteren Ausführungsformen wird vor, gleichzeitig mit oder nach der Aktivierung des Ganzzellkatalysators mit einem Induktor in Schritt b) weiterhin Glukose mit einer Gesamtkonzentration im Bereich von 40 mM bis 60 mM zusätzlich zur initialen Portion zugegeben, bevorzugt mittels der kontinuierlichen Zugabe im Bereich von 2 mM bis 4 mM pro Stunde. Die Glukose kann als Lösung oder als Feststoff zugegeben werden.

Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie z. B. Fettsäurepolyglykolester oder n-Octanol; eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können der wässrigen Komponente unter anderem Antibiotika, wie z. B. Chloramphenicol, Ampicillin oder Kanamycin; hinzugefügt werden. In Ausführungsformen erfolgt zur Aufrechterhaltung der Plasmidstabilität der Einsatz von Bakterienzellen mit teilweise inaktivierten Stoffwechselwegen (bspw. auxotrophe Mutanten), wobei auf einem (Expressions-)Vektor, enthaltend mindestens ein Gen definiert in i.) bis iv.), u. a. Gene zur Komplettierung unvollständiger Stoffwechselwege enthalten sind. Bevorzugt werden im erfindungsgemäßen Verfahren Bakterienzellen eingesetzt, welche auf einem (Expressions-)Vektor, enthaltend mindestens ein Gen definiert in i.) bis iv.), mindestens ein Antibiotika-Resistenzgen enthalten.

In Ausführungsformen erfolgt das erfindungsgemäße Verfahren unter aeroben Bedingungen. Um aerobe Bedingungen aufrecht zu erhalten, werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen, wie z. B. Luft, in die wässrige Komponente eingetragen.

In Ausführungsformen erfolgt Schritt c) in einem Zeitraum im Bereich von 0 h bis 2 h, bevorzugt 0 h bis 1 h, besonders bevorzugt 0 h bis 0,5 h nach Schritt b). Überraschend wurde der höchste Umsatz bei einer gleichzeitigen Zugabe von Induktor und Substrat erhalten. Im Vergleich dazu erfolgt bei biotechnologischen Verfahren standardmäßig eine Vorinduktion eines Ganzzellkatalysators mit einem Induktor für einige Stunden, insbesondere 6 h bis 14 h, vor der eigentlichen Substratzugabe zum Start des Umsatzes.

In weiteren Ausführungsformen umfasst das erfindungsgemäße Verfahren mindestens einen weiteren Schritt, wobei der mindestens eine weitere Schritt eine Isolierung der Verbindung nach Formel (V) nach den Schritten a) bis c) ist. Vorteilhaft ist die Aufreinigung der Verbindung nach Formel (V), erhalten mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens, einfacher als bei einer extraktiven Gewinnung, da weniger strukturell ähnliche Inhaltsstoffe abzutrennen sind. Weiterhin vorteil haft wird das Reaktionsprodukt der Formel (V) von dem Ganzzellkatalysator in die wässrige Komponente sekretiert, wodurch die Isolierung mindestens eines Reaktionsproduktes der Formel (V) von der Biomasse und der wässrigen Komponente begünstigt wird.

Bevorzugt erfolgt die Isolierung des Reaktionsproduktes der Formel (V) von der Biomasse und der wässrigen Komponente schrittweise, wobei in einem ersten Schritt durch Zentrifugation oder Filtration die Biomasse von der wässrigen Komponente, enthaltend ein Reaktionsprodukt der Formel (V), abgetrennt wird.

In Ausführungsformen erfolgt die Isolierung der Verbindung der Formel (V) durch Extraktion der wässrigen Komponente mit einem organischen Lösungsmittel ausgewählt aus Ethylacetat, n- Octanol, n-Decanol oder einem aromatischen und/oder aliphatischen Lösungsmittel mit vergleichbarer Polarität.

In Ausführungsformen dienen die genannten organischen Lösungsmittel in einem einphasigen, wässrigen System zur Extraktion nach dem Umsatz einer Verbindung nach Formel (V). In alternativen Ausführungsformen dienen die genannten organischen Lösungsmittel in einem zweiphasigen System in Form einer zweiten Phase neben der wässrigen Komponente als Reservoir für eine Verbindung nach Formel (I) und/oder zur Abtrennung einer Verbindung nach Formel (V).

Neben der Extraktion mit organischen Lösungsmitteln eignet sich darüber hinaus die Festphasenextraktion zur Produktabtrennung. Als Festphasenmaterialen kommen u. a. kommerziell erhältliche hydrophobe Copolymere bestehend aus Monomeren von Styrol, Styrolderivaten, Benzol, Vinylbenzole und/oder Vinylpyrrolidon in Frage, die u. a. auch polar modifiziert sein können oder Gruppen mit lonentauschereigenschaften enthalten können. Zweckmäßig erfolgt die Elution des Zielproduktes von diesen Materialen mit Methanol oder Ethanol und/oder durch eine Variation des pH-Wertes.

In Ausführungsformen erfolgt zur Aufreinigung der Verbindung nach Formel (V) im Anschluss an die Flüssigextraktion oder Festphasenextraktion eine Destillation, wobei bevorzugt das organische Lösungsmittel abgetrennt wird. In Ausführungsformen erfolgt die Abtrennung des organischen Lösungsmittels durch Verdampfung bei einem Druck im Bereich von 0,1 mbar bis 1000 mbar, bevorzugt im Bereich von 0,1 mbar bis 750 mbar, besonders bevorzugt im Bereich von 1 mbar bis 400 mbar. Das erhaltene Produkt kann anschließend in Wasser aufgenommen werden und/oder über präparative Hochleistungsflüssigchromatographie aufgereinigt werden. Das abgetrennte organische Lösungsmittel kann je nach Aufarbeitung wieder für die nächste Extraktion oder Elution eingesetzt werden.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen Ganzzellkatalysator umfassend: i. ein Gen kodierend für ein Enzym Phenolsäure-Decarboxylase und ii. mindestens ein Gen kodierend für ein Enzym umfassend eine Oxygenase- Untereinheit und/oder eine Reduktase-Untereinheit, bevorzugt einer Styrol- Monooxygenase oder Indol-Monooxygenase, und iii. ein Gen kodierend für ein Enzym Styroloxid-Isomerase, und iv. ein Gen kodierend für ein Enzym Alkoholdehydrogenase, und mindestens einen Promotor zur regulierbaren Expression der Gene i) bis iv).

In Ausführungsformen ist der Ganzzellkatalysator ein rekombinanter Mikroorganismus, bevorzugt eine rekombinante Bakterienzelle.

In Ausführungsformen ist die Bakterienzelle aus Escherichia, Arthrobacter, Bacillus, Rhodococcus, Pseudomonas, Sphingobium, Sphingopyxis, Corynebacterium, Marinobacterium, Variovorax und Gordonia ausgewählt, bevorzugt aus Escherichia coli, Rhodococcus opacus 1 CP, Rhodococcus species ST-5, Pseudomonas fluorescens ST, Corynebacterium species AC-5, Pseudomonas putida CA-3, Pseudomonas putida 312 und Variovorax paradoxus EPS.

In bevorzugten Ausführungsformen ist die Bakterienzelle Escherichia coli, insbesondere ein Derivat von Stamm BL21 bzw. Stamm B.

In bevorzugten Ausführungsformen ist der Ganzzellkatalysator Escherichia coli mit Insertionsmutation. Unter dem Begriff „Insertionsmutation“ wird die Einbringung von mindestens einem Gen durch Genom-Insertion oder durch Einbringung von Expressionsvektoren verstanden. Die Nukleotidsequenzen der Gene i.) bis iv.) umfassen dabei authentische und/oder artifizielle Leserahmen. Bevorzugt ist ein artifizieller Leserahmen über eine Gensynthese an das ’’Codon Usage" des Wirtsorganismus angepasst.

In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Phenolsäure-Decarboxylase, welche fähig ist Verbindung (I) zu Verbindung (II) umzusetzen, wobei R ¹ -H oder -OH ist und wobei R ² -H, -OH oder -OCH3 ist.

Erfindungsgemäß weist der Ganzzellkatalysator mindestens ein Gen kodierend für ein Enzym umfassend eine Oxygenase-Untereinheit und/oder eine Reduktase-Untereinheit, bevorzugt eine Monooxygenase, besonders bevorzugt eine Styrol-Monooxygenase oder eine Indol- Monooxygenase, auf.

In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator mindestens ein Enzym mit einer Oxygenase-Untereinheit und/oder einer Reduktase-Untereinheit, welches fähig ist Verbindung (II) zu Verbindung (III) umzusetzen, wobei R ¹ -H oder -OH ist und wobei R ² -H, -OH oder -OCH3 ist.

In Ausführungsformen ist das Enzym umfassend eine Oxygenase-Untereinheit und/oder eine Reduktase-Untereinheit ein Fusionsprotein, bevorzugt nach SEQ ID No. 14 oder SEQ ID No. 15.

In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Styroloxid-Isomerase, welche fähig ist Verbindung (III) zu Verbindung (IV) umzusetzen, wobei R ¹ -H oder -OH ist und wobei R ² -H, -OH oder -OCH3 ist.

In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Alkoholdehydrogenase, welche fähig ist Verbindung (IV) zu Verbindung (V) umzusetzen, wobei R ¹ -H oder -OH ist und wobei R ² -H, -OH oder -OCH3 ist.

Die entsprechenden Gen- und Aminosäuresequenzen für die genannten Enzyme (Phenolsäure- Decarboxylase, Oxygenase, Reduktase, Styroloxid-Isomerase und Alkoholdehydrogenase) sind dem Fachmann bestens bekannt oder können bekannten Datenbanken (z. B. NCBI, RCSB PDB, UniProt, PDB Europa) entnommen werden.

In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator i. Mindestens zwei Gene kodierend für ein Enzym Phenolsäure-Decarboxylase und/oder ii. mindestens zwei Gene kodierend für ein Enzym umfassend eine Oxygenase- Untereinheit und/oder eine Reduktase-Untereinheit, bevorzugt einer Styrol- Monooxygenase oder Indol-Monooxygenase, und/oder iii. mindestens zwei Gene kodierend für ein Enzym Styroloxid-Isomerase, und/oder iv. mindestens zwei Gene kodierend für ein Enzym Alkoholdehydrogenase, wobei die Gene kodierend für ein Enzym jeweils gleich oder unterschiedlich sein können. In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator i. ein Enzym Phenolsäure-Decarboxylase, welches fähig ist Verbindung (I) umzusetzen, und ii. mindestens ein Enzym mit einer Oxygenase-Untereinheit und/oder einer Reduktase-Untereinheit, welches fähig ist Verbindung (II) zu Verbindung (III) umzusetzen, und iii. ein Enzym Styroloxid-Isomerase, welches fähig ist Verbindung (III) zu Verbindung (IV) umzusetzen, und iv. ein Enzym Alkoholdehydrogenase, welches fähig ist Verbindung (IV) umzusetzen, wobei R ¹ -H oder -OH ist und wobei R ² -H, -OH oder -OCH3 ist.

In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Phenolsäure-Decarboxylase mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 3, bevorzugt mit mindestens 95 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 3, besonders bevorzugt mit mindestens 98 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 3.

In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Phenolsäure-Decarboxylase mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 3.

In weiteren Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Oxygenase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 4 bis SEQ ID No. 9, bevorzugt mit mindestens 95 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 4 bis SEQ ID No. 9, besonders bevorzugt mit mindestens 98 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 4 bis SEQ ID No. 9. In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Oxygenase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 4 bis SEQ ID No. 9.

In weiteren Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Reduktase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 10 bis SEQ ID No. 15, bevorzugt mit mindestens 95 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 10 bis SEQ ID No. 15, besonders bevorzugt mit mindestens 98 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 10 bis SEQ ID No. 15.

In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Reduktase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 10 bis SEQ ID No. 15.

In weiteren Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Styroloxid-Isomerase mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17 oder SEQ ID No. 18, bevorzugt mit mindestens 95 % Sequenzidentität mit SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17 oder SEQ ID No. 18, besonders bevorzugt mit mindestens 98 % Sequenzidentität mit SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17 oder SEQ ID No. 18.

In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Styroloxid-Isomerase mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 16, SEQ ID No. V oder SEQ ID No. 18.

In bevorzugten Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator i. eine Phenolsäure-Decarboxylase mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 3, und ii. eine Oxygenase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 4 bis SEQ ID No. 9, und iii. eine Reduktase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 10 bis SEQ ID No. 15, und iv. eine Styroloxid-Isomerase mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17 oder SEQ ID No. 18.

In Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Oxygenase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 4 bis SEQ ID No. 9 und eine Reduktase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 10 bis SEQ ID No. 13.

In alternativen Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Oxygenase- Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 4 bis SEQ ID No. 9 und eine Reduktase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit SEQ ID No. 14 oder SEQ ID No. 15.

In alternativen Ausführungsformen umfasst der Ganzzellkatalysator eine Reduktase-Untereinheit mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität mit SEQ ID No. 14 oder SEQ ID No. 15.

In Ausführungsformen kommt die Alkoholdehydrogenase in dem Ganzzellkatalysator natürlich vor.

Die Gene kodierend für ein Enzym Phenolsäure-Decarboxylase, ein Enzym umfassend eine Oxygenase-Untereinheit und/oder eine Reduktase-Untereinheit, eine Styroloxid-Isomerase und eine Alkoholdehydrogenase, sind funktionell unter die Kontrolle mindestens eines regulierbaren Promotors gestellt, wobei die Promotoren identisch oder untereinander unterschiedlich sein können.

In Ausführungsformen ist der mindestens eine Promotor zur regulierbaren Expression der Gene i) bis iv) ein gemeinsamer Promotor.

In alternativen Ausführungsformen stehen die Gene i) bis iv) funktionell unter der Kontrolle jeweils eines regulierbaren Promotors.

In Ausführungsformen unterscheiden sich die regulierbaren Promotoren voneinander, sodass die Promotoren Primärsignal-spezifisch aktivierbar sind.

Die entsprechenden Nukleinsäuresequenzen für Promotoren, z. B. T7-Promotor bei pET16- Expressionsystemen, die für ein erfindungsgemäßes Verfahren eingesetzt werden können, sind dem Fachmann bekannt oder können bekannten Datenbanken (z. B. EPD, TRED, MPromDB) entnommen werden. Vorteilhaft können künstlich in Organismen eingebrachte Promotoren und natürliche Promotoren verwendet werden. Die Erfindung umfasst auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Ganzzellkatalysators zur biokatalytischen Synthese einer Verbindung nach Formel (V), durch die biokatalytische Umsetzung eines Stoffes umfassend mindestens eine Verbindung nach Formel (I) wobei R ¹ -H oder -OH ist, wobei R ² -H, -OH oder -OCH3 ist.

Für die Realisierung der Erfindung ist es auch zweckmäßig, die vorbeschriebenen Ausführungsformen und Merkmale der Ansprüche zu kombinieren.

Nachfolgend soll die Erfindung anhand einiger Ausführungsbeispiele und zugehöriger Figuren eingehender erläutert werden. Die Ausführungsbeispiele sollen dabei die Erfindung beschreiben ohne diese zu beschränken.

Es zeigen die

Fig. 1 den Einfluss der Vorinduktionsdauer (Schritt b) vor Zugabe des Substrates Kaffeesäure (Schritt c) auf die Bildung von 3-Hydroxytyrosol.

Fig. 2 den Verlauf des Umsatzes von Kaffeesäure in 3-Hydroxtyrosol mit einem erfindungsgemäßen Ganzzellkatalysator im Fermenter. Beispiel 1 : Erfindunqsqemäßer Ganzzellkatalysator

In einem ersten Ausführungsbeispiel wird die BL21-Variante von Escherichia coli verwendet, welche eine eigene Alkohol-Dehydrogenasen besitzt. Besonders geeignet sind Escherichia coli T7Express lysY/lq oder Escherichia coli BL21 (DE3)pLysS. Der erfindungsgemäße Ganzzellkatalysator umfasst SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 15 mit SEQ ID No. 17 (Katalysator A) oder SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 14 mit SEQ ID No. 17 (Katalysator B) oder SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 12 mit SEQ ID No. 17 (Katalysator C) oder SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 10 mit SEQ ID No. 17 (Katalysator D) oder SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 15 mit SEQ ID No. 17 (Katalysator E). Die Gene werden ausgestattet mit je einer einem jedem Gen vorgelagerten ribosomalen Bindungsstelle (RBS) hintereinander einem IPTG- sensitiven Promotor unterworfen, insbesondere durch Einbringung in die Multiple Cloning Site (MCS) von pET- oder pRSF-Vektoren oder in einen Vektor mit mehreren MCSs, insbesondere pCOLA-Duet. Dabei kann die Einbringung aller Gene in die Zelle über einen Vektor oder alternativ über zwei Vektoren erfolgen.

Im Falle der Katalysatoren A bis D erfolgt die Einbringung aller genannter Gene in Stamm T7Express lysY/lq über einen einzelnen pET-Vektor. Katalysator E entspricht dagegen Stamm BL21 (DE3)pLysS, wobei die relevanten Gene mittels pCOLA-Duet-Vektor und pET-Vektor bereitgestellt werden.

Beispiel 2: Umsatz von Kaffeesäure in 3-Hvdroxytyrosol im Maßstab von 50 ml

Die Katalysatoren A bis D (siehe Beispiel 1) werden im Maßstab von 50 ml für den Umsatz von Kaffeesäure eingesetzt. Die Vorkultivierung ausgehend von Kryokulturen erfolgt zunächst in Reagenzgläsern mit 4 ml LB-Medium, welches zusätzlich 100 pg/ml Ampicillin enthält, bei 37°C und 120 rpm über Nacht. Anschließend erfolgt das Animpfen der Hauptkultur, bestehend aus 50 ml M9*-Medium (nach Panke et al. 1999) mit 100 pg/ml Ampicillin, durch Einbringen von 3,5 ml Vorkultur. Diese Kulturen werden bei 37°C und 120 rpm bis zu einer Zelldichte von ODsoo = 0,6 angezogen und anschließend mit 1 mM IPTG induziert. Zeitgleich wird mit fester Kaffeesäure eine Konzentration von 8 mM in den Hauptkulturen eingestellt. Die weitere Kultivierung erfolgt bei 120 rpm und 30°C. Nach ca. 6 h wird nochmals Kaffeesäure mit einer Konzentration von 4 mM zugegeben. Nach 12 h erfolgt die Probenahme zum Nachweis der Funktionsfähigkeit der Ganzzellkatalysatoren durch Entnahme von 100 bis 250 pl der Hauptkultur, Abstoppen mit Methanol, Zentrifugation zur Zellabtrennung und Analyse des klaren, abgenommenen Überstandes mittels Hochleistungsflüssigchromatographie. Mit Katalysator A waren unter diesen Bedingungen nach 12 h 7,4 mM Produkt realisierbar, was einer Ausbeute von 62 % entsprach. Katalysator B und C offenbarten nach 12 h 8,7 mM Produkt und eine Ausbeute von ca. 73 %. Katalysator D erreichte eine Produktkonzentration von 10,3 mM und eine Ausbeute von 86 %.

Beispiel 3: Umsatz von Ferulasäure und Kaffeesäure mit Katalysator E

Die Anzucht der Biomasse von Katalysator E (siehe Beispiel 1) in der Vorkultur sowie in der Hauptkultur bis zur Induktion mit 1 mM IPTG erfolgt entsprechend Beispiel 2. Parallel zur Induktion werden einmalig entweder 3 mM Kaffeesäure oder 3 mM Ferulasäure zugegeben. Anschließend werden die Kulturen bei 30°C und 120 rpm inkubiert. Nach 24 h wird die Produktbildung, wie in Beispiel 2 beschrieben, quantifiziert.

Nach 24 h konnten im Falle der Verwendung von Ferulasäure als Edukt 1 ,5 mM Homovanillylalkohol nachgewiesen werden, was einer Ausbeute von 50 % entspricht. Im Falle der Kulturen, die mit Kaffeesäure inkubiert wurden, ließen sich 1 ,6 mM 3-Hydroxytyrosol nachweisen, was einer Ausbeute von 53 % entspricht.

Beispiel 4: Einfluss des Induktionszeitpunktes auf den Umsatz von Kaffeesäure

Für Katalysator D (siehe Beispiel 1) wurde der Einfluss einer Vorinduktion vor der Zugabe des Edukts untersucht. Die Vorkultivierung und Hauptkultivierung erfolgt wie in Beispiel 2 beschrieben, allerdings wird nur einmalig eine Portion von 8 mM Kaffeesäure zugegeben. Je nach Ansatz wird nach der Zugabe des Induktors IPTG die Kaffeesäure nach 0 h, 0,5 h, 1 h, 1 ,5 h, 2 h, 4 h, 6 h oder 12 h zugegeben. Die Entnahme von Proben und Analyse der Proben erfolgt wie unter Beispiel 2 angegeben. Die Ergebnisse der Umsätze nach 21 h sind in Fig. 1 dargestellt.

Deutlich erkennbar ist eine signifikante Abnahme der erreichbaren Produktmengen, wenn die Kaffeesäure erst 1 h nach der Induktion zugegeben wird. Folglich ist eine Zugabe in einem Zeitraum von 0 bis 2 h, bevorzugt 0 bis 0,5 h, erfindungsgemäß sinnvoll. Längere, sonst übliche Vorinduktionszeiten würden dagegen in diesem Fall zu äußerst geringen 3-Hydroxytyrosol- Mengen führen. Beispiel 5: Umsatz von Kaffeesäure in 3-Hydroxytyrosol mit Biokatalysator A im Maßstab von

9,25 I im Fermenter

Für dieses Ausführungsbeispiel wird Katalysator A (siehe Beispiel 1) ausgewählt. Die Kultivierungsbedingungen entsprechen Beispiel 2. Allerdings erfolgt die Kultivierung der Vorkultur nur über einen Zeitraum von 6 h. Danach werden zweimal mit dem Inhalt von je einer Vorkultur je 200 ml LB-Medium, welches zusätzlich 100 g/ml Ampicillin enthält, angeimpft. Danach erfolgt die Kultivierung für 14 h bei 37°C und 120 rpm. Der Inhalt der beiden Kolben wird gemischt und 250 ml dieser Vorkultur zur Inokulation eines Fermenters eingesetzt. Dieser enthält 9 I eines auf 37°C vortemperierten M9*-Mediums (nach Panke et al., 1999) mit 100 pg/ml Ampicillin und 12,7 mM Glukose. Die Rührgeschwindigkeit und Sauerstoffversorgung der Hauptkultur wird so eingestellt, dass der pC>2-Wert bei 50 bis 90 % liegt. Kurz vor der Induktion wird die Temperatur auf 30°C gesenkt. Die Induktion mit 1 mM IPTG erfolgt bei einer Zelldichte der Hauptkultur von ODeoo = 0,6. Zeitgleich wird Kaffeesäure in einer Endkonzentration von 8 mM zugegeben. Die weitere Kultivierung erfolgt bei 30°C, wobei Rührgeschwindigkeit und Lufteintrag an den Bedarf der Kultur angepasst wurden, sodass der pO2-Wert zwischen 30 und 85 % gehalten wird. 1 ,5 h nach der Induktion wird ausgehend von einer flüssigen Stammlösung automatisiert Glukose mit einer Konzentration von 2,4 mM je Stunde zugegeben. Insgesamt werden 50 bis 51 mM Glukose eingebracht. Nach 6 h werden dem Fermenter nochmals 6 mM Kaffeesäure und nach 14 h 3 mM Kaffeesäure durch Zugabe von festem Substrat zugesetzt. 24 h nach der Induktion war der Umsatz beendet. Die Entnahme von Proben während des Umsatzes und die Analyse der Proben erfolgt wie unter Beispiel 2 angegeben.

Insgesamt konnten von 15 mM eingesetzter Kaffeesäure 14,6 mM 3-Hydroxytyrosol gebildet werden, was einer Ausbeute von 97 % entspricht. Das entspricht weiterhin einer Produktmenge von 2,3 g/l. Bezogen auf das Gesamtvolumen konnten ca. 21 g Produkt binnen 25 h realisiert werden.

Beispiel 6: Umsatz von Kaffeesäure in 3-Hydroxytyrosol mit Biokatalysator D im Maßstab von 9,25 I im Fermenter

Für dieses Beispiel wurde Katalysator D (siehe Beispiel 1) verwendet. Die Vorkultivierung erfolgt entsprechend Beispiel 5. Der Inhalt der beiden Kolben wird gemischt und 250 ml dieser Vorkultur zur Inokulation eines Fermenters mit 9 I eines auf 37°C vortemperierten M9*-Mediums (nach Panke et al., 1999) mit 100 pg/ml Ampicillin und 12,7 mM Glukose eingesetzt. Die Rührgeschwindigkeit und Sauerstoffversorgung der Hauptkultur wird so eingestellt, dass der pCh- Wert bei 50 bis 90 % liegt. Kurz vor der Induktion wird die Temperatur auf 30°C gesenkt. Die Induktion erfolgt bei einer Zelldichte von ODeoo = 0,6 mit 1 mM IPTG. Zeitgleich wird Kaffeesäure in einer Endkonzentration von 8 mM zugegeben. Die weitere Kultivierung erfolgt bei 30°C, wobei Rührgeschwindigkeit und Lufteintrag an den Bedarf der Kultur angepasst wärden, sodass der pC>2-Wert im Bereich zwischen 40 und 75 % liegt. 1 ,75 h nach der Induktion wird ausgehend von einer flüssigen Stammlösung automatisiert Glukose mit einer Konzentration von 2,4 mM je Stunde zugegeben. Insgesamt werden 40 bis 41 mM Glukose zugegeben. Zudem wird 5,75 h nach der Induktion automatisiert Kaffeesäurelösung mit 1 ,2 mM pro Stunde in den Fermenter eingeleitet (insgesamt 12 mM neben der initialen Portion von 8 mM). Spätestens 20 h nach der Induktion ist der Umsatz beendet. Die Entnahme von Proben während des Umsatzes und die Analyse der Proben erfolgt entsprechend Beispiel 2. Der Verlauf des Umsatzes ist in Fig. 2 dargestellt.

Insgesamt wurden durch den Einsatz von 20 mM Kaffeesäure 19,4 mM 3-Hydroxytyrosol gebildet, was einer Ausbeute von 97 % entspricht. Das entspricht zudem einer Produktmenge von fast 3 g/l. Bezogen auf das Gesamtvolumen wurden 27,7 g Produkt binnen 20 h erhalten.

Zitierte Nichtpatentliteratur

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