Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Steuerung der Zusaπuriensetzung stabiler mikrobieller Mischbiozönosen, in denen Bakterien der Familie Lactobacteriaceae (Milchsäuregärer) bestimmend sind.

Beinahe alle mikrobiellen Stoffumwandlungen in der Natur erfolgen durch mikrobielle Mischbiozönosen (eine Misch¬ biozönose ist die Lebensgemeinschaft verschiedener Mi¬ kroorganismen) . Auch viele biotechnische StoffUmwand¬ lungen- z.B. die biologische Abwasserreinigung oder der Sauerteig beruhen auf den Stoffwechsel von mikrobiellen Mischbiozönosen. Es ist bekannt, daß sich die Mischbio¬ zönosen in einem sehr langen Zeitraum - in Vergleich zur Generationszeit der einzelnen Arten - zu sehr stabilen (reifen, protektiven) Biozönosen entwickeln, bei denen die Orgnaisationshöhe, die z.B. als Verhältnis von Bio¬ masse zu Produktivität ausgedrückt werden kann, groß

ist. Dies gilt insbesondere für solche Biozönosen, deren Umweltbedingungen relativ konstant bleiben, wie dies bei homoisothermen Tieren (Warmblütlern) z.B. im Darm der Fall ist.

Stabile Biozönosen weisen im allgemeinen eine Vielzahl von Regelungsmechanismen auf, durch die Änderungen der äußeren Bedingungen abgefangen werden. Artenspektrum und Individuenzahl einer Biozönose pendeln in ihrem Klimax¬ stadium um einen Optimumpunkt. Erhöht sich beispielsweise das Nahrungsangebot, so vermehren sich vorübergehend fast nur die ubiquitären allochthonen Mikroorganismen, während die hochspezialisierten autochthonen fast konstant blei¬ ben.

Diese autochthonen Mikroorganismen haben sich häufig so spezialisiert, daß sie zum Leben Suppline benötigen. Suppline sind Stoffe, die zum Grundbestand der Zelle ge¬ hören und von einzelnen Organismen nicht aus den einfa¬ chen Bausteinen synthetisiert werden können. Es handelt sich dabei um Aminosäuren, Purine, Pyrimidine, organische Säuren, Kohlenhydrate sowie Vitamine. Kohlenhydrate kön¬ nen sowohl Nährstoff als auch Supplin sein. Insbesondere selten vorkommende Kohlenhydrate können häufig als Supplin betrachtet werden. Von ihrer Funktion und Kon¬ zentration her unterscheiden sich Suppline deutlich von Nährstoffen. Sie entsprechen den Vitaminen bei der tierischen und menschlichen Ernährung. In mikrobiellen Mischbiozönosen dienen häufig End- oder Zwischenprodukte des Stoffwechsels einer Art der anderen als Suppline, wodurch sich ein Regelmechanismus ergibt (vgl. Schlegel, Allgemeine Mikrobiologie, 5. Auflage 1981, Stuttgart, Verlag Thie e, S. 169). Ein weiterer Regelmechanismus besteht darin, daß die einzelnen Mitglieder einer mikro¬ biellen Biozönose unterschiedlich empfindlich auf Hemm¬ stoffe reagieren, die entweder von anderen Mitgliedern der mikrobiellen Biozönose oder aber auch von einem

höheren Symbiosepartner, z. B. einer Wirtspflanze, stam¬ men.

In Biozönosen werden die einzelnen Funktionen durch be¬ stimmte Mitglieder dieser Biozönose ausgeübt, denen damit eine bestimmte ökologische Nische zukommt. In der Regel kann die gleiche ökologische Nische von mehreren Arten eingenommen werden. Es wurde nun gefunden, daß in mikro¬ biellen Mischbiozönosen, in denen Bakterien der Familie Lactobacteriaceae (Milchsäuregärer) bestimmend sind, de¬ ren Funktion für den Menschen von Interesse ist, einzelne Bakterienarten mit positiven Eigenschaften gezielt ge¬ fördert und/oder einzelne Mitglieder mit bestimmten ne¬ gativen Eigenschaften gezielt unterdrückt werden können, wenn man die Tatsache nützt, daß viele autochthone Milchsäurebilder stabiler mikrobieller Mischbiozönosen eine unterschiedliche Bedürftigkeit gegenüber Supplinen und/oder Empfindlichkeit gegenüber biotischen Hemmstoffen aufweisen.

Häufig können Suppline einer Art in bestimmten Konzen¬ trationen auf andere Arten hemmend wirken. Das gleiche Supplin kann auf die gleiche Art sowohl hemmend als auch fördernd wirken.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, in sta¬ bilen mikrobiellen Mischbiozönosen, in denen Bakterien der Familie Lactobacteriaceae bestimmend sind, eine oder mehrere ökologischen Nischen, die mit einer oder mehreren unerwünschten Bakterienarten besetzt sind, mit einer oder mehreren erwünschten Bakterienar (en) zu besetzen, deren ökologische Potenz ganz. oder weitgehend der der uner¬ wünschten Bakterienart(en) entspricht.

Die genannte Aufgabe wird bei einem Verfahren der ein¬ gangs genannten Art dadurch gelöst, daß man in einer oder mehreren ökologischen Nischen dieser Biozönose eine oder

mehrere unerwünschte Bakterienart(en) durch eine oder mehrere erwünschte Bakterienar (en) ersetzt, indem man Suppline für die erwünschte(n) Art(en) und/oder Hemm¬ stoffe für die unerwünschte(n) Art(en), ggf. in Kombina¬ tion mit bestimmten Nährstoffen zugibt.

Die Stabilität der Biozönose verändert sich durch Sup¬ pline und/oder Hemmstoffe allein nicht oder nur unwe¬ sentlich, was ein wichtiger Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber dem Zusatz von Probiotika, künstlich gezüchteten, erwünschten Mikroorganismen (engl.: pro- biotics), ist. Durch Zugabe bestimmter geeigneter Nähr¬ stoffe wird eine Vermehrung der autochthonen Mikroorga¬ nismen ermöglicht. In diesem Vermehrungshub wird mit Supplinen und/oder Hemmstoffen eingegri fen. Dadurch wird es möglich, ökologische Nischen durch erwünschte Orga¬ nismen zu besetzen. Wenn die Nährstoffe bereits vorgege¬ ben sind, z. B. in bestimmten menschlichen Lebensmitteln, ist eine gesonderte Zugabe von Nährstoffen für Mikroor¬ ganismen überflüssig. Die ggf. vorteilhafte oder notwen¬ dige Zugabe von Nährstoffen kann gleichzeitig mit der Zugabe von Supplinen und/oder Hemmstoffen oder zeitlich unabhängig davon erfolgen.

Nac dem erfindungsgemäßen Verfahren können bestimmte er¬ wünschte Spezies der Familie Lactobacteriaceae gefördert und andere gleichzeitig unterdrückt werden. Denn alle Lactobacteriaceae benötigen zum Wachstum Suppline.

In der Kombination von Supplinen mit einer Mischung von Kohlenhydraten und/oder einer organischen Stickstoff¬ quelle lassen sich viele Milchsäuregärungen steuern. Hierzu gehören beispielsweise die Gärfutterbereitung aus grünen Pflanzenteilen (Erzeugung von Silage) aus Zucker¬ rübenblättern, Mais, Kartoffeln, Gras, Luzerne, die Her¬ stellung wichtiger menschlicher Lebensmittel, wie Sauer¬ teig, Sauerkraut, Sauerrahmbutter, Rohwurst (Salami,

Cervelat), Quark, Harzer und Mainzer Käse, Hartkäse, Buttermilch usw. Ferner kann durch eine Steuerung der Lactobacteriaceae in die Mikroflora der Nasenhöhle von Tier und Mensch eingegriffen werden.

Durch Unterdrückung bestimmter Milchsäuregärer kann man in der Mundhöhle die Kariesbildung verhindern. Erfin¬ dungsgemäß macht man Suppline für erwünschte Lactobacte¬ riaceae und/oder Hemmstoffe für unerwünschte Lactobacte¬ riaceae mit verschiedenen Mitteln in der Mundhöhle ver¬ fügbar. Hierbei handelt es sich um die folgenden Mittel:

Zahnpasta und Zahnpulver Mundwässer, Kaugummi

Mundpillen, Konfekt und Süßwaren, zahnumhüllende Konzen¬ trate orale Tabletten mit verzögerter Freigabe des Wirkstoffs.

Diesem Vorgehen steht DE-OS 30 43 792 Roland E. Günther nicht entgegen. Bei dessen Verfahren wird das Supplin (Biotin) der Mundflora entzogen. Dies ist inhaltlich wesentlich verschieden von der Zugabe einer oder mehrerer Suppline.

Bei der menschlichen Haut ist es möglich, durch geeignete Supplinkombination die schweißabbauenden Bakterien so zu steuern, daß zwar das "Säureschutzschild" erhalten bleibt,- jedoch möglichst wenig geruchsbildende Stoffe entstehen.

Nährstoffe für Bakterien der Familie Lactobacteriaceae sind an sich bekannt (vgl. Schlegel, Allgemeine Mikro¬ biologie usw. (s. oben), S. 176). Hierzu gehören insbe¬ sondere Kohlenhydrate.

In den obengenannten Anwendungsfällen auftretende uner-

wünschte Milchsäuregärer (Lactobacteriaceae), und für erwünschte Milchsäuregärer notwendige Suppline sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßt:

Tabelle 1

Reaktion unerwünschte erwünschte Suppline Milchsäure¬ Milchsäure¬ hierfür gärer gärer der¬ selben öko¬ logischen Nische

Gärfutter¬ Lactobacilli Nikotinsäure bereitung

Karies- Streptococcus Lactobacteri- Glutamin bildung mutans aceae spec. Alanin

S. salivarius Arginin

Asparagin

Glycin

Isoleucin

Leucin

Lysin

Phenylalanin

Prolin

Serin

Threonin

Valin

Nicotinsäure

Cholin

Riboflavin

Panthothen- säure

Inosit

Beispiel 1: Gärf tterbereitung.

Silage von Silomais wurde im Laborversuch angesetzt, wobei (wie in der Praxis) kein voller Luftabschluß gegeben war. Das er¬ wünschte Sinken des pH-Werts (als Indikator für die Milchsäurebildung) erfolgte ohne Zu¬ sätze wesentlich langsamer als mit Zusatz geeigneter Kombinationen aus einem Supplin und bestimmten Nährstoffen. Bei Zugabe einer Mischung von Nikotinsäure, Xylose und Mannit (1:100:75) in einer Menge von 0,7 g/kg Trok- kensubstanz am ersten Tag des Versuchs wurde bereits nach 15 Tagen ein pH-Wert von 4,1 erreicht gegenüber einem pH-Wert von 5,9 nach 15 Tagen bei der Probe ohne Zusätze.

Beispiel 2: Verhinderung der Kariesbildung (Mundwasser) .

Eine wichtige Voraussetzung für die Karies¬ bildung sind Milchsäuregärer (z. B. Strepto- coccus mutans und S. salivarius), die gleichzeitig Saccharose in Laevane umsetzen. Durch Spülen der menschlichen Mundhöhle mit einer wässrigen Aufschwemmung von hochdis¬ perser Kieselsäure (als Aufwuchssubstrat) mit einem geeigneten Präparat, das einen Hemm¬ stoff für Hexosyltransferase bildende Arten von Mikroorganismen enthält, läßt sich die Hexosyltransferaseausscheidung im Ausstrich des Zahnbelags vermindern. Das verwendete Präparat enthielt neben den üblichen Bestandteilen (alkoholischen Lösungen von etherischen Ölen, Netzmitteln, Adstringentien und Antiseptika) die folgende Wirkstoffkom¬ binationen pro Liter wässrige Zubereitung:

Glutamin 24 g

EDTA 60 g

Alanin 1 000 mg

Arginin 625 mg

Asparagin 1 400 mg

Glycin 720 mg

Isoleucin 720 mg

Leucin 900 mg

Lysin 1 000 mg

Phenylalanin 500 mg

Prolin 500 mg

Serin 720 mg

Threonin 720 mg

Valin 720 mg

Nicotinsäure 24 mg

Cholin 46 mg

Riboflavin 10 mg Panthothensäure 10 mg

Inosit 100 mg.

Mit 100 ml dieser Lösung spülte der Proband morgens vor dem Zähneputzen den Mund. Aus dem Ausgespülten wurden die Hexosyltransferase- bildner bestimmt.

a) Bestimmung der Hexosyltransferasebildner

Pro Proband wurden 15 kleine Petrischalen mit 1,5 % Agar (2 % Succrose, 2 % Hefeextrakt) zu je 5 ml gefüllt. Von dem Ausgespülten werden in aqua deion. steril. Verdünnungen in .fol¬ genden Konzentrationen hergestellt:

1:1000, 1:10 000, 1:100 000, 1:1 000 000, 1:10 000 000.

o

Nach 24 Stunden bei 37 C erfolgt die Auszäh¬ lung der Kolonien (Hexosyltransferasebild- ner) . Alle Verdünnungen werden in drei Pa- rallel-Versuchen bestimmt. Aus den Petri¬ schalen wird mit dem Lederbergstempel auf

Mannit-Agar (2 %) überimpft und erneut 24 o Stunden bei 37 C bebrütet (Streptoσoccus mutans). Die Ergebnisse sind in der folgenden

Tabelle 2 enthalten. Die Reduktion der Hexo- syltransferasebildner wird im Vergleich zum nichttherapiertεn Probanden bestimmt.

Erσebnis :

Innerhalb von 4 Tagen sinkt die ^' Anzahl der Hexosyltransferasebildner durchschnittlich auf 1,1 %, wobei der Wert für die Bakterien¬ art S.mutans durchschnittlich auf 1,5 x

-3 10 sinkt.

bel le 2

HTB = Hexosyltransferasebi dner Mann.posi Liv S.mutans

Beispiel 3: Verhinderung der Kariesbildung (Zahnpasta)

Eine Zahnpasta aus einer Grundmasse nach dem Stand der Technik aus:

33 % Calciumphosphat,

20 % Glycerin,

1,6 % Natriumlaurylsulfat,

Rest Wasser,

enthält pro Kilogramm Zahnpastagrundmasse bzw. pro Dosis (= 2 g Zahnpasta) die folgen¬ den Substanzen:

pro kg oro Dosis

Gluta in 24 g 48 mg

ΞDTA 60 g 120 mg

Alanin 1 000 mg 2 mg

Arginin 625 mg 1,2 mg

Asparagin 1 400 mg 2,8 mg

Glycin 720 mg 1,4 mg

Isoleucin 720 mg 1,4 mg

Leucin 900 mg 1,8 mg

Lysin 1 000 mg 2 mg

Phenylalanin 500 mg 1 mg

Prolin 500 mg 1 mg

Serin 720 mg 1,4 mg

Threonin 720 mg 1,4 mg

Valin 720 mg 1,4 mg

Nicotinsäure 24 mg 48 μg

Cholin 46 mg 92 μg

Riboflavin 10 mg 20 μg

Panthothensäure 10 mg 20 μg

Inosit 100 mg 200 μg,